文档内容
解密 17 发酵工程
考点热度 ★★★★★
内容索引
第 1 部分 传统发酵技术的应用
核心考点 1 传统发酵技术的原理
发酵与传统发酵技术
制作传统发酵食品
核心考点 2 制作泡菜
核心考点 3 制作果酒和果醋
制作果酒和果醋的原理
制作果酒和果醋的过程
制作果酒与果醋过程中的几个问题
第 2 部分 微生物的培养技术及应用
核心考点 1 微生物的基本培养技术
相关概念
（一）培养基的配制
（二）无菌技术
（三）微生物的纯培养
探究 · 实践：酵母菌的纯培养
固体培养基上接种微生物的方法
核心考点 2 微生物的选择培养和计数
（一）选择培养基
（二）微生物的选择培养
（三）微生物的数量测定
探究 · 实践土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
第 3 部分 发酵工程及其应用
核心考点 1 发酵工程的环节
核心考点 2 发酵工程的应用
2022 年高考题
考点 由高考知核心知识点 预测
（2022 浙江卷）29.微生物的培养与筛选
传 统 发
酵 技 术 （2022 全国甲卷）11. 微生物的培养与鉴定
的 应 （2022 全国乙卷）11. 微生物的培养与筛选
微生物的培养技术是高考的重
用 、 微 （2022 山东卷）14. 微生物的培养技术
点，多数省份的高考考查的都是
生 物 的 （2022 山东卷）20. 发酵工程的应用（啤酒）
这部分内容。
培 养 技 （2022 广东卷）21. 微生物的培养技术
术 及 应 （2022 海南卷）12. 微生物的培养技术
用 （2022 河北卷）23. 微生物的培养技术（2022 湖南卷）21.发酵工程
（2022 湖北卷）10. 传统发酵技术的原理
（2022 湖北卷）13. 发酵工程
（2022 湖北卷）4. 微生物的培养技术（消毒、灭菌）
（2022 江苏卷）3. 微生物的培养技术
（2022 江苏卷）16.酿造啤酒
（2022 辽宁卷）15. 微生物的培养技术
（2022 辽宁卷）18. 微生物的培养技术
第 1 部分 传统发酵技术的应用
发酵工程是指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人
类有用的产品。它涉及菌种的选育和培养、产物的分离和提纯等方面
核心考点 1 传统发酵技术的原理
发酵与传统发酵技术
1、发酵的概念:
1857年，法国微生物学家巴斯德通过实验证明，酒精发酵是由
活的酵母菌引起的
发酵(fermentation)，是指人们利用微生物，在适宜的条件下，
将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。
不同的微生物具有产生不同代谢物的能力，因此利用它们就可
以生产出人们所需要的多种产物。
2、传统发酵技术:
①实例:
腐乳是我国古代劳动人民创造出的一种经过微生物发酵制
作的大豆食品。
腐乳味道鲜美的原因：经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白
质被分解成小分子的肽和氨基酸
参与发酵的微生物：多种微生物参与了豆腐的发酵，如酵
母、曲霉和毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。
②定义:
直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、
卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术一般称为传统发酵技
术。
传统发酵以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主，通常是家庭式或作坊
式的。
利用传统发酵技术制作的食品还有酱、酱油、醋、泡菜和豆豉等，它们是
我国传统饮食文化的重要组成部分。
制作传统发酵食品乳酸菌:
代谢: 乳酸菌是厌氧细菌，在无氧的情况下能将葡萄糖分解成 乳 酸 。
酶
C
6
H
12
O
6
2C
3
H
4
O
3
（乳酸）+能量
用途: 可用于乳制品的发酵、泡菜的腌制等
分布: 在自然界中分布广泛，空气、土壤、植物体表、人或动物的
肠道内都有乳酸菌分布
种类: 乳酸菌种类很多，常见的有乳酸链球菌和乳酸杆菌
酵母菌:
酵母菌是一类 单细胞 真菌 ，能以多种糖类作为营养物质和能量的
来源，
一些含糖量较高的水果、蔬菜表面经常可以发现酵母菌的存在。
酵母菌是兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵，可用
于酿酒、制作馒头和面包等。
温度 是影响酵母菌生长的重要因素，酿酒酵母的最适生长温度约
酶
C H O 2C HO H（酒精）+ 2CO+能量
6 12 6 2 5 2
醋酸菌:
醋酸菌是好氧细菌。
当O、糖源都充足时能将糖分解成醋酸；
2
当缺少糖源时（O 充足）则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
2
醋酸菌可用于制作各种风味的醋。
多数醋酸菌的最适生长温度为 30~35 ℃ 。
酶
①C H O+2O 2CHCOOH（醋酸）+2 HO +2CO+能
6 12 6 2 3 2 2
量
酶
②C 6 H 12 O 6 +O 2 CH 3 COOH（醋酸）+H 2 O+能量
核心考点 2 制作泡菜
制作泡菜的原理：
制作传统泡菜是利用植物体表面天然的乳酸菌来进行发酵的。发
酵期间，乳酸会不断积累，当它的质量百分比为 0.4%~0.8%时，
泡菜的口味、品质最佳。
方法步骤： 用清水和食盐配制 质量百分比为 5%~20% 的盐水
配制盐水 并将盐水煮沸（①去除水中的氧气；②杀灭盐水中
的微生物 ） ，冷却待用
将新鲜蔬菜(如萝卜、黄瓜和豇豆等)洗净，切
成块状或条状，混合均匀，晾干后装入泡菜坛内；
装至半坛时，放入蒜瓣、生姜及其他香辛料，
继续装至八成满。
泡菜发酵初期，蔬菜表面的大肠杆菌、
装坛 酵母菌等较活跃，它们可进行发酵并产
生CO ，若泡菜坛装太满，发酵液可能
2
会溢出坛外。
倒入冷却的盐水，使盐水没过全部菜料，盖好坛盖。
盖好坛盖 。
密封 向坛盖边沿的水槽中注满水，并在发酵过 创造无氧环境
程中注意经常向水槽中补充水
腌制后五六天之内，亚硝酸盐含量最高，这时候不能吃
泡菜。
腌制 腌制十几天以后，亚硝酸盐含量降低，这时候可以吃泡
菜。但是，因为发酵尚未完成，泡菜口味不佳，所以这时候也不
能吃泡菜。
腌制二十天至一个月左右，发酵作用彻底完成，泡菜腌
制好了，这时候就可以吃美味泡菜了。亚硝酸盐的危害：
膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，但是当人体亚硝酸盐的总量
达到 0.3-0.5 g 时，会导致人体中毒，达到 3g 时，会导致死亡。
亚硝酸盐在一定条件下，可以在一定的微生物作用下，形成一种强烈的
致癌物质——亚硝胺
测定亚硝酸盐含量的原理
在 盐酸酸化 条件下，亚硝酸盐与 对氨基苯磺酸 发生 重氮化反应 后，与
N-1-奈基乙二胺盐酸盐 结合形成 玫瑰红 色染料，与已知浓度的 标准显色液
目测比较，估算泡菜中亚硝酸盐含量。
注：删除部分在人教2019版中没有要求核心考点 3 制作果酒和果醋
制作果酒和果醋的原理：
许多新鲜水果(如葡萄）的果皮表面附着有大量的不同种类的野生酵母
菌。在这些酵母菌的作用下，水果可以发酵成果酒。在有氧的条件下，
果酒经醋酸菌的作用还可以进一步发酵成果醋。
制作果酒和果醋的过程：
榨汁机等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分
数为70%的酒精消毒，晾干备用。
清洗、消毒 新鲜葡萄，用清水冲洗1~2 次，再去除枝梗和
腐烂的籽粒，沥干。 （ 先清洗，后去梗 ）
榨汁 用榨汁机榨
取葡萄汁
将葡萄汁装入发酵瓶中(注意；要留有大约
1/3 的空间)，盖好瓶盖。
（保留约1/3 空间的目的：在发酵开始时，让酵母菌利
装瓶
用上部空间中的氧气更快地增殖，快速形成大量菌体
细胞，以利于后期厌氧发酵实验的进行。）
18~30°C
在发酵过程中，每隔12h 左右 将瓶盖 拧松一
次 ( 注意：不是打开瓶盖 )，此后再拧紧瓶盖
酒精发酵
发酵时间为 10~12d 。可通过从 发酵瓶口 （或
出料口）取样来对发酵的情况进行监测
