文档文本内容
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
题型05 生物技术与功能类
命题点
真题在线
常见设问/关键词
微生物的基
本培养技术
2023·全国乙·T37 2022·天津·T3 2021·天津·T1
设问关键词：常规
PCR、重叠延伸
PCR、荧光定量PCR
发酵工程的
原理及应用
2023·山东·T20 2022·湖北·T13 2022·山东·T20
基因工程的
基本工具
2023·新课标·T6 2021·全国乙·T38 2021·湖北·T7
基因工程的
应用
2022·河北·T24 2022·广东·T22 2022·全国乙·T38 2021·河北·T24
动物细胞融
合和单克隆
抗体的制备
2023·北京·T1 2023·湖北·T22 2022·山东·T15 2022·福建·T13
2021·山东·T15 2021·江苏·T11 2020·全国Ⅰ·T38
植物细胞工
程的应用
2023·山东·T14
几种不同
PCR 的应用
2023·江苏·T22 2023·山东·T25 2022·江苏·T24 2022·山东·T25
2021·全国甲·T38 2021·山东·T25 2020·北京·T12 2020·江苏·T33
命题预测
PCR 技术是近年高考热点，常涉及对PCR 基本过程、引物的选择、多种PCR 的应用
本节导航
模板01 利用PCR 技术获取目的基因
模板02 利用PCR 技术鉴定目的基因的连接方式
模板03 利用PCR 技术引导基因定点突变
识·命题特点 明命题特点、窥命题预测
明·答题模板 答题要点
+ 答题技巧
+ 模板运用
练·高分突破 模板综合演练，快速技巧突破
1
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
关键技巧
掌握PCR 过程的基本原理
模板01 利用PCR 技术获取目的基因
获取目的基因是基因工程操作的第一步。获取目的基因的方法有多种，现在常用PCR 特异性地快速扩增目
的基因。PCR 是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA 复
制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。该技术由穆里斯等人于1985 年
发明，为此，穆里斯于1993 年获得了诺贝尔化学奖。
技巧
01
利用
PCR
技术获取目的基因
1．（2024·河南·模拟预测）数字PCR 技术被称为第三代PCR,在核酸定量检测中具有突出优势。该技术通过
将一个样本稀释分成几十至几万份，并分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子
(DNA 模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR 扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进
行统计学分析，计算初始样品中靶标分子的拷贝数。据此分析，下列说法正确的是（ ）
A．数字PCR 技术仅适用于样本中目标分子含量较高的材料
B．数字PCR 技术遵循的基本原理是DNA 的边解旋边复制
C．每个单元中加入等量的4 种核糖核苷酸溶液作为扩增原料
D．每个单元中目标分子的两条子链合成都是从5'端向3'端延伸
【答案】D
【思路详解】A、数字PCR 技术把检测样本稀释后分配到不同的反应单元，在每个单元进行一个或多个目
标分子扩增，再对每个单元的扩增结果综合分析，计算初始样品中靶标分子的拷贝数。该技术对高、中、
低水平的目标分子含量的材料均可实现正确、精密的测定，A 错误；
B、数字PCR 技术遵循的基本原理是DNA 半保留复制，B 错误；
CD、每个反应单元中分别对目标分子进行PCR 扩增，需要加入4 种脱氧核苷酸的等量混合液、与目标分子
特异性结合的两种引物和TaqDNA 聚合酶等，两条子链合成是从两种引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，C 错
误、D 正确。
2
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
（2024·安徽芜湖·二模）不对称PCR 是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法。加入
的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR 反应最初的若干次循
环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对
称PCR 的简单过程如图所示。假设模板DNA 分子初始数量为a 个，6 次循环后开始扩增产生ssDNA。下列
有关叙述错误的是（ ）
A．限制性引物和非限制性引物均可与模板DNA 单链结合
B．不对称PCR 循环6 次需要消耗（26-1）a 个限制性引物
