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解密24 基因工程
1．（2022·湖北黄冈·黄冈中学校考二模）大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA 就会缠绕在细胞
壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中。利用上述原理可初步获得质粒DNA。下列关于质粒的粗
提取和鉴定的分析正确的是（ ）
A．提取DNA 时可加入酒精，使不溶于酒精的蛋白质等物质析出
B．将提取的DNA 溶于0.14mol/LNaCl 溶液后，可用二苯胺试剂在沸水条件进行鉴定
C．用限制酶Ⅰ和Ⅱ分别处理提取的产物，电泳出现如图结果，说明未提取到质粒
D．溶菌酶能溶解大肠杆菌细胞壁，洗涤剂能瓦解其细胞膜，但对DNA 没有影响
【答案】D
【分析】DNA 的粗提取和鉴定：利用DNA 不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，以及DNA 在不同浓度的
NaCl 溶液中溶解度不同，可以将DNA 与蛋白质分离开；在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色，
因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA 的试剂。
【详解】A、提取DNA 时可加入酒精，是为了让DNA 析出，A 错误；
B、将提取的DNA 溶于2mol/LNaCl 溶液后，可用二苯胺试剂在沸水条件进行鉴定，B 错误；
C、用限制酶Ⅰ和Ⅱ分别处理提取的产物，电泳出现1 条带，说明提取到环状质粒，C 错误；
D、溶菌酶能溶解大肠杆菌细胞壁，洗涤剂能瓦解其细胞膜，但对DNA 没有影响，D 正确。
故选D。
2．（2021·辽宁朝阳·统考模拟预测）下图是三种限制酶的脱氧核苷酸识别序列和切割位点示意图（↓表示
切点）。下列相关分析错误的是（ ）
A 组 基础练
1
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A．这三种限制酶切割出的DNA 片段末端都是黏性末端
B．不同限制酶切割DNA 所得的黏性末端可能相同
C．能被限制酶3 切割的DNA 也能被限制酶1 切割
D．同一个DNA 经限制酶1 和限制酶3 分别切割后所得片段数一定相等
【答案】D
【分析】由图可知，三种限制酶的识别序列均不同，但限制酶1 和3 切割后产生的黏性末端相同。
【详解】A、据图可知，这三种限制酶切割位点均位于中轴线一侧，切割出的DNA 片段末端都是黏性末端，
A 项正确；
B、DNA 经限制酶1 和限制酶3 分别切割，所得的DNA 片段黏性末端相同，B 项正确；
CD、能被限制酶3 切割的DNA 也能被限制酶1 切割，但能被限制酶1 切割的DNA 不一定能被限制酶3 切
割，故同一个DNA 经限制酶Ⅰ和限制酶3 分别切割后所得片段数不一定相等，C 项正确，D 项错误。
故选D。
3．（2022·河南商丘·商丘市回民中学校考模拟预测）基因治疗可用于治疗A 型地中海贫血，具体过程是将
有功能的珠蛋白基因插入到被采集的患者血液干细胞DNA 中，再通过化疗去除患者体内原有的造血干细
胞，将改造后的造血干细胞注入患者体内，最终可以在患者体内增殖并表达出正常的珠蛋白。下列有关叙
述错误的是（ ）
A．基因治疗的原理属于基因重组
B．珠蛋白基因插入到DNA 的过程中需要解旋酶
C．珠蛋白基因在表达的过程中遵循中心法则D．导入的珠蛋白基因不能遗传给下一代
【答案】B
【分析】基因治疗过程中将目的基因导入干细胞DNA 中，该过程原理属于基因重组。
基因工程中涉及限制性内切酶，但不需要解旋酶。
【详解】A、基因治疗过程中将有功能的珠蛋白基因插入到被采集的患者血液干细胞DNA 中，其原理属于
基因重组，A 正确；
B、珠蛋白基因插入到DNA 的过程中需要限制性内切酶，不需要解旋酶，B 错误；
C、珠蛋白基因的表达包含转录和翻译，遵循中心法则，C 正确；
D、导人的珠蛋白基因在体细胞中，不能遗传给下一代，D 正确。
故选B。
4．（2022·北京顺义·杨镇第一中学校考模拟预测）获得抗除草剂转基因玉米的技术流程如下图。相关叙述
2
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正确的是（ ）
A．玉米DNA 聚合酶可识别报告基因启动子
B．将A 自交可得到抗除草剂玉米纯合子
C．需用含四环素的培养基筛选愈伤组织
D．转化愈伤组织时需用氯化钙处理愈伤组织
【答案】B
【分析】农杆菌转化法：取Ti 质粒和目的基因构建基因表达载体、将基因表达载体转入农杆菌、将农杆菌
导入植物细胞、将植物细胞培育为新性状植株。
【详解】A、玉米RNA 聚合酶可识别报告基因启动子，A 错误；
B、除草剂抗性基因会插入到玉米的染色体DNA 上，将A 自交可得到抗除草剂玉米纯合子，B 正确；
C、四环素是抗生素，对真核细胞一般不起作用，C 错误；
D、细菌才需要氯化钙处理，D 错误。
故选B。
5．（2021·福建福州·统考二模）苏云金芽孢杆菌会合成Bt 蛋白，在棉铃虫的碱性肠道环境中，Bt 蛋白在
特定的酶作用下产生毒性，导致棉铃虫死亡。我国科学家利用农杆菌转化法培育转Bt 蛋白基因的抗虫棉。
下列说法错误的是（ ）
A．可根据苏云金杆菌的DNA 特定序列设计引物，用PCR 技术扩增获得Bt 基因
B．需要将Bt 基因整合到Ti 质粒的T-DNA 上，从而构建基因表达载体
C．Bt 基因可以整合到棉花染色体上，抗虫棉自交后代不会发生性状分离
D．Bt 毒蛋白具有高度专一性，对害虫天敌、人畜均无毒性，在环境中易分解
【答案】C
【解析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
3
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（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--
DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋
白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、苏云金芽孢杆菌会合成Bt 蛋白，所以可以根据苏云金杆菌的DNA 特定序列设计引物，用
PCR 技术扩增获得Bt 基因，A 正确；
B、培养抗虫棉需要将Bt 基因整合到Ti 质粒的T-DNA（可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的
DNA）上，B 正确；
C、Bt 基因可以整合到棉花染色体上，由于只有1 条染色体上含有抗虫基因，因此抗虫棉自交后代会发生
性状分离，C 错误；
D、Bt 毒蛋白在在特定的酶作用下产生毒性，具有高度专一性，对害虫天敌、人畜均无毒性，其本质是蛋
白质，所以在环境中易分解，D 正确。
故选C。
6．（2020·浙江杭州·校联考模拟预测）下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ）
A．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA 检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除
草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者目的基因没有表达
