文档文本内容
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
第45 讲 基因工程以及生物技术的安全性和伦理问题
目录
01 课标达标练
【题型一】基因工程的基本工具
【题型二】基因工程的基本操作程序
【题型三】基因工程的应用、蛋白质工程
02 能力突破练 （新情境+新角度）
03 高考溯源练 （含2025 高考真题）
题型一 基因工程的基本工具
1． MseⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ三种限制酶的识别序列及切割位点分别是GAAT↓TAATTC、C↓TGCAG、
G↓AATTC，下图中图1、图2 中箭头表示相关限制酶的酶切位点。
若要用上图质粒和外源DNA 构建重组质粒，需要对质粒进行改造，构建新的限制酶酶切位点。在构建新
的限制酶酶切位点的过程中需要使用的酶是（ ）
A．限制酶PstⅠ、DNA 连接酶、DNA 聚合酶
B．限制酶EcoRⅠ、DNA 连接酶、DNA 聚合酶
C．限制酶EcoRⅠ、限制酶PstⅠ、DNA 聚合酶
D．限制酶PstⅠ、限制酶EcoRI、DNA 连接酶
【答案】B
【详解】对质粒进行改造是让它增加一种限制酶的酶切位点，其他酶切位点又不能被破坏，故只能用
1
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
EcoRⅠ切割质粒后增加一部分含有MseⅠ酶切位点的片段，这样保证了在基因工程中目的基因和抗性基因结
构的完整性。因此，应先用限制酶EcoRⅠ切割，然后用DNA 聚合酶合成MseI 酶的识别序列，最后利用
DNA 连接酶形成环状质粒。
B 正确，ACD 错误。
故选B。
2．下列关于基因工程中基本工具的叙述正确的是（ ）
①限制性内切核酸酶能识别双链DNA 分子的特定核苷酸序列并切断磷酸二酯键
②大多数限制酶的识别序列由6 个核苷酸组成
EcoRⅠ
③
限制酶切割DNA 分子产生平末端
T4DNA
④
连接酶能连接黏性末端
⑤质粒只存在于原核细胞中
⑤大多数天然质粒都不需要人工改造，可以直接作为载体使用
A．①③⑤
B．①②④
C．②④⑥
D．③⑤⑥
【答案】B
【详解】①限制性内切核酸酶能精准识别双链DNA 分子特定核苷酸序列，并切断相应的磷酸二酯键，①
正确；
②多数限制酶识别序列为6 个核苷酸，②正确；
EcoRⅠ
③
限制酶切割后产生黏性末端，③错误；
T4DNA
④
连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端，④正确；
⑤质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞核或原核细胞拟核DNA 之外，并具有自我复制能力的
环状双链DNA 分子，⑤错误；
⑥天然的质粒不能直接被用作载体，基因工程中真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人
工改造的，⑥错误。综上，①②④正确。
故选B。
3．下图1 为某种质粒简图，图2 表示某外源DNA 上的目的基因，小箭头所指分别为限制酶EcoRⅠ、
BamHⅠ、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述正确的是（ ）
A．分别将一个外源DNA 和质粒用EcoRⅠ酶切后连接，会形成一个含有1 个EcoRⅠ酶切点的重组DNA
B．为防止质粒和目的基因片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和EcoRⅠ两种限制酶同时处理
C．在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA 的切割，则可选EcoRⅠ
D．一个图1 所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后，含有1 个游离的磷酸基团
【答案】C
2
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
【详解】A、若将一个外源DNA 分子和一个质粒分别用EcoRⅠ酶切后再用DNA 连接酶连接，则形成的重
组DNA 中，目的基因两端应各含1 个EcoRⅠ酶切位点，即重组DNA 中EcoRⅠ酶切点有2 个，A 错误；
B、为了防止质粒和含目的基因的外源DNA 片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同
时处理，B 错误；
C、目的基因两侧都有，且质粒也有的限制酶是EcoRⅠ，所以在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和
外源DNA 的切割，可选EcoRⅠ，C 正确；
