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第42 讲 基因工程及生物技术的安全性和伦理问题
目录
01 课标达标练
【题型一】基因工程的基本工具
【题型二】基因工程的基本操作程序
【题型三】基因工程的应用
【题型四】蛋白质工程
【题型五】生物技术的安全性和伦理问题
02 能力突破练（新角度+新情境+新考法）
03 高考溯源练（含2025 年高考真题）
题型一 基因工程的基本工具
1．链状DNA 分子经限制酶切割产生的黏性末端如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．限制酶切断的是同一条链上两个特定相邻碱基间的氢键
B．图中同一条链上两个相邻碱基N 间有脱氧核糖、磷酸基团各2 个
C．每条链5'端、3'端的C 原子分别与羟基、磷酸基团相连接
D．理论上，图示黏性末端最多可能有256 种
【答案】D
【详解】A、限制酶的作用对象是DNA 分子的两条链中脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，DNA 分子有
两条链，因此，限制酶切断的是DNA 分子两条链上两个特定相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，A 错误；
B、图中同一条链上两个相邻碱基N 间有脱氧核糖2 个、磷酸基团1 个，B 错误；
C、图中每条链5'端、3'端的碳原子分别与磷酸基团、羟基相连接，C 错误；
D、图中黏性末端含有4 个碱基，因此，理论上，图示黏性末端最多可能有4⁴=256 种，D 正确。
故选D。
2．某研究小组以新鲜洋葱为材料进行“DNA 粗提取与鉴定”实验。操作流程如下：①组织捣碎后加入研
磨液充分研磨；②过滤取滤液，置于4℃冰箱静置分层；③取上清液加入等体积预冷的95%酒精；④离心
后收集白色絮状沉淀物；⑤取部分沉淀加NaCl 溶解后进行二苯胺鉴定。下列叙述正确的是（ ）
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A．步骤③中因为DNA 不溶于酒精而某些蛋白质可溶，所以冷酒精可使DNA 快速析出
B．步骤⑤鉴定时，直接取白色絮状物与二苯胺混合，室温下放置观察颜色变化
C．若对提取物进行琼脂糖凝胶电泳，迁移距离越大的DNA 片段分子量越大
D．步骤②静置后DNA 主要存在于沉淀中，需用高浓度NaCl 溶液重新溶解
【答案】A
【详解】A、DNA 不溶于酒精，而细胞中的某些蛋白质可溶于酒精，步骤③中使用预冷的95%酒精，可降
低DNA 的溶解度，同时抑制核酸酶活性以减少DNA 降解，从而使DNA 快速析出，A 正确；
B、鉴定DNA 时，不能直接取白色絮状沉淀物与二苯胺试剂混合，DNA 需先溶解在2mol/L 的NaCl 溶液
中，再加入二苯胺试剂并沸水浴加热，才能呈现蓝色，B 错误；
C、DNA 片段在琼脂糖凝胶中的迁移速率与分子量成反比，即分子量越小的DNA 片段，迁移距离越大，C
错误；
D、DNA 在2mol/LNaCl 溶液中溶解度较高，会溶解于滤液中，步骤②中滤液经4℃静置分层后，DNA 主
要存在于上清液中，而非沉淀，无需用高浓度NaCl 溶液重新溶解，D 错误。
故选A。
3．生物科技已有广泛的应用，下列相关叙述正确的是（ ）
A．基因工程可实现同一基因在不同生物体内进行不同的表达，这表明生物界在遗传物质种类及遗传密
码方面具有统一性
B．单克隆抗体的制备过程中需要进行严格的细胞筛选，这表明一种B 淋巴细胞可以产生多种抗体，B
淋巴细胞具有多样性和特异性
C．胚胎移植时需要选择合适发育时期的胚胎，这与胚胎发育中细胞分化程度及胚胎是否处于游离状态
有重要关系
D．蛋白质工程的实质是在DNA 分子水平上进行改造或合成，因此改造胰岛素应首先从设计胰岛素基
因中的脱氧核苷酸序列出发
【答案】C
【详解】A、借助基因工程可实现同一基因在不同生物体内进行不同的表达，主要与基因表达的调控有关，
而遗传密码的统一性使基因跨物种表达成为可能，但遗传物质种类（均为DNA）的统一性并非由该现象直
接体现，A 错误；
B、单克隆抗体制备需筛选两次，但一种B 淋巴细胞只能产生一种特异性抗体，B 错误；
C、胚胎移植通常选择发育到桑椹胚或囊胚阶段的胚胎，因该阶段胚胎细胞分化程度低且处于游离状态，
便于收集和存活，C 正确；
D、蛋白质工程应先设计目标蛋白质结构，再逆推相应基因序列，D 错误。
故选C。
4．同尾酶是指一组识别序列不同，但切出的黏性末端相同的限制酶。下图为EcoR I、BamH I、Bgl II 和
Mbo I 四种限制酶的识别序列及酶切位点。下列说法正确的是（ ）
A．BamH I、Bgl II、Mbo I 属于同尾酶，它们的识别序列相同
B．当目的基因编码区内有BamH I 识别序列时，使用Mbo I 可避免目的基因被破坏
C．选用上述任意两种不同的限制酶切割目的基因，就可以防止目的基因自身环化
D．用DNA 连接酶将BamH I 和Bgl II 形成的黏性末端连接后，仍可再被图中某种限制酶切开
【答案】D
【详解】A、BamH I、Bgl II、Mbo I 识别序列不同，但切出的黏性末端相同，属于同尾酶，A 错误；
B、根据相关限制酶的识别序列和切割位点可知，由于BamH Ⅰ的识别序列包括Mbo Ⅰ的识别序列，所以当
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目的基因编码区内有BamH I 识别序列时，使用Mbo I 也会破坏目的基因，B 错误；
C、BamH I、Bgl II 的识别序列不同，但会产生相同的黏性末端，若用二者切割目的基因，不能防止目的基
因自身的环化，C 错误；
D、用DNA 连接酶将BamH I 和Bgl II 形成的黏性末端连接后，不能被二者切开，但可再被限制酶Mbo I
切开，D 正确。
故选D。
5．下列有关限制酶和DNA 连接酶的叙述，正确的是（ ）
A．用限制酶酶切获得一个外源基因时得到两个切口，有2 个磷酸二酯键被断开
B．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA 中出现的概率就越小
C．序列—C↓ATG—和—G↓GATCC—被限制酶切出的黏性末端碱基数不同
D．T4DNA 连接酶和E.coli DNA 连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接
【答案】C
【详解】A、限制酶切割DNA 双链时，每个切口会断开2 个磷酸二酯键（双链各1 个）。若获得一个外源
基因需切两次（两个切口），则共断开4 个磷酸二酯键，A 错误；
B、限制酶识别序列越短，可能的组合数越少（如4 碱基序列有4⁴ 种组合，6 碱基有4⁶ 种），因此短序列
在DNA 中出现的概率更大，B 错误；
C、序列—C↓ATG—被切割后，黏性末端为单链“AT”的2 个碱基；而—G↓GATCC—被切割后，黏性末端
为单链“GATC”的4 个碱基（如BamHI 酶切），两者碱基数不同，C 正确；
D、T₄ DNA 连接酶可连接黏性末端和平末端，而E.coli DNA 连接酶仅能连接黏性末端，不能催化平末端连
接，D 错误。
故选C。
题型二 基因工程的操作流程
6．将一段编码序列（CDS）插入一个载体上，将该载体命名为pVN2024。如图A 所示，将CDS 插入载体
的Sacl Ⅱ位点，该位点位于lacZ 基因的MCS 区（含多个酶切位点），CDS 的终止子上游0.8kb 处有一个
PstI 的酶切位点。为确认CDS 的大小和插入方向，科研人员用不同的限制酶切割重组质粒并进行电泳，结
果如图B。下列说法错误的是（ ）
A．Spe I 酶切可用于判断CDS 插入的方向
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B．与lacZ 基因相比，CDS 插入时方向相反
C．CDS 长度为2.6kb，在距一端0.5kb 处有一个EcoR I 识别位点
D．若重组质粒同时用EcoR I 和Spe I 酶切，电泳能检测到4 个不同条带
【答案】A
【详解】A、由题意可知，CDS 的终止子上游0.8kb 处有一个Pst Ⅰ的酶切位点，而Spe Ⅰ酶切后产生的两个
片段为4.3kb 和1.3kb，由此只能推出CDS 上有1 个Spe Ⅰ酶切位点，且位于CDS 的中间位置，但不能判断
CDS 插入的方向，A 错误；
B、CDS 的终止子上游0.8kb 处有一个PstⅠ的酶切位点，由图B 可知，Pst Ⅰ切割后产生了0.8kb 的片段，结
合图A 可知，Pst Ⅰ位于CDS 的终止子位置，则与lacZ 基因相比，CDS 插入时方向相反，B 正确；
C、线性空载体为3.0kb，MCS 上有两个EcoR I 位点，EcoR I 酶切后产生3.0kb、2.1kb、0.5kb 共3 个片段，
说明CDS 长度为2.6kb，在距一端0.5kb 处有一个EcoR I 识别位点，C 正确；
D、由图B 可知，重组质粒上有3 个EcoR I 位点，1 个Spe Ⅰ位点，该重组质粒为一个环状质粒，若重组质
粒同时用EcoR Ⅰ和Spe Ⅰ酶切，电泳能检测到4 个不同条带，D 正确。
故选A。
7．随机PCR 是一种在对模板序列一无所知的情况下，通过随意设计或选择一个非特异性引物进行PCR 扩
增的技术。与常规PCR 相比，随机PCR 技术能够在模板序列未知的情况下实现对DNA 片段的扩增。研究
人员计划使用随机PCR 技术对一个未知物种的基因组进行DNA 指纹图谱分析，其过程如下图所示，
注：随机PCR 技术起始的数轮扩增是在不严格条件下进行的，之后再在严格条件下进行扩增，得到目的产
物。
下列关于实现这一技术的关键操作与原理的叙述，正确的是（ ）
A．需要根据模板两端可能存在的保守序列设计一对特异性引物，以启动扩增反应。
B．依赖一种特殊的DNA 聚合酶，该酶在没有引物的情况下也能随机起始DNA 链的合成。
C．反应初期采用较低的退火温度以允许引物与模板非特异性结合，后续循环再提高退火温度以确保扩
增的特异性。
D．整个PCR 扩增过程均在不严格的条件下进行，以保证引物能结合到尽可能多的模板位点。
【答案】C
【详解】A、依题意，随机PCR 技术是指设计的引物是随机的，对模板的序列是一无所知的，A 错误；
B、依题意，利用随机PCR 技术扩增DNA 时，仍需引物，只是引物是随意设计或非特异性引物，B 错误；
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C、由于所用的引物不具有特异性，且是随机设计的引物，故起始的退火温度应相对低一些，以保证有扩
增产物。后续的循环应适当提高退火温度，以确保扩增产物的特异性，C 正确；
D、依题意，起始的扩增在不严格条件下进行， 后续的扩增在严格条件下进行，D 错误。
故选C。
8．苹果富含多种维生素，口感脆，苹果切开后不久颜色便会加深，这种现象称为“褐变”。褐变是由位
于细胞的多酚氧化酶（PPO）催化位于液泡中的多酚类物质生成棕色色素所致。据此，科研人员培育出了
抗褐变的转基因苹果，其工作流程如图所示，下列相关叙述错误的是（ ）
A．想获得抗褐变的转基因苹果，目的基因可以是抑制PPO 表达的基因
B．过程①是基因工程的核心步骤，一般需要限制性内切核酸酶和DNA 聚合酶的参与
C．在步骤③之前，需要用70%酒精或5%次氯酸钠溶液对苹果嫩叶碎片进行消毒处理
D．与导入不含目的基因质粒的植株作对照，评估目的基因对抑制苹果褐变的效果
【答案】B
【详解】A、要想获得抗褐变的转基因苹果，可选抑制PPO 表达的基因作为目的基因，使液泡中的多酚类
物质不能生成棕色色素，A 正确；
B、过程①是目的基因表达载体的构建，是基因工程的核心步骤，该过程中至少需要限制性内切核酸酶和
DNA 连接酶的参与，B 错误；
C、在步骤③之前，先用70%酒精消毒30s，然后用无菌水清洗后再用5%次氯酸钠溶液对苹果嫩叶碎片处
理30min，最后还要用无菌水清洗，从而保证脱分化过程正常进行，C 正确；
D、为了评估目的基因对抑制苹果褐变的效果，可与导入不含目的基因质粒的植株作对照，该设计的目的
是排除质粒导入本身对实验结果的影响，同时也能检测导入目的基因的效果，D 正确。
故选B。
9．马铃薯在生长期易受多种病毒侵染而严重减产。科研人员通过农杆菌介导法，将4 种病毒CP 融合基因
导入马铃薯，获得多抗转基因马铃薯，有效解决了多种病毒的侵染问题。其转化中所涉及的CP 融合基因、
Ti 质粒部分结构如图所示。下列相关叙述错误的是（ ）
注∶ClaⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、SacⅠ为相应限制酶的识别位点，Kan 片段为卡那霉素抗性基因片段
A．具体操作过程中CP 融合基因需先经PCR 扩增，再进行凝胶电泳加以分离和鉴定
B．为了使CP 融合基因能在马铃薯叶细胞中表达，可从马铃薯任何部位细胞中获取启动子1
C．应选择BamHⅠ和SacⅠ同时处理CP 融合基因所在的DNA 分子和Ti 质粒
D．若经限制酶处理的CP 融合基因与Ti 质粒反向连接，会导致CP 融合基因不能正常表达
【答案】B
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【详解】A、将4 种病毒CP 融合基因导入马铃薯前，需要对CP 融合基因进行扩增，即进行PCR 扩增，再
进行凝胶电泳加以分离和鉴定，A 正确；
B、为了使CP 融合基因能在马铃薯叶细胞中表达，启动子1 应为来源于叶细胞中特异性表达的启动子，B
错误；
C、在构建重组质粒时为了避免目的基因自身环化等，通常采用两种限制酶，根据题图可知，应选择
BamHⅠ和SacⅠ同时处理CP 融合基因所在的DNA 分子和Ti 质粒，C 正确；
D、经限制酶处理的CP 融合基因虽然带有相应的启动子1，但要利用T-DNA 的终止子，若与Ti 质粒反向
连接，可能因缺失相应的终止子或相关的终止子位置改变，导致CP 融合基因不能表达或不能正确表达出
相应的mRNA，D 正确。
故选B。
10．为探究DNA 片段P 与O2蛋白结合的关键位点，研究者获得片段P 不同位点的突变体M1、M2 和
M3，用O2蛋白进行结合试验，并用指示探针（带荧光的片段P）等进行检测，结果如图。下列分析错误
的是（ ）
A．泳道2 与泳道1 相比较，条带2 变窄
B．出现条带1 是因为O2蛋白与指示探针结合
C．M2 和M3 与O2蛋白的结合强度相同
D．M1 的突变位点几乎不影响O2蛋白的结合
【答案】C
【详解】A、泳道1 应为 “仅指示探针”（未加 O₂ 蛋白和待测物），条带2 代表游离的指示探针；泳道2
可能为 “指示探针+O₂ 蛋白”（未加待测物），O₂ 蛋白会与指示探针结合，导致游离探针减少，条带2 变
窄，A 正确；
B、指示探针是带荧光的片段P，若O₂ 蛋白与其结合，会形成 “O₂ 蛋白-探针复合物”，电泳时迁移速率
与游离探针不同，可能表现为条带1（复合物条带），B 正确；
C、若M2 和M3 与O₂ 蛋白结合强度相同，两组中游离指示探针的量应一致（条带2 宽度相同）。但根据
实验设计，突变体的结合位点不同，结合能力可能存在差异，条带2 的变化不同，因此无法推断二者结合
强度相同，C 错误；
D、若M1 与O₂ 蛋白的结合能力接近野生型片段P，则加入M1 后，O₂ 蛋白主要与M1 结合，对指示探针
的结合影响小，条带2 宽度与“仅加O₂ 蛋白” 组接近，说明M1 的突变位点不影响结合，D 正确。
故选C。
题型三 基因工程的应用
11．CAR-T 细胞疗法被《自然》期刊评为2025 年值得关注的七大突破性技术。该技术是基于T 细胞的基
因工程疗法，首先从患者体内收集T 细胞，对其进行基因工程改造，使之表达嵌合抗原受体（CAR），再
将转基因T 细胞体外扩增后重新输回患者体内，使其特异性识别并裂解靶细胞。目前CAR-T 疗法在临床上
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对系统性红斑狼疮和血液恶性肿瘤的治疗均取得了较好的效果，下列叙述错误的是（ ）
A．将插入了CAR 基因的重组质粒导入T 细胞，可得到CAR-T 细胞
B．CAR-T 细胞表面的CAR 可呈递抗原给B 细胞，促进其分裂分化为浆细胞
C．CAR-T 细胞识别肿瘤细胞并使其裂解死亡，体现了免疫系统的监视功能
D．系统性红斑狼疮是免疫系统将自身成分当作外来异物进行攻击而引起的自身免疫病
【答案】B
【详解】A、CAR-T 细胞的制备需将CAR 基因通过基因工程导入T 细胞，重组质粒作为载体可实现该过程，
A 正确；
B、CAR-T 细胞通过表面CAR 直接识别并裂解靶细胞，无需呈递抗原给B 细胞，B 错误；