当葡萄酒制作完成后，打开瓶盖，盖上一层
纱布，进行葡萄醋的发酵。
醋酸发酵
发酵温度为 30~35 ℃ ，
时间为7~8d。制作果酒与果醋过程中的几个问题：
1.在制作果酒和果醋的过程中，发酵液分别有哪些变化?其中最明显的变化发生在发酵后多少天?引起变化
的原因是什么?
在葡萄酒的制作过程中，发酵液中会产生气泡，这是因为酵
母菌发酵产生CO；
2
如果是用紫色葡萄制作葡萄酒，随着发酵时间的延长，由果
皮进入发酵液的花青素会越来越多，因而发酵液的颜色会逐渐加深变
成深红色。
果醋发酵 过程中一般不会出现气泡，发酵完成时，在发酵液
的液面上会出现一层菌膜，这是醋酸菌膜。（制作泡菜时产生的白膜
是酵母菌）
2.在制作果酒的过程中，除了酵母菌，是否还有其他微生物生长?它们会对果酒发酵产生影响吗?如果有，
如何避免这种影响?
果酒中除了酵母菌，还有乳酸菌、醋酸菌等微生物。
乳酸菌 可能分解果酒中的糖、甘油、酒石酸等，从
控制乳酸菌： 而使果酒变质。
可以通过调节发酵的温度、果酒的pH 等来控制乳酸
菌的含量。
果汁中的糖 也是醋酸菌重要的碳源和能源。
在有氧的情况下，醋酸菌能把糖分解成醋酸；
在缺少糖源的情况下，乙醇便是醋酸菌的碳源和能源，它
控制醋酸菌： 将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
由于醋酸菌在有氧的条件下才能进行旺盛的代谢活动，因
此 在制作果酒的过程中尽量减少 O 含量，可以抑制醋酸菌的生长
2
繁殖。此外，通过调节发酵的温度、果酒的pH 等同样可以控制醋
酸
3.在制作果醋的过程中，酵母菌是否还会继续发酵?醋酸菌从何而来?采用什么措施可以加快果醋的制作?
随着醋酸发酵的进行，发酵液的pH、发酵温度等均不利于酵母菌的生长繁殖，因
此酵母菌活性很低。在我们的实验条件下，当打开瓶盖后，空气中的醋酸菌会进入
发酵液中大量繁殖，其他的菌因不适应环境条件而不能繁殖。在工业上，后期醋的
发酵需要人工接种醋酸菌。我们制作果醋时，可以先买一瓶醋，将其打开暴露于空
气中，一段时间后在 醋的表面会有一层薄膜 ( 实际上是醋酸菌 )，用这层薄膜进行接
种可以明显缩短制作果醋的时间。
注意： 制作泡菜时产生的白膜是酵母菌
醋的表面会有一层薄膜(实际上是醋
酸菌)第 2 部分 微生物的培养技术及应用
核心考点 1 微生物的基本培养技术
相关概念
食用自制酸奶导致肠胃不适的主要原因是：在制作过程中有杂菌混入。
微
生物：
微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称，包括细菌、真菌、病毒及一些
原生生物等。本章中提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。
微生物培养和研究
的前提：
防止杂菌污染（关键）
获得纯净的微生物培养物
实验室培养微生物
的前提：
为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件
确保其他微生物无法混入
依赖于 培养基 和 无菌技术
将需要的微生物分离出来
（一）培养基的配制
1、培养基的作用：
基础作用：为微生物提供营养物质
作用：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物
2、培养基的种类：
不含凝固剂 (如琼脂)、呈液体状态的培养基
液体培养基： 可用于微生物的扩大培养、选择培养，但不能用
于鉴别、计数
呈固体状态的培养基。
在液体培养基中加入琼脂后制成的琼脂固体
固体培养基：
培养基，是实验室中最常用的培养基之一。
可 用于分离、鉴别、计数
微生物在 琼脂固体培养基 表面或内部 生长，可以形成肉眼可见的 菌落 。
(由一个或少数几个细菌繁殖而成的肉眼可见的子细胞群体叫菌落)。
菌落：
（分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可
见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。）3、培养基的成分：
1000mL牛肉膏和蛋白胨培养基的营养构成
组分 含量 提供的主要营养
牛肉 5g 碳源、磷酸盐和维生素
膏
蛋白 10g 氮源和维生素等
胨
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000mL 水
注：牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素
和有机氮等营养物质
①营养成分： 水
碳源（提供碳元素的物质）
氮源（提供氮元素的物质）
无机盐
②其它条件： pH、特殊营养物质以及O
2
实例：
乳酸杆菌：添加维生素；
霉菌：酸性；
细菌：中性或弱碱性；
厌氧微生物：无氧的条件。（二）无菌技术
1、无菌技术的作用：
①防止杂菌污染（是获得纯净的微生物培养物的关键关键）
②避免操作者自身被微生物感染，从而防止实验室内
细菌传染物体被带出实验室
2、防止杂菌污染的方法：消毒和灭菌
（1）消毒：消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方
法杀死物体表面或内部一部分微生物。
煮 沸 在 100 ℃煮沸 5~6min ，
消毒法： 可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢
巴 氏
即在 62 ～ 65 ℃消毒 30 min 或 80 ～ 90 ℃处理 30s~1min ，
消毒法：
可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且不破坏牛奶的营养成分
化学药物用 酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
消毒：
紫外线照射 30min ，以杀死物体表
紫 外 线 面或空气中的微生物。 用于对接种室、接种箱
照射消毒： 在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚 或超净工作台消毒
皂溶液等消毒液，可以加强消毒效
果
生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中的
生物消 部分微生物的方法。
毒法 例如，有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细
菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。
（2）灭菌 是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，
包括芽孢和孢子。
适用对象：对培养基灭菌
湿热灭 用具：高压蒸汽灭菌锅
菌： 条件：100kPa、温度为 121 ℃ 的条件下，维持15~30min
适用对象：耐高温的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(如吸
管、培养皿等）、金属用具等
干 用具：干热灭菌箱
热灭菌： 条件：在 160~170 ℃ 的热空气中维持2~3h 可以达到灭菌的目的。
方法：直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
灼
适用对象：接种工具，如涂布器、接种环、接种针或
烧灭菌 ：
其他金属用具，以及试管口、瓶口等容易
被污染的部位
（三）微生物的纯培养1、什么是微生物的纯培养？
培养物： 在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的
含特定种类微生物的群体称为 培养物 。
纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。（例如，单菌
落）
纯培养： 获得纯培养物的过程就是纯培养
2、微生物的纯培养的步骤：
包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤
探究·实践：酵母菌的纯培养
1.制备培养基
（1）配制培养基:（马铃薯琼脂培养基）
①称取 去皮的马铃薯 200 g，切成小块，加水1000mL，加热
煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。
②向滤液中加入 20g 葡萄糖 (也可用蔗糖代替）、
③15~20g琼脂
④ 用蒸馏水定容至 1000mL 。
（2）灭菌:（培养基：高压蒸汽灭菌；培养皿：干热灭
菌）
①称将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛
皮纸，并用皮筋勒紧
②放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为 121 ℃
的条件下，灭菌15~30min
③将5~8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干
热灭菌箱内，在 160 ～ 170 ℃ 灭菌2h。
（3）倒平板
待培养基冷却至 50 ℃ 左右（不烫手）时，在酒精灯火焰附近倒平板。
具体操作步骤（教材P12）①拔出锥形瓶的棉塞。
②将瓶口迅速通过火焰。
③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将
培养基（10～20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。
④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。
2.接种和分离酵母菌（操作步骤：P13）
接种方法：平板划线法：
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操
作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的
表面。
3.培养酵母菌：
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的
平板和一个未接种的平板倒置，放入 28 ℃ 左右(培养温
度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中
培养 24 ～ 48 h 。
固体培养基上接种微生物的方法：
通过接种环在固体培养基表面连续划线
的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的
表面。
第一次划线时，先烧灼接种环，冷却后蘸取菌液、
划线
平板划线法 操作
以后每次划线前都需要烧灼，但不能蘸取菌液
每次都在上一次划线的末端划线
适用于微生物的分离、鉴别、纯化（注意 不能 用于 计
数）
取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
操
将涂布器放在火焰上灼烧
作：
待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进
稀释涂布平板法
行涂布。
适用于微生物的分离、鉴别、纯化、计数
其它方法核心考点 2 微生物的选择培养和计数
（一）选择培养基
1、选择培养基：
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长
同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
称为选择培养基。
原理：即人为提供有利于目的菌生长的条件(包
括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他
微生物的生长。（生物与环境相适应）
2、实例：
组分 含量
КН РО 1.4 g
2 4
Na HPO 2.1 g
2 4
MgSO ·7H O 0.2 g
4 2
葡萄糖 10.0 g
尿素[CO(NH ) ] 1.0 g
2 2
琼脂 15.0 g
H O 定容至1000mL
2
此培养基的营养组成特点：尿素是唯一的氮源
用此培养基可以筛选分解尿素的微生物。
细菌分解尿素的原理是：它们能产生脲酶
脲酶能够催化尿素生成氨， NH 可作为
3
细菌的氮源
拓展了解：
__以纤维素为唯一碳源__的培养基
可用于筛选纤维素降解菌；
__无氮__培养基只能供有固氮能力
的菌生长，是固氮菌的选择性培养基；
__pH5.0~5.5__的培养基有利于真菌
的生长，而____中性或微碱性__的培养基对
细菌和放线菌生长更有利；
在培养基中加入特定的__染料__或
__抗生素__抑制某些菌的生长，也可提高培
养基的选择性（二）微生物的选择培养
选择能分解尿素的细菌的方法：
选择培养基+稀释涂布平板法→（能分解尿素的细菌的）单菌落
稀释涂布平板法具体操作：
①铲土取样，将样品装入纸袋中
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶
中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL
无菌水的试管中，依次等比稀释。
③ 取 0.1mL 菌液 ，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂
布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。
涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
⑦待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置
放入 30~37 ℃ 的恒温培养箱中培养1~2d。
⑧在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察
到分离的单菌落
（三）微生物的数量测定
1、用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数
样品的稀释度足够高时，培养基表面生长
原 的一个单菌落，来源于样品稀释液中的
一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就
能推测出样品中大约含有多少活菌。
具
①稀释、涂布平板、培养
体操作：
②一般选择 菌落数为 30~30 0 的平板进行计数
③在同一稀释度下，应至少对 3 个平板 进行
重复计数，然后求出平均值。
统计误差及
原因：
统计的菌落数往往 比活菌的实际数目少 （偏少） ，
这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。2、利用显微镜进行直接计数
血细胞计数板：
血细胞计数板比细菌计数板厚，常用于相对较
大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。
计数原理相同
细菌计数板：
可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
误差来源: 计的结果一般是 活菌数和死菌数的总和 （比 实际 数目 多 ）
探究·实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
基础知识
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮
源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌，该选择培养基的配方见右栏。
组分 含量
КН РО 1.4 g
2 4
Na HPO 2.1 g
2 4
MgSO ·7H O 0.2 g
4 2
葡萄糖 10.0 g
尿素[CO(NH ) ] 1.0 g
2 2
琼脂 15.0 g
H O 定容至1000mL
2
实验设计
操作提示
取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需
要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
绝大多数分布在距地表3~8cm 的土壤层。因
此，取样时一般要铲去表层土
测定土壤中细菌的数量，一般选用 1×10 4 、
1×10 5 和 1×10 6 倍稀释的稀释液进行平板培养, ，以保证
能从中选择出菌落数为30~300 的平板进行计数.