C．最后获得的ssDNA 中不含非限制性引物
D．子链的延伸都是从两种引物的3'端开始的
模板02 利用PCR 技术鉴定目的基因的连接方式
检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体上的标记基因、PCR
技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中，PCR 技术不仅可以
精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。
【补充】利用PCR 技术快速检测病原体
病原体检测是诊断和控制传染病的重要手段，为迅速而准确地确定病原体的存在和种类，发展了许多快速
检测方法。PCR 技术是一种基于DNA 扩增原理的快速病原体检测方法，它能够在几小时内扩增和检测极
小量的病原体DNA，并且具备高度的特异性和敏感性。
技巧02 利用PCR 技术鉴定目的基因的连接方式
（2024·广西·模拟预测）现将XplA 和XplB 两种能降解弹药使用后残留的危险污染物的基因转入实弹射击场
的柳枝稷草中。若要通过PCR 检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的XplA 和XplB 基因，应选择
的引物组合是（ ）
3
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
A．引物1+引物3
B．引物1+引物2
C．引物2+引物3
D．引物3+引物4
【答案】A
【思路详解】根据启动子的位置，若正确插入，模板链应为题甲图中下链，则引物1 应与下链的3'端结合，
引物3 可以结合题甲图上链的3'端，若XplA 和XplB 基因正确插入，则使用引物1+引物3 可通过PCR 扩增出
XplA 和XplB 基因融合片段，若Xp1A 和XplB 基因其中一个基因反接或者两个都基因反接，通过PCR 均无法
扩增出Xp1A 和XplB 基因融合片段，因此，使用引物1+引物3 通过PCR 可检测所获转基因柳枝稷草中是否
含有正确插入的Xp1A 和XplB 基因，A 正确；BCD 错误。
（2024·浙江绍兴·一模）免疫PCR 是对微量抗原的一种检测方法。下图是利用该技术检测牛乳中微量抗生
素的流程图：首先将抗体1 固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA 标记的抗体2，进行PCR
扩增，最后进行电泳检测。下列相关叙述错误的是（ ）
A．PCR 扩增中延伸时间取决于引物的长度
B．引物浓度大小会影响PCR 扩增获得产物的数量
C．图示过程中三次冲洗的目的均不同
D．图示抗原检测过程发生两次抗原与抗体的结合
模板03 利用PCR 技术引导基因定点突变
4
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
重叠延伸PCR 技术是指在PCR 技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR 产物形成了重叠链，通
过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术在基因的定点突变、长片段基因
的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。
【补充】利用PCR 技术扩增未知基因序列
利用PCR 技术进行基因扩增时，为了便于设计引物，要求目的基因两侧的序列是已知的。当DNA 的某些
序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR 技术。
技巧03 利用PCR 技术引导基因定点突变
反向PCR 是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。下列叙述正确的
有（ ）
A．应选择引物1 和引物4 进行PCR 扩增
B．设计的引物中GC 碱基含量越高，退火温度越低
C．PCR 产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA 分子
D．在环化阶段，可选E.coliDNA 连接酶而不能选T4 DNA 连接酶
【答案】A
【思路详解】A、DNA 子链合成的方向为5'端到3'端，因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增
应选择引物1 和引物4 进行PCR 扩增，A 正确；
B、GC 碱基含量越高，碱基对间氢键的含量越多，退火的温度越高，B 错误；
C、PCR 产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA 分子，C 错误；
D、在环化阶段，因为图示的末端为黏性末端，因此，既可选E.coliDNA 连接酶也可选T4 DNA 连接酶，D 错。
（2024·广西·模拟预测）基因定点突变的目的是通过定向地改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链