C、免疫监视功能指免疫系统识别并清除异常细胞（如肿瘤细胞），CAR-T 细胞识别肿瘤细胞并使其裂解
死亡，体现了免疫系统的监视功能，C 正确；
D、自身免疫病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，如风湿性心脏病、
类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等，D 正确。
故选B。
12．科学家们致力于通过基因工程手段解决各种医学和工业难题。下列关于基因工程技术应用的叙述，错
误的是（ ）
A．目前利用基因工程技术可以生产细胞因子、抗体和疫苗等
B．通过将肠乳糖酶导入到奶牛乳腺细胞中，以降低乳汁中乳糖含量，从而解决部分人群的乳糖不耐
受问题
C．将来源于某些病毒、真菌的抗病基因导入植物中，可培育转基因抗病植物
D．利用基因工程菌来生产工业用酶的优点是酶纯度更高、生产成本显著降低、生产效率较高
【答案】B
【详解】A、基因工程技术在医学领域应用广泛，可通过工程菌或动物细胞培养生产细胞因子（如干扰
素）、抗体（如单克隆抗体）和疫苗（如乙肝疫苗）等生物制品，A 正确；
B、应将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵等，使转基因奶牛乳腺细胞表达肠乳糖酶来降低乳汁乳糖，直接导
入乳腺细胞无法稳定遗传和表达，B 错误；
C、抗病基因可来源于病毒（如病毒外壳蛋白基因）或真菌（如几丁质酶基因），导入植物后可增强抗病
性，C 正确；
D、基因工程菌能高效生产高纯度工业酶，且成本低，D 正确。
故选B。
13．抗凝血酶Ⅲ是抗凝系统中最重要的成分，它由肝脏合成，为一种多功能的丝氨酸蛋白酶抑制物，可抑
制凝血酶生成，具有很强的抗凝活性，临床上可用抗凝血酶Ⅲ来治疗获得性和自发性的深静脉血栓。利用
乳腺生物反应器和膀胱生物反应器来生产抗凝血酶Ⅲ使得该药物的价格低廉。下列叙述正确的是（ ）
A．肝脏有严重疾病的人，其血液中抗凝血酶Ⅲ的含量比正常人的低
B．乳腺生物反应器与膀胱生物反应器均不受性别和时间的限制
C．制备乳腺生物反应器和膀胱生物反应器均可向受精卵中直接导入目的基因
D．将乳腺细胞中能表达的任一基因的启动子与目的基因连接来制备乳腺生物反应器
【答案】A
【详解】A、抗凝血酶Ⅲ由肝脏合成，肝脏疾病患者合成能力下降，导致其血液中含量降低，A 正确；
B、乳腺生物反应器需在雌性个体中表达，受性别限制；而膀胱生物反应器无性别限制，B 错误；
C、制备生物反应器需将目的基因与特定启动子（如乳腺或膀胱特异性启动子）连接后导入受精卵，而非
直接导入目的基因，C 错误；
D、乳腺生物反应器需使用乳腺特异性启动子（如乳蛋白基因启动子），而非“任一能表达的基因”的启
动子，D 错误。
故选A。
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14．慢病毒可有效感染人类肝细胞、肿瘤细胞以及鹌鹑胚胎细胞等多种细胞。科学家利用含有产生黑色素
的基因的慢病毒侵染鹌鹑胚胎细胞，希望能使鹌鹑长出令人喜爱的黑皮肤。下列相关叙述错误的是（ ）
A．即使携带产生黑色素的基因的慢病毒成功侵染鹌鹑胚胎细胞，鹌鹑也不一定能表现为黑皮肤
B．可以用 T2 噬菌体替代慢病毒，作为运载体转入黑色素基因
C．使用皮肤细胞中特异性表达的启动子有利于得到此结果
D．经过人工改造的慢病毒载体有望用于人体内的基因治疗
【答案】B
【分析】T2 噬菌体是一种感染大肠杆菌的病毒。
【详解】A．慢病毒成功侵染后，黑色素基因需整合到宿主细胞基因组并正确表达，若未在皮肤细胞中表
达或未整合，则性状不表现，A 正确；
B．T2 噬菌体专一感染大肠杆菌，无法侵染真核生物（如鹌鹑胚胎细胞），不能作为运载体，B 错误；
C．皮肤细胞特异性启动子可使黑色素基因仅在皮肤细胞表达，避免其他组织表达，C 正确；
D．慢病毒经改造后可携带目的基因整合到宿主基因组，用于基因治疗（如遗传病），D 正确；
故选B。
15．基因芯片的测序原理是: 先将各不相同的已知序列的八核苷酸探针分别固定在玻片的方格中，再与带
荧光标记的待测DNA 单链进行杂交，通过确定荧光强度最强的探针位置与对应序列，推出待测序列，如
图所示。下列有关叙述正确的是（ ）
A．上述测序方法是基于DNA-RNA 分子杂交实现的
B．通过给探针标记荧光也可达到与上图同样的效果
C．应洗去未与探针结合的待测DNA 分子后再检测荧光
D．根据图示结果可推出待测序列为5'-ATACGTTAGATC-3'
【答案】C
【详解】A、因为是已知序列的探针与待测DNA 单链杂交，所以上述测序方法是基于DNA-DNA 分子杂交
实现的，A 错误；
B、由题干可知是给待测DNA 单链标记荧光，若给探针标记荧光，则无法区分与待测DNA 单链结合的不
同探针，B 错误；
C、若不洗去未与探针结合的待测DNA 分子，会干扰对与探针结合的待测DNA 分子的荧光检测，所以应
洗去未与探针结合的待测DNA 分子后再检测荧光，C 正确；
D 、根据图示，待测DNA 单链可以与1 ～5 探针结合，1 ～5 探针的碱基序列连在一起是5'-
ATACGTTAGATC-3'，待测序列为5'-GATCTAACGTAT-3'，D 错误。
故选C。
题型四 蛋白质工程
16．已知某水生动物体内存在一种酶X，由363 个氨基酸构成。科学家利用蛋白质工程技术将X 中的133
位的苏氨酸变为丝氨酸，将254 位的精氨酸变为甘氨酸，改变后的蛋白质X 不仅仅具有原来X 的催化功能
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还额外具有了转运蛋白的活性。下列相关说法正确的是（ ）
A．蛋白质工程生产的蛋白质是自然界本来就存在
B．改造该酶的实质是要改造控制该酶合成的基因
C．可以利用PCR 技术从该水生动物基因组中扩增出所需目的基因
D．蛋白质工程也可以对蛋白质直接进行改造，操作时不需要构建基因表达载体
【答案】B
【详解】A、蛋白质工程通过改造基因生产自然界可能不存在的新蛋白质，A 错误；
B、蛋白质工程的实质是通过修改基因来改变蛋白质结构，因此改造酶的实质是改造控制该酶合成的基因，
B 正确；
C、PCR 扩增需以目标基因为模板，但原基因组中不含改造后的基因序列，无法直接扩增，需人工合成或
修饰基因，C 错误；
D、蛋白质工程需通过基因改造间接实现，不能直接对蛋白质进行可遗传的改造，且必须构建基因表达载
体，D 错误。
故选B。
17．T4 溶菌酶来源于T4噬菌体，是重要的工业用酶。科学家通过一定技术使T4 溶菌酶的第3 位异亮氨酸
变为半胱氨酸（异亮氨酸的密码子是AUU、AUC、AUA，半胱氨酸的密码子是UGU、UGC），于是在该
半胱氨酸与第97 位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，从而使T4溶菌酶的耐热性得到了提高。对上述过程
的叙述错误的是（ ）
A．对T4溶菌酶的改造属于蛋白质工程的范畴
B．上述过程通过直接改造T4溶菌酶密码子上的2 个碱基实现
C．参与新的T4溶菌酶合成所用到的tRNA 种类可能不变
D．改造后的T4溶菌酶肽键数不变，新形成二硫键能够增强蛋白质分子的稳定性
【答案】B
【详解】A、蛋白质工程通过修改基因来定向改造蛋白质，题干中改变T4 溶菌酶的结构属于此范畴，A 正
确；
B、密码子位于mRNA 上，科学家通过改变基因（DNA）的碱基序列来间接改变密码子，而非直接修改密
码子，B 错误；
C、异亮氨酸和半胱氨酸的密码子不同，但细胞中可能已存在对应的tRNA，因此合成新酶时tRNA 种类可
能不变，C 正确；
D、氨基酸替换未改变肽链长度，肽键数不变；二硫键的形成增强了蛋白质的空间结构稳定性，D 正确。
故选B。
18．2024 诺贝尔化学奖颁给“AI 蛋白质设计和结构预测”，利用AI 算法快速模拟、预测和优化的蛋白质
结构与已知的蛋白质完全不同，但它们与天然蛋白质同样具有活性，并且最终设计出的蛋白质，是通常需
要数百年才能进化出来的高活性蛋白质。下列关于蛋白质工程的叙述，错误的是（ ）
A．进行蛋白质工程研究的原因是基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质
B．蛋白质工程是基因水平上对蛋白质进行改造或制造
C．大肠杆菌常用于蛋白质工程中产物的生产，这离不开其繁殖速度快，能对分泌蛋白进行复杂加工、
遗传背景清晰等生理特点
D．“AI 蛋白质设计和结构预测”解决了蛋白质工程中，序列-结构-功能关系难以准确预测的问题
【答案】C
【详解】A、蛋白质工程的研究目的是生产自然界不存在或现有蛋白质无法满足需求的蛋白质，而基因工
程只能生产天然存在的蛋白质，A 正确；
B、蛋白质工程通过修改基因的碱基序列来改变蛋白质结构，属于基因水平的定向改造，B 正确；
C、大肠杆菌为原核生物，缺乏内质网和高尔基体，无法对分泌蛋白进行复杂加工（如糖基化），其优势
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在于繁殖快、遗传背景清晰，C 错误；
D、AI 技术通过模拟和预测蛋白质结构，解决了传统方法中序列-结构-功能关系难以准确预测的难题，D
正确。
故选C。
19．AI 与蛋白质工程结合将引发下一代生物技术革命，AI 预测可加速蛋白质结构解析、功能优化和设计，
蛋白质工程基于蛋白质结构和功能，定点突变或片段替换进行改造蛋白质。下列叙述正确的是（ ）
A．蛋白质工程的设计思路和天然蛋白质合成的过程是一样的
B．基因工程可以制造出大自然中没有的蛋白质满足人类的需求
C．多肽链上的氨基酸被替换，对应的mRNA 上碱基序列也改变
D．蛋白质工程是基因工程的延伸，得到的产物一定会对人类有益的
【答案】C
【详解】A、蛋白质工程的设计思路是从预期的蛋白质功能出发→设计结构→推测氨基酸序列→确定脱氧
核苷酸序列，而天然蛋白质的合成遵循中心法则（DNA→mRNA→蛋白质），两者方向相反，A 错误；
B、基因工程只能通过重组现有基因生产自然界已有的蛋白质，无法直接创造全新蛋白质；而蛋白质工程
通过改造基因可合成自然界不存在的蛋白质，B 错误；
C、多肽链中氨基酸的替换由mRNA 上密码子改变导致，而密码子由DNA 碱基序列决定，因此对应的
mRNA 碱基序列必然发生改变，C 正确；
D、蛋白质工程产物可能因结构改变产生未知功能或毒性，并非必然有益，D 错误。
故选C。
20．天然胰岛素易形成二聚体或六聚体，皮下注射胰岛素后往往要经历一个逐渐解离为单体的过程，这在
一定程度上延缓了疗效。科研人员发现，将胰岛素B28 位的脯氨酸替换为天冬氨酸或与B29 位的赖氨酸交
换位置，可有效抑制胰岛素的聚合，由此研发出的速效胰岛素类似物产品已经在临床上广泛应用。下列叙
述正确的是（ ）
A．该工程属于蛋白质工程，其生产的蛋白质是自然界已有的蛋白质
B．胰岛素改造的基本思路与中心法则中遗传信息的流动方向相同
C．速效胰岛素类似物注射后无需解离为单体的性状是可以遗传的
D．可利用大肠杆菌直接合成有生物学活性的速效胰岛素类似物
【答案】C
【详解】A、蛋白质工程通过改造基因来合成自然界不存在的蛋白质，而题干中的胰岛素类似物是人工改
造的，并非自然界已有，A 错误；
B、蛋白质工程的设计思路是从预期的蛋白质结构出发，逆推至基因序列，与中心法则（DNA→RNA→蛋
白质）的遗传信息流动方向相反，B 错误；
C、速效胰岛素类似物的特性（无需解离为单体）由工程菌的基因改造决定，其遗传物质已改变，能够稳
定遗传给后代，C 正确；
D、大肠杆菌缺乏内质网和高尔基体，无法对真核生物的蛋白质进行加工，因此无法直接合成有活性的胰
岛素类似物，D 错误。
故选C。
题型五 生物技术的安全性及伦理问题
21．生物技术的安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述正确的是（ ）
A．转基因技术是安全的，无需进行风险评估
B．使用转基因大豆加工成的食用油不一定要进行标识
C．生殖性克隆是利用克隆技术产生特定的细胞来修复或替代受损的细胞
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D．将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物，可防止转基因花粉的传播
【答案】D
【详解】A、转基因技术可能存在潜在风险，如生态安全、生物安全等，需要进行严格的风险评估，A 错
误；
B、我国规定转基因产品必须进行标识，无论是否含有转基因成分，B 错误；
C、生殖性克隆的目的是产生新个体，而治疗性克隆是指将患者的细胞诱导成特定的细胞、组织和器官，
用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的，C 错误；
D、将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物，可使花粉中α-淀粉酶基因表达，破坏淀粉储存导致花粉败
育，从而防止转基因花粉传播，D 正确。
故选D。
22．现代生物技术为人们的生活带来便利，同时也存在安全性和伦理问题，下列叙述错误的是（ ）
A．α-淀粉酶基因可使花粉失去活性，将它和目的基因一起转入植物，可以避免花粉扩散带来的“基因
污染”
B．我国政府主张全面禁止和彻底销毁生物武器
C．生殖性克隆和治疗性克隆均涉及伦理问题
D．设计试管婴儿技术是一种有性生殖的新技术，不涉及伦理问题
【答案】D
【详解】A、α-淀粉酶基因可使花粉失去活性，与目的基因共同转入可防止转基因植物花粉传播，避免基
因污染，A 正确；
B、我国政府明确反对生物武器，支持全面禁止和销毁生物武器，B 正确；
C、生殖性克隆涉及人类伦理争议，治疗性克隆虽用于医学但涉及胚胎使用，仍存在伦理问题，C 正确；
D、设计试管婴儿需经胚胎筛选，可能引发性别选择、遗传歧视等伦理争议，因此涉及伦理问题，D 错误。
故选D。
23．当代生物技术迅速发展，安全性问题引发社会的广泛关注，下列叙述正确的有（ ）个。
①生物武器最大的特点是传染性
②治疗性克隆都不需要严格监管
③转基因栽培作物不会发生基因漂移
④治疗性克隆的原理是细胞的全能性
⑤我国禁止进行任何生殖性克隆人实验
⑥治疗性克隆不会产生道德、伦理问题
⑦我国反对生物武器的研发、生产和扩散
⑧转基因食品存在引发过敏的风险
A．1 个
B．2 个
C．3 个
D．4 个
【答案】D
【详解】①生物武器具有传染性强、作用范围广等特点，应严格禁止，①正确；
②治疗性克隆涉及胚胎操作，需严格监管以防止滥用，②错误；
③转基因作物的基因可能通过花粉传播到近缘物种（基因漂移），③错误；
④治疗性克隆的原理是细胞核的全能性，而非整个细胞的全能性，④错误；
⑤我国明确禁止生殖性克隆人实验，⑤正确；
⑥治疗性克隆因涉及胚胎使用，存在伦理争议，⑥错误；
⑦我国坚决反对生物武器的研发、生产和扩散，⑦正确；
⑧转基因食品可能含新蛋白质，存在过敏风险，⑧正确。
①⑤⑦⑧正确。
故选D。
24．转基因技术在农牧业、医药卫生等领域的应用，使人类获得了更符合要求的新性状个体。下列关于转
基因技术应用或对待转基因技术态度的叙述，正确的是（ ）
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A．将抗病基因导入植物，可获得与原物种具有生殖隔离的新物种
B．用转基因技术改造天花病毒，使其成为新型生物武器
C．在体外条件下将人体细胞诱导成为iPS 细胞，再用iPS 细胞来克隆人
D．用转基因技术抑制抗原决定基因的表达，可能会获得不会产生免疫排斥反应的克隆器官
【答案】D
【详解】A、将抗病基因导入植物仅使其获得新性状，但未形成生殖隔离，仍属于同一物种，A 错误；
B、改造天花病毒作为生物武器违反国际公约和伦理，B 错误；
C、iPS 细胞克隆人涉及伦理问题且技术尚未成熟，C 错误；
D、抑制抗原决定基因表达可减少器官移植的免疫排斥，符合转基因技术应用方向，D 正确。
故选D。
25．20 世纪90 年代，有一名19 岁的姑娘患了白血病，需要进行骨髓移植。然而，她亲人的骨髓配型并不
适合她，在骨髓库中也找不到合适配型的骨髓。她的父母通过“设计试管婴儿”生下了一个配型适合她的
婴儿。在婴儿出生2 个月后，医生就抽取婴儿骨髓中的造血干细胞移植给她，她得救了。下图是培育“试
管婴儿”的主要过程。下列叙述错误的是（ ）
A．“设计试管婴儿”与“试管婴儿”不同的是需在③时进行遗传学诊断
B．若该婴儿能健康成长，她的造血干细胞也可能会挽救其他贫血病患者
C．“试管婴儿”与“设计试管婴儿”技术的实施均需要遵守国家相关规定
D．“设计试管婴儿”的技术不属于“治疗性克隆”，但也需关注伦理问题
【答案】A
【分析】试管婴儿技术是指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育为早期