本实验使用的平板和试管较多，为了避免混
淆，最好在使用前做好标记（做编号、组别）。
鉴定自己分离的菌种。结果分析与评价（P19）
1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养其上的菌
落教明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30~300的平板?在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接
近?
如果得到了两个或多个菌落数为30-300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少?与其他同学统计的结果接近吗?如果差异很大，
可能是什么原因引起的?
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配
制是否合理等方面查找原因。
进一步探究
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌，对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以
查阅相关资料，进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
提示：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基
的碱性增强，能使酚红指示剂变红
第 3 部分 发酵工程及其应用
发酵工程：
发酵工程是指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人
类有用的产品。
核心考点 1 发酵工程的环节
它涉及菌种的选育和培养、产物的分离和提纯等方面。具体包括：
菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品的分离、
提纯等环节性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变
育种或基因工程育种获得。生产柠檬酸就需要筛选产酸量高
选育菌种
的黑曲霉。在啤酒生产中，使用基因工程改造的啤酒酵母，
可以加速发酵过程，缩短生产周期。
在生产实践中，培养基的配方要
配制培养基 经过反复试验才能确定。
扩大培养
（注意：扩大培养一定要用 发酵工程中所用的菌种大
液体培养基） 多是单一菌种。一旦有杂菌污染，
可能导致产量大大下降。
例如，在青霉素生产过程
中如果污染了杂菌，某些杂菌会分
泌青霉素酶将青霉素分解掉。
接种 灭菌 因此，培养基和发酵设备
都必须经过严格的灭菌
现代发酵工程使用的大型发酵罐均有计算机控
制系统，能对发酵过程中的温度、pH、溶解氧、罐压、
通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制：还可以
进行反馈控制，使发酵全过程处于最佳状态。
这是发酵工程的中心环节。在发酵过程中，要
随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解
发酵进程。还要及时添加必需的营养组分，要严格控制
发酵罐内发酵 温度、pH 和溶解氧等发酵条件。
环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且
会影响微生物代谢物的形成。例如，谷氨酸的发酵生产：
在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸；在酸性条件下则
容易形成谷氨酰胺和 N - 乙酰谷氨酰胺 。
如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结
束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥，即
分离、提纯产物 可得到产品。
如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适
当的提取、分离和纯化措施来获得产品。
获得产品相关问题：
1.微生物菌种资源丰富，选择发酵工程用的菌种时需要考虑哪些因素?
需要考虑的因素包括：在低成本的培养基上能迅速生长繁殖；生产所需代谢物的产量高；发酵条件容易
控制；菌种不易变异、退化等。
2.怎样对发酵条件进行调控以满足微生物的生长需要?
要对 温度、 pH 、溶解氧 等发酵条件进行严格控制，使其最适合微生物的生长繁殖，同时及时添加必要的
营养组分。
3.在产物分离和提纯方面，发酵工程与传统发酵技术相比有哪些改进之处?
传统发酵技术获得的产物一般不是单一的组分，而是成分复杂的混合物，很多时候不会再对产物进行分
离和提纯处理，或者仅采用简单的沉淀、过滤等方法来分离和提纯产物。
在发酵工程中使用的分离相提纯产物的方法较多。在产物的初分离阶段，常采用沉淀、萃取、膜分离、
吸附和离子交换等方法；在进一步纯化阶段，会采用液相层析法、结晶法等方法。发酵工程产物无论是
代谢物还是菌体本身，都需要进行质量检查，合格后才能成为正式产品。
4.在进行发酵生产时，排出的气体和废弃培养液等能直接排放到外界环境中吗?为什么?
不能。因为在进行发酵生产时，微生物及其代谢物中都可能含有危害环境的物质。为了减少或避免污染
物的产生和排放，实现清洁生产，应该对排出的气体和废弃培养液进行二次清洁或灭菌处理。
核心考点 2 发酵工程的应用
在食品工业上的应用
第一，生产传统的发酵产品。
用黑曲霉生产酱油：
以大豆为主要原料
黑曲霉产生的蛋白酶，将
发酵工程使这些产品的产量和质
原料中的蛋白质水解成小分子的肽
量明显提高
和氨基酸，然后经淋洗、调制成的
酱油产品
用酿酒酵母发酵生产的各种酒类
第二，生产各种各样的食品添加剂
由黑曲霉的发酵制备柠檬酸
由谷氨酸棒状杆菌发酵可以得到谷氨酸，谷
氨酸经过一系列处理就能制成味精。
第三，生产酶制剂啤酒:
啤酒是以大麦为主要原料经酵母菌发酵制
成的
发酵过程分为主发酵和后发酵两个阶
段
主发酵: 酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的
生成
后发酵: 主发酵结束后，发酵液还不适合饮用，要在
低温、密闭的环境下储存一段时间进行后发
酵，这样才能形成澄清、成熟的啤酒。
啤酒的工业化生产流程：
发芽 大麦种子发芽，释放淀粉酶。
焙烤 加热杀死种子胚但不使淀粉酶失活。
碾磨 将干燥的麦芽碾磨成麦芽粉。
糖化 淀粉分解，形成糖浆。
蒸煮 产生风味组分，终止酶的进一步作用，并对糖浆灭
菌。
发酵 酵母菌 将糖转化为酒精和 CO 。
2
消毒 杀死啤酒中的大多数微生物，延长它的保存期。
终止 过滤、调节、分装啤酒进行出售。
在医药工业上的应用
利用发酵工程生产抗生素、多种氨基酸、激素和免疫调节剂等
结合基因工程、蛋白质工程等生产基因工程药物
在农牧业上的应用
第一，生产微生物肥料
第二，生产微生物农药
第三，生产微生物饲料
在其他方面的应用2022年高考题
（2022 浙江卷）29. 回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：
（1）为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用___________制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于
80℃的___________中保温一段时间，其目的是___________。
（2）为提高筛选效率，可将菌种的___________过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释
后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用___________显色方法，根据透明圈与菌落直径比值
的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。
（3）为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过___________后再筛选获得，或利用转基
因、___________等技术获得。
【答案】（1） ①. 无菌水 ②. 水浴 ③. 杀死不耐热微生物
（2） ①. 分离 ②. KI-I
2
（3） ①. 人工诱变 ②. 原生质体融合
【解析】
【分析】（一）选择培养基是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的
