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第45 讲 基因工程以及生物技术的安全性和伦理问题
目录
01 课标达标练
【题型一】基因工程的基本工具
【题型二】基因工程的基本操作程序
【题型三】基因工程的应用、蛋白质工程
02 能力突破练 （新情境+新角度）
03 高考溯源练 （含2025 高考真题）
题型一 基因工程的基本工具
1． MseⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ三种限制酶的识别序列及切割位点分别是GAAT↓TAATTC、C↓TGCAG、
G↓AATTC，下图中图1、图2 中箭头表示相关限制酶的酶切位点。
若要用上图质粒和外源DNA 构建重组质粒，需要对质粒进行改造，构建新的限制酶酶切位点。在构建新
的限制酶酶切位点的过程中需要使用的酶是（ ）
A．限制酶PstⅠ、DNA 连接酶、DNA 聚合酶
B．限制酶EcoRⅠ、DNA 连接酶、DNA 聚合酶
C．限制酶EcoRⅠ、限制酶PstⅠ、DNA 聚合酶
D．限制酶PstⅠ、限制酶EcoRI、DNA 连接酶
2．下列关于基因工程中基本工具的叙述正确的是（ ）
①限制性内切核酸酶能识别双链DNA 分子的特定核苷酸序列并切断磷酸二酯键
1
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②大多数限制酶的识别序列由6 个核苷酸组成
EcoRⅠ
③
限制酶切割DNA 分子产生平末端
T4DNA
④
连接酶能连接黏性末端
⑤质粒只存在于原核细胞中
⑤大多数天然质粒都不需要人工改造，可以直接作为载体使用
A．①③⑤
B．①②④
C．②④⑥
D．③⑤⑥
3．下图1 为某种质粒简图，图2 表示某外源DNA 上的目的基因，小箭头所指分别为限制酶EcoRⅠ、
BamHⅠ、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述正确的是（ ）
A．分别将一个外源DNA 和质粒用EcoRⅠ酶切后连接，会形成一个含有1 个EcoRⅠ酶切点的重组DNA
B．为防止质粒和目的基因片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和EcoRⅠ两种限制酶同时处理
C．在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA 的切割，则可选EcoRⅠ
D．一个图1 所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后，含有1 个游离的磷酸基团
4．质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因（如图所示），通过标记基因可以推知外源基因
（目的基因）是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在
培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入（插入点有a、b、c）后细菌的生长情况。下列有关叙述
正确的是（ ）
项
目
细菌在含氨苄青霉素的培
养基上生长情况
细菌在含四环素的培养
基上生长情况
①
能生长
不能生长
②
能生长
能生长
③
不能生长
能生长
A．质粒的复制原点是转录的起始位点
B．①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b
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C．质粒被一个限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2 个
D．将外源基因与质粒连接时需用DNA 聚合酶
题型二 基因工程的基本操作程序
5．下图表示PCR 过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R 表示方向。下列叙述正
确的是（ ）
A．DNA 体内复制与体外复制（PCR）所需能量均只来自dNTP
B．PCR 过程中需要添加缓冲液，其中所含的Mg2+可用于激活DNA 聚合酶
C．②链从L 到R 的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板
D．引物③的5′端添加了某序列，至少需经3 次循环才可获得该序列的双链产物
6．（2025·福建厦门·一模）RT-PCR 是将RNA 逆转录（RT）成cDNA（与mRNA 互补的DNA 单链）和聚
合酶链式反应（PCR）相结合的技术，具体过程如图所示，下列叙述正确的是（ ）
A．过程Ⅰ获得cDNA 的过程与DNA 复制过程中碱基配对方式相同
B．图中A、B 两种引物在72°C 时通过碱基互补配对结合到模板链
C．图中子链的合成均是以四种核糖核苷酸为原料从引物的一端开始的
D．过程Ⅱ中，若进行6 轮循环，则共需要加入引物的数量为63 个
7．实时荧光定量PCR 简称qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将荧光标记
的Taqman 探针与待测样本DNA 混合，当探针完整时，不产生荧光。在PCR 过程中，与目的基因结合的
探针被TaqDNA 聚合酶水解，R 与Q 分离后，R 发出的荧光可被检测到在特定光激发下发出荧光（如图所
示），随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct 值（该值与待测样
本中目的基因的个数呈负相关）。下列相关叙述错误的是（ ）
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A．每个模板DNA 分子含有2 个游离的磷酸基团
B．在反应过程中，无需ATP 为新链的合成提供能量
C．做qPCR 之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成引物和Taqman 探针
D．荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小