胚胎后，再经移植后产生后代的技术。设计试管婴儿技术是通过体外受精获得许多胚胎，然后从中选择符
合要求的胚胎，再经移植后产生后代的技术。
【详解】A、“设计试管婴儿”的目的是用于治疗某些疾病，需在②胚胎移植前进行遗传学诊断，A 错误；
B、该婴儿能健康成长，只要供者和受者的主要HLA 有一半以上相同，即可进行器官移植，因此该女婴造
血干细胞也能挽救其他贫血病患者，B 正确；
C、“试管婴儿”与“设计试管婴儿”均需要符合国家相关规定，C 正确；
D、“设计试管婴儿”与“试管婴儿”一样，也是利用体外授精和胚胎移植的方法培育新生命，均属于有
性生殖，“设计试管婴儿”的技术不属于“治疗性克隆”，但也需关注伦理问题，D 正确。
故选A。
26．依据《中华人民共和国生物安全法》，生物安全是指国家有效防范和应对危险生物因子及相关因素威
胁，生物技术能够稳定健康发展，人民生命健康和生态系统相对处于没有危险和不受威胁的状态，生物领
域具备维护国家安全和持续发展的能力。下列叙述错误的是（ ）
A．高致病性微生物须在高等级生物安全实验室中开展实验活动
B．生物技术可广泛应用在人类自身基因组改造和新物种创造中
C．外来入侵物种可能增加本土食物来源却给自然生态造成破坏
D．动物饲料中的抗生素会通过食物链使人体微生物耐药性增强
【答案】B
【分析】《中华人民共和国生物安全法》是为维护国家安全，防范和应对生物 安全风险，保障人民生命
健康，保护生物资源和生态环境，促进生物技术健康发展，推动构建人类命运共同体，实现人与自然和谐
共生，制定的法律。
【详解】A、高致病性微生物须在高等级生物安全实验室中开展实验活动，防止造成致病性微生物外泄，
造成污染，危害生物健康，A 正确；
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B、生物技术可应用在新物种创造中，但对人类自身基因组改造到目前还存在相应的问题，难以实现，B
错误；
C、外来入侵物种可能增加本土食物来源，但如果缺乏天敌会造成自然生态破坏，C 正确；
D、长期使用抗生素，必然产生残留，而其残留在动物饲料中的抗生素，会随着食物链进入人体引发微生
物的耐药性，D 正确。
故选B。
1．（2025·湖南·模拟预测）基因编辑技术中CRISPR/Cas9 系统的问世源于对细菌免疫机制(如
图)的研究。细菌CRISPR 序列的间隔区储存入侵过细菌的外源DNA 信息，gRNA(引导RNA)能识别外源
DNA 的靶序列，Cas9 基因表达的核酸内切酶Cas9 能对外源DNA 的靶序列进行切割。下列说法错误的是
（ ）
A．细菌CRISPR 序列间隔区储存外源DNA 信息，为gRNA 合成提供模板
B．Cas9/gRNA 复合物与基因工程的限制性内切酶类似，切割具有序列特异性
C．外源DNA 入侵后，Cas9 基因表达产物随即切割外源DNA
D．gRNA 识别外源DNA 靶序列时，有可能会发生错配
【答案】C
【分析】题图分析，同种外源DNA 再次侵染时，细菌的Cas9 基因及小片段DNA 表达产物组成一种复合
物，将入侵的DNA 切断使其失效。在该过程中，复合体上的gRNA 的作用识别噬菌体DNA，Cas9 蛋白的
作用是切割DNA。该过程中涉及到gRNA 特异性识别DNA 的过程，因此细菌这种抵抗外源DNA 的功能
相当于哺乳动物体内的特异性免疫功能。
【详解】A、细菌CRISPR 序列间隔区储存的外源DNA 信息是转录生成gRNA 的模板，A 正确；
B、由于gRNA 能识别外源DNA 的靶序列，Cas9/RNA 复合物与限制性内切酶一样具有序列特异性，B 正
确；
C、外源DNA 入侵后，并非Cas9 基因表达产物随即切割外源DNA，而是要与gRNA 进行一系列组装过程，
形成有靶向切割能力的复合体，C 错误；
D、gRNA 识别外源DNA 靶序列遵循碱基互补配对原则，但在实际过程中可能会受到多种因素影响而出现
错配的情况，D 正确。
故选C。
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2．（2025·湖南长沙·二模）下列有关“DNA 粗提取与鉴定”、“DNA 片段的扩增及电泳鉴
定”实验叙述，正确的是（ ）
A．可以利用洋葱为实验材料，也可以选择猪血、猪肝等作为DNA 粗提取的实验材料
B．将提取到的丝状物直接与二苯胺溶液充分混匀后沸水浴，溶液即可变为蓝色
C．电泳缓冲液加入电泳槽不能没过凝胶
D．PCR 得到的产物需要与含有电泳指示剂的凝胶载样缓冲液混合后方可用于电泳
【答案】D
【分析】DNA 的粗提取与鉴定的实验原理是：
（1）DNA 的溶解性，DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点
可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA 溶解或析出，从而达到分离的目的。
（2）DNA 不容易酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA 进
一步分离。
【详解】A、理论上只要含有DNA 的生物组织均可作为该实验的材料，因此菜花、洋葱、猪肝等均可作为
提取DNA 的材料，但猪血不能作为实验材料， 因为其中成熟的红细胞没有细胞核和细胞器，因而不含
DNA，A 错误；
B、将丝状物溶于2mol/L 的5mL 的NaCl 溶液中，然后向试管中加入4mL 的二苯胺试剂，沸水浴加热
5min，试管冷却后溶液呈现蓝色，B 错误；
C、电泳缓冲液加入电泳槽时，需要没过凝胶1mm 为宜，C 错误；
D、PCR 得到的产物需要与凝胶载样缓冲液混合后方可用于电泳，因为凝胶载样缓冲液可以增加样品密度，
同时还可提供电泳指示，便于观察，D 正确。
故选D。
3．（以生物的性别决定机制为情境）（24-25 高三下·湖南长沙·阶段练习）生物的性别决定机制
一直是研究的热点。我国科学家以植物君迁子（DiospyroslotusL.）为研究材料，发现其性别决定与干扰
RNA（síRNA）有关。siRNA 的来源及在君迁子中的作用机制如图所示，下列说法中正确的是（ ）
A．据图甲分析，双链RNA 经核酸内切酶作用断开氢键，形成多个小片段的siRNA
B．RISC 上的RNA 能与mRNA 进行碱基的互补配对，从而特异性识别mRNA，引起mRNA 的降解，
抑制基因的转录
C．君迁子的Y 染色体上的SDR 会形成干扰RNA，能特异性识别并结合常染色体上表达的MeGI，从
而抑制雌蕊的发育
D．dsRNA 上含有两个游离的磷酸基团，彻底水解后可以获得4 种产物
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【答案】C
【分析】题图分析，双链RNA 被切割成siRNA，siRNA 与AGO 蛋白结合，形成沉默复合体，与相应的
mRNA 结合，会引起mRNA 的降解。
【详解】A、双链RNA 经核酸内切酶处理后，会断开磷酸二酯键，形成siRNA，A 错误；
B、mRNA 的降解，抑制的是翻译过程，B 错误；
C、君迁子的Y 染色体上的SDR 会形成干扰RNA，能特异性识别并结合常染色体上表达的MeGI，从而抑
制雌蕊的发育，从而发育成雄株，C 正确；
D、dsRNA 上两端各有一个游离的磷酸基团，RNA 彻底水解后可以获得6 种产物，磷酸、核糖、4 种含氮
碱基，D 错误。
故选C。
4．（24-25 高三下·湖南·开学考试）某基因表达载体构建过程中，需将目的基因1 和目的基因2
按照下图所示导入整合区域。用四种产生的黏性末端各不相同的限制酶将目的基因1 和目的基因2 切割，
先后插入ZS 质粒时，最佳的限制酶使用方案是（ ）
A．①③
B．①④
C．②③
D．②④
【答案】D
【分析】1、基因表达载体的构建的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表
达和发挥作用；
2、基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因；启动子在基因的首段，它是RNA 聚合酶
的结合位点，能控制着转录的开始；终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束。
【详解】AB、若使用①③或①④，目的基因1 两端都是酶1 切割产生的黏性末端，当将目的基因1 和目的
基因2 先后插入ZS 质粒时，目的基因1 会因为两端黏性末端相同而反向插入，AB 错误；
C、②中目的基因1 一端是酶1 切割产生的黏性末端，另一端是酶2 切割产生的黏性末端；③中目的基因2
一端是酶1 切割产生的黏性末端，另一端是酶4 切割产生的黏性末端。 这样将目的基因2 插入ZS 质粒时，
可能会将目的基因1 切除，C 错误；
D、若使用②④，目的基因1 两端分别是酶1 和酶2 切割产生的黏性末端，目的基因2 两端分别是酶3 和酶
4 酶4 切割产生的黏性末端。 用不同的酶切割产生不同的黏性末端，这样在将目的基因1 和目的基因2 先
后插入ZS 质粒时，目的基因不会反向插入，所以该方案可行，D 正确。
故选D。
5．（2025·湖南永州·模拟预测）利用洋葱可以完成很多实验，下列有关叙述错误的是（ ）
A．提取洋葱DNA 溶于2mol/L NaCl 溶液，加入二苯胺试剂后水浴加热呈蓝色
B．观察根尖分生区组织细胞有丝分裂的实验步骤为：解离→染色→漂洗→制片
C．紫色洋葱鳞片叶的外表皮细胞放在0.3g/mL 的蔗糖溶液中液泡颜色加深
D．从洋葱绿叶中提取色素时添加二氧化硅有利于充分研磨
【答案】B
【分析】1、质壁分离的原因分析：外因：外界溶液浓度＞细胞液浓度；内因：原生质层相当于一层半透
膜，细胞壁的伸缩性小于原生质层。2、提取绿叶中色素时，需要加入无水乙醇（丙酮）、SiO2、
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CaCO3，其中无水乙醇（丙酮）的作用是提取色素，SiO2 的作用是使研磨更充分，CaCO3 的作用是防止
色素被破坏。
【详解】A、提取洋葱DNA 溶于2mol／LNaCl 溶液，加入二苯胺试剂后需要通过水浴加热会呈蓝色，据
此可鉴定DNA 的存在，A 正确；
B、观察根尖分生区组织细胞有丝分裂的实验步骤为：解离→漂洗→染色→制片，B 错误；
C、紫色洋葱鳞片叶的外表皮细胞放在0.3g/mL 的蔗糖溶液中会发生质壁分离，液泡颜色加深，C 正确；
D、从洋葱绿叶中提取色素时添加二氧化硅有利于充分研磨，D 正确。
故选B。
6．（25-26 高三上·湖南长沙·阶段练习）未成熟豌豆豆荚的黄色对绿色为显性，黄色豆荚植株中基因H
（编码叶绿素合成酶）的上游缺失非编码序列G。科研人员为探究G 和下游H 的关系，拟将某绿色豆荚植
株的基因H 突变为h（突变位点如图a 所示，h 编码的蛋白无功能），并进行图a 实验。为筛选Hh 植株，
根据突变位点两侧序列设计一对引物提取待测植株的DNA 进行PCR 后电泳，电泳结果如图b 所示。以下
推理不正确的是（ ）
（注：缺失G“用△G”表示）
A．若扩增产物电泳结果全为预测的1125bp，则基因H 可能未发生突变，或发生了碱基对的替换
B．若H 的扩增产物能被酶切为699bp 和426bp 的片段，而h 的酶切位点丧失，则图b 中的Ⅱ对应的是
Hh 植株
C．若图a 的F1中绿色豆荚∶黄色豆荚＝1 1∶，则F1中黄色豆荚植株的基因型可表示为（G＋H）/（△G
＋H）
D．若图a 的F1中两种基因型植株的数量无差异，但豆荚全为绿色，则说明只要G 序列存在H 基因的表
达不受影响（或影响很小）
【答案】C
【详解】A、若扩增产物电泳结果全为预测的 1125bp，则基因H 可能未发生突变，也可能是基因H 发生了
碱基对的替换，使得扩增产物的长度不变，A 正确；
B、若H 的扩增产物能被酶切为699bp 和426bp 的片段，而h 的酶切位点丧失，则Hh 植株会产生两种类型
的扩增产物，一种是H 经酶切后的699bp 和426bp 片段，一种是h 未被酶切的1125bp 片段，所以图b 中
的Ⅱ对应的是Hh 植株，B 正确；
C、Hh 植株与黄色豆荚植株 (
G
△＋H)/(
G
△＋H) 杂交，若 F1 中绿色豆荚∶黄色豆荚＝1 1∶，说明Hh 植株
产生了两种配子 G＋H 和G＋h，且黄色豆荚植株只能产生含△G＋H 的配子，所以F1 中黄色豆荚植株的
基因型可表示为（G＋h）/（△G＋H），C 错误；
D、结合对C 选项的分析可知：F1 的基因型为（G＋H）/（△G＋H）和（G＋h）/（△G＋H），若F1 中
两种基因型植株的数量无差异，但豆荚全为绿色，则说明只要G 序列存在H 基因的表达不受影响（或影响
很小），D 正确。
故选C。
7．（25-26 高三上·湖南长沙·阶段练习）2025 年研究显示，新型SD DNA 聚合酶可耐受92 ℃高温，其通
过引入古菌特有的糖基化修饰位点，形成保护性水合层，显著提升热稳定性。下列关于这类耐高温的DNA
聚合酶的叙述正确的是（ ）
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A．基本单位是脱氧核苷酸
B．在细胞内或细胞外，当模板DNA 和脱氧核苷酸存在时即可催化反应
C．为维持较高活性，适宜在70℃~75℃下保存
D．对酶活性结构域特定氨基酸位点突变可进一步提升其耐热性
【答案】D
【详解】A、DNA 聚合酶的本质是蛋白质，其基本单位为氨基酸，而非脱氧核苷酸，A 错误；
B、DNA 聚合酶催化反应需模板、引物和脱氧核苷酸，仅模板和底物无法启动反应，B 错误；
C、酶保存需低温（如4℃）以维持活性，高温保存会破坏酶结构，即使耐高温酶长期保存仍需低温，C 错
误；
D、通过突变特定氨基酸位点可优化酶结构域稳定性，如糖基化修饰以提升耐热性，进一步突变可能增强
特性，D 正确。
故选D。
8．（2025·湖南长沙·模拟预测）某病毒表面的RBD 蛋白是引导其进入宿主细胞的关键结构。科研人员将
GP67 基因（引导新合成的蛋白分泌到细胞外）与RBD 基因融合，构建融合基因导入山羊细胞中，从山羊
乳汁中分离生产RBD 蛋白，用于制备疫苗，流程如图。下列相关叙述正确的是（ ）
A．过程①的基础是生物界共用一套密码子
B．过程②可通过农杆菌转化法导入山羊的受精卵内
C．过程③可选择囊胚期的滋养层细胞，通过PCR 技术检测是否合成RBD
D．过程④需经胚胎移植，并从乳汁中分离获得RBD
【答案】D
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②检测目
的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；
个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、过程①是构建融合基因（基因工程操作 ），生物界共用一套密码子是基因工程中 “外源基
因能在受体细胞表达” 的基础，而不是构建融合基因的基础，构建融合基因是通过限制酶和 DNA 连接
酶实现的，A 错误；
B、农杆菌转化法常用于植物细胞的转化，将目的基因导入山羊细胞（动物细胞 ）常用显微注射法，B 错
误；
C、过程③筛选的是导入融合基因的山羊细胞，需检测是否含有融合基因及是否转录出相应 RNA，而桑椹
胚期的滋养层细胞常用于胚胎移植前的性别鉴定等，且检测是否合成 RBD（蛋白质 ）常用抗原 - 抗体杂
交技术，不是PCR 技术，PCR 用于检测核酸，C 错误；
D、要从山羊乳汁中分离RBD 蛋白，需将导入融合基因的山羊细胞经胚胎移植发育成转基因动物，使其乳
腺细胞表达该蛋白，进而从乳汁中分离获得，D 正确。
故选D。
9．（2025·湖北襄阳·一模）以T-DNA 作载体将某突变基因导入拟南芥的染色体DNA 时，可出现三种结果：
仍为野生型（导入失败）、突变杂合子（在一对同源染色体上只导入1 个突变基因）及突变纯合子。研究
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人员用引物LP、RP 和BP 对上述三种拟南芥进行核酸电泳检测，结果如下图。下列说法正确的是（ ）
A．PCR 时，核糖核苷酸最初添加在引物的3＇端
B．根据电泳结果推断模板链过长时无PCR 产物
C．甲为突变纯合子
D．丙自交后代的核酸电泳结果与丙相同
【答案】B
【分析】PCR 是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA 半 保留复制的原理，在体外提供参与DNA
复制的各种组分与 反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【详解】A、在PCR 反应中，以单链DNA 为模板，在DNA 聚合酶作用下从引物的3'端开始添加脱氧核苷