B．基因工程常用的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA 连接酶，其中的限制性核酸内切酶均能特异性地识
别6 个核苷酸序列
C．质粒可以作为基因的载体使用，通常采用抗生素合成基因作为标记基因
D．目的基因在供体细胞与受体细胞中的表达产物可能不同
【答案】D
【分析】目的基因的表达受到受体细胞和环境因素的影响。目的基因转入受体细胞后，不一定能正常转录；
即使正常转录，也不一定能正常翻译；即使能正常翻译，也不一定能形成和在供体细胞中一样的蛋白质。
【详解】A、抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，但不抗除草剂，也可能是翻译后的肽链未能正确
折叠形成特定的空间结构，A 错误；
B、限制性核酸内切酶通常能特异性地识别4 个或6 个核苷酸序列，B 错误；
C、质粒中的抗生素合抗性基因通常作为标记基因，C 错误；
D、原核细胞中表达的真核细胞基因，由于原核细胞没有内质网、高尔基体等细胞器，表达产物与真核细
4
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胞中可能不同，D 正确。
故选D。
7．（2022·辽宁沈阳·沈阳二中校考模拟预测）如图为蛋白质工程操作的基本思路，下列叙述不正确的是（
）
A．图中①代表转录，②代表翻译，④代表分子设计，⑤代表DNA 合成
B．因为蛋白质的高级结构十分复杂，所以蛋白质工程是一项难度很大的工程
C．蛋白质工程的目标是对基因的结构进行分子设计
D．从图中可以看出蛋白质工程的基本途径与中心法则是相反的
【答案】C
【分析】1、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基
因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。(基因工程在
原则上只能生产自然界已存在的蛋白质)
2、蛋白质工程的基本原理：它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。
3、基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应
的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因，从而获得所需要的蛋白质。
【详解】A、图中①代表转录，②代表翻译，④代表分子设计，⑤代表DNA 合成，A 正确；
B、因为蛋白质的高级结构十分复杂，所以蛋白质工程是一项难度很大的工程，B 正确；
C、蛋白质工程的目的是对蛋白质的结构进行分子设计，通过基因合成或修饰实现，C 错误；
D、从图中可以看出蛋白质工程的基本途径与中心法则是相反的，D 正确。
故选C。
8．（2022·浙江·模拟预测）T4DNA 连接酶可将任意2 个具有相同黏性末端的DNA 片段连接在一起。该反
应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸（AMP）通过共价键与酶相连，随后AMP 转移至DNA 片段，
进而完成连接反应。下列叙述正确的是（ ）
A．T4DNA 连接酶的底物种类较多，故其无专一性
B．T4DNA 连接酶催化反应后，其组成成分已改变
C．ATP 在该反应过程中可能打开两个高能磷酸键
D．T4DNA 连接酶需保存于最适温度和pH 条件下
【答案】C
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【分析】1、DNA 连接酶分为E. coliDNA 连接酶和T4DNA 连接酶。DNA 连接酶连接的是两个核苷酸之间
的磷酸二酯键。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA 连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效
率比较低。
2、酶的特性：专一性、高效性和作用条件温和。
3、酶是催化剂，在催化反应前后性质不变。
【详解】A、T4DNA 连接酶有专一性，A 错误；
B、酶在催化反应前后性质不变，故T4DNA 连接酶催化反应后，其组成成分不变，B 错误；
C、APT 水解产生ADP 需要打开两个高能磷酸键，结合题干“该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷
一磷酸（AMP）通过共价键与酶相连”可推测ATP 在该反应过程中可能打开两个高能磷酸键，C 正确；
D、T4DNA 连接酶需在低温和最适pH 条件下保存，D 错误。
故选C。
9．（2023·北京顺义·统考模拟预测）从植物根系中分离出的C 菌可抑制多种土壤传播的植物病原菌。科研
人员利用基因工程改造C 菌，使其抑菌能力增强的同时具备生物固氮能力。
(1)C 菌的抗生素合成受RetS 蛋白抑制，图1 示敲除C 菌中retS 基因的过程。
①研究人员将整合了lox 序列的庆大霉素抗性基因导入C 菌，使用添加____________的培养基可初步筛选
出导入成功的C 菌。
②lox-庆大霉素抗性基因通过同源重组的方式整合到C 菌基因组中，若要通过PCR 技术证明C 菌基因组中
retS 基因已被lox-庆大霉素抗性基因替换，图2 中应选择的正确引物组合是____________。
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A．Ⅰ和Ⅱ B．Ⅱ和Ⅲ C．Ⅰ和Ⅳ
D．Ⅱ和Ⅳ
③给C 菌导入PC 质粒，并将其置于添加____________的培养基中，获得敲除retS 基因且无庆大霉素抗性
基因标记的Cr菌。
(2)为获得具有固氮能力的CrN菌，科研人员提取固氮菌M 体内的固氮酶基因导入Cr菌。
①需依据固氮酶基因序列设计引物，扩增待检验菌和____________的基因组DNA，对比电泳结果，筛选转
化成功的CrN菌。
②将C 菌、固氮菌M 以及转化成功的CrN菌同时接种在长满枯草芽孢杆菌菌落的培养基上，测量抑菌圈直
径，并检测三者的固氮酶活性，分别是为了评估CrN菌的____________。
(3)为进一步评估CrN菌对拟南芥生长的影响，科研人员在______________（施加/不施加）氮肥的条件下种
植拟南芥，并对其根部进行接种实验，结果如图3，其中对照组1 和对照组2 的接种物分别是
____________。
(4)以上获得的CrN菌并不能盲目推广应用于农业生产，试举一例说明CrN菌的盲目释放可能带来的生态安全
问题____________。
【答案】(1) 庆大霉素 C 乳糖
(2) 固氮菌M 和Cr菌（只答固氮菌M 即可得分） 抑菌能力和固氮酶基因的表达情况
(3) 不施加 缓冲液、固氮菌M+缓冲液
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(4)可能影响土壤微生物群落的组成和结构或造成基因污染等
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）①据图可知，庆大霉素抗性基因是重组质粒的标记基因，故使用添加庆大霉素的培养基可
初步筛选出导入成功的C 菌。
②PCR 扩增时，应选择一对方向相反的引物，且引物应与目的基因的3'端结合，该过程的目的是通过PCR
技术证明C 菌基因组中retS 基因已被lox-庆大霉素抗性基因替换，即扩增基因应为lox 基因，据图可知，
应选择引物I 和IV，故选C。
③据图可知，启动子是乳糖诱导型，故给C 菌导入PC 质粒，并将其置于添加乳糖的培养基中，获得敲除
retS 基因且无庆大霉素抗性基因标记的Cr 菌。
（2）①分析题意，实验目的是获得具有固氮能力的CrN菌，需依据固氮酶基因序列设计引物，扩增待检验