8．重叠延伸PCR 技术是采用具有互补末端的引物，使 PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应
中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。某实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得
到了LTB 基因和ST1 基因片段，并用重叠延伸PCR 技术构建了LTB -ST1 融合基因（如图）。下列有关
叙述正确的是（ ）
A．可在同一个反应体系中进行LTB 基因和ST1 基因的扩增
B．PCR 过程中，第2 次循环获得目的链L 时所用的引物为P1
C．图中的引物P2 与引物P3 的碱基序列均不能互补配对
D．杂交链延伸生成LTB-ST1 融合基因时需要加入引物P1 和P4
9．科研人员利用两种识别不同序列的限制酶（E1 和E2）处理某一基因表达载体后进行琼脂糖凝胶电泳，
结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
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A．该载体的长度约为800bp，E1 和E2 在该载体上的酶切位点最短相距约400bp
B．电泳加样时，将扩增得到的PCR 产物与电泳缓冲液（内含指示剂）混合，注入加样孔内
C．待观察到DNA 片段前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
D．凝胶中的DNA 分子与核酸染料结合后可以在紫外灯下被检测出来
10． B 基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B 基因表达
对卵细胞的影响，设计了如下实验来获取能够在卵细胞中表达B 基因的转基因植株。
注：启动子*指可在水稻卵细胞中启动转录的启动子；Luc 基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光
下列关于该实验的叙述，不正确的是（ ）
A．B 基因在水稻卵细胞中不转录，可能是B 基因的启动子在卵细胞中无法启动转录
B．可从水稻体细胞和精子中提取RNA 合成cDNA 来获得B 基因中编码蛋白的序列
C．在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光
D．过程②在培养基中应加入卡那霉素以检测T-DNA 是否整合到水稻细胞染色体DNA 上
11．研究人员将GNA 基因和ACA 基因连接成融合基因后再与pBH21 质粒载体结合并导入玉米细胞，最终
获得了抗蚜虫玉米新品种，部分操作如图所示。下列相关叙述错误的是（ ）
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A．提取GNA 基因和ACA 基因至少需要两种限制酶，①②过程均需要使用DNA 连接酶
B．为了保证基因转录方向正确，需要用限制酶KpnI 和XhoI 处理融合基因和载体
C．目的基因进入受体细胞后，需要通过PCR 技术检测目的基因是否成功表达
D．在加入了卡那霉素的培养基上存活下来的玉米细胞可能成功导入了重组载体
12．糖尿病已经成为危害人类健康的严重疾病之一，注射胰岛素是目前治疗糖尿病最为有效的途径和手段。
如何生产优质而不昂贵的人胰岛素，是当下医药界急需攻克的科学难题。下图为利用基因工程技术生产人
胰岛素的操作过程示意图，请回答：
(1)在基因表达载体中的启动子是 酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录。
(2)图中细胞1 是胰岛 (“A”或“B”)细胞。过程②为逆转录，所需要的酶是
。
(3)过程③④⑤为利用 PCR 技术扩增目的基因，其中③为PCR 的 过程，断开的是
(“氢键”或“磷酸二酯键”)。
(4)PCR 可进行多次循环， 最后需在约72℃保持7-10min， 其意义是 。
(5)图中C 的组成中必须含有标记基因，其作用是 。为使大肠杆菌易吸收外源DNA 分子，需用
含 的溶液处理大肠杆菌使其成为 细胞。
(6)过程⑩得到的人胰岛素需要体外加工才具有生物活性，原因是大肠杆菌细胞
13．土壤中的污染物RDX 具有高毒性和不易降解的特点。研究人员拟将细菌来源的RDX 降解酶基因XplA
与XplB 整合为融合基因，导入柳枝稷草，以修复污染土壤。图1 为基因XplA、XplB 及引物结合位点示意
图；图2 为融合基因表达载体构建过程及农杆菌筛选流程示意图。请回答下列问题：
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(1)PCR 的原理是 ，PCR 扩增过程的每个循环都分为 三步。
(2)据图分析，构建融合基因需把基因XplA 的b 链的3′端与基因XplB 的 （填“a 链”或“b 链”）
的5′端相连，理由是 。利用PCR 拼接融合基因时，需在引物 的5′端加入互补序列。
(3)构建表达载体时，需将融合基因插入Ti 质粒的T-DNA 区，其目的是 ；用限制酶切割后，用DNA
连接酶连接形成重组质粒。在农杆菌培养基中添加潮霉素的作用是 。
(4)选用筛选出的农杆菌侵染柳枝稷草愈伤组织，经组织培养获得的植株不能降解RDX，原因可能是
。（写出2 点即可）
14．水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程向大肠杆菌导入含特殊DNA 序列的重组质粒，制
备具有感知、降解和自杀功能的智能工程菌，为治理水杨酸环境污染提供新方法。回答下列问题：
(1)大肠杆菌常被改造为基因工程菌，其原因包括 （写出2 点）。科学家利用大肠杆菌制备图1 所
示的水杨酸传感器，其工作机理：当环境中存在水杨酸时， 。
(2)水杨酸羟化酶催化水杨酸转化为龙胆酸后可被工程菌利用。现将水杨酸羟化酶基因sah 与基因mrfp 连接
成融合基因（如图2）。并导入工程菌实现对水杨酸的动态检测和清除。利用PCR 技术扩增基因sah 和基
因mrfp 时，需要设计引物，引物的作用是 。为了使基因sah 和基因mrfp 能正确连接成融合基因，
其中两个引物的部分序列需要互补配对，这两个引物是 。
