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易错点 28 基因工程
1.有关“启动子、起始密码子、终止子、终止密码子”
位置 作用
启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别和结合位点，启动转录过程
起始
位于mRNA分子上 决定翻译的开始
密码子
终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束
终止
位于mRNA分子上 决定翻译的结束
密码子
2.有关“DNA有关的酶”
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段
将两个DNA片段连接为
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段
一个DNA分子
DNA聚合酶或热稳定 将单个脱氧核苷酸依次连
磷酸二酯键 脱氧核苷酸
DNA聚合酶(Taq酶) 接到DNA单链末端
将DNA片段水解为单个
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 DNA
脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解
解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA
旋为单链，形成两条长链
将单个核糖核苷酸依次连
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸
接到RNA单链末端
3.有关“质粒”
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的
很小的双链环状DNA分子。
4. 有关“基因治疗”
基因治疗：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的
目的，是治疗遗传病的最有效手段。方法
体外基因治疗 体内基因治疗
比较
不 从患者体内获取某种细胞→体外完成基 直接向患者体内组织细胞中转
途径
同 因转移→筛选、细胞扩增→输入体内 移基因
点 特点 操作复杂，但效果可靠 方法较简单，但效果难以控制
都是将外源基因导入靶细胞，以纠正缺陷基因，目前两种方法都处于临
相同点
床试验阶段
1．下图为不同限制性核酸内切膀识别的序列及切割位置（箭头所指），下列叙述错误的是（
）
A．图示4种限制性核酸内切酶均不能够识别和切割RNA分子内的核苷酸序列
B．若DNA上的碱基随机排列，Not I限制性核酸内切酶切割位点出现频率较其他三种限制性
核酸内切酶高
C．酶切时使用两种限制酶同时处理是为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化
D．用酶Bgl II切出的目的基因与酶BamH I切割的质粒重组后，则不能再被这两种酶切开
2．下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞
内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法正确的是（ ）A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是用Ca2+处理细菌
B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的是只导入了质粒A的细
菌
C．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有四环素的培养基上生长
D．工程菌产生的生长激素可以直接使用效果良好
3．某种荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞
中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5’端，
获得了L1-GFP融合基因（简称为n），并将其插入质粒P，构建基因表达载体P1，其部分结
构和酶切位点的示意图如下（图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同）。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将n插入质粒P时，应使用图示中的_______________进行酶切，这是
为了保证_______________。
(2)体外利用PCR技术扩增基因n时，①使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因
是_______________；②利用PCR技术扩增基因n时，设计的引物之间不能_______________，
以避免影响引物与相应单链的结合。
(3)将P1转入大肠杆菌后，若在该大肠杆菌中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在大肠样菌中
依次完成了____________过程。
(4)真核生物基因（目的基因）在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防
止蛋白质被降解，在实验中应选用____________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加__________________的抑制剂。
1.限制酶的选择方法
根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和
标记基因等来确定限制酶的种类。
（1）应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ；不能选择酶切位点位
于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
（2）为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶（非同尾酶）切
割目的基因所在片段和质粒（双酶切），如图甲可选择用 Pst Ⅰ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确
保质粒上也有这两种酶的切割位点）。
（3）切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，
以用于重组DNA的鉴定和筛选，如图乙中的质粒不能使用Sma Ⅰ切割。
2.标记基因的作用
标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞：
3.农杆菌转化法分析
（1）构建基因表达载体需要两种工具酶：限制酶和DNA连接酶。（2）基因表达载体（重组质粒）导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感
受态，有利于重组质粒的导入。
（3）将导入目的基因的受体细胞培育成完整的植株要用到植物组织培养技术。
【拓展】如何筛选出含有目的基因的受体细胞
（1）原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基
因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如下图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四
环素抗性基因失活。
（2）被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的
细菌。
（3）筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重
组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到
