夜雨聆风
大家好，今天为大家介绍美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校王兴团队在《Advanced Materials》上发表的一项工作。该团队利用DNA折纸纳米结构作为“分子钉板”，将靶向CD117蛋白的适配体在管状DNA折纸上分别排列成左手螺旋和右手螺旋的手性适配体结构。其中左手螺旋结构在急性髓系白血病细胞中展现出显著增强的细胞内化和抗肿瘤药物递送效率，其细胞毒性是右手螺旋结构的两倍以上。这项研究证实了三维空间手性适配体结构可驱动细胞对映选择性识别，为精准靶向药物递送提供了新方法。
癌症是亟待解决的重大健康挑战之一。尽管大量抗癌药物（如小分子、siRNA、mRNA、多肽等）已被开发并展现出巨大潜力，但缺乏靶向递送能力所导致的脱靶效应，仍是其临床转化的主要障碍。手性作为生命体系的基本结构特征，蛋白质、核酸等生物大分子的手性构象决定了其特异性识别与功能。在药物设计中，利用手性选择性提升靶向效率已成为重要策略。然而，传统手性药物设计主要聚焦于分子层面，如何在纳米尺度上通过空间排列实现手性识别，仍是亟待突破的难题。近年来研究表明，工程化核酸纳米结构（如DNA折纸纳米结构）具有良好的生物相容性、生物稳定性及可调的免疫原性，并已成功应用于治疗领域。特别是基于定制化DNA纳米结构（DDN）的平台，凭借其优异的可寻址性，能够以纳米级精度将多种分子结合剂排布为预设结构，通过DDN上结合剂与病毒或细胞表面蛋白之间的多价及结构匹配相互作用，使亲和力增强数千至数百万倍，从而实现高效靶向递送。然而，现有研究多集中于适配体序列本身的优化（即“0维”方法），对于三维空间中适配体的手性排列如何影响细胞识别与内化，尚缺乏系统研究。基于此，本研究利用DNA折纸纳米结构的精准可寻址性，构建了左、右手性适配体结构，探究手性排列对CD117阳性白血病细胞识别、内化及药物递送的影响，以期为提升靶向治疗效果提供新策略。
图1. DNA折纸模板化手性适配体结构的设计示意图。
作者选取管状DNA折纸纳米结构（“DNA管”）作为分子钉板，通过在管表面设计特定的单链DNA对接位点，将这些位点分别排布为左手螺旋和右手螺旋的形状，进而通过DNA杂交将靶向CD117蛋白的适配体精确组装到相应位点上，形成手性适配体结构（L-CAP和R-CAP）。当这些CAP结构与表达CD117的急性髓系白血病细胞孵育时，左手螺旋的CAP结构展现出更强的细胞识别、内化及药物杀伤效果。
图2. L-和R-手性DNA管-适配体的形成与表征。
为验证DNA管的手性排列可行性，作者首先对DNA管骨架进行了表征。图2a和2e分别展示了用于形成L-和R-手性适配的DNA管侧视图和俯视图示意图，其中相邻对接位点沿Z轴的距离设计为9.5 nm。原子力显微镜（图2b, 2f）和透射电镜（图2c, 2g）成像清晰证实了DNA管的成功组装，其尺寸约为101 × 16 nm，形态均一、结构完整。由于AFM和TEM难以直接观察适配体结构，作者采用13 nm金纳米颗粒标记对接位点的互补序列，形成L-和R-手性AuNP-DNA管复合物。TEM结果显示出金纳米颗粒分别呈左旋和右旋的螺旋排列，从而验证了DNA管表面对接位点的手性空间构型（图2d, 2h）。
图3. L-/R- CAP结构在靶细胞内化中的对映选择性。
为探究L-CAP与R-CAP结构是否具有不同的生物学功能，研究者将FAM标记的CD117靶向适配体（绿色荧光）分别组装至L-和R-手性DNA管上，并与CD117高表达的H9细胞共孵育。共聚焦显微镜结果显示，L-CAP处理组的绿色荧光与溶酶体红色荧光呈现明显重叠，表明L-CAP被细胞有效内化并转运至溶酶体；而R-CAP处理组几乎检测不到绿色荧光信号（图3b）。仅含对接位点（不含适配体）的L/R-DNA管对照组亦未见荧光，证实细胞识别依赖于适配体。流式细胞术定量分析进一步显示，L-CAP处理组绿色荧光强度最高（图3c）。为排除非特异性结合，研究者使用不表达CD117的H6细胞重复上述实验，L-与R-CAP处理组荧光强度均较低且无明显差异（图3e, 3f）。以上结果表明，L-CAP可被CD117阳性细胞特异性识别并内化，而R-CAP几乎不具备此能力。