(3)工程菌治理环境污染具有针对性强、高效等优点，但菌体对水源存在安全隐患，因此需进一步改造工程
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菌。当水体中无水杨酸污染时或水杨酸被完全降解时，工程菌可启动自杀程序，已知基因ccdB 表达的毒
素蛋白可使工程菌致死，基因ccdA 表达的抗毒素蛋白导致毒素蛋白失效，则图3 的i、ii 应分别插入
基因，理由是 。
14．抗生素的发现为人类健康作出伟大贡献，但伴随抗生素的滥用带来了“超级细菌”、水体污染等问题。
抗菌肽具有抗菌谱广泛、热稳定性高、无耐药性等优点而成为抗生素的良好替代品。对虾抗菌肽是无脊椎
动物特有的内源性抗菌物质，某科研团队构建水稻种子植物生物反应器来生产四种对虾抗菌肽。
回答下列问题：
(1)科研人员采用 和琼脂糖凝胶电泳从南美白对虾体内分别获得四种抗菌肽基因Pen1、Pen2、
Pen3 和Pen4，并设计了自剪切肽LP4-2a 基因（自剪切肽具有独特的自剪切特性），构建表达四种抗菌肽
的人工编码基因PEN1234，其结构如图1 所示。其中在基因PEN1234 中的自剪切肽LP4-2a 基因的作用是
。
(2)科研人员利用水稻种子胚乳细胞中的启动子PosG2 构建基因表达载体，部分结构如图2。使用启动子
PosG2 目的是 。PEN1234 基因的部分碱基序列及限制酶Nco I 和BstEⅡ识别序列、切割位点如图3。
用这两种限制酶切割PEN1234 基因后，基因两端的黏性末端序列分别为5’- -3’和5’- -3’。
(3)科研人员为探究转基因水稻种子胚乳的抗菌肽活性。用野生型水稻种子、转基因水稻种子、大肠杆菌菌
液、LB 固体培养基（常用细菌培养基）等材料设计实验，实验思路是 。
15．我国是世界上最大的水稻生产国，水稻的栽培历史源远流长。在水稻育种方面，转基因技术已成为新
品种培育的一条崭新途径，研究人员运用基因工程技术进行转基因水稻的研究。图1 是研究人员利用T-
DNA 将目的基因导入水稻的一条染色体DNA 局部示意图。
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注：①图中灰色部分为带有目的基因的T-DNA 片段。
②酶切位点及引物2-5 位于T-DNA 末端区域。
回答下列问题：
(1)由于该T-DNA 长度过长，PCR 无法扩增完整序列，为检测植株是否含有目的基因，应选取的引物是
（从引物2~引物5 中选择），进行PCR 及电泳检测，得到结果，如图2。其中，1 和2 分别为野生型和已
知转基因植株作为对照， 为转基因植株。
(2)反向PCR 技术是一种用于扩增已知序列侧翼未知DNA 序列的技术。为进一步确定含目的基因的T-DNA
插入染色体的具体位置，研究人员利用图2 转基因植株2 的染色体DNA 检测，流程如图3。
通过过程Ⅰ、Ⅱ获得环状DNA 后，过程Ⅲ应选取图1 中的引物 扩增。为了验证T-DNA 的定位，
根据过程Ⅳ测序结果设计引物6，选取引物3 和6，以植株2 的染色体DNA 为模板，进行PCR 扩增，电泳
结果获得扩增产物，说明植株2 的T-DNA 整合在 区域。利用引物3 和6 检测其他转基因植物，电
泳结果显示仅部分转基因植物有PCR 扩增产物，则说明 。
(3)对植株2 自交所得子代植株DNA 进行PCR 检测，得到结果如图4。结合图1 推测：子代PCR 时除了使
用了引物2 和6 组合外，还使用了引物 组合，根据PCR 结果可以确定 为所需纯合转基因
植株。
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题型三 基因工程的应用、蛋白质工程
16．组织型纤溶酶原激活物（t-PA）能激活纤溶酶原转化为纤溶酶，将沉积在血管内外的纤维蛋白溶解，
从而保持血管畅通。T-PA 进入血浆后大部分与纤溶酶原激活剂抑制物形成复合物，并迅速失去活性。科学
家对其进行改造，增加溶栓效能、减少药用剂量和降低副作用等。下列叙述错误的是（ ）
A．改造t-PA 可通过改造基因或合成基因来实现
B．改造t-PA 的过程不需要构建基因表达载体
C．需根据t-Pa 氨基酸序列合成出相应的基因
D．利用蛋白质工程生产的改造t-PA 在自然界中不存在
17．我国拥有自主知识产权的基因工程药物——重组人胰岛素已经研制成功并得到广泛应用，研究人员利
用酵母菌表达、分泌该蛋白，通过分离纯化，制备胰岛素原料药。下列说法正确的是（ ）
A．酵母蛋白表达系统可以对胰岛素进行加工修饰
B．利用PCR 技术从酵母菌基因组中获取目的基因
C．发酵过程中先通气再密闭可以提高胰岛素产量
D．发酵结束后通过离心收集沉淀物来提纯胰岛素
18．科研人员以β-甘露葡萄糖酶为核心研究材料，在其N 端找到了两个关键的氨基酸位点，将这两个位点
的组氨酸和脯氨酸分别替换为脯氨酸后，其热稳定性得到了显著提高。下列说法正确的是（ ）
A．细胞内合成改造后的高热稳定性蛋白质的过程不遵循中心法则
B．替换蛋白质中的氨基酸实际可通过改造基因中的碱基序列实现
C．在分子水平上，可利用PCR 等技术检测细胞内是否合成新的目的蛋白质
D．制备过程中应先获得目标蛋白质的三维结构，再预期其生物学功能
19．糖化血红蛋白（HbA1c）含量是糖尿病诊断标准之一，其含量测定需要蛋白酶、果糖氨基酸氧化酶
（FPOX）的参与，但FPOX 会降低蛋白酶的催化效果，影响诊断结果。科学家利用蛋白质工程对FPOX
进行改造，提升了诊断的准确性和效率。下列叙述正确的是（ ）
A．改造后的FPOX 在自然界中也存在
B．改造后的FPOX 蛋白的合成过程不遵循中心法则
C．可通过基因修饰或合成基因来实现对FPOX 的改造
D．根据改造后的FPOX 氨基酸序列可得到一种脱氧核苷酸序列
20．控制合成凝血因子Ⅷ的基因主要在肝脏中表达，A 型血友病是凝血因子Ⅷ基因发生突变，导致凝血因
子Ⅷ含量降低或功能异常所致。研究人员发现，用丝氨酸替换凝血因子第309 位的丙氨酸，可以增加凝血
因子Ⅷ的分泌量，从而达到基因治疗的目的。下列相关说法错误的是（ ）
A．对凝血因子Ⅷ的改造属于蛋白质工程，需要在分子水平对基因进行操作
B．基因工程和上述改造工程的相同点之一是均只能生产自然界存在的蛋白质
C．进行基因治疗时需要将改造后的凝血因子Ⅷ基因构建的表达载体导入患者肝细胞中