酸，A 错误；
BC、乙只有BP+RP 扩增条带，为突变纯合子；丙同时具有LP+RP 及BP+RP 扩增条带，为突变杂合子；
甲只有LP+RP 扩增条带，为正常纯合子；LP 与RP 间为1.1kb，T-DNA 为17kb，T-DNA 插入LP 与RP 之
间会显著增大模板链长度，导致LP+RP 无扩增产物，B 正确、C 错误；
D、丙为杂合子，有1/2 的自交后代与丙的核酸电泳结果相同，D 错误。
故选B。
10．（2025·湖南常德·三模）下列说法正确的有（ ）
PCR
①
反应缓冲液中一般添加Ca2+激活DNA 聚合酶
②靶细胞、辅助性T 细胞参与细胞毒性T 细胞的活化
③洋葱根尖细胞能产水的细胞器有叶绿体、线粒体和核糖体
④特定蛋白质分子的运动有助于氨基酸跨膜运输
⑤ 可用电刺激、聚乙二醇、蛋白酶合成抑制剂激活重构胚
⑥交感和副交感神经共同调节骨骼肌的收缩和舒张
⑦胃黏膜属于生物膜系统
⑧植物细胞吸水达到渗透平衡时，细胞内外溶液浓度相等
⑨无子西瓜和无子番茄都离不开生长素的作用
A．3 项
B．4 项
C．5 项
D．6 项
【答案】A
【分析】克隆时，用电刺激、Ca2+载体、乙醇或蛋白酶合成抑制剂等方法激活重构胚，使其完成细胞分裂
和发育进程。
【详解】①PCR 反应缓冲液中一般添加Mg2+激活DNA 聚合酶，①错误；
②细胞毒性T 细胞识别并与靶细胞结合后开始分裂分化，辅助性T 细胞分泌细胞因子促进细胞毒性T 细胞
的分裂分化过程，②正确；
③洋葱根尖细胞无叶绿体，③错误；
④氨基酸的跨膜运输需要载体蛋白（如氨基酸转运蛋白），这些蛋白质通过构象变化协助运输，蛋白质分
子的运动（构象变化）是运输的关键，④正确；
⑤聚乙二醇是促进原生质体或动物细胞融合，无激活重构胚的作用。可用乙醇激活重构胚，⑤错误；
⑥交感和副交感神经属于自主神经系统，是支配内脏、血管和腺体的传出神经，⑥错误；
⑦生物膜系统是指细胞膜、细胞器膜、核膜构成的膜系统，胃黏膜不属于生物膜系统，⑦错误；
⑧渗透平衡不等于细胞内外溶液浓度相等，渗透平衡是指水分子的运输达到平衡，⑧错误；
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⑨无籽西瓜的发育也离不开生长素的作用，只是不需人工涂抹生长素；无子番茄是通过外源生长素处理未
受精的雌蕊发育而成，依赖生长素，⑨正确。
综上所述，A 正确；BCD 错误。
故选A。
11．（24-25 高三上·广东·阶段练习）我国的科研团队首次发现了高粱细胞中AT1 基因编码的AT1 蛋白可以
调节作物的耐碱性表型，对于研究如何提高作物在盐碱地的存活率具有重要意义。在盐碱地种植的作物会
受胁迫产生过量的有害物质H2O2。图中的PIP2s 为某种水通道蛋白，其磷酸化水平影响H2O2的跨膜运输，
其机理如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．细胞膜上PIP2s 蛋白磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s 蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1 基因或降低其表达可提高高粱的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是研究农作物抗逆性的有效途径
【答案】B
【分析】分析题图：AT1 蛋白通过抑制PIP2s 蛋白的磷酸化而抑制细胞内的H2O2 排到细胞外，从而导致
植物抗氧化胁迫能力减弱，进而引起细胞死亡。AT1 蛋白缺陷，可以提高PIP2s 蛋白的磷酸化水平，促进
细胞内的H2O2 排到细胞外，从而提高植物抗氧化的胁迫能力，进而提高细胞的成活率。
【详解】A、由题图右侧的信息可知，AT1 蛋白缺陷，可以促进PIP2s 蛋白的磷酸化，进而促进H2O2 排出
膜外，A 正确；
B、据题图左侧的信息可知，AT1 蛋白能够抑制PIP2s 蛋白的磷酸化，减少了H2O2 从细胞内输出到细胞外
的量，导致抗氧化胁迫能力弱，不能减轻其对细胞的毒害，B 错误；
C、结合对A 选项的分析可推测，敲除AT1 基因或降低其表达，可提高禾本科农作物抗氧化胁迫的能力，
进而提高其成活率，C 正确；
D、从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因，可通过基因工程技术改良农作物抗逆性，D 正确。
故选B。
12．（2025·福建厦门·一模）基因芯片的测序原理是：先将各不相同的已知序列的八核苷酸探针分别固定
在玻片的方格中，再与带荧光标记的待测DNA 单链进行杂交，通过确定荧光强度最强的探针位置与对应
序列，推出待测序列，如图所示。
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下列叙述错误的是（ ）
A．上述测序方法是基于DNA-DNA 分子杂交实现的
B．通过给探针标记荧光也可达到与上图同样的效果
C．应洗去未与探针结合的待测DNA 分子后再检测荧光
D．根据图示结果可推出待测序列为5'-GATCTAACGTAT-3'
【答案】B
【分析】1、基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA 重组和转基因等技术，赋
予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；
2、基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的
基因的检测与鉴定；
3、题意分析：题干信息：基因芯片测序原理是将已知序列的八核苷酸探针固定在玻片方格中，与带荧光
标记的待测DNA 单链杂交，通过确定荧光强度最强的探针位置与对应序列推出待测序列。
【详解】A、因为是已知序列的探针与待测DNA 单链杂交，所以上述测序方法是基于DNA-DNA 分子杂交
实现的，A 正确；
B、由题干可知是给待测DNA 单链标记荧光，若给探针标记荧光，则无法区分与待测DNA 单链结合的不
同探针，B 错误；
C、若不洗去未与探针结合的待测DNA 分子，会干扰对与探针结合的待测DNA 分子的荧光检测，所以应
洗去未结合的，C 正确；
D 、根据图示，待测DNA 单链可以与1~5 探针结合，1~5 探针的碱基序列连在一起是5'-
ATACGTTAGATC-3'，待测序列为5'-GATCTAACGTAT-3'，D 正确。
故选B。
13．（2025·湖南长沙·一模）科学家通过蛋白质工程改造绿色荧光蛋白（GFP）的氨基酸序列，成功开发
出能发出不同颜色的荧光蛋白。荧光蛋白的荧光颜色主要由其核心生色团决定，非生色团区域的改变一般
不改变光谱特性。下列叙述中正确的是（ ）
A．改变GFP 的氨基酸种类或数目必然会导致荧光颜色发生变化
B．荧光蛋白的荧光颜色差异的直接原因是控制其合成的基因碱基序列不同
C．若在GFP 氨基酸序列的中间插入一个氨基酸，肽键数目会增加1 个
D．改造GFP 的过程需破坏氨基酸之间的肽键以替换特定氨基酸
【答案】C
【详解】A、改变氨基酸种类或数目若发生在非生色团区域，可能不会影响荧光颜色，A 错误；
B、荧光颜色差异的直接原因是荧光蛋白结构不同，而基因碱基序列不同是根本原因，B 错误；
C、插入一个氨基酸会增加1 个肽键，原肽链有n 个氨基酸时含n-1 个肽键，插入后变为n+1 个氨基酸，肽
键数为n，增加1 个，C 正确；
D、蛋白质工程通过修改基因指导新蛋白质合成，而非直接破坏肽键，D 错误。
故选C。
14．（2025·湖南株洲·一模）杂交作物的优势性状无法很好地传递到下一代。研究团队以拟南芥为材料，
敲除AtOSD1等3 个与减数分裂有关的基因和AtDMP8 等2 个与受精过程有关的基因得到突变体1。突变体
1 以类似有丝分裂的方式产生克隆卵细胞，克隆卵细胞无法正常受精，最终形成克隆种子和后代。下列说
法错误的是（ ）
A．杂种优势不能保存的原因是子代发生性状分离
B．AtOSD1 基因可能与着丝粒的分裂有关
C．AtDMP8 可能与卵细胞识别精子有关
D．可用PCR 技术检验基因敲除是否成功
【答案】B
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【分析】PCR 技术是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA 复制的各种组分与反应条件，
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【详解】A、杂种自交，后代会发生性状分离，所以杂种优势不能保存，A 正确；
B、AtOSD1 基因与减数分裂分裂有关，突变体1 仍可以进行有丝分裂，故AtOSD1 基因可能减数分裂过程
中的同源染色体的分离有关，而与着丝点的分裂无关，B 错误；
C、AtDMP8 基因与受精作用有关，受精作用的过程涉及精子和卵细胞间的识别，C 正确；
D、通过设计特异性引物，PCR 可以检测目标基因是否成功被敲除。正常情况下，目标基因的PCR 产物会
消失或出现明显的变化，这通常意味着敲除是成功的，D 正确。
故选B。
15．（以FSHD 为情境）（2025·湖南·二模）FSHD 是由于DUX4 基因突变产生对骨骼肌有毒的
DUX4 蛋白而导致的神经肌肉疾病，研究者尝试将如下表达载体导入患病组织，从而达到抑制DUX4 基因
表达的目的。下列说法正确的是（ ）
A．利用PCR 技术获取目的基因，需要DNA 聚合酶和DNA 连接酶
B．利用图中质粒和DUX4 基因构建表达载体时，应选择的限制酶为BamHⅠ和HindⅢ
C．可采用农杆菌转化法将基因表达载体导入患病组织
D．获取受体细胞的mRNA 经逆转录获得DNA 后，利用DUX4 基因序列制备的引物进行PCR 可检测
表达载体是否构建成功
【答案】B
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、利用PCR 技术获取目的基因，需要DNA 聚合酶，不需要DNA 连接酶，A 错误；
B、DUX4 的反义基因与DUX4 基因的碱基序列相同，但转录的模板链不同，因此DUX4 的反义基因的模
板链为DUX4 基因的编码链，子链延伸的方向是5'→3'，因此DUX4 基因右侧连接启动子，左侧连接终止
子，构建DUX4 反义基因表达载体，选用的限制酶为HindⅢ和BamHⅠ，B 正确；
C、当受体细胞为动物时应选用显微注射法，C 错误；
D、由于DUX4 的反义基因与DUX4 基因的碱基序列相同，两者转录的模板不同，但形成的mRNA 序列互
补，经逆转录获得的双链DNA 相同，因此不能检测表达载体是否构建成功，D 错误。
故选B。
1．（2025·黑吉辽蒙卷·高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母
菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
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(1)可从 中查询基因N 的编码序列，设计特定引物。如图1 所示，a 链为转录模板链，为保证基因
N 与质粒pYL 正确连接，需在引物1 和引物2 的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR
扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA 片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb 为千碱基
对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL 对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒，以1-4 号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1 和引物2 进行PCR 扩增，电泳
PCR 产物，结果如图2。在第5 组的PCR 反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR
反应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因
N，理由是 。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240 位脯氨酸或第243 位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨
酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA 等。a 是诱变第240 位脯氨酸编码序列的引物（GCA 为诱变序列），
b、c、d 其中一条是诱变第243 位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a 的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的
密码子除GCA 外，还有 。
a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3'
b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3'
c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3'
d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3'
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改
造方案。
【答案】(1) 基因数据库/序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶
(2) 外源DNA 1 目的基因N 大小为2.3kb
(3)GCC
(4)香树脂醇
【分析】PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷酸
为原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子
链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要
原因是DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。PCR 反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】（1）GenBank 是目前国际上广泛使用 的序列数据库之一，它的数据主要是各国的 实验室、测
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序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序
列数据库或基因数据库中查询基因N 的编码序列，设计特定引物。保证基因N 与质粒pYL 正确连接，需
要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目
的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1 可知，质粒pYL 应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶
切，由于目的基因N 含有Spe Ⅰ识别序列，故N 基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末
端，基因N 酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N 基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；题干信息：N
基因a 链为转录模板链，才有引物1 和引物2 扩增N 基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1 序列，而编
码链的5'端含有引物2 序列，结合质粒pYL 上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2 需要5'端添加
Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xho Ⅰ识别序列。PCR 扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA 连接酶连接DNA 片
段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb 为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL 对应部分大小基
本不变。
（2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb 为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL 对应部分大小基
本不变，而质粒pYL 本身7.2kb，可知目的基因N 大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1 的质
粒中成功插入了基因N。在第5 组的PCR 反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR
反应体系是否存在污染，即检验PCR 反应中是否有外源DNA 污染。
（3）编码第240 位脯氨酸或第243 位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子
有GCA；密码子位于mRNA 上，mRNA 上的序列与编码链序列相似，而a 是诱变第240 位脯氨酸编码序列
的引物（GCA 为诱变序列），可知a 引物延伸后的序列为编码链；b、c、d 其中一条是诱变第243 位苯丙
氨酸的引物，其配对模板与a 的配对模板相同，分析题图bcd 序列可知c 是诱变第243 位苯丙氨酸的引物，
且c 引物延伸后的序列为编码链，根据a 引物5'-端首位GCA 为240 位，则c 引物5'-端GCC 为243 位，故
据此分析，丙氨酸的密码子除GCA 外，还有GCC。
（4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进
一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方
案。
2．（2025·浙江·高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母
菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1 次
PCR 扩增出该基因的中间部分，再通过第2 次PCR 分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，
如图所示，回答下列问题：
(1)分析不同物种的GPD 蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的
，确定DNA 序列，进而设计1 对引物。以该菌株基因组DNA 为模板进行第1 次PCR，利用 凝胶
电泳分离并纯化DNA 片段，进一步测定PCR 产物的序列。在制备PCR 反应体系时，每次用微量移液器吸
取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 。
(2)若在上述PCR 扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是
__________。
A．DNA 模板被其他酵母细胞的基因组DNA 污染
B．每个引物与DNA 模板存在2 个配对结合位点
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C．在基因组中Gpd 基因有2 个拷贝
D．在基因组中存在1 个与Gpd 基因序列高度相似的其他基因
(3)为获得完整的Gpd 基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA 后，各自用DNA 连接
酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入 沉淀环形DNA。根据第一次PCR
产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA 为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第
二次PCR 的一对引物，其序列应是DNA 链上的 （A．P1 和P2 B．P3 和P4 C．P1 和P4 D．P2
和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd 基因序列，其中的启动子和终止子具有 功能。
(4)为确定克隆获得的Gpd 基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 进行比对。将Gpd 基
因的编码区与 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用
酿酒酵母高效合成甘油的目的。
【答案】(1) 密码子/遗传密码 琼脂糖 更换微量移液器的枪头
(2)C
(3) 预冷的体积分数为95%的酒精 C 调控
(4) 基因数据库/序列数据库 表达载体
【分析】基因工程技术的基本步骤：(1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成。(2) 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子、复制原点和标记基因等。(3) 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一
样。 将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物
细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4) 目的基因的检
测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；
②检测目 的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质一抗原-抗体杂交
技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）分析不同物种的GPD 蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应
的密码子，根据碱基互补配对，确定DNA 序列，进而设计1 对引物。可通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化
目标DNA 片段。在制备PCR 反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要更换微量移液器的枪
头，以避免交叉污染。
（2）A、DNA 模板被其他酵母细胞的基因组DNA 污染，可能扩增出其他DNA，从而出现另外一条条带，
A 不符合题意；
B、每个引物与DNA 模板存在2 个配对结合位点，从而扩增出不同的DNA 片段，从而出现另外一条条带，
B 不符合题意；
C、在基因组中Gpd 基因有2 个拷贝，扩增出的DNA 是相同DNA，电泳时只会出现一个条带，C 符合题
意；
D、在基因组中存在1 个与Gpd 基因序列高度相似的其他基因，可能将相似的基因扩增出来，从而出现另
外一条条带，D 不符合题意。
故选C。
（3）DNA 在冷的95%乙醇中溶解度较低，可通过将酶切后的DNA 经苯酚-氯仿抽提除去杂质，在加入冷
的95%乙醇中沉淀，得到环形DNA。因为引物P1 与P2 的序列从左向右为3’→5’，与图中上边的DNA 链
部分序互补配对，引物P3 与P4 的序列从左向右为5’→3’，与图中下边的DNA 链部分序互补配对。 以环
形DNA 为模板进行第二次PCR 时，应选择对已知序列反向，但对未知序列却是相向的引物，即P1 和
P4，从而得以扩增出未知序列。启动子可启动转录，终止子可终止转录，即启动子和终止子具有调控功能。
（4）为确定克隆获得的Gpd 基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的基因数据库进行对比，若二
者相同，则说明克隆获得的Gpd 基因准确。将Gpd 基因的编码区与表达载体连接，构建重组质粒，再将重
组质粒导入酿酒酵母细胞中，使之进行表达，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。
3．（2025·河北·高考真题）T-DNA 插入失活是研究植物基因功能的常用方法，研究者将带有卡那霉素抗性
基因的T-DNA 插入拟南芥2 号染色体的A 基因内，使其突变为丧失功能的a 基因，花粉中A 基因功能的缺
失会造成其不育。回答下列问题：
(1)基因内碱基的增添、缺失或 都可导致基因突变。
(2)以Aa 植株为 （填“父本”或“母本”）与野生型拟南芥杂交，F1中卡那霉素抗性植株的占比为
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0，其反交的F1中卡那霉素抗性植株的占比为 。
(3)为进一步验证基因A 的功能，将另一个A 基因插入Aa 植株的3 号染色体。仅考虑基因A 和a，该植株
会产生 种基因型的可育花粉，其中具有a 基因的花粉占比为 。该植株自交得到F1。利用图1 所示
引物P1 和P2、P1 和P3 分别对F1进行PCR 检测，电泳结果如图2 所示。根据电泳结果F1植株分为Ⅰ型和
Ⅱ型，其中Ⅰ型植株占比为 。F1中没有检测到仅扩增出600bp 条带的植株，其原因为 。
(4)实验中还获得了一个E 基因被T-DNA 插入突变为e 基因的植株，e 基因纯合的种子不能正常发育而退化。
为分析基因E/e 和A/a 在染色体上的位置关系，进行下列实验：
①利用基因型为AaEE 和AAEe 的植株进行杂交，筛选出基因型为 的F1植株。
②选出的F1植株自交获得F2．不考虑其他突变，若F2植株中花粉和自交所结种子均发育正常的植株占比为
0，E/e 和A/a 在染色体上的位置关系及染色体交换情况为 ；若两对基因位于非同源染色体，该类植株
的占比为 。除了上述两种占比，分析该类植株还可能的其他占比和原因： 。
【答案】(1)替换
(2) 父本 1/2
(3) 3 1/3 2/3 a 花粉不育，无法形成纯合aa 植株
(4) AaEe E/e 和A/a 连锁且无交换，F₂ 中无同时含A 和E 的配子 1/6 若基因连锁但发生
交换，正常植株占比介于0～1/6
【分析】自由组合定律的实质：控制不同性状的遗传因子的分离和组合是互不干扰的；在形成配子时，决
定同一性状的成对的遗传因子彼此分离，决定不同性状的遗传因子自由组合。
【详解】（1）基因突变是指DNA 分子上碱基对增添、缺失或替换引起基因结构的改变。基因内碱基的增
添、缺失或替换都可导致基因突变。
（2）据题分析可知，带有卡那霉素抗性基因的T-DNA 插入拟南芥2 号染色体的A 基因内，使其突变为丧
失功能的a 基因，花粉中A 基因功能缺失（a 基因）会导致不育，因此Aa 植株作为父本时，其含a 基因花
粉不育，无法参与受精，仅产生含A 基因的花粉，故以Aa 植株为父本与野生型（AA）拟南芥杂交，F1
（AA）中卡那霉素抗性植株的占比为0；若Aa 植株作为母本，其卵细胞可育（含a 基因），而野生型父
本花粉（含A 基因）可育，F1 基因型为Aa（抗性）和AA（非抗性），比例为1：1，因此卡那霉素抗性
植株占比为1/2。
（3）为进一步验证基因A 的功能，将另一个A 基因插入Aa 植株的3 号染色体。仅考虑基因A 和a，插入
A 基因后，植株基因型为Aa（2 号染色体为Aa，3 号染色体为A0）。该植株会产生4 种基因型的花粉，即
AA、A0、Aa、a0，其中a 不育，即产生3 种可育基因型的花粉，而具有a 基因的花粉占比为1/3。该植株
雌配子即AA、A0、Aa、a0，均可育，其自交得到F1，利用棋盘法可知，F1 的基因型为AAAA：AAA0：
AA00：AAAa：AAa0：AAaa：Aa00：Aa00=1 2 1 2 3 1 1 1
∶∶∶∶∶∶∶。利用图1 所示引物P1 和P2、P1 和P3 分别对
F1 进行PCR 检测，电泳结果如图2 所示。根据电泳结果F1 植株分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型（含A、a）：PCR
扩增出900bp（A）和600bp（a）条带。Ⅱ型（仅含A）：仅扩增出900bp 条带。其中Ⅰ型植株占比为
（2+3+1+1+1）/（1+2+1+2+3+1+1+1）=2/3。F1 中没有检测到仅扩增出600bp 条带的植株，其原因为a 花
粉不育，无法形成纯合aa 植株。
（4）①利用基因型为AaEE 和AAEe 的植株进行杂交，筛选出F1 中AaEe 植株（双杂合）。若E/e 和A/a
连锁且无交换，F2 中无同时含A 和E 的配子（花粉或种子致死），正常植株占比为0。若两基因独立遗传
（非同源染色体），F1 植株（AaEe）产生雌配子为AE：Ae：aE：ae=1：1：1：1，均可育，而雄配子
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AE：Ae=1；1，aE 和ae 不可育，利用棋盘法可知，F2 为AAEE：AAEe：AaEE：AaEe=1：2：1：2，其中
只有AAEE 的花粉和自交所结种子均发育正常，即正常植株（AAEE）占比为1/6。其他可能：若基因连锁
但发生交换，正常植株占比介于0～1/6。
4．（2025·江苏·高考真题）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展
了以下研究。请回答下列问题：
(1)川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有 。川金丝猴的警
戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有 。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以
降低被捕食风险，另一方面为争夺 获得更多机会。
(2)川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成
关系。
(3)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA 提取、扩增，部分实验过程如下。
请完成下表：
实验目的
简要操作步骤
释放DNA
在去杂后的样本中加入裂解液
析出DNA
离心后取① ，加入乙醇
②
在沉淀物中加入纯水
扩增DNA
将③ 、引物、样本DNA、含有Mg²⁺缓冲
液、超纯水等加入PCR 管中，进行PCR
(4)为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F 和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的
rbeL 基因片段，是因为引物F 和R 的碱基能与rbcL 基因的保守序列的碱基 。用引物F 和R 对4 种植
物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA 进行扩增测序，结果如图所示。若对4 个样本的扩增产物进行DNA 电
泳条带分析，能检出的样本是 。研究者用引物F 和R 对川金丝猴粪便DNA 进行扩增并测序，得到
的序列有图中的3 种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有 。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的
植物，参照叶绿体基因库，还需选用 的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA 进行扩增、测序
分析。
注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基：“……”表示省略200 个碱基
(5)依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有 （填字母）。
a．建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流