含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为 2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为
含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进
行培养。
4．几种获取目的基因方法的比较
项目 从基因文库中获取 人工合成
方法 从基因组文库中获取 从cDNA文库中获取 化学合成法 反转录法
供体细胞中的DNA 目的基因的 蛋白质的氨
↓限制酶 mRNA 基酸序列 目的基因的
许多DNA片段 ↓反转录 ↓推测 mRN A
↓插入 单链DNA mRNA的核 ↓反转录
过 载体 ↓合成 苷酸序列 单链DNA
程 ↓导入 双链DNA ↓推测 ↓合成
受体菌群(基因组文库) ↓插入 基因的核苷 双链DNA
↓ 载体 酸序列 (即目的
外源DNA扩增，产生特 ↓导入 ↓化学合成 基因)
定性状 受体菌群 目的基因(cDNA文库)
↓分离
↓分离
目的基因
目的基因
适用于片段较
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导 小，核苷酸序
以RNA为模
说 入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有 列已知的目的
板，需要逆转
明 这种生物的不同的基因，称为基因文库，包括 基因；利用
录酶
基因组文库和cDNA文库 DNA合成仪合
成
5.PCR技术相关分析
(1)PCR技术的过程
关于引物的2点提醒：①引物是一小段单链的DNA或RNA，作为新子链的合成起点，只能结
合在母链的3′端；②只有通过引物，DNA才可以开始进行复制。
(2)PCR技术和DNA复制的比较
6．基因表达载体构建过程若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：目的基因与目的基因的连接、
目的基因与质粒的连接、质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。
7.蛋白质工程与基因工程的比较
项目 蛋白质工程 基因工程
原理 中心法则的逆推、中心法则 基因重组
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所
区 定向改造或生产人类所需的
实质 需的生物类型或生物产品(基因的异体表
别 蛋白质
达)
结果 可生产自然界没有的蛋白质 生产自然界已有的蛋白质
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程，对现有
联系 蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现；
②基因工程所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造
8．DNA的粗提取与鉴定实验
（1）DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”
实验操作 实验操作的目的
加蒸馏水 ①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；②加到含DNA的2 mol/L的NaCl
2次 溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14 mol/L，使DNA析出
①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②过滤用2 mol/L的NaCl溶
用纱布过
液充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；③滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析
滤4次
出的DNA(黏稠物)；④过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14 mol/L的NaCl
用NaCl
溶液使DNA析出；③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④
溶液4次
用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
（2）注意事项
(1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核
(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
(2)加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加
入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成
絮状沉淀。
(3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。(4)提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主
要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
(5)在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为 95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出
DNA。
1．下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入
受体菌并进行筛选。下列叙述正确的是（ ）
注：AmpR：氨苄青霉素抗性基因，TetR：四环素抗性基因
A．应选择的限制酶E组合和酶F
B．所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因
C．用含氨苄青霉素的培养基只能筛选出含重组质粒的受体菌
D．同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到3个条带
2．下图为科研人员研发冠状病毒疫苗的几种技术思路，请回答：
(1)途径Ⅰ与途径Ⅱ相比，疫苗安全性更高的是途径_____。途径Ⅲ中，过程①的操作需要_____
酶，该途径涉及技术的核心是_____（用图中数字作答）。除图中所示外，常见疫苗类型还有
_____。
(2)途径IV生产的DNA疫苗在动物细胞中表达将引起机体免疫应答。与DNA疫苗相比，
mRNA疫苗的安全性更有优势，因为mRNA不会进入细胞核，无_____的风险，且易被_____水解，不会遗传给子细胞。
(3)人体在感染新冠病毒后可引发“细胞因子风暴”（机体感染病原体后，体液中多种细胞因子
迅速大量产生的现象），进而伤害正常细胞。“细胞因子风暴”引发的免疫功能异常称为
_____。
(4)该病毒表面蛋白A为主要抗原，为进一步获得更符合治疗要求的单克隆抗体，科研人员通
过仔细研究，找到既不影响抗体空间结构又降低免疫反应的_____序列，借助基因工程技术对
抗体结构进行人源化改造。
(5)科研人员发现利用农杆菌转化法培育出的抗虫棉品种自交的后代中，抗虫植株均有某抗病性
状，原因可能是：
①_____。
②_____。
3．戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白（pORF2）位于病毒衣壳表面。
我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如下图。
请回答下列问题：
(1)过程①④需要的酶分别是____________、____________。
(2)过程⑤需要用____________处理大肠杆菌使其成为____________细胞，以完成转化过程。