5
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
上一个或几个氨基酸。该技术是蛋白质工程的重要技术，图示为利用PCR 技术进行定点突变的流程，相关
叙述错误的是（ ）
注：引物1 和引物3 的突起处代表与模板不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是
可以互补的。
A．酶①应为耐高温DNA 聚合酶，引物X 和Y 为引物2 和4
B．将四种引物置于同一个反应系统中同时进行第一个阶段的反应
C．第一阶段PCR 过程中需要进行两次循环才能得到两种所需的DNA 片段
D．通过该技术获得的突变基因可以表达出原来自然界不存在的蛋白质
1．发酵工程在食品、医药、农牧业等方面有着广泛地应用，下列有关说法正确的是（ ）
A．发酵工程的中心环节是灭菌，防止杂菌污染
B．pH 能影响发酵产物，谷氨酸的发酵生产过程中，碱性条件下易产生谷氨酰胺
C．啤酒生产中的焙烤、蒸煮环节既可以杀菌，又可以使所有酶失活
D．微生物饲料中的单细胞蛋白除蛋白质外还含有糖类、脂质、维生素等
2．“细菌喜荤，霉菌喜素”，一般来说，在培养细菌时，需添加动物性营养物质，如蛋白胨等；而在培
养霉菌时，一般需要添加植物性营养成分，如豆芽汁。下列相关叙述不正确的是（ ）
A．蛋白胨为细菌提供碳源、氮源和特殊营养物质
B．细菌和霉菌体内的酶存在差异，导致二者偏好的营养成分不同
C．分别培养细菌和霉菌时，需将培养基调节至相同的pH
D．若需要比较细菌和霉菌形成的菌落差异，培养基中还需添加琼脂
3．如图是老陈醋的生产流程，下列相关叙述正确的是（ ）
6
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
A．蒸熟的高粱米应先加入大曲再冷却
B．“糖化”是将高粱中的淀粉等大分子氧化分解为小分子，为酒精发酵提供原料
C．“醋醅”中含有的醋酸菌，是一种异养的单细胞真核生物
D．“醋酸发酵”步骤中每天翻料两次，可为醋酸菌提供更多氧气
4．下列关于细胞工程的说法正确的是（ ）
A．体外培养的动物细胞形态相比体内正常细胞可能会发生改变
B．作物脱毒苗培养时先诱导愈伤组织生根，再诱导生芽
C．iPS 细胞都是通过将外源基因导入体细胞获得的
D．离心法收集细胞只能用于传代培养细胞的收集
5．肝细胞中的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因突变会导致酪氨酸血症。下图是研究人员利用基因编辑技术
纠正病人来源肝细胞，成功治疗酪氨酸血症小鼠的过程，为治疗人类酪氨酸血症奠定理论基础。相关叙述
准确的是（ ）
A．酪氨酸血症的发生说明基因能通过控制蛋白质的结构控制生物性状
B．过程②需在培养液中添加琼脂、葡萄糖、干扰素动物血清等物质
C．过程③需敲入正常的延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因，并敲除相关抗原基因
D．基因编辑后的人源肝细胞植入小鼠分化为完整肝脏，是治疗小鼠酪氨酸血症的关键
6．碱性磷酸酶是抗肿瘤药物多柔比星前体的专一性活化酶，将碱性磷酸酶与单克隆抗体制成“生物导
弹”，使多柔比星前体在肿瘤细胞处被活化，对其DNA 造成损伤，抑制以DNA 为模板进行的生理活动，
达到治疗肿瘤的目的。下列叙述正确的是（ ）
A．给小鼠注射多柔比星前体后，可从脾脏中得到能产生肿瘤抗体的B 细胞
B．制备单克隆抗体的过程中需用特定的选择培养基和抗体检测进行筛选
C．“生物导弹”利用了碱性磷酸酶的定向制导作用和单克隆抗体的特异性杀伤能力
D．多柔比星前体活化后可直接抑制肿瘤细胞的DNA 复制和翻译，而抑制其无限增殖
7
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
7．下列关于动物细胞融合和单克隆抗体制备的叙述，错误的是（ ）
A．灭活的病毒可与细胞质膜发生作用，从而诱导细胞融合
B．用特定抗原免疫小鼠后；可从其骨髓中分离出浆细胞，用于细胞融合
C．产生特定抗体的杂交瘤细胞可在小鼠体内培养，从腹水中提取抗体
D．单克隆抗体可高度特异性地识别抗原，从而辅助肿瘤诊断
8．黑曲霉多不耐高温，发酵获得柠檬酸的过程需大量冷却水控制温度，生产成本高。现利用原生质体融
合技术获得耐高温高产黑曲霉，过程如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．处理①培养基中黄色圈大的菌落不一定为高产菌株
B．处理②、③用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁
C．处理④升高温度即可筛选出耐高温高产黑曲霉
D．发酵结束后通过适当的过滤、沉淀等方法获得柠檬酸
9．抗体一药物偶联物，也就是ADC，又被称为“生物导弹”，由单克隆抗体、细胞毒性药物以及两者之间
的连接物共3 个部分组成。下列叙述正确的是（ ）
A．该抗体一药物偶联物能识别肿瘤细胞上的各种膜蛋白性.