D、一个图1 所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后，产生两个黏性末端，含有2 个游离的磷酸基团，D 错误。
故选C。
4．质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因（如图所示），通过标记基因可以推知外源基因
（目的基因）是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在
培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入（插入点有a、b、c）后细菌的生长情况。下列有关叙述
正确的是（ ）
项
目
细菌在含氨苄青霉素的培
养基上生长情况
细菌在含四环素的培养
基上生长情况
①
能生长
不能生长
②
能生长
能生长
③
不能生长
能生长
A．质粒的复制原点是转录的起始位点
B．①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b
C．质粒被一个限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2 个
D．将外源基因与质粒连接时需用DNA 聚合酶
【答案】C
【详解】A、质粒的复制原点上复制的起始位点，转录的起始位点是启动子，A 错误；
B、如果外源基因插入到a 中，会破坏此基因结构，使细菌在含有氨苄青霉素的培养基上不能生长；同理
如果外源基因插入到b 中，使细菌在含有四环素的培养基上不能生长，①②③三种重组后细菌的外源基因
插入点①是b②是c③是a，B 错误；
C、质粒被一种限制酶切开时，有两条链断裂，被水解的磷酸二酯键有2 个，C 正确；
D、将外源基因与质粒连接时需用DNA 连接酶，D 错误。
故选C。
3
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
题型二 基因工程的基本操作程序
5．下图表示PCR 过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R 表示方向。下列叙述正
确的是（ ）
A．DNA 体内复制与体外复制（PCR）所需能量均只来自dNTP
B．PCR 过程中需要添加缓冲液，其中所含的Mg2+可用于激活DNA 聚合酶
C．②链从L 到R 的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板
D．引物③的5′端添加了某序列，至少需经3 次循环才可获得该序列的双链产物
【答案】B
【详解】A、体内DNA 复制由ATP（解旋）、dNTP 提供能量，体外DNA 复制（PCR）由dNTP 和加热提
供能量，A 错误；
B、DNA 聚合酶都需要Mg2+激活，因此PCR 反应的缓冲液中一般要添加Mg2+，B 正确；
C、根据DNA 分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从 L 到 R 的方向为 5′→3′，图中①②链均可作
为子链合成的模板，C 错误；
D、引物③的5′端添加了某序列，经过第 1 次循环，得到的1 个 DNA 分子中有 1 条链含有该序列；经
过第 2 次循环，得到的1 个 DNA 分子的两条链均含有该序列，所以至少需经 2 次循环就可获得该序列
的双链产物，D 错误。
故选B。
6．（2025·福建厦门·一模）RT-PCR 是将RNA 逆转录（RT）成cDNA（与mRNA 互补的DNA 单链）和聚
合酶链式反应（PCR）相结合的技术，具体过程如图所示，下列叙述正确的是（ ）
A．过程Ⅰ获得cDNA 的过程与DNA 复制过程中碱基配对方式相同
B．图中A、B 两种引物在72°C 时通过碱基互补配对结合到模板链
C．图中子链的合成均是以四种核糖核苷酸为原料从引物的一端开始的
D．过程Ⅱ中，若进行6 轮循环，则共需要加入引物的数量为63 个
【答案】D
【详解】A、过程I 是逆转录过程，是以mRNA 为模板合成cDNA，该过程的碱基配对方式为A-T、U-A、
G-C、C-G，而DNA 复制过程的碱基配对方式为A-T、T-A、G-C、C-G，二者碱基配对方式不完全相同，
4
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
A 错误；
B、引物是通过碱基互补配对结合到模板链上的，该过程是在复性阶段完成的，复性的温度一般为55-
60°C，而不是72°C，72°C 是延伸阶段的温度，B 错误；
C、图中子链的合成是以四种脱氧核糖核苷酸为原料，从引物的一端开始进行合成，C 错误；
D、过程Ⅱ中，若进行6 轮循环，最终产生的DNA 单链数为26=64（条），新合成的子链数为63 条，则进
行6 轮循环，共需要加入引物的数量为63 个，D 正确。
故选D。