(3)基因表达载体上ORF2基因的启动子需来源于____________。表达载体上往往带有抗性基因，
其作用是____________。
(4)生产pORF2的意义主要有两个：一是开发戊肝疫苗，用于预防戊型肝炎；二是用于戊肝抗
体诊断试剂盒的生产。抗体诊断试剂盒所利用的原理是____________。1．二代乙肝疫苗是将乙肝病毒表面抗原基因进行质粒构建，再将重组质粒导入酵母菌，经发
酵、纯化制作而成。下列叙述错误的是（ ）
A．构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶
B．重组质粒的构建是一种DNA重组技术
C．二代乙肝疫苗是酵母菌细胞产生的抗体
D．该技术定向地改造了生物的遗传性状
2．Kampen等科学家为研究脂肪酶突变体对底物专一性的影响，将其蛋白质第356位的丝氨酸
替换为缬氨酸，发现其活性降低了12倍，下列叙述错误的是（ ）
A．上述过程属于蛋白质工程
B．蛋白质工程需要构建重组DNA分子
C．该过程的实质是对脂肪酶在分子水平上进行改造
D．常用化学方法直接将脂肪酶第356位的丝氨酸替换为缬氨酸
3．利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物
为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是（ ）
A．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列
B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连
C．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物
D．第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16
4．下列利用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A．将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，要弃去上清液
B．采用体积分数为95%酒精溶液析出DNA的方法可去除部分杂质
C．用塑料离心管是因为用玻璃离心管容易破损
D．将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡，观察颜色变化5．下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述正确的是（ ）
A．限制酶将DNA双链切割成两条单链
B．同种限制酶既可以切割含目的基因的DNA片段又可以切割质粒，因此不具有专一性
C．序列—CTAG↓—和—G↓GATCC—被限制酶切出的黏性末端相同
D．E．coli DNA连接酶能催化平末端和黏性末端的连接
6．“试管婴儿”技术是通过将不孕夫妇的精子和卵细胞取出，在试管中完成受精，并在试管
中培养使其发育到如图所示的时期，再将胚胎植入女性子宫内发育成胎儿，该技术使一部分不
能生育的夫妇重新获得了生育的机会。下列叙述错误的是（ ）
A．“试管婴儿”技术在生物学上所依据的原理是有性生殖
B．试管婴儿技术中为了某些需要，需要提取③处的细胞DNA进行检测
C．“试管婴儿”的形成用到的技术有人工授精、体内培养、核移植
D．设计试管婴儿与普通试管婴儿的区别在于前者在植入前需要对胚胎进行遗传学诊断
7．抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提
供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（
）
A．预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
8．乙酰胆碱酯酶（AChE）是催化乙酰胆碱分解的水解酶，还能与有机磷农药发生特异反应，在水质检测中可用于有机磷农药污染的快速检测，乙酰胆碱酯酶对防治人类疾病、保护生态环
境等方面的研究具有非常重要的意义。回答下列问题：
(1)AChE的提取与纯化：AChE广泛存在于各种动物组织中，欲从动物肝脏中提取AChE，获取
新鲜肝脏后，必须立即处理或低温保存，因为______。将猪肝切碎后，加低温蒸馏水，为了防
止血液过快的凝结，可适量加入______，在组织捣碎机中捣碎后离心，取______用于进一步分
离和纯化。
(2)AChE的基因克隆技术：利用PCR技术或RT－PCR技术（即利用逆转录和PCR技术）克隆
AChE基因时，反应体系中均需要加入______酶，加入dNTP用于提供______。PCR产物经
______技术纯化后，可用______酶处理回收的DNA和克隆载体，获得重组DNA分子，最终达
到体内克隆AChE基因的目的。
(3)AChE的基因表达：若构建大肠杆菌表达系统，最好选择______技术（填“PCR”或“RT－
PCR”）获取AChE基因．与克隆AChE基因相比，表达载体中还需要加入大肠杆菌的______等。
在培养大肠杆菌时，常使用______培养基进行扩大培养，用______法接种到平板上，更易获得
相应菌株。
(4)研究人员在进行某地水质检测时，发现水样能与AChE发生特异反应，若不及时治理，可能
会造成水体______。
9．下图表示某种绿色荧光蛋白基因表达载体的构建过程，绿色荧光蛋白基因有720个碱基对
（bp），质粒有5369个碱基对（bp）。请据图回答问题：
(1)质粒中“氨苄青霉素抗性基因”的作用是______________。研究发现复制原点处的A和T
特别多，有利于DNA复制时______________过程的发生。
(2)限制酶BamHⅠ的识别序列和切割位点是G↓GATCC，该酶切形成的黏性末端是
______________。过程③所需的工具酶是______________。(3)已知图中质粒经BamHⅠ、HindⅢ双酶切后进行电泳，出现了一条长度为5300bp的DNA条
带，则重组质粒的长度为______________的DNA片段条带。
(4)过程①用两种限制酶切割质粒，与单一酶切相比，其优势有______________。过程②通过
PCR技术实现，进行PCR时，需要在两种引物的______________端分别添加BamHⅠ和HindⅢ
的识别序列。
(5)将重组质粒导入大肠杆菌前，要用CaCl 处理大肠杆菌，其目的是______________；进行筛
2
选时，大肠杆菌培养基中除需要加入水、无机盐、C源、N源、琼脂等物质外，还要分别添加
______________。
10．大肠杆菌pUC18质粒是基因工程中常用的载体。某限制酶在此质粒上的唯一酶切位点位
于LacZ基因中，如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β半乳糖苷酶。当培养基中含
有IPTG和X－gal时，X－gal便会被β半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反
之，则形成白色菌落。下图表示利用此质粒实施基因工程的主要流程。请分析并回答下列问题：
(1)基因工程的核心步骤是_______。
(2)目的基因插入质粒构建重组质粒的过程中，需要DNA连接酶恢复____键。
(3)将试管Ⅰ中的物质和大肠杆菌共同置于试管Ⅱ的目的是进行______；大肠杆菌需事先用
_____进行处理，使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
(4)将试管Ⅱ中的菌液接种于选择培养基上培养，培养基中应含有大肠杆菌必需的营养物质
_______和生长因子，还应加入IPTG、X－gal以及氨苄青霉素，其中加入_______的作用是筛
选出导入pUC18质粒和重组质粒的大肠杆菌。
(5)若观察到培养基上出现____色菌落，则说明大肠杆菌中已成功导入了重组质粒。如果作为受
体细胞的大肠杆菌也含有LacZ基因，则不利于重组质粒的筛选，原因是______。