D．通过选择肝脏特异性启动子，可以实现凝血因子Ⅷ基因只在肝细胞中特异性表达
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1．毕赤酵母（能以甲醇为唯一碳源）可作为生产抗原蛋白的工程菌。研究人员以图1 所示质粒
为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白基因HBsAg 的重组质粒，导入大肠杆菌中进行扩增后，再经酶
切后导入毕赤酵母，经同源重组整合到其染色体DNA 上，其中的T 启动子是一种甲醇诱导型启动子。图
1、图2 中的限制酶酶切位点对应的碱基序列如图3 所示。下列说法错误的是（ ）
A．利用PCR 技术获取HBsAg 基因时，引物A 结合的单链是b 链
B．构建重组载体后，导入大肠杆菌，在含有氨苄青霉素的培养基上进行培养，与含空白质粒的大肠杆
菌菌落相比，含有重组质粒的菌落具有不能发绿色荧光的特征
C．科研人员利用限制酶和E．coliDNA 连接酶将HBsAg 基因正确插入图1 所示质粒时，应选用SmaⅠ、
BclⅠ酶对质粒进行酶切处理
D．将大肠杆菌中获取的HBsAg 基因导入毕赤酵母后，转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需
要向其中加入甲醇，其目的是诱导HBsAg 基因表达，同时也为毕赤酵母提供碳源
2．环境雌激素来源于各种农药及其代谢物、防晒剂等，并通过污水排放和地表水径流进入水体环境，进
入人体内的环境雌激素对人类健康产生了极大的危害。在环境雌激素的诱导下，斑马鱼表达卵黄蛋白原的
水平与环境雌激素的浓度呈正相关。若向斑马鱼体内转入荧光蛋白基因，在特定条件下能发出荧光。科研
人员欲利用基因工程技术，构建能够监测环境中雌激素污染物的转基因荧光斑马鱼，实验部分流程如图1
所示。图2 所示pEGFP-1 是一种无启动子的绿色荧光蛋白（EGFP）载体，其中KanR 为卡那霉素抗性基因，
ori 为复制起点，poly（A）为终止子序列，BamHⅠ、HindⅢ、StuⅠ、KasⅠ所指位置分别是4 种限制酶的切割
位点。回答下列问题：
(1)基因工程的核心环节是 。已知卵黄蛋白原启动子序列中无上述四种酶的识别序列，扩增时应在引
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物的 端添加相应的碱基序列。DNA 复制时需要引物的原因是 。
(2)依据pEGFP-1 的结构，应选择 两种酶对质粒进行切割，再利用DNA 连接酶将其与卵黄蛋白原启
动子序列缝合。不选用另外两种酶切割的理由是 （答出两点）。
(3)构建重组质粒后，通过 法导入斑马鱼的胚胎中，并从个体水平检测转基因斑马鱼是否表现出绿色
荧光。为避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，可考虑采取的措施是 （答1 点）。
3．平滑肌细胞（SMC）是高等动物血管壁的重要组成，其功能障碍会导致主动脉瘤的发生。与
肌肉收缩相关的M 蛋白（由M 基因控制合成）在SMC 中含量较高，而在其他细胞中几乎不存在。小括博
士科研团队为获得血管SMC 被特异性标记的模型鼠进行了系列实验。
(1)获得融合基因：如图1 所示，利用 技术获得Cre 重组酶基因和雌激素受体基因的融合基因
（CE）。欲得到大量完整的CE 基因，该技术的最后一个环节应选用引物 。
(2)构建基因表达载体：为保证CE 在SMC 中特异性表达，需将CE 插入小鼠的 基因的启动子之后。
已知CE 基因（融合基因）的连接处有XbaI 的识别序列，图2 为用于构建融合基因表达载体的质粒的部分
示意图。据图可知，可用 限制酶对载体质粒进行双酶切，在CE 融合基因的两端分别添加
限制酶的识别序列。将经筛选后构建成功的表达载体通过显微注射法导入小鼠的 作为受体细胞，
培养之后获得小鼠A。同时构建含Stop 和tdT 的表达载体并获得小鼠B，让小鼠A 与B 进行杂交，获得同
时含有以上基因的CE 杂合小鼠C（图3）。
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(3)在外源药物T 的诱导下，定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核，而Cre 重组酶能导致loxP 位点间的
序列丢失。用药物T 饲喂小鼠C 后，借助一定的技术手段可观察到 。
一、单选题
1．（2025·福建·高考真题）紫杉醇是红豆杉的代谢产物，会干扰纺锤体的正常功能。科研人员利用农杆菌
将紫杉醇合成的相关基因导入烟草中，实现了紫杉醇前体物质的合成。下列叙述错误的是（ ）
A．农杆菌转化前应先使用Ca2+处理烟草细胞
B．紫杉醇合成的相关基因会整合到烟草染色体DNA 上
C．紫杉醇因干扰肿瘤细胞的有丝分裂而具有抗癌作用
D．该技术的突破有利于红豆杉天然资源的保护
2．（2025·福建·高考真题）科研人员将光合系统相关基因整合到大肠杆菌后，该菌能在无碳源培养基中生
长繁殖。下列叙述错误的是（ ）
A．必需整合光反应和暗反应系统的相关基因
B．暗反应所需的所有能量来源于细胞中的ATP
C．改造成功的大肠杆菌可用
作为唯一碳源
D．该菌在无碳源培养基中生长繁殖一定需要光照
3．（2025·福建·高考真题）质粒P 含有2 个EcoRⅠ、1 个SacⅠ和1 个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知
BamHⅠ位点位于2 个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3 种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其
中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3 种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下
列叙述正确的是（ ）
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A．DNA 分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极