7．实时荧光定量PCR 简称qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将荧光标记
的Taqman 探针与待测样本DNA 混合，当探针完整时，不产生荧光。在PCR 过程中，与目的基因结合的
探针被TaqDNA 聚合酶水解，R 与Q 分离后，R 发出的荧光可被检测到在特定光激发下发出荧光（如图所
示），随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct 值（该值与待测样
本中目的基因的个数呈负相关）。下列相关叙述错误的是（ ）
A．每个模板DNA 分子含有2 个游离的磷酸基团
B．在反应过程中，无需ATP 为新链的合成提供能量
C．做qPCR 之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成引物和Taqman 探针
D．荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小
【答案】D
【详解】A、DNA 分子为两条反向平行的两条链，每条链都含有1 个游离的磷酸基团，则一个DNA 分子
含有2 个游离的磷酸基团，A 正确；
B、在反应过程中，dNTP 为新链的合成提供能量，无需ATP，B 正确；
C、做qPCR 之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1 对引物和1 种Taqman 探针，C 正确；
D、若荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明扩增次数少，说明更多的荧光探针与目的基
因进行了碱基互补配对，可推测获得的核酸产物中含有病变的概率越大，D 错误。
故选D。
【点睛】
8．重叠延伸PCR 技术是采用具有互补末端的引物，使 PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应
中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。某实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得
5
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
到了LTB 基因和ST1 基因片段，并用重叠延伸PCR 技术构建了LTB -ST1 融合基因（如图）。下列有关
叙述正确的是（ ）
A．可在同一个反应体系中进行LTB 基因和ST1 基因的扩增
B．PCR 过程中，第2 次循环获得目的链L 时所用的引物为P1
C．图中的引物P2 与引物P3 的碱基序列均不能互补配对
D．杂交链延伸生成LTB-ST1 融合基因时需要加入引物P1 和P4
【答案】B
【详解】A、引物P2 和P3 存在碱基互补配对，引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合，从而影响
PCR 过程，因此不能在同一个反应体系中进行LTB 基因和STI 基因的扩增，A 错误；
B、DNA 子链是从5 '端向3 '端延伸的，为了使杂交链引物P2 的碱基末端提供3'端，需要第二次循环，该
次循环使用引物P1，B 正确；
C、LTB 基因和ST1 基因能融合的关键是引物P2 和引物P3 部分碱基能互补配对，从而将两个基因融合在
一起，C 错误；
D、杂交链延伸生成LTB-ST1 融合基因的过程中，不需要加入引物，两条母链的起始位置的碱基序列即为
引物，可以作为子链合成的引物，为DNA 聚合酶提供3'端，D 错误。
故选B。
9．科研人员利用两种识别不同序列的限制酶（E1 和E2）处理某一基因表达载体后进行琼脂糖凝胶电泳，
结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．该载体的长度约为800bp，E1 和E2 在该载体上的酶切位点最短相距约400bp
6
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
B．电泳加样时，将扩增得到的PCR 产物与电泳缓冲液（内含指示剂）混合，注入加样孔内
C．待观察到DNA 片段前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
D．凝胶中的DNA 分子与核酸染料结合后可以在紫外灯下被检测出来
【答案】D
【详解】A、由题可知，仅用一种限制酶切割时，仅产生一种长度的DNA 片段，这种载体最可能是环状
DNA 分子，该载体的长度约为800bp，E1 和E2 在该载体上的酶切位点最短相距约200bp，A 错误；
B、电泳加样时，是将酶切后的产物与电泳缓冲液（内含指示剂）混合，注入加样孔内，B 错误；