菌和固氮菌M 和Cr菌的基因组DNA，对比电泳结果，筛选转化成功的CrN菌。
②抑菌圈直径能够反应抑菌能力，固氮酶活性可以反应固氮酶基因的表达情况。
（3）分析题意可知，CrN菌具有固氮能力，故为进一步评估CrN菌对拟南芥生长的影响，应在不施加氮肥
的条件下种植拟南芥；实验设计应遵循对照与单一变量原则，结合实验结果可知，对照组1 和对照组2 的
接种物分别是缓冲液、固氮菌M+缓冲液。
（4）明CrN菌的盲目释放可能影响土壤微生物群落的组成和结构或造成基因污染等。
10．（2023·全国·一模）嗜热土壤芽狍杆菌产生的β-萄糖苷酶(BglB)是一种耐热纤维素酶。为使其在工业
生产中更好地应用，开展了以下实验。如图为质粒限制酶酶切图谱，如表为几种限制酶的识别序列及酶切
位点。请回答下列问题：
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限制酶
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
EoRⅠ
Nde Ⅰ
识别序列及切割位点
G↓GATCC
A↓AGCTT
G↓AATTC
GA↓TATG
(1)通常情况下，获得的目的基因需要进行扩增，最简便的方法是_________技术。
(2)分析上图，可选择____________和______________两种不同的限制酶切割质粒，以防止质粒自身环化。
质粒被切割后，可用_____________将其与目的基因连接。在动物基因工程中将目的基因导入受体细胞时
通常的方法是__________。
(3)大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述建构好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为
_____________________。
(4)蛋白质工程是二代基因工程，它的基本途径是从预期的蛋白质功能出发
→________________→_____________→找到相对应的脱氧核苷酸序列。
(5)基因工程和蛋白质工程相比较，基因工程在原则上只能生产________________的蛋白质，不一定符合人
类生产和生活的需要。而蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过
________________或____________，对现有蛋白质进行__________，或制造一种新的蛋白质，以满足人类
的生产和生活的需求。
【答案】(1)PCR
(2) NdeⅠ BamHⅠ DNA 连接酶 显微注射法
(3)转基因的大肠杆菌分泌出有活性的BglB 酶
(4) 设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列
(5) 自然界已存在 基因修饰 基因合成 改造
【分析】基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因．
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启动子是RNA 聚合酶特异性识别和结合的DNA 序列，是基因的一个组成部分，控制基因表达（转录）的
起始时间和表达的程度．
终止子是给予RNA 聚合酶转录终止信号的DNA 序列．
基因工程的基本工具：
1、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）。来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。功
能：能够识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的
磷酸二酯键断开，因此具有专一性。结果：经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式：黏性末
端和平末端。
2、“分子缝合针”——DNA 连接酶两种DNA 连接酶（E·coliDNA 连接酶和T4-DNA 连接酶）的比较：相
同点：都缝合磷酸二酯键。区别：E·coliDNA 连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA 片段互补的黏性末
端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA 连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。与
DNA 聚合酶作用的异同：DNA 聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。
DNA 连接酶是连接两个DNA 片段的末端，形成磷酸二酯键。
3、“分子运输车”——载体载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存。具有一至多个限制酶切
点，供外源DNA 片段插入。具有标记基因，供重组DNA 的鉴定和选择。最常用的载体是：质粒,它是一种
裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA 分子。其它载体：λ
噬菌体的衍生物、动植物病毒。
【详解】（1）目的基因需要进行扩增，最简便的方法是PCR 技术;
（2）选择NdeⅠ和BamHⅠ两种不同的限制酶切割质粒，既不破坏启动子和终止子，又能防止质粒自身环化。
质粒被切割后，可用DNA 连接酶将其与目的基因连接。在动物基因工程中将目的基因导入受体细胞时通
常的方法是显微注射法。
（3）大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述建构好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为
基因的大肠杆菌分泌出有活性的BglB 酶。
（4）蛋白质工程是二代基因工程，它的基本途径是从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→
推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列
（5）基因工程和蛋白质工程相比较，基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，不一定符合人
类生产和生活的需要。而蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基
因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
11．（2023·全国·一模）径柳匙叶草是一种泌盐植物。科研工作者将径柳匙叶草的TaNHX2 基因转移到棉
花细胞内，获得了转基因耐盐棉花新品种。图1 是获取的含有目的基因的DNA 片段，图中箭头所指为
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Sau3AI、EcoRI、BamHI 三种限制酶的切点；图2 是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；图3 是农
杆菌中用于携带目的基因的Ti 质粒结构示意图，请分析回答问题：
(1)基因工程的核心步骤是______________________________。
(2)将含有径柳匙叶草不同基因的DNA 片段导入受体菌的群体中储存，再根据TaNHX2 基因的特定核苷酸
序列从中提取图1 的片段，此法为从____________获取目的基因。此外也可利用PCR 技术扩增TaNHX2 基