b．保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物
c．需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量
d．主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量
【答案】(1) 捕食和种内竞争 物理信息、化学信息、行为信息 食物和空间、配偶等
(2)互利共生
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(3) 上清液 溶解DNA 4 种脱氧核苷酸、耐高温的DNA 聚合酶
(4) 互补配对 丁 丙丁 叶绿体基因组其他DNA 片段
(5)ab
【分析】生态系统中信息的种类(1)物理信息：生态系统中的光、声、温度、湿度、磁力等，通过物理过程
传递的信息，如蜘蛛网的振动频率；(2)化学信息：生物在生命活动中，产生了一些可以传递信息的化学物
质，如植物的生物碱、有机酸，动物的性外激素等；(3)行为信息：动物的特殊行为，对于同种或异种生物
也能够传递某种信息，如孔雀开屏。
【详解】（1）捕食者与川金丝猴是捕食关系，川金丝猴和同种个体之间是种内竞争关系。生态系统中信
息的种类有物理信息、化学信息和行为信息。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕
食风险，另一方面为争夺食物和空间等资源获得更多机会。
（2）川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物从川金丝猴胃
内获取营养物质，又能为川金丝猴分解纤维素，两者构成互利共生关系。
（3）研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA 提取、扩增，部分实验过程如
下：释放DNA：在去杂后的样本中加入裂解液，细胞裂解，内容物释放，→析出DNA：DNA 呈溶解状态，
离心后取①上清液，再加入乙醇，DNA 不溶于酒精→故在沉淀物中加入纯水，②再次溶解DNA→扩增
DNA：PCR 扩增DNA，需要将③4 种脱氧核苷酸、耐高温的DNA 聚合酶、引物、样本DNA、含有Mg²⁺
缓冲 液、超纯水等加入PCR 管中，进行PCR。
（4）为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F 和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的
rbeL 基因片段，是因为引物F 和R 的碱基能与rbeL 基因的保守序列的碱基互补配对，从而在耐高温的
DNA 聚合酶的作用下延伸子链。用引物F 和R 对4 种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA 进行扩增测序，
结果如图所示，可知植物甲乙丙的条带一样长，植物丁的短，对4 个样本的扩增产物进行DNA 电泳条带
分析，只能区分不同长度的DNA 片段，故能检出的样本是丁。研究者用引物F 和R 对川金丝猴粪便DNA
进行扩增并测序，得到的序列有图中的3 种序列，说明摄食的植物有三种，甲和乙的序列相同，不能确定，
故据此可确定川金丝猴摄食的植物有丙和丁。选用叶绿体的其他基因的保守序列设计引物，对川金丝猴粪
便DNA 进行扩增、测序分析，能更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物。
（5） a、建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流，能够保护川金丝猴遗传多样性和物种多样性，a
正确；
b、保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物，能够保护川金丝猴，b 正确；
c、川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，不能用标记重捕法定期重捕，c 错误；
d、保护川金丝猴主要依赖就地保护，d 错误。
故选ab。
5．（2025·安徽·高考真题）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科
研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。
(1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用 （填方法）将研磨
液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是 。
(2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R 基因是
合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R 基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆
R 基因的上游片段R-U 和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA 片段
中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1 所示。
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采用PCR 技术鉴定R 基因的敲除结果。PCR 通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的
。R 基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR 检测结果如图2 所示，其中R 基因敲除株为
菌落 （填序号），出现菌落④的可能原因是 。
(3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利
用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路 。
【答案】(1) 稀释涂布平板法 分离不同条件下生长的内生放线菌
(2) 指数级扩增 ② 重组质粒通过（单交换）同源重组整合到了内生放线菌的基因组中
(3)
设置两组培养实验：对照组在低（或常规）铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。
在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，
观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制圈大小）。若高铁组的抑制效果明显
弱于低铁组，则支持该推测。
【分析】基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用同源DNA 片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除
的目的，由此可见，基因敲除可定向改变生物体的某一基因。基因敲除既可以是用突变基因或其它基因敲
除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。
【详解】（1） 从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌落，并接种到选择培养基中常用的接种方法是
稀释涂布平板法。使用选择培养基和不同的温度条件，目的是为了抑制其他杂菌的生长，分离不同条件下
生长的内生放线菌。
（2）PCR 技术的核心原理是通过多次循环（变性、复性、延伸），使目标DNA 片段的数量以指数形式快
速增加，实现体外扩增。PCR 鉴定是利用引物1 和引物2 进行的。 在野生型菌株中，引物1 和引物2 之间
的DNA 片段长度为 R-U (500bp) + R 基因 (2000bp) + R-D (500bp) = 3000 bp。对应图2 中的菌落①和③。
在成功发生双交换的R 基因敲除株中，R 基因(2000bp)被替换，引物1 和引物2 之间的DNA 片段长度为
R-U (500bp) + R-D (500bp) = 1000 bp。对应图2 中的菌落②。 菌落④的PCR 产物大小约为7000 bp。这个
大小可以通过以下方式解释：发生了单交换同源重组事件。整个重组质粒（大小为3000bp 质粒骨架 +
500bp R-U + 500bp R-D = 4000bp）整合到了基因组中。整合后，引物1 和引物2 之间的区域长度变为原来
的长度(3000bp)加上整个质粒的长度(4000bp)，即 3000 + 4000 = 7000 bp。因此，这是单交换同源重组整合
的结果。
（3）设置两组培养实验：一组为对照组，在常规（或低铁）浓度的培养基上进行；另一组为实验组，在
添加了足量铁离子的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相
同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况（如菌落大小或抑制
圈大小）。预期结果与结论： 如果实验组（高铁培养基）中内生放线菌对稻瘟病致病菌的抑制作用明显
减弱或消失，而对照组（低铁培养基）中抑制作用明显，则说明该内生放线菌是通过竞争铁离子来抑制稻
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瘟病致病菌生长的。
6．（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti 质粒的改造，利用农杆菌转化法
将Ti 质粒上的T-DNA 随机整合到小麦基因组中，筛选到2 个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。
与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1)Ti 质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI 对抗除草剂基因X 进行完
全酶切，再选择SmaI 和 对Ti 质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。
利用DNA 连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X 的片段与酶切并补平的Ti 质粒进行连接，构建重组载体，
转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果
呈现一长一短2 条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是由于T-DNA 插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后
产生含有T-DNA 的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR 难以扩增大片段DNA，最好使
用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA 中应不含该酶的酶切位点。需首先
将图乙的片段 ，才能利用引物P1 和P2 成功扩增未知序列。PCR 扩增出未知序列后，进行了一系列
操作，其中可以判断出2 条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或
“测序和序列比对”）。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，
（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。
【答案】(1) 复制原点 XbaI DNA 聚合酶 SmaI 和SpeI 550bp
(2) 4 环化 测序和序列比对
(3)不能
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等；
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（3）将目的基因导入受体细胞；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--
DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋
白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）DNA 复制的起点是复制原点，因此Ti 质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制
原点。根据SmaI 限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI 酶切，抗除草剂基因和质
粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需
要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为该限制酶
会破坏终止子，因此可选择XbaI 和SmaI 进行酶切，XbaI 酶切会形成黏性末端，需要用DNA 聚合酶聚合
脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI 酶切后产生的黏性末端无法用
DNA 聚合酶抹平，因为DNA 聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA 连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因
X 的片段与酶切并补平的Ti 质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA 片段上含有一
个SmaI 酶切位点和一个SpeI 酶切位点，可以选择用SmaI 和SpeI 进行酶切，转录的方向是从模板的
3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2 条带，较短的条带长度近似为
550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。
（2）由于后续PCR 难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4 个碱基的限制酶，原因是识别序列
越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR 扩增。由于引物是根据已知序列设
计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。
为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序
列比对。
（3）突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野
生型。
7．（2025·陕晋青宁卷·高考真题）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。
我国科研人员发现，野生马铃薯中S 基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显
著增强其抗寒能力。回答下列问题。
(1)PCR 扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、 、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA 聚合酶。
DNA 聚合酶在PCR 的 步骤中起作用。
(2)图中标识了载体和S 基因中限制酶的切割位点。为将S 基因正确插入载体，PCR 扩增S 基因时需在引物
的 （填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是
5'- -3'，切割载体时应选用的两种限制酶是 ，PCR 扩增产物和载体分别被限制酶切割后，
经纯化和连接，获得含S 基因的表达载体并导入农杆菌。