B．可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物
C．泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物
D．泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数
4．（2023·福建·高考真题）关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”(实验I)和“DNA 的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的
实验操作，下列相关叙述正确的是（ ）
A．实验I 中，PCR 实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理
B．实验I 中，将扩增得到的PCR 产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源
C．实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D．实验Ⅱ中，将白色丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴，用于鉴定DNA
5．（2025·江西·高考真题）为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含有抗病基因D 的重组Ti
质粒(如图)，通过农杆菌转化法将D 基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正
确的是
A．水稻愈伤组织细胞中RNA 聚合酶无法识别U6 启动子
B．在含重组Ti 质粒的农杆菌中U6 启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达
C．农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素
D．愈伤组织再分化获得的含有D 基因的幼苗属于抗病植株
6．（2025·全国卷·高考真题）琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4 的电泳结果如图所示
（“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知样品1 和2 中的DNA 分子分别是甲和乙，甲只有限制酶
R 的一个酶切位点，样品3 和4 中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（ ）
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A．配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B．该实验条件下甲、乙两种DNA 分子均带负电荷
C．甲、乙两种DNA 分子所含碱基对的数量可能不同
D．据图推测样品3 可能是甲被酶R 完全酶切后的产物
二、非选择题
7．（2025·福建·高考真题）为建立一种效率高、毒性小的基因敲除系统，将图1 所示的质粒1 和质粒2 导
入大肠杆菌，质粒2 中的sgRNA 基因依据目的基因设计，其转录的短链RNA 通过与目的基因碱基互补配
对，与Cas9 蛋白共同作用，敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。
回答下列问题：
(1)大肠杆菌LacZ 基因的表达产物可催化X-gal 生成蓝色物质从而使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将质
粒1 与含LacZ 基因相应sgRNA 基因的质粒2 同时转化到大肠杆菌中，涂布到含抗生素 的平板（含有
X-gal）上进行培养。若长出的是 色菌落则为LacZ 基因被敲除的大肠杆菌。
(2)Cas9 基因的表达量会影响敲除效率，但其过量表达会对大肠杆菌有毒。为评估毒性和敲除效率，用5 种
启动子（A、B、C、D 和E）启动Cas9 的转录，相应检测结果如图2 所示。结果表明，启动子 对细
胞毒性最小；综合考量毒性和敲除效率，应选用启动子 用于该系统。
(3)含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养，少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1 和质粒2 的特
点，在成功敲除LacZ 基因的大肠杆菌中消除质粒1 和质粒2，实验流程如图3 所示。
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①培养12 小时后，图3 试管1 中大部分的大肠杆菌 （填选项）。
A．含质粒1 和质粒2 B．只含质粒1 C．只含质粒2 D．无质粒1 和质粒2
②若要从图3 平板上筛出质粒1 和质粒2 均被消除的大肠杆菌，简要写出实验思路和预期结果： 。
8．（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR 来应对感染。麻
疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要
受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46 转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。
回答下列问题：
(1)利用PCR 技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。
(2)将hCD46 接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体
内，应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。
(3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c 的子宫中，应选用