因，需要加入的酶是_____________________，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，55～60℃有
利于______________结合到互补DNA 链上。
(3)若用BamHI 切割图1 所示的DNA 片段，获得目的基因，则需选用限制酶__________切割图3 所示质粒，
该方案的缺陷是_______________________________（答出一点即可）。
(4)目的基因是否成功转录出了mRNA，常用____________的方法进行检测，为了检测技术成果，科研工作
者将转基因棉花种植在盐碱地，观察其生长状况，这属于____________水平的检测。
【答案】(1)基因表达载体的构建
(2) 基因文库 Taq 酶（耐高温的DNA 聚合酶） 引物
(3) Sau3AI 目的基因或质粒自身环化（或目的基因在质粒上的连接方向不确定）
(4) 分子杂交 个体
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记
基。
3、将目的基因导入受体细胞:根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法
有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法;将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法;将目的
基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定: (1)分子水平上的检测:①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--
DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成
蛋白质-抗原-抗体杂交技术。(2)个体水平上的鉴定:抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
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【详解】（1）构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子
和标记基。
（2）将径柳匙叶草不同基因的DNA 片段导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有径柳匙叶草的不
同基因，称为径柳匙叶草的基因文库，再根据TaNHX2 基因的特定序列从中提取图1 所示DNA 片段，因
此该获取目的基因的方法为从基因文库中获取。利用PCR 技术扩增TaNHX2 基因时，需要加入的酶是Taq
酶（耐高温的DNA 聚合酶），反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，55～60℃有利于引物结合到
互补DNA 链上，即有利于氢键的生成，为复性过程。
（3）分析图2 可知，Sau3AⅠ与BamHⅠ酶切后产生的黏性末端相同，故若用BamHⅠ切割图1 所示的DNA
片段获得目的基因，则需选用Sau3AⅠ切割图3 所示质粒，以便构建基因表达载体，但该方案由于切出后的
目的基因和质粒两端的黏性末端相同，故容易出现目的基因和质粒的自身环化、目的基因在质粒上的连接
方向不确定的缺陷。
（4）目的基因是否成功转录出了mRNA，常用分子杂交的方法进行检测，人们可通过个体生物学鉴定的
方法进行检测目的基因是否成功表达，即将转基因棉花种植在盐碱地，观察其生长状况，从而达到在个体
水平上检测目的基因是否成功表达的目的。
12．（2023·全国·一模）如图是利用基因工程方法培育抗虫棉的过程。请据图回答相关问题：
(1)从苏云金芽孢杆菌的DNA 上获取抗虫基因，需要用到的工具是_____________，此工具主要是从原核生
物中分离纯化出来的，它能够识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列。并且使每一条链中特定部位的
两个脱氧核苷酸之间的_____________。
(2)构建重组质粒时，常用Ti 质粒作为载体。是因为Ti 质粒上具有_____________，它能把目的基因整合到
受体细胞的_____________上。
(3)E 过程是利用_____________技术完成。要确定抗虫基因导入棉花细胞后，是否赋予了棉花抗虫特性，
在个体水平上还需要做抗虫接种实验；若要检测具有抗虫基因的棉花是否产生了相应毒蛋白，在分子水平
上可利用____________方法进行检测。
(4)在转基因绵羊培育过程中，可利用_____________法将目的基因导入到该种生物的受精卵中。
【答案】(1) 限制酶 磷酸二酯键断开
(2) T-DNA 染色体DNA
(3) 植物组织培养 抗原-抗体杂交
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(4)显微注射
【分析】获得目的基因的方法有①从基因文库中获取；②利用PCR 技术扩增等；目的基因的检测与鉴定包
括分子水平和个体水平两个层次的鉴定。
【详解】（1）从苏云金芽孢杆菌的DNA 上获取抗虫基因，需要用到的工具是限制性内切酶，此工具主要
是从原核生物中分离纯化出来的，它能够识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中
特定部位的两个脱氧梭苷酸之间的磷酸二酯键断开。
（2）构建重组质粒时，常用Ti 质粒作为载体，是因为Ti 质粒上具有T
DNA
﹣
，它能把目的基因整合到受
体细胞染色体DNA。
（3）E 过程是根据植物细胞的全能性，利用植物组织培养技术完成的，要确定抗虫基因导入棉花细胞后，
是否赋予了棉花抗虫特性，在分子水平上需要做抗原﹣抗体杂交技术实验。
（4）将目的基因导入动物细胞的方法有显微注射法，最好的受体细胞是受精卵。
1．（2022·湖南邵阳·邵阳市第二中学校考模拟预测）下图为10-23 型酶与靶RNA 按照碱基互补配对原则结
合并发挥作用的模式图，图中字母表示相应的核苷酸。下列相关叙述正确的是（ ）
A．图中10-23 型酶的基本组成单位是核糖核苷酸
B．10-23 型酶能够降低切割Y 与R 间的氢键所需活化能
C．10-23 型酶发挥作用的过程伴随着氢键的形成
D．图示10-23 型酶作用模型体现了酶的高效性
【答案】C
【分析】分析题图：10-23 型脱氧核酶与靶RNA 结合并进行定点切割，切割位点在一个未配对的嘌呤核苷
B 组 提升练
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酸（图中R 所示）和一个配对的嘧啶核苷酸（图中Y 所示）之间，可能将靶RNA 切割成长度不等的多个
核糖核苷酸链。
【详解】A、10-23 型酶能与靶RNA 按照碱基互补配对原则结合，且其组成成分中含有碱基T，说明该酶
是DNA，DNA 的基本组成单位是脱氧核苷酸，A 错误；
B、酶能降低化学反应的活化能，但10-23 型酶切割的是Y 与R 所在核苷酸间的磷酸二酯键，B 错误；
C、10-23 型酶与靶RNA 按照碱基互补配对原则结合并发挥作用，故10-23 型酶与靶RNA 的结合伴随着氢
键的形成，C 正确；
D、题图所示10-23 型酶作用模型体现了酶的专一性，D 错误。
故选C。
2．（2010·江苏无锡·统考一模）基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，以便于重组和筛