C、接通电源后，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳，C 错误；
D、凝胶中的DNA 分子和核酸染料结合后，在紫外灯下可以被检测出来，这是核酸检测的常见方法，D 正
确。
故选D。
10． B 基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B 基因表达
对卵细胞的影响，设计了如下实验来获取能够在卵细胞中表达B 基因的转基因植株。
注：启动子*指可在水稻卵细胞中启动转录的启动子；Luc 基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光
下列关于该实验的叙述，不正确的是（ ）
A．B 基因在水稻卵细胞中不转录，可能是B 基因的启动子在卵细胞中无法启动转录
B．可从水稻体细胞和精子中提取RNA 合成cDNA 来获得B 基因中编码蛋白的序列
C．在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光
D．过程②在培养基中应加入卡那霉素以检测T-DNA 是否整合到水稻细胞染色体DNA 上
【答案】D
【详解】A、启动子是与RNA 聚合酶结合并能起始mRNA 合成的序列，所以B 基因在水稻卵细胞中不能
转录，可能是B 基因的启动子在卵细胞中无法启动转录，A 正确；
B、目的基因获取途径之一就是从cDNA 文库中获得，故可从水稻体细胞和精子中提取RNA 合成cDNA 来
获得B 基因中编码蛋白的序列，B 正确；
C、由于基因表达载体上有Luc 基因，其表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，所以在鉴定和筛选转基
因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光，C 正确；
D、检测T-DNA 是否整合到水稻细胞染色体DNA 上，应该用DNA 分子杂交法，D 错误。
故选D。
11．研究人员将GNA 基因和ACA 基因连接成融合基因后再与pBH21 质粒载体结合并导入玉米细胞，最终
获得了抗蚜虫玉米新品种，部分操作如图所示。下列相关叙述错误的是（ ）
7
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
A．提取GNA 基因和ACA 基因至少需要两种限制酶，①②过程均需要使用DNA 连接酶
B．为了保证基因转录方向正确，需要用限制酶KpnI 和XhoI 处理融合基因和载体
C．目的基因进入受体细胞后，需要通过PCR 技术检测目的基因是否成功表达
D．在加入了卡那霉素的培养基上存活下来的玉米细胞可能成功导入了重组载体
【答案】C
【分析】1、基因工程又称基因拼接技术和DNA 重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和
微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA 分子，然后导
入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的
研究提供了有力的手段。
2、基因工程的基本操作程序：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的
基因的检测和表达。
【详解】A、GNA 和ACA 基因两侧的酶切位点不同，因此提取GNA 基因和ACA 基因至少需要两种限制
酶；①过程为获得融合基因，②过程为构建基因表达载体，两个过程均需要使用DNA 连接酶，A 正确；
B、Kpn I 和Xho I 作用位点不同，用Kpn I 和Xho I 两种限制酶处理融合基因和载体，只有基因方向正确才
能形成重组载体，从而保证基因转录方向正确，B 正确；
C、可利用PCR 技术扩增目的基因，目的基因进入受体细胞后，需要通过抗原-抗体杂交技术检测目的基因
是否成功表达，C 错误；
D、在加入卡那霉素的培养基上存活下来的细胞，可能是成功导入重组载体的细胞，也可能是导入含有卡
那霉素抗性基因的非重组载体的细胞，D 正确。
故选C。
12．糖尿病已经成为危害人类健康的严重疾病之一，注射胰岛素是目前治疗糖尿病最为有效的途径和手段。
如何生产优质而不昂贵的人胰岛素，是当下医药界急需攻克的科学难题。下图为利用基因工程技术生产人
胰岛素的操作过程示意图，请回答：
8
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
(1)在基因表达载体中的启动子是 酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录。
(2)图中细胞1 是胰岛 (“A”或“B”)细胞。过程②为逆转录，所需要的酶是
。
(3)过程③④⑤为利用 PCR 技术扩增目的基因，其中③为PCR 的 过程，断开的是