培养基使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。
（2022 全国甲卷）11. 某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基
础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。
实验所用的培养基成分如下。
培养基Ⅰ：KHPO，MgSO，NHNO，石油。
2 4 4 4 3
培养基Ⅱ：KHPO，MgSO，石油。
2 4 4
操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；
②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。
回答下列问题。
透明圈大小
菌株
平板Ⅰ 平板Ⅱ
A +++ ++
B ++ -（1）实验所用培养基中作为碳源的成分是____________。培养基中NHNO 的作用是为菌株的生长提供氮
4 3
源，氮源在菌体内可以参与合成____________（答出2种即可）等生物大分子。
（2）步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N 个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是
0
____________。
（3）为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示
（“+”表示有透明圈，“+”越多表示透明圈越大，“-”表示无透明圈），推测该同学的实验思路是
__________。
（4）现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是
____________，理由是___________。
【答案】（1） ①. 石油 ②. DNA、RNA、蛋白质
（2）N•2n （3）在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，
0
平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并
作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力
（4） ①. A ②. A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长
【解析】
【分析】培养基对微生物具有选择作用。配置培养基时根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求, 加
入某些物质或除去某些营养物质，抑制其他微生物的生长，也可以根据某些微生物对一些物理、化学因
素的抗性，在培养基中加入某种化学物质,从而筛选出待定的微生物。这种培养基叫做选择培养基。
【小问1详解】
培养基的成分有碳源、氮源、无机盐和水等，从组成培养基的物质所含化学元素可知，作为碳源的成分
是石油。生物大分子DNA、RNA、蛋白质都含有N元素，故氮源在菌体内可以参与合成这些物质。
【小问2详解】
由题意“资源和空间不受限制”可知，细菌的种群数量呈J型曲线增长，由于细菌进行二分裂，细菌每
繁殖一代就是上一代的2倍，根据公式N=N•λt，λ=2，繁殖n代后细菌的数量是N•2n。
t 0 0
【小问3详解】
分析表格数据可知，实验的结果是：在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力高于B菌株；在平板Ⅱ上，A菌
株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，根据实验的单一变量和对照原则，推测该同学的思路是：在无
菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解
能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力。
【小问4详解】
由表格数据可知，在平板Ⅱ（无氮源的培养基）上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，所以要
治理贫氮且被石油污染的土壤，应该选用A菌株，因为A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添
加氮源的培养基中也能生长。
（2022 全国乙卷）11. 化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业、用菌株C可生产S，S的产量与菌
株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果
见表。
碳源 细胞干重（g/L） S产量（g/L）
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
回答下列问题。
（1）通常在实验室培养微生物时，需要对所需的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有______（答出2点即
可）。
（2）由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是______；用菌株C生产S的最适碳源是______。菌株C
的生长除需要碳源外，还需要______（答出2点即可）等营养物质。
（3）由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是______。
（4）若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写
出实验思路：______。
（5）利用制糖废液生产S可以实现废物利用，其意义是______（答出1点即可）。
【答案】（1）高压蒸汽灭菌、干热灭菌
（2） ①. 葡萄糖 ②. 制糖废液 ③. 氮源、无机盐、水
（3）缺少淀粉酶 （4）分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株
C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的 S的产量，S产量最高时对应
的制糖废液浓度即为生产S的最适碳源浓度
（5）减少污染、节省原料、降低生产成本
【解析】
【分析】1、实验室常用的灭菌方法：（1）灼烧灭菌：将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属工具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌；（2）干热灭菌：能耐高温的，
需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等，可以采用这种方法灭菌；（3）高压
蒸汽灭菌：将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，为达到良好的灭菌效果，一般在压力为
100 kPa，温度为121℃的条件下，维持15～30 min。
2、培养基的营养构成：各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐；不同培养
基还要满足不同微生物对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
【小问1详解】
通常在实验室培养微生物时，为防止实验用的玻璃器皿等物品中原有的微生物污染培养物，需要使用强
烈的理化因素杀死物体内外一切微生物的细胞、芽孢和孢子，即对所需的玻璃器皿进行灭菌，玻璃器皿
常用的灭菌的方法有干热灭菌、高压蒸汽灭菌等。
【小问2详解】
由实验结果可知，与以制糖废液为碳源相比，以葡萄糖为碳源时菌株C的细胞干重最大，说明最适于菌
株C生长的碳源是葡萄糖；而以制糖废液为碳源时，用菌株C生产S的产量高于以葡萄糖为碳源时的产量，
说明最适于生产S的碳源是制糖废液。微生物的生长一般都需要水、碳源、氮源和无机盐，还需要满足
微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求，故菌株C的生长除需要碳源外，还需要氮源、无机盐、
水等营养物质。
【小问3详解】
分析题图表格可以看出在以淀粉为碳源的培养基中，菌株C不能生长，原因可能是菌株C不能合成淀粉酶