选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-↓GATC-，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-G↓GATCC-。根据图示判
断下列操作正确的是（ ）
A．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
B．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
C．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
D．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
【答案】C
【分析】分析题图：限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-↓GATC-，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-G↓GATCC-，
因此限制酶Ⅰ也能作用于限制酶Ⅱ的识别序列。
【详解】限制酶I 的识别序列和切点是-↓GATC-，限制酶II 的识别序列和切点是-G↓GATCC-，可知限制酶I
能够识别和切割限制酶Ⅱ切割后的黏性末端；目的基因的右端限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-↓GATC-，目
的基因左端是限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-G↓GATCC-，只有用限制酶Ⅰ才能同时将目的基因切割下来；
质粒有GeneI 和GeneⅡ表示两种标记基因，分别有限制酶I 的识别序列和限制酶Ⅱ的识别序列；如果用限
制酶Ⅰ切割，则GeneI 和GeneⅡ都被破坏，造成重组质粒无标记基因；用限制酶Ⅱ切割，则破坏GeneⅡ，
保留GeneI，其黏性末端和切割目的基因所在DNA 的黏性末端相同，可以连接形成重组DNA。
故选C。
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3．（2023·辽宁沈阳·统考一模）PCR 又称聚合酶链式反应，在基因工程中常用它特异性地快速扩增目的基
因。下列有关PCR 的叙述错误的是（ ）
A．以DNA 半保留复制为原理，反应需要在缓冲液中进行
B．耐高温的DNA 聚合酶只能从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸
C．反应过程中的每一轮循环依次包括变性、复性、延伸三步
D．常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR 的产物
【答案】B
【分析】PCR 是利用DNA 在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C 左右）时引物与单
链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA 聚合酶最适反应温度（72°C 左右），DNA 聚合酶沿着磷
酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR 仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，
复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
【详解】A、PCR 是体外进行DNA 复制，以半保留复制为原理，为了维持反应的稳定，反应需要在缓冲液
中进行，A 正确；
B、耐高温的DNA 聚合酶只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，B 错误；
C、反应过程中的每一轮循环依次包括变性（高温解旋）、复性（引物结合）、延伸（子链延伸）三步，C
正确；
D、常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR 的产物，按相对分子质量大小分离DNA 的凝胶电泳技术，D 正确。
故选B。
4．（2023·辽宁·辽宁实验中学校联考模拟预测）烟草花叶病毒（TMV）可使烟草叶片出现坏死斑点，不仅
影响烟草的产量，也使烟草的品质下降。科学将抗TMV 的54KD 蛋白基因导入根瘤农杆菌，然后将烟草
叶片与携带载体质粒的根瘤农杆菌共培养，共同培养后的烟草细胞转移至含卡那霉素（Km）的培养基上
培养筛选，筛选后的细胞培育成植株，检测发现Km 抗性基因（NPTII）在烟草植株中已经表达，从而培
育成转基因抗TMV 的烟草植株，其流程如图所示。下列分析错误的是（ ）
RNA
重组Ti 质粒
受体细胞
再生
植株
转基因抗TMV 烟草
A．图中过程①②获得的54KD 蛋白基因可通过PCR 技术进行扩增
B．过程③为基因表达载体的构建，该过程是获得转基因抗病毒烟草的核心工作
C．过程④的受体细胞首先为根瘤农杆菌，根瘤农杆菌再将DNA 转移至烟草细胞
D．通过抗原—抗体杂交技术检测NPTII 表达，可直接证明54KD 蛋白基因的存在
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【答案】D
【分析】基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成。(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终
止子和标记基因等。(3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。(4）目的
基因的检测与鉴定。
【详解】A、图中过程①②通过逆转录过程获得54KD 蛋白基因，再通过PCR 技术进行扩增，A 正确；
B、基因表达载体的构建是转基因抗病毒烟草的核心工作，B 正确；
C、过程④的受体细胞首先为根瘤农杆菌，根瘤农杆菌再将DNA 转移至烟草细胞，C 正确；
D、通过抗原一抗体杂交技术检测NPTII 表达，只能间接证明54KD 蛋白基因的存在，D 错误。
故选D。
5．（2022·广东深圳·深圳市光明区高级中学校联考模拟预测）2019 年年底，华中农业大学水产学院高泽霞
教授团队从斑马鱼身上发现了对调控鱼刺生长起主要作用的主效基因。目前，高泽霞团队和中科院水生所
桂建芳院士团队已经通过实验获得了第一代杂合体(F0)的少刺鱼，它们生长良好，形态正常，习性和普通
有刺鱼没有差异。培育“无刺鱼”的过程中，筛选控制“鱼刺”生长的候选基因，其流程为：从成体鱼身
上挑出每一根“鱼刺”→剔除结缔组织→提取m RNA→获得在鱼刺中表达的DNA 片段→测出DNA 片段
的序列→数据库比对找到对应的基因。假设基因敲除的斑马鱼均能正常生长、发育、繁殖。下列有关叙述
错误的是（ ）
A．筛选控制“鱼刺”生长的候选基因流程中要用到PCR 技术
B．科研人员要想获得第一代杂合体(F0)的少刺鱼，需找到主效基因进行基因敲除
C．科研人员获得第一代杂合体(F0)的少刺鱼可以证明生物体的性状是由基因控制的
D．若研究中开始只得到了一条F0，要想通过杂交得到稳定遗传的无刺鱼，最快只需繁育一代
【答案】D
【分析】由题意知：培育“无刺鱼”的过程中，首先要筛选控制“鱼刺”生长的候选基因，然后将其敲除，
其流程为：从成体鱼身上挑出每一根“鱼刺”→剔除结缔组织→提取mRNA→获得在鱼刺中表达的DNA
片段→测出DNA 片段的序列→数据库比对找到对应的基因。
【详解】A、培育“无刺鱼”的过程中，需要筛选控制“鱼刺”生长的候选基因，其流程为：从成体鱼身