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(3)用携带S 基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA 进入愈伤组织细胞，将S
基因整合到 ，抗性基因 可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经 形成芽、
根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
【答案】(1) 4 种脱氧核苷酸 延伸
(2) 5'端 AGATCT BamHⅠ、EcoRⅠ
(3) 栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上 2 再分化
【分析】1、基因工程的步骤：目的基因的提取、目的基因与运载体结合、目的基因导入受体细胞、目的
基因的检测与鉴定。
2、对限制酶选择条件：不能破坏目的基因和启动子、终止子，以便于目的基因和载体正确连接。
【详解】（1）PCR 扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、4 种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温
的DNA 聚合酶。PCR 一般分为变性、复性和延伸三步，其中DNA 聚合酶在PCR 的延伸步骤中起作用。
（2）为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。结
合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BamH I、EcoR I 和Xba I 的识别序列，而S 基因内部含有
Xba I、Nde I 和BamH I 的识别序列，要用BamH I、EcoR I 或Xba I 切割载体，又不能用Xba I、Nde I 或
BamH I 切割S 基因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知，需要用BamH I、EcoR I 切割载体，
用BamH I 的同尾酶Bgl Ⅱ和EcoR I 切割S 基因，故PCR 扩增S 基因时需在上游引物添加的碱基序列是5'-
AGATCT-3'。
（3）T-DNA 属于可转移DNA，用携带S 基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-
DNA 进入愈伤组织细胞，将S 基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上，抗性基因1 位于T-DNA
外部，用于筛选含有重组载体的农杆菌，而抗性基因2 位于T-DNA 内部，可用于筛选成功转化的愈伤组织。
该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
8．（2025·湖南·高考真题）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA 病毒，可引起急性猪传染病。基因A 编码该病
毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题：
(1)制备特定抗原
①获取基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制
酶切割位点、标记基因、启动子和 等；为确定基因A 已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中
的一对引物 对待测质粒进行PCR 扩增，预期扩增产物的片段大小为 bp。
②将DNA 测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A 合成。收集重组菌发
酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是 （答出两点即可）。
(2)制备抗蛋白A 单克隆抗体
用蛋白A 对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有
（答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和 ，多次筛选获得足够数量的能分
泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A 单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。
【答案】(1) 终止子、复制原点 P1 和 P3 782 重组菌没有裂解或没有将蛋白A 释放到
细胞外、转速过高使蛋白A 发生沉淀、蛋白A 亲水性较差发生沉淀、蛋白A 被大肠杆菌的蛋白酶降解
(2) 聚乙二醇（PEG）融合法（或灭活病毒诱导法、电融合法） 抗体检测
【分析】1 基因工程的操作步骤：（1）目的基因的选与获取：从基因文库中获取目的基因、利用PCR 技
术获取和扩增目的基因、化学方法直接合成目的基因。（2）基因表达载体的构建：基因表达载体是载体
的一种，除目的基因、标记基因外，它还必须有启动子、终止子(terminator 等，这是基因工程的核心步骤。
（3）将目的基因导入受体细胞：构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。（4）目
的基因的检测与鉴定。首先是分子水平的检测，包括通过PCR 等技术检测受体细胞的染色体DNA 上是否
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插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；从转基因生物细胞中提取蛋白质，用相应的抗体进
行抗原一抗体杂交，检测目的基因是否翻译成相应的蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。
【详解】（1）重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和终止子，复制
原点等，终止子能终止转录过程。 要确定基因 A 已连接到质粒中且插入方向正确，应选用引物 P1 和
P3。因为 P1 与基因 A 下游的非编码区互补配对，P3 与基因 A 上游且靠近启动子的区域互补配对，这
样扩增的片段大小为200+582=782bp。
将 DNA 测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌，培养后上清液中无蛋白 A，可能的原因有：重组
菌没有裂解或没有将蛋白A 释放到细胞外，转速过高使蛋白A 发生沉淀，蛋白A 亲水性较差发生沉淀，蛋
白A 被大肠杆菌的蛋白酶降解。
（2）①诱导动物细胞融合的常用方法有聚乙二醇（PEG）融合法、灭活病毒诱导法、电融合法等，这里答
出其中一种即可，比如聚乙二醇（PEG）融合法。
②选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细
胞。
9．（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两
个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段
的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2 为模式蛋白。测试质粒功能。
回答下列问题：
(1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA 短肽的mKate2，将质粒导入感受态细
胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR 及 检测，筛选
获得重组菌株W1。
(2)将W1 在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 （答一种）。接种
前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强
度快速下降，原因是 。
(3)研究者选用启动子PX、X 基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入
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野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2 的生长趋势不变，培养期间荧光强度的
变化趋势为 。
(4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A 活性弱，且
莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在
生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提
出重组生产菌株构建思路： 。
【答案】(1)荧光
(2) 稀释涂布平板法、显微镜直接计数法 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰 PGro 在生
长稳定期停止基因转录，且带有SsrA 短肽的mKate2 被降解
(3)快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定
(4)先敲除野生菌株中的酶B 基因，再将质粒①中的mKate2 基因替换为酶B 基因，将质粒②中的mKate2 基
因替换为酶A 基因，并将两种质粒导入野生菌株中
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术
扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启
动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
2、引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA 聚合酶能够从引
物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR 的引物长度通常为20—30 个核苷酸。
3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA 片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA 聚合
酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
【详解】（1）在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，根据质粒中存在红色荧光蛋
白基因，可利用荧光检测，筛选获得重组菌株W1。
（2）检测培养液中细胞密度常用的方法有稀释涂布平板法（通过统计平板上的菌落数来估算细胞数量，
进而得到细胞密度）、显微镜直接计数法（利用血细胞计数板在显微镜下直接对细胞进行计数）。接种前
检测液体培养基的荧光强度，是为了排除培养基本身荧光对实验结果的干扰，作为空白对照。进入生长稳
定期后，由于PGro 在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA 短肽的mKate2，同时C-末端带
有SsrA 短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。
（3）在重组菌株W2 中，启动子PX 被阻遏蛋白X 阻遏转录。在细胞快速生长阶段，阻遏蛋白X 阻遏
mKate2 基因的表达；随着细胞进入生长稳定器，阻遏蛋白X 停止表达并被降解，对PX 启动子的阻遏作用
降低，mKate2 基因开始表达，荧光强度开始上升，由于原料的限制，最后保持稳定，所以培养期间荧光强
度的变化趋势为快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定 。
（4）为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，
结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除
酶B 基因；然后将质粒①中的mKate2 基因替换为酶B 基因，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表
达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后该酶降解，减少对莽草酸的转化；同时将质粒②中的mKate2
基因替换为酶A 基因，利用其调控机制在生长稳定期实现莽草酸合成相关基因的稳定表达，从而大量积累
莽草酸，最后将两种质粒导入野生菌株。
10．（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应
用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下
列问题：
(1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是 。将培养后的菌液混匀并充分 ，再接
种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG 活性最高的菌种。
(2)为构建携带cg（CG 的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg 的PCR 扩增产物和质粒进行双酶
切，随后用E.coliDNA 连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg 转录模板链的5'端最好含有 酶切
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位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA 连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒
分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是 。
限制酶的识别序列和切割位点如下：
(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 ，随后在含
和 的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
(4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG 的耐热性，研究
人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2
所示。根据分析结果，选择第 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是 。
【答案】(1) 在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释
(2) BamHI 重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列
(3) 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态 卡拉胶 四环素
(4) 44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功
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能的影响较小
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的
基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉
胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大，因此可选择海藻和海
泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得