B．经步骤①筛选得到的杂交瘤细胞具有的特点是能准确识别抗原的细微差异并能大量制备
C．ADC 起作用时会被细胞吞噬，并在溶酶体内被分解后释放药物
D．诱导骨髓瘤细胞与脾脏中的细胞融合，可用的诱导因素只有灭活的病毒
10．如图是我国科学家培育克隆猴“中中”“华华”的过程，Kdm4d 为组蛋白去甲基化酶基因、TSA 为组
蛋白脱乙酰酶抑制剂。下列说法错误的是（ ）
8
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
A．各种动物胚胎移植的最佳时期不尽相同，一般是在原肠胚期前
B．灭活的仙台病毒可诱导体细胞和去核卵母细胞融合
C．Kdm4d 的mRNA 和TSA 的作用是对组蛋白进行表观遗传修饰来调控相关基因表达
D．克隆猴和核供体所具有的微小差异来自基因突变或者染色体变异
11．某小组通过PCR（假设引物长度为8 个碱基，短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA 片段，并用
限制酶进行酶切（如图），再用所得片段与质粒连接成功构建了基因表达载体。下列叙述正确的是（ ）
A．其中一个引物序列为3'-TGCGCAGT-5'
B．步骤①所用的酶是SpeI 和CfoI
C．用步骤①的酶对质粒进行酶切，至少获得2 个片段
D．构建基因表达载体时需要使用限制酶和DNA 聚合酶
12．紫外线引发的DNA 损伤，可通过“核苷酸切除修复（NER）”方式修复，机制如图所示。着色性干皮
症（XP）患者的NER 酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤易出现炎症，进而发展成皮肤癌。下列叙述错
误的是（ ）
9
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
A．图中切口的产生应是限制酶的作用
B．填补缺口时，新链合成以5'到3'的方向进行
C．在DNA 复制时可以进行缺口修复
D．XP 患者年龄增长，发生皮肤癌的可能性会下降
13．科学家常利用λ-Red 同源重组酶系统进行基因敲除。图为科学家运用A-Red 同源重组酶系统到大肠杆
菌（E．coli）内进行靶基因敲除的过程，其中重组质粒pKD46 在30℃时正常复制，而37℃时自动丢失。下
列说法正确的是（ ）
A．HA1 和HA2 分别添加在两种引物的5'和3'端
B．过程I 和Ⅱ的培养温度分别是30℃、37℃
10
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
C．靶基因敲除过程，只发生磷酸二酯键的断裂及合成
D．若过程I 是使用含青霉素的培养基成功筛选出含质粒pKD46 的大肠杆菌，则说明该大肠杆菌自身含
有青霉素抗性基因
14．双脱氧测序法（Sangtr 法）是第一代DNA 测序方法。在4 支试管中分别加入4 种dNTP 和少量的1 种
ddNTP 进行PCR，再把PCR 产物变性，利用电泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测
定并比较某疾病患者与对照个体DNA 模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述错误的是（ ）
注：dNTP 是PCR 的四种原料；双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP 四种；在
DNA 聚合酶作用下，ddNTP 与dNTP 竞争核苷酸链延长位点，以加入ddATP 的体系为例：若配对的为
ddATP，延伸终止；若配对的为dATP，继续延伸
A．5'-TAGTGCCCATC-3'为对照个体的一段序列
B．PCR 过程中需要DNA 聚合酶，不需要DNA 解旋酶和DNA 连接酶
C．上述PCR 反应体系中模板链需要足够多