上挑出每一根“鱼刺”→剔除结缔组织→提取 mRNA→经逆转录和 PCR 技术过程得到在鱼刺中表达的
DNA 片段→测出 DNA 片段的序列→数据库比对找到对应的基因，A 正确；
B、科研人员在筛选出“鱼刺”生长的候选基因后，通过比较和检测，找到主效基因进行基因敲除，B 正
确；
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C、敲除表达鱼刺的主效基因可以获得无刺鱼，说明了基因控制性状的表达，C 正确；
D、若研究中开始只得到了一条 F0 ，要想通过杂交得到稳定遗传的无刺鱼，需要先将 F0与正常的异性斑
马鱼交配，再让子代雌雄鱼相互交配才能得到纯合的基因敲除无刺鱼，即需要繁育两代才能获得无刺鱼，
D 错误。
故选D。
6．（2022·天津·模拟预测）生物工程的应用领域非常广泛，下列对于生物工程应用有关叙述错误的是（
）
A．泡菜的腌制过程中加入一定量的“老汁”（陈泡菜水），是因为“老汁”中含有大量的乳酸菌，使其
在短时间形成优势菌种
B．作物脱毒目前一般采用茎尖组织培养技术脱去病毒，是因为茎尖分生区分裂旺盛
C．利用蛋白质工程可以生产出自然界不存在的蛋白质，但这种技术最终只能通过操作基因来完成
D．胚胎分割若在囊胚期，内细胞团需均等分割，滋养层则不必
【答案】B
【分析】1、蛋白质工程的过程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找
到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。
2、进行胚胎分割时，应选择发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚。对囊胚阶段的胚胎进行分割时要注意
将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
【详解】A、泡菜的腌制过程中加入一定量的“老汁”（陈泡菜水），是因为“老汁”中含有大量的乳酸
菌，使其在短时间形成优势菌种，增加菌种数量，有助于泡菜的制作，A 正确；
B、脱毒苗的培育采用了植物组织技术，培育脱毒苗应选用分生组织，因为其分裂旺盛，所含的病毒少或
者不含病毒，B 错误；
C、蛋白质工程不是对蛋白质分子的直接改造，而是通过修改基因或创造合成新基因来改变生物的遗传和
表达形状，合成新的蛋白质，这种技术最终只能通过操作基因来完成，C 正确；
D、若在囊胚期进行胚胎分割，内细胞团需均等分割，而滋养层不需要均等分割，D 正确。
故选B。
7．（2020·江苏宿迁·沭阳县修远中学校考模拟预测）科学家设计了一种自然界中不存在的蛋白质LCB1，
可与新冠病毒表面S 蛋白的受体结合域（RBD）紧密结合，以干扰新冠病毒的感染。下列说法不合理的是
（ ）
A．LCB1 的作用机理与S 蛋白的抗体类似
B．可依据S 蛋白的RBD 结构设计LCB1
C．LCB1 可以通过细胞中原有基因表达产生
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D．LCB1 的设计和生产属于蛋白质工程
【答案】C
【分析】研究发现，新型冠状病毒感染人体细胞的关键在于：冠状病毒的S 蛋白与人体细胞膜上的ACE2
蛋白的结合——准确地说，是S 蛋白“劫持”了原本是控制血压的ACE2，通过与它的结合入侵人体。
S 蛋白全称为spike glycoprotein （刺突糖蛋白），位于新冠病毒最外层，像一个个突起的“皇冠”。美国
得克萨斯大学奥斯汀分校研究团队的最新解析结果显示，新冠病毒S 蛋白以三聚体形态存在，每一个单体
中约有1300 多个氨基酸，其中300 多个氨基酸构成了“受体结合结构域”（RBD），即S 蛋白与ACE2 相
联结的地方。
ACE2 全称为“血管紧张素转化酶2”，是人体内一种参与血压调节的蛋白，在肺、心脏、肾脏和肠道广泛
存在。
【详解】A、由题干信息可知：“LCB1，可与新冠病毒表面S 蛋白的受体结合域（RBD）紧密结合，以干
扰新冠病毒的感染”，故可知LCB1 的作用机理与S 蛋白的抗体类似，A 正确；
B、RBD 是 S 蛋白的受体结合域，可知，依据S 蛋白的RBD 结构可以设计LCB1，B 正确；
C、科学家设计了一种自然界中不存在的蛋白质，可知细胞中没有控制合成LCB1 的基因，C 错误；
D、LCB1 是一种蛋白质，它的设计和生产属于蛋白质工程，D 正确。
故选C。
8．（2023·辽宁·辽宁实验中学校联考模拟预测）科学家利用病毒介导的方法将细胞发育过程中起重要作用
的转录因子（如基因Oct3/4 和基因Sox2 等）导入已分化的体细胞中，使其重新编程得到了一种类似于胚
胎干细胞的新型细胞——诱导多能干细胞（iPS）。研究发现，iPS 可在适当诱导条件下定向分化成各种类
型的细胞，也可以发育成具有繁殖能力的个体。下列叙述错误的是（ ）
A．iPS 可诱导发育成个体，体现了动物的体细胞具有全能性
B．iPS 定向诱导获得的皮肤可避免免疫排斥反应的发生
C．已分化的体细胞与iPS 的遗传物质存在某些差异
D．iPS 与胚胎干细胞一样可作为治疗某些疾病的潜在来源
【答案】A
【分析】胚胎干细胞的特点：在形态上，体积较小，细胞核大，核仁明显；在功能上，具有发育的全能性，
可分化为成年动物任何一种组织细胞。另一方面，在体外培养条件下，ES 细胞可不断增殖而不发生分化，
可进行冷冻保存，也可以进行某些遗传改造。
【详解】A、iPS 不是体细胞，因此不能体现动物的体细胞具有全能性，A 错误；
B、由于是自身细胞，因此机体对iPS 定向诱导获得的皮肤不会发生免疫排斥反应，B 正确；
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C、已分化的体细胞导入基因Oct3/4 和基因Sox2，因此遗传物质发生了改变，C 正确；
D、iPS 与胚胎干细胞都具有定向分化为各种细胞的能力，因此都可作为治疗某些疾病的潜在来源，D 正确。
故选A。
9．（2022·河北唐山·开滦第二中学统考模拟预测） 重组人胰岛素是世界上第一个基因工程药物， 它的使
用造福了亿万糖尿病患者。兴趣小组探究工程菌的构建， 实验所用质粒载体如下图所示， 其中 LacZ 基
因的表达产物能将无色反应物 X-gal 水解， 从而使菌落呈蓝色，否则菌落呈现白色；Ampr基因的表达产
物分泌到细胞外发挥作用。本实验所用的受体大肠杆菌无 LacZ 基因。
(1)大肠杆菌细胞最常用的转化方法是: 一般先用__________处理细胞，使细胞处于_____的生理状态，然后
再将重组的基因表达载体导入其中。
(2)双重筛选培养基: 培养基中加入__________用以监选出导入了质粒载体的受体菌 （转化子）， 培养基
中加入__________用以鉴别出含重组质粒的受体菌 （重组子）。重组子的菌落颜色是__________，原因
是__________（答出 1 点即可）。
(3)某些重组子不能合成胰岛素， 可能的原因是__________（答出1 点即可）。
(4)长时间培养后， 培养基中转化子形成的菌落周围出现了一些非转化子形成的较小菌落， 这些非转化子
菌落形成的原因是__________________________。
(5)若从个体水平鉴定受体菌合成的人胰岛素是否具有生物学活性， 则实验组的操作是
__________________________。
【答案】(1) Ca2+ 一种能吸收周围环境中DNA 分子
(2) 氨苄青霉素 X-gal 白色 重组子因lacZ 基因被破坏，无法合成水解X-gal 的酶，
菌落呈白色
(3)两个质粒可能反向连接破坏lacZ 基因结构；目的基因与质粒反向连接
(4)培养时间过长，Ampr基因（抗性基因）的表达产物分泌积累，使周围培养基氨苄青霉素失效
(5)静脉注射受体菌合成的人胰岛素给实验动物（如糖尿病小鼠），监测其血糖变化