或菌株C不能分泌淀粉酶，因而不能利用淀粉。
【小问4详解】
要测定生产S的最适制糖废液为碳源的浓度，实验自变量为制糖废液的浓度，可分别配制一系列不同浓
度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较
不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度，即为生产S的最适碳源浓度。
【小问5详解】
利用制糖废液生产S可以实验废物利用，既有利于减少污染、节省原料，又能降低生产成本。
（2022 山东卷）14. 青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身
生存所需的能量供应。目前已实现青霉素的工业化生产，关于该生产过程，下列说法错误的是（ ）
A. 发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖
B. 可用深层通气液体发酵技术提高产量
C. 选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中
D. 青霉素具有杀菌作用，因此发酵罐不需严格灭菌
【答案】D【解析】
【分析】培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等四类营养物质。配制培养基时除了满足基本的营
养条件外，还需满足微生物生长对特殊营养物质、pH、O 的要求。
2
【详解】A、青霉菌处于葡萄糖浓度不足的环境中会通过分泌青霉素杀死细菌；提供相同含量的碳源，葡
萄糖溶液单位体积中溶质微粒较多，会导致细胞失水，发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖，乳糖是二糖，
可被水解为半乳糖和葡萄糖，是青霉菌生长的最佳碳源，可以被青霉菌缓慢利用而维持青霉素分泌的有
利条件，A正确；
B、青霉菌的代谢类型为异养需氧型，可用深层通气液体发酵技术提高产量，B正确；
C、选育出的高产青霉素菌株经扩大培养纯化后，才可接种到发酵罐中进行工业化生产，C正确；
D、为了防止细菌、其他真菌等微生物的污染，获得纯净的青霉素，发酵罐仍需严格灭菌，D错误。
故选D。
（2022 山东卷）20. 啤酒的工业化生产中，大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵、消毒等工序
后，最终过滤、调节、分装。下列说法正确的是（ ）
A. 用赤霉素处理大麦，可使大麦种子无须发芽就能产生α-淀粉酶
B. 焙烤是为了利用高温杀死大麦种子胚并进行灭菌
C. 糖浆经蒸煮、冷却后需接种酵母菌进行发酵
D. 通过转基因技术可减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期
【答案】ACD
【解析】
【分析】果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是异养兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼
吸，大量繁殖，把糖分解成二氧化碳和水；在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。故果酒的制作原理
是酵母菌无氧呼吸产生酒精。
【详解】A、赤霉素能促进种子的萌发，据此可推测若用赤霉素处理大麦，可诱导α-淀粉酶相关基因的
表达，促进α-淀粉酶的合成，进而使大麦种子无须发芽就能产生α-淀粉酶，A正确；
B、焙烤可以杀死大麦种子的胚，但不使淀粉酶失活，没有进行灭菌，B错误；
C、糖浆经蒸煮（产生风味组分、终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌）、冷却后再接种酵母菌进行发酵，
防止高温杀死菌种，C正确；
D、转基因技术已被用来减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期，属于转基因技术在微生物领
域的应用，D正确。
故选ACD。
（2022 广东卷）21. 研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察
船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。
回答下列问题：
（1）研究者先制备富集培养基，然后采用________________法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28℃厌
氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养物，除了稀释涂布平板法，还可
采用________________法。据图分析，拟杆菌新菌株在以________________为碳源时生长状况最好。
（2）研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原
因可能是________________。（答一点即可）
（3）藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的
角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是________________。
（4）深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，
其特性可能还有________________。
【答案】（1） ①. 高压蒸汽灭菌 ②. 平板划线 ③. 纤维素
（2）某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活）
（3）拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利
于碳循环的顺利进行 （4） 耐低温
【解析】
【分析】进行微生物纯种培养物时，人们需要按照微生物对营养物质的不同需求配制培养基；还需要防
止杂菌污染，无菌技术主要包括消毒和灭菌。获得微生物纯培养物的常用方法有平板划线法和稀释涂布
平板法。
【小问1详解】
培养基通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。可以采用稀释涂布平板法或平板划线法，将单个微生物分散
在固体培养基上，经过培养得到单菌落，从而获得纯净培养物。分析图12可知，在以纤维素为碳源的培
养基中，细胞数量最多，可推知拟杆菌新菌株在以纤维素为碳源时生长状况最好。
【小问2详解】
深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境
中才能存活），故将采集的样品置于各种培养基中培养，仍可能有很多微生物不能被分离筛选出来。【小问3详解】
拟杆菌为异养生物，作为该生态系统的分解者，能将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，
归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。
【小问4详解】
深海冷泉温度较低，故生活在其中的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，应具有耐低温的特性，才能高效
降解多糖，保证拟杆菌的正常生命活动所需。
（2022 海南卷）12. 为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实
验。下列有关叙述错误的是（ ）
A. 采样时应随机采集植物园中多个不同地点的土壤样本
B. 培养细菌时，可选用牛肉膏蛋白胨固体培养基
C. 土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落
D. 鉴定细菌种类时，除形态学鉴定外，还可借助生物化学的方法
【答案】C
【解析】
【分析】1、培养基的营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物
生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
2、统计菌落数目的方法：（1）稀释涂布平板法（间接）：①当样品的稀释庋足够高时，培养基表面生
长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌；②通过统计平板上的菌落数来推测样品中大约含有的