(“氢键”或“磷酸二酯键”)。
(4)PCR 可进行多次循环， 最后需在约72℃保持7-10min， 其意义是 。
(5)图中C 的组成中必须含有标记基因，其作用是 。为使大肠杆菌易吸收外源DNA 分子，需用
含 的溶液处理大肠杆菌使其成为 细胞。
(6)过程⑩得到的人胰岛素需要体外加工才具有生物活性，原因是大肠杆菌细胞
【答案】(1)RNA 聚合
(2) B 转录酶/反转录酶
(3) 变性 氢键
(4)使子链充分延伸
(5) 用于筛选出含有目的基因的受体细胞 Ca2+ 感受态
(6)没有内质网和高尔基体，不能对胰岛素进行加工修饰
【详解】（1）启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。
（2）图中细胞1 中提取到胰岛素mRNA，说明该细胞中胰岛素基因表达了，推测该细胞是胰岛素B 细胞。
过程②为胰岛素mRNA 经逆转录获得目的基因，该过程需要逆转录酶的参与。
（3）过程③④⑤为利用PCR 技术扩增目的基因，此过程中需要Taq 酶（或耐高温的DNA 聚合酶）在引物
作用下，从引物3'端开始延伸DNA 链。PCR 反应过程包括变性→复性→延伸，变性是指当温度上升到
90℃以上时，双链DNA 解聚为单链，其中③表示DNA 双链打开，表示变性过程，此过程断开的是氢键。
（4）PCR 反应过程：变性→复性→延伸，在延伸阶段，72℃左右时，Taq 酶有最大活性，可使DNA 新链
由5'端向3'端延伸，PCR 可进行多次循环，最后需在约72℃保持7-10min，其意义是使子链充分延伸。
（5）图中C 表示基因表达载体，其中必须含有标记基因，其作用是用于筛选出含有目的基因的受体细胞。
将目的基因导入大肠杆菌最常用的转化方法是Ca2+处理法，用 Ca2+处理可使大肠杆菌细胞处于能够吸收周
围环境中DNA 分子的生理状态，即成为感受态细胞。
（6）大肠杆菌是原核生物，细胞内没有内质网和高尔基体，不能将肽链加工成为有活性的人胰岛素，因
此过程⑩得到的人胰岛素需要体外加工才具有生物活性。
13．土壤中的污染物RDX 具有高毒性和不易降解的特点。研究人员拟将细菌来源的RDX 降解酶基因XplA
与XplB 整合为融合基因，导入柳枝稷草，以修复污染土壤。图1 为基因XplA、XplB 及引物结合位点示意
图；图2 为融合基因表达载体构建过程及农杆菌筛选流程示意图。请回答下列问题：
9
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
(1)PCR 的原理是 ，PCR 扩增过程的每个循环都分为 三步。
(2)据图分析，构建融合基因需把基因XplA 的b 链的3′端与基因XplB 的 （填“a 链”或“b 链”）
的5′端相连，理由是 。利用PCR 拼接融合基因时，需在引物 的5′端加入互补序列。
(3)构建表达载体时，需将融合基因插入Ti 质粒的T-DNA 区，其目的是 ；用限制酶切割后，用DNA
连接酶连接形成重组质粒。在农杆菌培养基中添加潮霉素的作用是 。
(4)选用筛选出的农杆菌侵染柳枝稷草愈伤组织，经组织培养获得的植株不能降解RDX，原因可能是
。（写出2 点即可）
【答案】(1) DNA 半保留复制 变性、复性、延伸
(2) a 链 基因XplA 和XplB 共用启动子和终止子，二者的转录模板链应在DNA 的同一条链上
2 和4
(3) 利用T-DNA 携带融合基因整合到植物的染色体DNA 上 筛选得到含基因表达载体的农杆菌
(4)T-DNA 未整合到柳枝稷草染色体上、导入的融合基因不能成功表达、蛋白质翻译后加工异常
【详解】（1）PCR 的原理是 DNA 双链复制，因为 PCR 技术就是在体外模拟细胞内 DNA 复制的过程。
PCR 扩增过程的每个循环都分为变性、复性、延伸三步。变性是指在高温（约 90 - 95℃）下，DNA 双
链解开成为单链；复性是在低温（约 55 - 60℃）时，引物与模板 DNA 单链的互补序列结合；延伸是在
DNA 聚合酶的作用下，在适宜温度（约 70 - 75℃）下，以 dNTP 为原料，从引物的 3' 端开始合成新的
DNA 链。
（2）构建融合基因需把基因 XplA 的 b 链的3' 端与基因 XplB 的 a 链的 5' 端相连。理由是 DNA 两
条链反向平行，基因XplA 和XplB 共用启动子和终止子，且转录时只能以模板链的 3'→5' 方向为模板进
行转录，要使融合基因能正常转录，需将基因 XplA 的 b 链的 3' 端与基因 XplB 的 a 链的 5' 端相连 。
利用 PCR 拼接融合基因时，需在引物 2 和引物4 的 5' 端加入互补序列，这样在 PCR 过程中，引物 2
和引物 4 扩增出的片段就能通过互补序列连接形成融合基因。
（3）构建表达载体时，需将融合基因插入 Ti 质粒的 T - DNA 区，其目的是 T - DNA 可转移至受体细胞，