桑葚胚的原因是 。
(4)利用PCR 技术对子代小鼠进行hCD46 基因检测，应设置不加DNA 模板的对照组，目的是 。
(5)若能进一步构建既表达hCD46 受体又敲除IFNAR 基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原
因是 。
9．（2023·福建·高考真题）菊花是两性花，LFY 基因是控制植物花分生组织形成的基因。过量表达LFY
导致植物提早开花。为使菊花花期提前，科学家制备了含有拟南芥过量表达的LFY 基因的转基因菊花。重
组Ti 质粒的部分信息及实验流程如图1 所示。启动子均为真核细胞启动子。
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一、将重组Ti 质粒导入农杆菌中，利用农杆菌转化法转化并筛选LFY 转基因菊花。
(1)根据图中的信息，加入潮霉素是为了筛选 ，步骤①培养过程一般 （填“需要”或“不需要”）
光照，流程图中的Ⅰ是 。
(2)通过调整过程②和③中 的浓度和比例，可诱导菊花根和芽的形成，进而培养LFY 转基因菊花。
(3)以 为模板、选用与LFY 基因特异性结合的引物，利用PCR 技术鉴定菊花细胞是否存在LFY 基因。
再选用 技术检测转基因菊花的LFY 蛋白的表达水平，进一步筛选LFY 转基因菊花。
二、为了避免潮霉素抗性基因对环境造成污染，请优化以上实验。利用携带双T-DNA 的Ti 质粒（如图2）
培养转基因植物。
(4)已知Ti 质粒携带双T-DNA 时，每个T-DNA 都可以独立地整合到植物细胞的染色体DNA 上。请设计培
育转基因植物和杂交育种相结合的实验方案，筛选出只表达LFY 转基因菊花 。（写出实验思路即可）
10．（2025·广西·高考真题）CAR-T 是指通过基因工程技术表达CAR 基因的T 细胞。CAR-T 能更好地识
别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T 过程见图，回答下列问题：
(1)构建含CAR 基因的重组质粒，选用的限制酶组合是 。
(2)将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原
因是 。
(3)将获得的重组质粒导入T 细胞并成功表达后，为了研究CAR-T 识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，
除了有CAR-T 与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有 ，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有
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（至少写出2 点）。
(4)研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1 与CAR-T 表达的PD-1 结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，
可采取的策略有抑制PD-1 与PD-L1 的结合以及 。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T 难以接
触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1 启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决
上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1 连接的生物
开关，在该PD-1 与PD-L1 结合后会被打开，释放P 因子激活P 启动子。依据上述特性构建新的重组质粒
并使其在T 细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是 ，②是 ，③是 ，④
是 。
11．（2025·江西·高考真题）流行病学调查在传染病防治中具有重要意义。AB 基因编码的AB 蛋白是致病
菌W 的一种特异性分泌蛋白。为构建快速检测致病菌W 感染的血清学诊断技术(一种抗原抗体特异性反应
技术)，研究人员从致病菌W 中克隆AB 基因，构建表达载体，导入原核宿主E，诱导后，分析表达情况
(如表)。
细胞
AB 基因的mRNA
AB 蛋白
致病菌W
十
十
宿主E
—
—
工程菌
十
—
注：“十”表示有检出，“—”表示未检出
回答下列问题：
(1)根据中心法则，结合表中数据判断，AB 基因在工程菌中能进行 ，但不能进行有效的
。
(2)分析发现，致病菌W 合成AB 蛋白时，某些氨基酸使用的部分密码子在宿主E 中的使用频率低(称为该
物种的稀有密码子，如表中密码子CGG 在宿主E 中为稀有密码子)。从蛋白质合成条件的角度分析，形成
这一现象的原因是宿主E 中缺乏 。
精氨酸的密码子
密码子使用频率(10-3)
致病菌W
宿主E
CGA
7.2
4.3
CGC
28.5
26.0
CGG
24.7
4.1
CGU
8.5
21.1
AGA
1.3
1.4
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AGG
3.2
1.6
(3)进一步分析发现，宿主E 缺乏高效表达GC 含量过高的外源基因所需要的机制。已知AB 基因的GC 含
量较高，为在宿主E 中实现AB 蛋白的高效表达，可将精氨酸密码子CGG 的使用进行优化，从第(2)题表
中选择最佳密码子为 。
(4)现有一位体内未检测到致病菌W 的人。为了解此人是否有致病菌W 感染史，设计一个直接利用AB 蛋
白的血清学诊断实验。①简要写出实验思路： ；②预测实验结果： ；③分析实验
结果： 。
12．（2025·全国卷·高考真题）为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X 的基因（目的基因）插入质
粒P0，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR 方法验证重组质粒构建成功（引物1~4