活菌数。（2）利用显微镜直接计数。
【详解】A、采集植物园中土壤样本的原则之一是要随机采样，A正确；
B、牛肉膏蛋白胨固体培养基中含有细菌生长所需的碳源、氮源、水、无机盐等，可用于细菌的培养，B
正确；
C、土壤溶液稀释倍数足够高时，才能将聚集的细菌分散开，有助于在培养基表面形成单菌落，C错误；
D、不同种类细菌的理化特性一般不同，鉴定细菌种类时，除根据菌落特征进行形态学鉴定外，还可以借
助生物化学的方法进行鉴定，D正确。
故选C。
（2022 河北卷）23. 番茄灰霉病菌严重影响番茄生产，枯草芽孢杆菌可以产生对多种病原菌具有抑制作
用的蛋白质。为探究枯草芽孢杆菌能否用于番茄灰霉病的生物防治，研究者设计了相关实验。回答下列
问题：
（1）检测枯草芽孢杆菌对番茄灰霉病菌的抑制作用时，取适量________菌液涂布于固体培养基上，将无
菌滤纸片（直径5mm）在________菌液中浸泡后覆盖于固体培养基中心，数秒后取出滤纸片，培养皿倒置
培养后测量________大小以判定抑菌效果。（2）枯草芽孢杆菌为好氧微生物，液体培养时应采用________（填“静置”或“摇床震荡”）培养。培
养过程中抽样检测活菌数量时，应采用________（填“稀释涂布平板法”或“显微镜直接计数法”），
其原因是________。
（3）电泳分离蛋白质混合样品的原理是________。利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定枯草芽孢杆菌的抗
菌蛋白分子量时，SDS的作用是________。
（4）枯草芽孢杆菌长期保藏时，常以其________作为保藏对象。
【答案】（1） ①. 番茄灰霉病菌 ②. 枯草芽孢杆菌 ③. 透明圈
（2） ①. 摇床震荡 ②. 稀释涂布平板法 ③. 用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一个菌
落都来自一个活细胞，而显微镜直接计数法会将死亡的枯草芽孢杆菌也计算在内
（3） ①. 利用待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子
产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离 ②. SDS带有大量的负电荷，且能使蛋白质变
性成为肽链，使蛋白质的迁移速率只与蛋白质的相对分子质量有关，而与所带电荷性质无关 （4）菌
液
【解析】
【分析】统计菌落数目的方法：
（1）显微镜直接计数法
原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积 的样品中微生物数量。
（2）间接计数法（活菌计数法）
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌．通过
统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
【小问1详解】
分析题意，要检测枯草芽孢杆菌对番茄灰霉病菌的抑制作用，先把适量的番茄灰霉病菌菌液涂布于固体
培养基上，将无菌滤纸片在枯草芽孢杆菌菌液中浸泡后覆盖于固体培养基中心，若对番茄灰霉病菌有抑
制作用，被覆盖的位置的番茄灰霉病菌就会被杀死，培养皿倒置培养后会出现透明圈，测量透明圈大小
以判定抑菌效果强弱。
【小问2详解】
枯草芽孢杆菌为好氧微生物，采用摇床震荡培养可增大培养液的溶氧量，有利于枯草芽孢杆菌的生长繁
殖。培养过程中要抽样检测活菌数量，应该采用稀释涂布平板法，用稀释涂布平板法在培养基上看到的
每一个菌落都来自一个活细胞，而显微镜直接计数法会将死亡的枯草芽孢杆菌也计算在内。
【小问3详解】
电泳分离蛋白质混合样品的原理是：利用待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身的大小、形
状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。SDS带有大量的负电荷，且能使蛋白质变性成为肽链，使蛋白质的迁移速率只与蛋白质的相对分子质量有关，而与所带电荷性质
无关。
【小问4详解】
长期保藏枯草芽孢杆菌，应该将培养的菌液转移到灭菌好的甘油瓶中，与甘油充分混合，放在-20℃的冷
冻箱中保存。
（2022 湖南卷）21. 黄酒源于中国，与啤酒、葡萄酒并称世界三大发酵酒。发酵酒的酿造过程中除了产
生乙醇外，也产生不利于人体健康的氨基甲酸乙酯（EC）。EC主要由尿素与乙醇反应形成，各国对酒中
的EC含量有严格的限量标准。回答下列问题:
（1）某黄酒酿制工艺流程如图所示，图中加入的菌种a是_______，工艺b是_______（填“消毒”或
“灭菌”），采用工艺b的目的是____________________。
（2）以尿素为唯一氮源的培养基中加入________指示剂，根据颜色变化，可以初步鉴定分解尿素的细菌。
尿素分解菌产生的脲酶可用于降解黄酒中的尿素，脲酶固定化后稳定性和利用效率提高，固定化方法有
_________________________（答出两种即可）。
（3）研究人员利用脲酶基因构建基因工程菌L，在不同条件下分批发酵生产脲酶，结果如图所示。推测
________是决定工程菌L高脲酶活力的关键因素，理由是__________________。
（4）某公司开发了一种新的黄酒产品，发现EC含量超标。简要写出利用微生物降低该黄酒中EC含量的
思路_____________________________。
【答案】（1） ①. 酵母菌 ②. 灭菌
③. 杀死黄酒中全部的微生物及芽孢、孢子，防止成品酒变酸或腐败变质
（2） ①. 酚红 ②. 化学结合法、包埋法、物理吸附法
（3） ①. pH ②. 两图中脲酶活力随时间变化的曲线基本一致，而维持pH在6.5不变与pH从
6.5降为4.5相比较而言，酶活力值始终要高（4）方案一：配置一种选择培养基，筛选出产生 EC降解酶的细菌，从细菌中分离得到EC降解酶，纯化
的EC降解酶进行固定化操作后，加入该黄酒中。
方案二：配置一种选择培养基，筛选出产生脲酶的细菌，从细菌中分离得到脲酶，纯化的脲酶进行固定
化操作后，在黄酒工艺流程的发酵环节中加入。
【解析】
【分析】由于细菌分解在尿素的过程中合成脲酶，脲酶将尿素分解成氨，会使培养基碱性增强，pH升高，
所以可以用检测pH的变化的方法来判断尿素是否被分解，可在培养基中加入酚红指示剂，尿素被分解后
产生氨，pH升高，指示剂变红。
【小问1详解】
制造果酒利用的是酵母菌的无氧呼吸，加入的菌种a是酵母菌。过滤能除去啤酒中部分微生物，工艺b是
灭菌，灭菌能杀死啤酒中全部微生物，，包括芽孢和孢子，防止杂菌污染，延长其保存期。黄酒酿造好
后须经煎酒(灭菌)后灌坛贮存,贮存一定时间后,经过滤,灌瓶压盖、灭菌、包装。
【小问2详解】
由于细菌分解尿素的过程中合成脲酶，脲酶将尿素分解成氨，会使培养基碱性增强，pH升高，所以可以
用检测pH的变化的方法来判断尿素是否被分解，故在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂可以
鉴别尿素分解菌。固定化酶实质上是将相应酶固定在不溶于水的载体上，实现酶的反复利用，并提高酶
稳定性，酶的各项特性（如高效性、专一性和作用条件的温和性）依然保持。固定化酶的方法包括化学
结合法、包埋法、物理吸附法等。
【小问3详解】
对比两坐标曲线，两图中脲酶活力随时间变化的曲线基本一致，说明培养时间不是决定因素；而维持pH
在6.5不变与pH从6.5降为4.5相比较而言，酶活力值始终要高，说明pH为6.5时，有利于酶结构的稳
定，故pH是决定工程菌L高脲酶活力的关键因素。
【小问4详解】
从坐标图形看，利用脲酶消除其前体物质尿素可降低该黄酒中EC含量。配置一种选择培养基，筛选出产
生EC降解酶的细菌，从细菌中分离得到EC降解酶，纯化的EC降解酶进行固定化操作后，加入该黄酒中。
或者配置一种选择培养基，筛选出产生脲酶的细菌，从细菌中分离得到脲酶，纯化的脲酶进行固定化操
作后，在黄酒工艺流程的发酵环节中加入。
（2022 湖北卷）4. 灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是（ ）
A. 动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行
B. 微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染
C. 为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌D. 可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
