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10XscATAC的结果说明(2)之网页报告解读summary

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10XscATAC的结果说明(2)之网页报告解读summary

方老师小课堂

前言

10X scATAC结果中最重要的结果汇总都会在网页报告中集中展示,10X cellranger ATAC分析后的网页报告存放在web_summary.html中,报告分为两个部分:Summary和Data Quality,这里先给大家介绍下报告中Summary的各个部分的结果解读和应当注意哪些指标的情况。

核心指标

最主要的指标往往都是标记十分醒目的。

·Estimated number of cells:

鉴定出来的细胞数目;

·Median high-quality fragments per cell:

每个细胞的高质量fragment的中位数。

·Fraction of high-quality fragments overlapping peaks:

mapping quality大于30的fragments中ovelap部分 call peaks的比例,一般这个值也不能太低,小于15-20%,可能反应实验中,细胞核状态不好,Tn5酶捕获的开放区域太少导致peaks比较少的含量出现。

Sample

 这里汇总了样本的基本信息。

·Sample ID

样本名称,对应cellranger ATAC软件参数的id参数;

·Sample description

样本描述,对应cellranger ATAC软件参数的description参数;

·Pipeline version

cellranger ATAC软件的版本;

·Reference path

cellranger ATAC使用的参考基因组信息;

·Chemistry

化学试剂匹配;

·Organism

物种信息。

Sequencing

这里展示的是测序reads的质量信息。

·Sequenced read pairs

用于比对的reads总数;

·Valid barcodes

匹配到白名单的barcodes占比,一般该指标要大于75%,过低可能是测序和文库构建问题;

·Q30 bases in barcode

在i2 index read大于Q30的barcodes占比,一般该指标要大于65%,过低可能是测序出现问题;

·Q30 bases in read 1

在read1中大于Q30的reads占比,一般该指标要大于65%,过低可能是测序出现问题;

·Q30 bases in read 2

在read2中大于Q30的reads占比,一般该指标要大于65%,过低可能是测序出现问题;

·Q30 bases in sample index i1

在i1 index read的Q30的reads占比,一般该指标要大于90%,过低可能是测序出现问题。

Cells

这里介绍的是一些关于Cell calling相关的一些指标情况

·Estimated number of cells

是检测鉴定到的真实细胞数目;

·Mean raw read pairs per cell

每个细胞的原始reads数目的均值;

·Fraction of high-quality fragments in cells: mapping quality大于30的fragments的比例(不嵌合而且是unique的)一般大于40%,如果很低,可能实验上细胞核的状态不好,Tn5酶结合的有效fragments比较少;

·Fraction of transposition events in peaks in cells

转座位点位于peaks区域的比例。一般大于25%。如果比例过小,有可能是细胞状态不好,或者测序深度不够。

·Median high-quality fragments per cell: 每个细胞mapping quality大于30的fragmens数目的中位数。

这里图片展示的就是cell calling的基本情况。

左图是基于fragments ovelap部分 call peaks后,每个细胞按其进行排序,横轴是barcodes排序的位次,纵轴是fragments ovelap部分call peaks的数目。

采用cell calling这个算法最经典的,横轴和纵轴展示都是进行了log转换的,这样就会形成一个类似弯曲的膝盖的形状。往往数值高的部分是真实细胞,数值很低的是背景噪音,在批量下滑的那个区域内进行cell calling算法取其截断值,这里展示了截断的部分,黄色部分是真实细胞,蓝色部分是背景噪音。

一般该曲线呈急剧下降表明细胞相关的barcode与非细胞相关的barcode分离良好;曲线呈圆曲线和缺乏陡峭的下降可能表明样品质量低或单细胞行为的损失。

右图是展示了Fragments的分布情况。

可以看到蓝色部分是背景,黄色部分是真实细胞。可以看到,黄色区域真实细胞的fragments的数目情况比背景要高很多,存在明显分离。注意,此图横轴是fragments的数目,纵轴是fragments数目对应的barcodes的数目。

Cell Clustering

cellranger ATAC分析会简单的将数据进行降维展示。

左图:

数字分群映射到降维tSNE的结果。

右图:

Fragments数目映射到降维tSNE的结果。

  后记 

本次介绍了cellranger ATAC网页报告的Summary结果,下一期接着和大家介绍网页报告的后半部分Data Quality。这部分也很重要。大家对ATAC感兴趣的可以持续关注后续方老师笔记更新哈!

策划:ZZJ & MultiBioLab

责编:ZZJ & MultiBioLab

一审:王若霖

二审:赵志杰

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