结合位置如图所示，→表示引物5＇→3＇方向）。回答下列问题：
(1)PCR 是根据DNA 复制原理在体外扩增DNA 的技术。在细胞中DNA 复制时解开双链的酶是 ，
而PCR 过程中解开双链的方法是 。
(2)PCR 过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有 。
(3)该同学进行PCR 实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作用是： ；②无扩增产物，
原因是 ；③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA 产物分别是 。
管号
①
②
③
④
⑤
⑥
模板
无
P0
Px
无
P0
Px
引物对
引物1 和引物2
引物3 和引物4
(4)设计实验验证大肠杆菌表达的酶X 有活性，简要写出实验思路和预期结果 。
13．（2025·贵州·高考真题）番茄细胞中线粒体形态与其自身功能密切相关，并影响番茄果实的成熟过程。
研究者将决定蛋白质在细胞内定位的特定肽链“嫁接”到绿色荧光蛋白（GFP）上，控制GFP 在番茄细胞
内的分布，从而在显微镜下观察线粒体的形态变化。回答下列问题：
(1)根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的 拼接在一起完成“嫁接”，
细胞色素c 氧化酶Ⅳ（COXⅣ）参与有氧呼吸生成水的过程。COXⅣ的一段肽链序列X 决定了COXⅣ在
细胞内的分布，研究者选择将X 与GFP 拼接，理由是 。
(2)拼接好的序列应插入下图中农杆菌T-DNA 的 （填下图字母）处。理由是 。
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(3)选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为 。农杆菌侵染后有一定几
率将目的基因整合到番茄细胞的 中，番茄组织培养过程中，芽诱导期需在培养基中添加的植物激素
是 。
14．（2025·重庆·高考真题）绝大多数哺乳动物生来怕辣，而小型哺乳动物树鼩先天不怕辣，喜食含辣椒
素类物质的植物。为探究其原因，我国研究人员进行了系列研究。
(1)研究发现，树鼩的受体蛋白TR1 对辣椒素的敏感性低于其他哺乳动物。为研究树鼩和其他哺乳动物TR1
蛋白的差异，可设计开展如下实验：
① ；
②将 分别进行酶切并连接；
③将重组DNA 分子导入大肠杆菌；
④分离表达的TR1 蛋白质测定 ，明确蛋白之间的差异。
(2)树鼩及一些哺乳动物的TR1 蛋白存在差异，如图所示。据分析，树鼩对辣椒素的敏感性降低，很可能是
由于TR1 第579 位氨基酸差异造成的，可证实该推测的实验思路是 。
(3)树鼩与其喜食植物的地理分布基本一致，据此可推测树鼩对含辣椒素类物质植物的适应形成的必要条件
是 。
15．（2025·甘肃·高考真题）水稻白叶枯病（植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑）由白
叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9 基因组编辑技术，对水稻白叶枯
病的感病基因SWEET（该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻）的启动子区进行了定点“修改”，编辑后
的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株（如下图）。回答下列问题。
(1)CRISPR-Cas9 重组Ti 质粒构建完成后，可通过 （方法）将该质粒转入植物细胞，并将
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整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞，需要在植物组织培养基中添加 。
(2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为 ，对其消毒时需依次使用酒精和
处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素，原因是 。
(3)为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用 技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑；
然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较 来验证
抗病性。
(4)在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为 。
16．（2025·四川·高考真题）杆菌M2 合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与
细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA 进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-
lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。
注：①F1、F2、F3 和F4 为与相应位置的DNA 配对的单链引物，“→”指引物5-3 方向。②密码子对应的
氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。
(1)用PCR 技术从杆菌M2 基因组中扩增lrcA-lrcF 目的基因时，应选用 引物。本研究载体使用了链
霉菌的复制原点，其目的是 。
(2)采用EcoRI 和BamHI 完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 条电泳
条带，电泳检测酶切产物的目的是 。
(3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带 （填氨基酸名称）的tRNA 进入结合位点，