【答案】D
【解析】
【分析】使用强烈的理化因素杀死物体内外一切微生物的细胞、芽孢和孢子的过程称为灭菌，常用的方
法有灼烧灭菌、干热灭菌和湿热灭菌。消毒是指用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体体表或内部的
一部分微生物的过程。
【详解】A、动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行，A错误；
B、动物细胞培养基中需添加一定量 的抗生素以防止污染，保证无菌环境，而微生物的培养不能加入抗生
素，B错误；
C、一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，以防止杂菌污染，C错误；
D、可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌，以防止杂菌污染，D正确。
故选D。
（2022 湖北卷）10. 关于白酒、啤酒和果酒的生产，下列叙述错误的是（ ）
A. 在白酒、啤酒和果酒的发酵初期需要提供一定的氧气
B. 白酒、啤酒和果酒酿制的过程也是微生物生长繁殖的过程
C. 葡萄糖转化为乙醇所需的酶既存在于细胞质基质，也存在于线粒体
D. 生产白酒、啤酒和果酒的原材料不同，但发酵过程中起主要作用的都是酵母菌
【答案】C
【解析】
【分析】果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是兼性厌氧型生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，
大量繁殖，在无氧条件下，酵母菌进行酒精发酵。
【详解】A、在白酒、啤酒和果酒的发酵初期需要提供一定的氧气，让酵母菌大量繁殖，再进行酒精发酵，
A正确；
B、白酒、啤酒和果酒酿制的过程也是微生物生长繁殖的过程，如发酵初期酵母菌大量繁殖，B正确；
CD、酒精发酵利用的菌种是酵母菌，葡萄糖转化为乙醇所需的酶存在于细胞质基质，不存在线粒体中，C
错误，D正确。
故选C。
（2022 湖北卷）13. 废水、废料经加工可变废为宝。某工厂利用果糖生产废水和沼气池废料生产蛋白质
的技术路线如图所示。下列叙述正确的是（ ）A. 该生产过程中，一定有气体生成
B. 微生物生长所需碳源主要来源于沼气池废料
C. 该生产工艺利用微生物厌氧发酵技术生产蛋白质
D. 沼气池废料和果糖生产废水在加入反应器之前需要灭菌处理
【答案】A
【解析】
【分析】培养基的主要成分有水、无机盐、碳源与氮源，统计微生物的方法有稀释涂布平板法和显微镜
直接计数法。
【详解】A、据图可知，该生产过程中有酿酒酵母的参与，酵母菌呼吸作用会产生二氧化碳，故该生产过
程中，一定有气体生成，A正确；
B、糖类是主要的能源物质，微生物生长所需的碳源主要来源于果糖生产废水，B错误；
C、分析图示可知，该技术中有连续搅拌反应器的过程，该操作的可以增加微生物与营养物质的接触面积，
此外也可增大溶解氧含量，故据此推测该生产工艺利用微生物的有氧发酵技术生产蛋白质，C错误；
D、沼气生产利用的是厌氧微生物，在连续搅拌反应器中厌氧微生物会被抑制，因此沼气池废料无需灭菌，
D错误。
故选A。
（2022 江苏卷）3. 下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是（ ）
A. 选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B. 在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C. 适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D. 可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌
【答案】D
【解析】
【分析】为了筛选可分解尿素的细菌，配置的培养基应选择尿素作为唯一氮源，含脲酶的微生物在该培
养基上能生长，其它微生物在该培养基上因缺乏氮源而不能生长，可用于分离含脲酶的微生物。
【详解】A、农田或公园土壤中含有较多的含脲酶的微生物，A正确；
B、为了筛选可分解尿素的细菌，配置的培养基应选择尿素作为唯一氮源，含脲酶的微生物在该培养基上
能生长，B正确；C、当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C正确；
D、在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指
示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D错
误。
故选D。
（2022 江苏卷）16. 在制作发酵食品的学生实践中，控制发酵条件至关重要。下列相关叙述错误的有（
）
A. 泡菜发酵后期，尽管乳酸菌占优势，但仍有产气菌繁殖，需开盖放气
B. 制作果酒的葡萄汁不宜超过发酵瓶体积的2/3，制作泡菜的盐水要淹没全部菜料
C. 葡萄果皮上有酵母菌和醋酸菌，制作好葡萄酒后，可直接通入无菌空气制作葡萄醋
D. 果酒与果醋发酵时温度宜控制在18-25℃，泡菜发酵时温度宜控制在30-35℃
【答案】ACD
【解析】
【分析】参与果酒制作 的微生物是酵母菌，其新陈代谢类型为异养兼性厌氧型。参与果醋制作的微生物
是醋酸菌，其新陈代谢类型是异养需氧型。
【详解】A、乳酸菌属于厌氧菌，开盖放气会影响乳酸菌发酵，因此不能开盖放气，A错误；
B、制作果酒的葡萄汁不宜超过发酵瓶体积的2/3，是为了发酵初期让酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，同
时为了防止发酵过程中发酵液溢出，制作泡菜的盐水要淹没全部菜料，以保证乳酸菌进行无氧呼吸，B正
确；
C、醋酸菌为需氧菌，且发酵温度高于果酒的发酵温度，因此制作好葡萄酒后，除通入无菌空气，还需要
适当提高发酵装置的温度，C错误；
D、果酒与果醋发酵时温度宜控制在18-25℃，果醋发酵时温度宜控制在30-35℃，泡菜的制作温度低于
30-35℃，D错误。
故选ACD。
（2022 辽宁卷）15. 为避免航天器在执行载人航天任务时出现微生物污染风险，需要对航天器及洁净的
组装车间进行环境微生物检测。下列叙述错误的是（ ）
A. 航天器上存在适应营养物质匮乏等环境的极端微生物
B. 细菌形成菌膜粘附于航天器设备表面产生生物腐蚀
C. 在组装车间地面和设备表面采集环境微生物样品
D. 采用平板划线法等分离培养微生物，观察菌落特征
【答案】D
【解析】
【分析】微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，
最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，
经培养后可形成单个菌落。
【详解】A、嗜极微生物适应极端环境的特性使它们有在空间暴露环境或地外星球环境中存活的可能，因
此航天器上存在适应营养物质匮乏等环境的极端微生物，A正确；
B、细菌形成菌膜粘附于航天器设备表面产生生物腐蚀，会腐蚀舱内材料以及设备线路、元器件，B正确；
C、对航天器及洁净的组装车间进行环境微生物检测，需要在组装车间地面和设备表面采集环境微生物样
品，C正确；
D、航天器及洁净的组装车间环境微生物很少，分离培养微生物，观察菌落特征，不需要采用平板划线法，
D错误。
故选D。
（2022 辽宁卷）18. β-苯乙醇是赋予白酒特征风味的物质。从某酒厂采集并筛选到一株产β-苯乙醇的
酵母菌应用于白酒生产。下列叙述正确的是（ ）
A. 所用培养基及接种工具分别采用湿热灭菌和灼烧灭菌
B. 通过配制培养基、灭菌、分离和培养能获得该酵母菌
C. 还需进行发酵实验检测该酵母菌产β-苯乙醇的能力
D. 该酵母菌的应用有利于白酒新产品的开发
【答案】ACD
【解析】
【分析】选择培养基是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，
使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。
【详解】A、培养基一般选择高压蒸汽灭菌，接种工具一般用灼烧灭菌，A正确；
B、分离纯化酵母菌，操作如下：配制培养基→灭菌→接种→培养→挑选菌落，B错误；
C、为了筛选的到目的菌，应该进行发酵实验检测该酵母菌产β-苯乙醇的能力，C正确；
D、筛选到一株产β-苯乙醇的酵母菌可应用于白酒新产品的开发，D正确。
故选ACD。