了CG 活性最高的菌种。
（2）E.coliDNA 连接酶只能连接具有黏性末端的片段，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的
限制酶，即不能选择EcoRV 酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与
XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连、甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只
能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA 形
成的方向是5’→3’，且mRNA 与DNA 的模板链方向相反，因此基因模板链的3’应靠近启动子，故为保证
连接准确性和效率，cg 转录模板链的5'端最好含有BamHI 酶切位点。T4DNA 连接酶既可以连接平末端，
也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4DNA 连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连
接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合
进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA 连接酶重复上述实验，获得的部分重
组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是重组质粒连
接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。
（3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是使细胞处于一种能
吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，便于重组DNA 进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶（CG）
的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因
的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目
的菌株。
（4）据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44 位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容
易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44 位的氨基酸替换成半胱氨酸最
合适。
11．（2025·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）~（4）题。
野生动物个体识别的新方法
识别野生动物个体有助于野外生态学的研究。近年，人们发现可以从动物粪便中提取该动物的DNA，PCR
扩增特定的DNA 片段，测定产物的长度或序列，据此可识别个体，在此基础上可以获得野生动物的多种
生态学信息。
微卫星DNA 是一种常用于个体识别的DNA 片段，广泛分布于核基因组中。每个微卫星DNA 是一段串联
重复序列，每个重复单位长度为2~6bp（碱基对），重复数可以达到几十个（图1）．基因组中有很多个微
卫星DNA，分布在不同位置。每个位置的微卫星DNA 可视为一个“基因”，由于重复单位的数目不同，
同一位置的微卫星“基因”可以有多个“等位基因”，能组成多种“基因型”．分析多个微卫星“基因”，
可得到个体特异的“基因型”组合，由此区分开不同的个体。
依据微卫星“基因”两侧的旁邻序列（图1），设计并合成特异性引物，PCR 扩增后，检测扩增片段长度，
即可得知所测个体的“等位基因”（以片段长度命名），进而获得该个体的“基因型”。例如，图2 是对
某种哺乳动物个体A 和B 的一个微卫星“基因”进行扩增后电泳分析的结果示意图，个体A 的“基因型”
为177/183。
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有一个远离大陆的孤岛，陆生哺乳动物几乎无法到达，人类活动将食肉动物貉带到该岛上。科学家在岛上
采集貉的新鲜粪便，提取DNA，扩增并分析了10 个微卫星“基因”，结果在30 份样品中成功鉴定出个体
（如表）。几个月后再次采集貉的新鲜粪便，进行同样的分析，在40 份样品中成功鉴定出个体（如表）。
据此，科学家估算出该岛上貉的种群数量。
两次采样所鉴定出的貉的个体编号
第一次采集的30 份粪便样品所对应的个体编号
N0
1
N0
2
N0
3
N0
4
N0
5
N0
6
N0
7
N0
8
N0
8
N0
9
N1
0
N1
1
N1
2
N1
2
N1
3
N1
4
N1
4
N1
5
N1
6
N1
7
N1
8
N1
8
N1
9
N2
0
N2
1
N2
2
N2
2
N2
3
N2
4
N2
4
第二次采集的40 份粪便样品所对应的个体编号
N0
3
N0
4
N0
5
N0
8
N0
9
N0
9
N1
2
N1
4
N1
8
N2
3
N2
4
N2
5
N2
6
N2
6
N2
6
N2
7
N2
8
N2
9
N3
0
N3
0
N3
1
N3
2
N3
2
N3
3
N3
3
N3
3
N3
4
N3
5
N3
6
N3
7
N3
8
N3
9
N4
0
N4
1
N4
2
N4
3
N4
4
N4
4
N4
5
N4
6
(1)图2 中个体B 的“基因型”为 。
(2)使用微卫星DNA 鉴定个体时，能区分的个体数是由微卫星“基因”的数目和 的数目决定的。
(3)科学家根据表1 信息，使用了 法的原理来估算这个岛上貉的种群数量，计算过程及结果为 。
(4)在上述研究基础上，利用现有DNA 样品，设计一个实验方案，了解该岛貉种群的性别比例 。
【答案】(1)174/174
(2)重复单位
(3) 标记重捕 根据标记重捕法的计算公式N= （M×n ）/m ，则该岛上豹的种群数
量N=(24×32)/10≈77（只）。
(4)从现有 DNA 样品中，选择 Y 染色体上特有的微卫星 DNA 序列，设计特异性引物；对所有 DNA 样
品进行 PCR 扩增；对扩增产物进行电泳分析，若能扩增出相应条带，则该个体为雄性，若不能扩增出相
应条带，则该个体为雌性；统计雄性和雌性个体的数量，从而计算出该岛豹种群的性别比例。
【分析】标记重捕法是一种用于估算动物种群数量的常用方法。其原理是在被调查种群的活动范围内，捕
获一部分个体，做上标记后再放回原来的环境，经过一段时间后进行重捕，根据重捕到的动物中标记个体
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数占总个体数的比例，来估计种群密度。标记重捕法适用于活动能力强、活动范围大的动物，使用时需要
满足一定条件，比如标记个体与未标记个体在重捕时被捕获的概率相等，在调查期间没有个体迁入、迁出、
出生、死亡等。
【详解】（1）从图 2 中可知，个体 B 扩增后的电泳条带对应的片段只有长度为 174 ，根据 “以片段
长度命名” 等位基因进而确定基因型的规则，个体 B 的 “基因型” 为 174/174。
（2）根据题干信息 “每个位置的微卫星 DNA 可视为一个‘基因’，由于重复单位的数目不同，同一位
置的微卫星‘基因’可以有多个‘等位基因’，能组成多种‘基因型’，分析多个微卫星‘基因’，可得
到个体特异的‘基因型’组合，由此区分开不同的个体” 可知，使用微卫星 DNA 鉴定个体时，能区分
的个体数是由微卫星 “基因” 的数目和重复单位的数目决定的。
（3）科学家采用了标记重捕法的原理来估算种群数量。第一次采集 30 份粪便样品鉴定出 24 个不同个
体（相当于标记数M=24），第二次采集 40 份粪便样品鉴定出 32 个不同个体（相当于重捕数n=32），
其中两次都有的个体数为 10 个（相当于重捕中被标记的个体数m=10）。根据标记重捕法的计算公式N=
（M×n）/m，则该岛上豹的种群数量N=(24×32)/10≈77（只）。
（4）从现有 DNA 样品中，选择 Y 染色体上特有的微卫星 DNA 序列，设计特异性引物。 对所有
DNA 样品进行 PCR 扩增。 对扩增产物进行电泳分析，若能扩增出相应条带，则该个体为雄性；若不能
扩增出相应条带，则该个体为雌性。 统计雄性和雌性个体的数量，从而计算出该岛豹种群的性别比例。
12．（2025·四川·高考真题）杆菌M2 合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与
细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA 进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-
lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。
注：①F1、F2、F3 和F4 为与相应位置的DNA 配对的单链引物，“→”指引物5-3 方向。②密码子对应的
氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。
(1)用PCR 技术从杆菌M2 基因组中扩增lrcA-lrcF 目的基因时，应选用 引物。本研究载体使用了链
霉菌的复制原点，其目的是 。
(2)采用EcoRI 和BamHI 完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 条电泳
条带，电泳检测酶切产物的目的是 。
(3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带 （填氨基酸名称）的tRNA 进入结合位点，
导致 ，最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀
菌活性丧失，可能的原因是 。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一
步研究的问题有 （答出1 点即可）。
【答案】(1) F2、F4 保证载体能在链霉菌细胞中能正常复制
(2) 2 验证重组质粒是否构建成功
(3) 苯丙氨酸或phe 翻译受阻
(4) 目的基因发生突变或变异 发酵条件优化
【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术
扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、
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启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不
一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物
细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因
的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子
杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗
原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）引物需要结合到模板的3'端，且与目的基因的部分碱基序列互补配对，子链延伸方向为5'端
→3'端，因此用PCR 技术从杆菌M2 基因组中扩增lrcA-lrcF 目的基因时，应选用F2、F4 引物。载体使用链
霉菌的复制原点，是为了保证载体能在链霉菌细胞中复制，也使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传
给后代。
（2）采用 EcoRI 和 BamHI 完全酶切构建的重组质粒，会得到载体片段和目的基因片段，共 2 条电泳
条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功，若能得到预期的载体片段和目的基因片段
大小的条带，说明酶切成功，重组质粒构建可能成功，但是还需要进一步的鉴定。
（3）观察拉索西丁的作用机制图，结合所给密码子信息，可知拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带苯
丙氨酸的 tRNA 进入结合位点。因为位点 2 对应的密码子是 UUC，编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带
苯丙氨酸的 tRNA 进入结合位点，会导致翻译过程无法正常进行，进而使细菌无法合成蛋白质，最终引起
细菌死亡。
（4）重组链霉菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是目的基因发生
突变或变异，导致其表达的产物结构改变，从而失去杀菌活性；也可能是目的基因的表达受到抑制等。若
运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有：优化发酵条件，如温度、
pH、溶氧量等；如何提高发酵产物的产量；产物的分离和纯化方法等。
13．（2025·云南·高考真题）我国研究人员发明了生产维生素C 的两步发酵法，流程如图甲。为了减少氧
化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，需要进行灭菌以结束第一步发酵。
在两步发酵法的基础上，我国研究人员进一步尝试用三菌混菌体系建立一步发酵法。在氧化葡糖杆菌（原
始菌MCS）中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。MCS 和IR3C 单菌培养时，
活菌数变化曲线如图乙，MCS、IR3C 分别与普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌进行三菌混菌发酵时，
产物含量变化曲线如图丙。
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回答下列问题：
(1)要使基因ccdB 在IR3C 中稳定遗传、表达并发挥作用，构建的基因表达载体除启动子外，还必须有
。
(2)绘制图乙需统计活菌数，常用方法是 。当活菌达到一定数量时，基因
ccdB 编码的蛋白质开始发挥作用，推测该蛋白质的作用是 ，开始发挥作用的时间是
，判断理由是 。
(3)基于图丙，利用IR3C 三菌混菌发酵的产量 （填“高于”或“低于”）MCS 三菌混菌发酵的
产量，其原因是 。
【答案】(1)标记基因、目的基因、终止子、复制原点
(2) 稀释涂布平板法 能抑制细菌增殖 15h 在15h 时，IR3C 数量下降，而MSC 数量上升
(3) 高于 IR3C 转入了ccdB 基因，阻止细胞增殖，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更
多山梨糖被用于合成维生素C。
【分析】基因工程是指按照人类的愿望，将不同生物的遗传物质在体外人工剪切并和载体重组后转入细胞
内进行扩增，并表达产生所需蛋白质的技术，基因工程能够打破种属的界限，在基因水平上改变生物遗传
性，并通过工程化为人类提供有用产品及服务。
【详解】（1）基因工程中构建的基因表达载体，除启动子外、还要有标记基因、目的基因、终止子、复
制原点等。
（2）统计活菌数目常用稀释涂布平板法，从图2 看出，随着时间推移，种群数量不断增加，在15h 时，
IR3C 数量下降，而MSC 数量上升，所以推测转入的基因ccdB 编码的蛋白质诱导能抑制细菌增殖或诱导细
菌凋亡，发挥作用的时间大约在15h。
（3）从图丙看出，IR3C 三菌混菌发酵产生的2-酮-L-古龙酸含量比MSC 三菌混菌发酵产量高，因此可以
推测，IR3C 三菌混菌发酵维生素C 产量更高，可能的原因是IR3C 转入了ccdB 基因，诱导细菌死亡，减
少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C。
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