【分析】在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。研究人员一般
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先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，然后再将重组的
基因表达载体导入其中。
在构建基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同种限制酶或能产
生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA 片段；再利用DNA 连接酶将目的基因片段拼接到载体的切
口处，这样就形成了一个重组DNA 分子。
【详解】（1）大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：一般先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环
境中DNA 分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
（2）质粒载体中含有Ampr基因，如果受体菌中导入了质粒载体，受体菌能在含氨苄青霉素的培养基中存
活；由于质粒载体中的酶切位点在LacZ 基因中，导入目的基因后，重组子LacZ 基因结构被破坏无法合成
水解X-gal 的酶，菌落呈白色，从而可以筛选出重组子。
（3）目的基因与质粒连接时，存在正向连接和反向连接两种，正相连接的目的基因能够正常表达，反向
连接的目的基因不能正常表达，所以某些重组子不能合成胰岛素， 可能的原因是目的基因与质粒反向连
接或两个质粒可能反向连接破坏lacZ 基因结构。
（4） 培养基中转化子含有Ampr基因，可产生抗氨苄青霉素的物质，培养时间过长，Ampr基因的表达产
物分泌积累，使周围培养基氨苄青霉素失效，使得培养基中转化子形成的菌落周围出现了一些非转化子形
成的较小菌落。
（5）若从个体水平鉴定受体菌合成的人胰岛素是否具有生物学活性，可通过注射受体菌合成的人胰岛素，
观察血糖含量的变化，实验组的操作是静脉注射受体菌合成的人胰岛素给实验动物如糖尿病小鼠等，监测
其血糖变化。
10．（2023·陕西咸阳·二模）大丽轮枝菌（一种丝状真菌）是引起棉花黄萎病的主要病原菌。为观察大丽
轮枝菌对棉花根的侵染路径，研究人员利用绿色荧光蛋白基因（sGFP）转染大丽轮枝菌，培育出表达绿色
荧光蛋白的转基因菌株，主要过程如下。分析回答下列问题：
(1)过程①中，PCR 扩增sGFP 的原理是___________，该过程除需要根据___________设计特异性引物序列
外，为保证sGFP 正确插入到质粒中，还需要在目的基因两端添加图中___________限制酶的识别序列。
(2)过程②需要的工具酶是___________。研究中将sGFP 插入启动子和终止子之间的目的是___________。
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(3)过程③中需要配制细菌培养基，配制时要在培养基灭菌并冷却到80℃左右后，再加入潮霉素溶液，潮霉
素不能与培养基一同灭菌的原因是___________。
(4)选择过程③筛选培养得到的不同农杆菌菌落，分别提取细菌质粒DNA，并用BamHI 和HindⅢ完全酶切，
可以得到___________种长度不同的DNA 片段。
(5)将导入重组质粒的农杆菌加入大丽轮枝菌的孢子细胞悬液中，在适宜条件下完成转染后利用滤膜过滤得
到孢子细胞，再在真菌培养基上培养获得菌落，最终通过检测___________，筛选出绿色荧光蛋白旺盛表
达的大丽轮枝菌。
【答案】(1) DNA 的半保留复制 sGFP 两端（3'端）核苷酸序列##sGFP 两端（3'端）碱基序
列 HindⅢ和BamHI
(2) DNA 连接酶 保证sCFP 能在大丽轮枝菌细胞中表达
(3)潮霉素在灭菌时结构被破坏，无法筛选出转化成功的受体细胞（意近即可）
(4)三
(5)大丽轮枝菌菌丝细胞中绿色荧光强度
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术
扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启
动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最
有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与
鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②
检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技
术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、PCR 是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA 复制的
各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【详解】（1）PCR 是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与
DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。因此PCR 扩增sGFP
（绿色荧光蛋白基因）的原理是DNA 的半保留复制。
由于DNA 两条链反向平行，且DNA 聚合酶只能使新合成的DNA 子链从5′→3′方向延伸，所以该过程需要
根据sGFP（绿色荧光蛋白基因）两端（3′端）核苷酸（或碱基）序列设计特异性引物序列，为了保证
sGFP（绿色荧光蛋白基因）正确插入到质粒中，还需要在引物的5′端添加限制酶识别序列，由于质粒大片
段是利用HindⅢ和BamHⅠ共同切割得到的质粒的长片段，还需要在目的基因两端添加图中HindⅢ和
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BamHⅠ限制酶的识别序列。
（2）过程②为构建重组DNA，需要的工具酶是DNA 连接酶。启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，
而终止子是使转录终止的序列，而目的基因不携带启动子和终止子，所以将sGFP（绿色荧光蛋白基因）插
入到启动子和终止子之间的目的是保证sGFP（绿色荧光蛋白基因）能在大丽轮枝菌细胞中表达。
（3）过程③中需要配制细菌培养基，配制时要在培养基灭菌并冷却到80℃左右后，加入潮霉素溶液，以
防止杂菌污染。由于潮霉素在灭菌时结构会被破坏，不能发挥选择作用，无法筛选出转化成功的受体细胞，
所以潮霉素不能与培养基一同灭菌。
（4）根据质粒中BamHI 和HindⅢ的识别位点以及用BamHI 和HindⅢ酶切后得到的质粒大片段为
3500bp，可知质粒小片段应为3750-3500=250（bp）。sGFP 的基因长度为720bp，质粒大片段为3500bp，
二者连接后的长度为3500+720=4220（bp）。用BamHI 和HindⅢ完全酶切后会形成4220bp，3500bp 和
720bp 三种长度不同的DNA 片段。
（5）转基因成功的标志是形成目的基因的产物，所以最终可通过检测大丽轮枝菌菌丝细胞中绿色荧光强
度，以筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌。