图4. L-/R- CAP结构在不同孵育时间点的细胞相互作用与内化。
为探究L-和R-CAP内化差异的机制，作者进行了时间梯度的流式细胞术分析。结果显示孵育1 h时，L-CAP和R-CAP均引起相似程度的荧光峰右移，表明两者在细胞表面的初始结合能力相当。然而，孵育2 h后，L-CAP处理组的荧光信号进一步增强，而R-CAP组则停留在较低水平。这一结果表明适配体本身的手性排列并不影响其与CD117蛋白的初始结合，但L-CAP能够促进后续的内化过程。
图5.L-/R-CAP结构对映选择性机制的分子模拟与能量分析。
为揭示手性依赖性内化的分子机制，作者设计了L-CAP、半间距（4.5 nm）L-CAP-HP、R-CAP、R-CAP-HP以及非手性直线排列共五种构型，并进行了计算模拟与流式细胞术分析（图5a）。流式细胞术结果显示，L-CAP与L-CAP-HP的细胞内化信号随时间持续增强，非手性排列虽有一定内化但强度较低；相比之下，R-CAP与R-CAP-HP的信号微弱且易于脱落，表明手性特征相较于适配体间距对细胞内化更为关键（图5b）。在L-CAP的设计模型中，四个CD117二聚体复合物（每个二聚体由两个适配体分别结合一个CD117单体）通过适配体锚定于DNA管表面（图5c）。经溶剂化模型构建及能量最小化计算，L-CAP系统的最终自由能显著低于R-CAP系统，提示L-CAP在热力学上更为稳定（图5d–5f）。值得注意的是，在约3000步最小化后，R-CAP中的部分适配体从对接位点发生脱离，而L-CAP的结构保持完整（图5g）。能量计算进一步表明，破坏对接位点杂交所需的能量（约1650 kJ/mol）远低于CD117二聚体的稳定性（约-4900 kJ/mol），因此R-CAP的不稳定性主要源于其刚性几何构型与CD117二聚体空间构象的不匹配。综上所述，L-CAP通过稳定CD117二聚化促进细胞内化，而R-CAP无法有效诱导二聚化，导致适配体脱离及内化失败。
图6. 药物负载CAP结构的抗肿瘤效应。
基于上述结果，作者进一步评估了负载抗肿瘤药物柔红霉素（Dau）的CAP结构的治疗潜力。首先将柔红霉素负载于适配体，随后将其分别组装至L-或R-手性DNA管上，获得L-CAP-Dau与R-CAP-Dau，并与K1细胞（CD117阳性AML细胞）或RAW264.7细胞（CD117阴性对照）共孵育。共聚焦显微镜及流式细胞术结果显示，仅L-CAP-Dau能够被K1细胞有效内化（图6b, 6c）。细胞活力测定表明，在K1细胞中，仅L-CAP-Dau处理组呈现显著的细胞活力下降；而在CD117阴性的RAW细胞中，各处理组均未观察到明显细胞毒性（图6d）。上述结果提示，L-CAP通过适配体介导的CD117结合诱导CD117二聚化，触发CAP复合物的内化，从而将柔红霉素递送至细胞内，引起DNA损伤及细胞死亡；相比之下，R-CAP虽能与CD117结合，但无法有效诱导二聚化，因而内化受阻，抗肿瘤疗效微弱。
综上所述，作者利用DNA折纸纳米结构的精准可寻址性，构建了空间手性适配体结构L-CAP和R-CAP，并揭示了左手螺旋结构L-CAP能够显著增强CD117阳性白血病细胞的靶向内化及抗肿瘤药物递送效率。机制研究表明，L-CAP通过诱导CD117蛋白二聚化触发内吞，而R-CAP因无法稳定二聚体导致适配体脱落。该工作为理解细胞表面蛋白对纳米结构手性的识别提供了新视角，鉴于针对其他癌细胞表面标志物的适配体可被筛选或合成，该方法有望广泛应用于多种恶性肿瘤的靶向治疗，为下一代智能纳米药物设计提供了新策落。
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推送人：LYT
Ø原文链接:
https://doi.org/10.1002/adma.202519007
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