D．患者该段序列中某位点的碱基C 突变为T
15．抗虫和耐除草剂玉米“双抗12-5”是我国自主研发的转基因品种。在转基因产品的研发、生产、销售
等环节，可采用PCR 技术进行基因监测，为转基因生物安全监管提供依据。下列叙述错误的是（ ）
A．PCR 开始阶段的预变性可使模板DNA 变性更充分
B．PCR 循环过程中，复性的目的是使DNA 聚合酶与模板相结合
C．进行PCR 基因监测时，应使用待检目的基因的特征序列作为引物
D．安全监管中，应阻止检测出转基因扩增产物的非转基因标识农产品上市
16．基因工程技术给人类生产生活和医疗带来巨大的影响，下面有关说法正确的是（ ）
A．限制酶具有专一性，因此不同的限制酶不能产生相同的黏性末端
B．在自然条件下，农杆菌转化法不适用于将目的基因导入大多数的单子叶植物细胞
C．只要有证据证明转基因产品不安全，就应禁止转基因技术的研究
D．将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的调控元件重组在一起，导入哺乳动物的乳腺细胞，可获
得乳腺生物反应器
17．随着转基因技术的发展，其安全性问题引发了极大的关注，下列叙述错误的是（ ）
11
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
A．转基因农产品可能会引发过敏反应
B．转基因农作物中都含有会危害健康的毒性蛋白
C．转基因农作物可通过传粉将转入的基因扩散到其近缘物种中
D．对转基因安全性的争议源于对基因结构、功能及调控机制了解有限
18．CRISPR/Cas9 基因编辑技术已被广泛应用于基因治疗等领域。其基本工具sgRNA/Cas9 来源于原核细胞，
包括具有导向功能的sgRNA 和行使DNA 双链切割功能的Cas9 蛋白，技术原理如图甲所示。回答下列问题：
I.某研究团队以人乳腺癌MDA-MB-231 细胞、Lenti-CAS9-sgRNA 质粒等为材料，进行原位定点敲除乳腺癌细
胞中的人源粘着斑蛋白（VCL）基因，以研究该基因在细胞中的作用，为乳腺癌的治疗提供理论支持。
(1)获取目的基因。经过改造的质粒已经插入了Cas9 蛋白基因如图乙，故只需要根据 基因的
部分序列人工合成sgRNA 基因即可。
(2)构建表达载体。人工合成的sgRNA 基因如图丙，需要通过 扩增，为了确保酶切后能正确连
接到质粒上（相应酶切序列如图丙），需在引物1 的5'端加上碱基序列 ，引物2 的5'端加上
碱基序列 。
(3)导入受体细胞。利用慢病毒将包含SgRNA 基因的重组质粒及相应对照质粒（空质粒）分别转入不同的乳
腺癌MDA-MB-231 细胞。感染后用 筛选稳转细胞系。设计转入空质粒的乳腺癌细胞的目的是
。
(4)检测与鉴定。获得稳转细胞系，培养3d 后收集细胞全部蛋白检测VCL，结果如图丁，显示敲除成功。检
测特定蛋白质的原理是 。
12
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
Ⅱ、其他应用
(5)敲入目的基因与个体化治疗。通过同源重组修复可插入外源目的基因。正确的操作是：导入基因编辑工
具表达载体的同时，导入外源目的基因，且在目的基因两端加上与 相同的序列。
(6)对基因或染色体定位跟踪。将Cas9 基因改造成Cas9i 基因（表达的Cas9i 蛋白丧失切割功能），并与绿
色荧光蛋白（GFP）基因融合，表达载体构建关键部分为：—启动子—Cas9i 基因—GFP 基因—终止子—，
最终表达成融合蛋白Cas9i-GFP，利用SgRNA/Cas9i-GFP 荧光跟踪特定基因在细胞中的分布。改造Cas9 基因
的技术属于 （填“基因工程”“蛋白质工程”“酶工程”）。
(7)调控基因表达。转录因子M 如果结合到基因上游的调控序列，就会招募转录元件聚集以促进下游基因转
录。要通过sgRNA/Cas9i 工具促进乳腺癌细胞中的X 基因表达，表达载体构建关键部分为： 。
13