11．（2023·山东·模拟预测）利用图1 和2 所示的质粒X 和含S 蛋白基因的DNA 构建基因表达载体，以培
养转S 蛋白基因的大肠杆菌，其中限制酶的识别序列及切割位点见下表所示。回答下列问题。
限制酶
BamHⅠ
BclⅠ
Sau2AⅠ
HindⅢ
识别序列及切割位
点
(1)BamHⅠ、BclⅠ和Sau2AⅠ三种限制酶切割DNA 时，形成的末端__________（填“能”或“不能”）互连，
理由是________________。
(2)利用图1 和2 所示的质粒X 和含S 蛋白基因的DNA 构建基因表达载体时，质粒X 中能作为标记基因的
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是__________，理由是___________。
(3)Sau2AⅠ__________（填“能”或“不能”）将由质粒X 和含S 蛋白基因的DNA 构建的基因表达载体切
割，理由是__________。基因工程中，构建基因表达载体时常选用两种限制酶切割载体和含目的基因的
DNA，与同一种限制酶切割相比，一般情况下，优点在于可以防止_________。
(4)从分子水平上，鉴定导入大肠杆菌的S 蛋白基因是否成功表达，常采用的方法为__________。
【答案】(1) 能 这3 种限制酶切割
形成的末端能发生碱基互补配对（或这3 种限制酶切割
形成的末端相同）
(2) 四环素抗性基因 将蛋白基因切割下来，需用到
或
中的一种，其中
会
破坏四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，
仅破坏氨苄青霉素抗性基因，保留四环素抗性基因
(3) 能 构建的基因表达载体中含有
识别的
序列 目的基因和载体的自身
环化以及载体与目的基因的反向连接
(4)抗原—抗体杂交法
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）据图分析，BamHI 、BclI 和Sau2AI 三种限制酶切割DNA 时，形成的末端相同，均为-
GATC-，能发生碱基互补配对，所以形成的末端之间能互连。
（2）据图可知，将S 蛋白基因切割下来，需用到BamHI 或BclI 中的一种，其中BamHI 会破坏四环素抗
性基因和氨苄青霉素抗性基因， BclI 仅破坏氨苄青霉素抗性基因，保留四环素抗性基因，因此利用图1
和2 所示的质粒X 和含S 蛋白基因的DNA 构建基因表达载体时，质粒X 中能作为标记基因的是四环素抗
性基因。
（3）由质粒X 和含S 蛋白基因的DNA 构建的基因表达载体中含有Sau2AI 识别的GATC 序列，所以
Sau2AI 能对该基因表达载体进行切割；一般情况下，两种酶切割 形成的末端不同，选用两种限制酶切割
载体和含目的基因的 ，可以防止构建基因表达载体时目的基因和载体的自身环化以及载体与目的基因的
反向连接。
（4）从分子水平上，鉴定导入大肠杆菌的 蛋白基因是否成功表达，常采用的方法为抗原—抗体杂交法。
12．（2023·广东揭阳·统考一模）中国科学家采集了某深海海域的沉积物样品，分离、鉴定得到其中的深
海放线菌，以期获得具有前景的抗生素替代品。据此回答下列问题：
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(1)研究人员欲筛选出深海放线菌进行研究，取1g 沉积物样品接种在液体培养基中摇瓶培养，稀释后取菌
液通过__________法接种到高氏一号（加数滴质量分数为10％的酚）培养基表面以获得单菌落。培养基中
的酚能抑制细菌等杂菌的生长，而放线菌能在该培养基上正常生长，这种培养基属于__________（填“选
择”或“鉴别”）培养基。
(2)通过PCR 技术扩增分离得到的放线菌的16S rRNA 基因可进行菌株的种属鉴定。PCR 技术中起关键作用
的酶是__________。该技术能在放线菌总的DNA 中专一性扩增出16S rRNA 基因的原因是__________。
PCR 产物一般可通过__________鉴定。
(3)紫色杆菌的紫色菌素（一种毒素，致死率高）能使培养基呈紫色，已知呋喃酮C30 能明显抑制紫色菌素
的产生。研究人员筛选出了放线菌菌株A，用甲醇将菌株A 发酵产物提取后配制成溶液，对提取物能否抑
制紫色菌素的产生进行了研究。
①将紫色杆菌菌液均匀地涂布在培养基表面，待菌液干燥后，将无菌圆纸片贴于培养基表面，按图1 所示
在滤纸片上滴加溶液。该实验以__________组为对照，通过比较A、B、C 三组的__________可知提取物
是否能抑制紫色菌素的产生。
②实验表明甲醇溶液不会影响紫色杆菌的繁殖，培养过程中对A、B、C 三组紫色杆菌的数量进行监测，
结果如图2 所示，据图推测，深海放线菌A 的提取物作为抗生素替代品的优点是__________。
【答案】(1) 稀释涂布平板##涂布平板 选择
(2) 耐高温的DNA 聚合酶 引物能与16S rRNA 基因特异性结合##引物是根据16S rRNA 基因一
段已知序列设计合成的 琼脂糖凝胶电泳
(3) A、C 褪色（透明）圈直径 不会影响致病菌的生长，从而不会胁迫致病菌使其产生耐药
性##不易对致病菌形成选择压力而导致其产生耐药性
【分析】PCR 反应过程：变性→复性→延伸。变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA 解聚为单链，
复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合，延伸：72℃左右时，Taq
酶有最大活性，可使DNA 新链由5'端向3'端延伸。
【详解】（1）分离和纯化微生物常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法，题干信息提示菌液已经先
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经过稀释，推知这里的接种方法是稀释涂布平板法。该培养基允许放线菌生长，同时抑制或阻止其他细菌
等杂菌的生长，推知该培养基为选择培养基。
（2）PCR 技术的变性（90℃以上）、复性（50℃左右）、延伸（72℃左右）阶段需要的温度都比较高，
所以需要耐高温的DNA 聚合酶。引物是一段能与DNA 母链部分碱基互补配对的短单链核酸，因此能特异
性扩增出目的基因片段，该PCR 中引物能与16S rRNA 基因特异性结合，因此能在放线菌总的DNA 中专
一性扩增出16S rRNA 基因。PCR 扩增的产物是DNA 分子，DNA 分子具有可解离的基团，在一定的pH 条
件下，这些基团可以带上正电荷或者负电荷，在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带的电荷相反的
电极移动，因此PCR 产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
（3）①研究提取物的作用时，一般需要设置空白对照和阳性对照。由题干可知呋喃酮C30 能明显抑制紫
色菌素的产生，推知阳性对照滴加5μL 呋喃酮C30，而菌株A 发酵产物通过甲醇提取，推知空白对照滴加
5μL 甲醇溶液，即该实验以A、C 组为对照。由于紫色菌素使得培养基呈紫色，若提取物能抑制紫色菌素
产生，则会产生褪色圈（透明圈），根据褪色圈的直径即可推知其抑制作用大小。
②由图8 可知，滴加呋喃酮C30 和菌株A 提取物后，紫色杆菌的数量与空白对照组（滴加甲醇溶液）差别
不大，推知提取物不会影响致病菌的生长，但是致病菌产生的紫色菌素却有区别，推知提取物不会对致病
菌进行选择，使得其不会产生耐药性。
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