导致 ，最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀
菌活性丧失，可能的原因是 。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一
步研究的问题有 （答出1 点即可）。
17．（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期
两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶
段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2 为模式蛋白。测试质粒功
能。回答下列问题：
(1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA 短肽的mKate2，将质粒导入感受态细
胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR 及 检测，筛选
获得重组菌株W1。
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(2)将W1 在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 （答一种）。接种
前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强
度快速下降，原因是 。
(3)研究者选用启动子PX、X 基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入
野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2 的生长趋势不变，培养期间荧光强度的
变化趋势为 。
(4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A 活性弱，且
莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在
生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提
出重组生产菌株构建思路： 。
17．（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应
用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下
列问题：
(1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是 。将培养后的菌液混匀并充分 ，再接
种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG 活性最高的菌种。
(2)为构建携带cg（CG 的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg 的PCR 扩增产物和质粒进行双酶
切，随后用E.coliDNA 连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg 转录模板链的5'端最好含有 酶切
位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA 连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒
分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是 。
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限制酶的识别序列和切割位点如下：
(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 ，随后在含
和 的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
(4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG 的耐热性，研究
人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2
所示。根据分析结果，选择第 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是 。
18．（2025·河南·高考真题）某二倍体植物松散株型与紧凑株型是一对相对性状，紧凑株型适合高密度种
植，利于增产。研究人员获得了一个紧凑株型的植株，为研究控制该性状的基因，将其与纯合松散株型植
株杂交，F1均为松散株型，F2中松散株型：紧凑株型=3：1，控制该相对性状的基因为A/a。回答下列问题：
(1)该紧凑株型性状由 （填“A”或“a”）基因控制。
(2)在A 基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a 基因（图1），a 基因表达的肽链比A 基因表达的肽
链短。造成此现象的原因是 。
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(3)研究人员设计了3 条引物（P1~P3），位置如图1（→表示引物5´→3´方向）。以3 个F2单株（甲、乙、
丙）的DNA 为模板，使用不同引物组合进行PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳结果分别为图2-A 和2-B（不考
虑PCR 结果异常）。
①图2-A 中使用的引物组合是 ；丙单株无扩增条带的原因是 。
②结合图2-A 的扩增结果，在图2-B 中，参照甲的条带补充乙与丙的电泳条带（将正确条带涂黑）
。
③使用图2-A 中的引物组合扩增F2全部样本，有扩增条带松散株型：无扩增条带松散株型= 。
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