并整合到受体细胞染色体的 DNA 上，从而使融合基因能够稳定存在于受体细胞中并表达。在农杆菌培养
基中添加潮霉素的作用是筛选出含有重组质粒的农杆菌。因为重组质粒中含有潮霉素抗性基因，含有重组
质粒的农杆菌能在含有潮霉素的培养基上生长，而不含重组质粒的农杆菌不能生长。
（4）用筛选出的农杆菌侵染柳枝稷草愈伤组织，经组织培养获得的植株不能降解 RDX，原因可能是：
融合基因没有导入柳枝稷草细胞，导致细胞中没有 RDX 降解酶基因，无法合成降解 RDX 的酶；融合基
因在柳枝稷草细胞中没有表达，可能是因为基因表达调控的问题，如启动子没有发挥作用等，使得虽然有
10
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
基因存在，但不能合成相应的蛋白质来降解 RDX；也有可能是蛋白质翻译后加工异常。
14．水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程向大肠杆菌导入含特殊DNA 序列的重组质粒，制
备具有感知、降解和自杀功能的智能工程菌，为治理水杨酸环境污染提供新方法。回答下列问题：
(1)大肠杆菌常被改造为基因工程菌，其原因包括 （写出2 点）。科学家利用大肠杆菌制备图1 所
示的水杨酸传感器，其工作机理：当环境中存在水杨酸时， 。
(2)水杨酸羟化酶催化水杨酸转化为龙胆酸后可被工程菌利用。现将水杨酸羟化酶基因sah 与基因mrfp 连接
成融合基因（如图2）。并导入工程菌实现对水杨酸的动态检测和清除。利用PCR 技术扩增基因sah 和基
因mrfp 时，需要设计引物，引物的作用是 。为了使基因sah 和基因mrfp 能正确连接成融合基因，
其中两个引物的部分序列需要互补配对，这两个引物是 。
(3)工程菌治理环境污染具有针对性强、高效等优点，但菌体对水源存在安全隐患，因此需进一步改造工程
菌。当水体中无水杨酸污染时或水杨酸被完全降解时，工程菌可启动自杀程序，已知基因ccdB 表达的毒
素蛋白可使工程菌致死，基因ccdA 表达的抗毒素蛋白导致毒素蛋白失效，则图3 的i、ii 应分别插入
基因，理由是 。
【答案】(1) 遗传背景清楚、繁殖速度快、易于培养、转化效率高等 水杨酸进入工程菌，与调控
蛋白结合形成复合物激活启动子Ps，驱动基因mrfp 表达出红色荧光蛋白，使菌体发出红色荧光
(2) 使DNA 聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 引物2 和引物4
(3) ccdB、ccdA 基因ccdB 与启动子Pc 连接能持续表达毒素蛋白。基因ccdA 与水杨酸响应启动
子Ps 连接，方可实现水杨酸存在时表达抗毒素蛋白，使毒素蛋白失效，工程菌存活；水杨酸不存在时不能
表达抗毒素蛋白，毒素蛋白即可使工程菌致死
【详解】（1）大肠杆菌常被改造为基因工程菌，这是因为大肠杆菌的遗传背景清楚、繁殖速度快、易于
11
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
培养、转化效率高等。科学家利用大肠杆菌制备图1 所示的水杨酸传感器，其工作机理：当环境中存在水
杨酸时，水杨酸进入工程菌，与调控蛋白结合形成复合物激活启动子Ps，驱动基因mrfp 表达出红色荧光
蛋白，使菌体发出红色荧光。
（2）利用PCR 技术扩增基因sah 和基因mrfp 时，需要设计引物，引物可以使DNA 聚合酶能够从引物的3′
端开始连接脱氧核苷酸。由于融合基因共用启动子和终止子，将基因sah 和基因mrfp 拼接成融合基因时，
基因sah 和基因mrfp 的转录模板链应在DNA 的一条链上，因此基因sah 的a 链的3'端需要与mrfp 基因的
5'端相连，引物2 和引物4 要有部分序列能互补配对，两个基因片段就可以通过互补配对的序列连接起来。
（3）工程菌治理环境污染具有针对性强、高效等优点，但菌体对水源存在安全隐患，因此需进一步改造
工程菌。当水体中无水杨酸污染时或水杨酸被完全降解时，工程菌可启动自杀程序，已知基因ccdB 表达
的毒素蛋白可使工程菌致死，基因ccdA 表达的抗毒素蛋白导致毒素蛋白失效，则图3 的i、ii 应分别插入
基因ccdB、ccdA，这两个基因的作用机理为：基因ccdB 与启动子Pc 连接能持续表达毒素蛋白。基因
ccdA 与水杨酸响应启动子Ps 连接，方可实现水杨酸存在时表达抗毒素蛋白，使毒素蛋白失效，工程菌存
活；水杨酸不存在时不能表达抗毒素蛋白，毒素蛋白即可使工程菌致死。
14．抗生素的发现为人类健康作出伟大贡献，但伴随抗生素的滥用带来了“超级细菌”、水体污染等问题。
抗菌肽具有抗菌谱广泛、热稳定性高、无耐药性等优点而成为抗生素的良好替代品。对虾抗菌肽是无脊椎
动物特有的内源性抗菌物质，某科研团队构建水稻种子植物生物反应器来生产四种对虾抗菌肽。
回答下列问题：
(1)科研人员采用 和琼脂糖凝胶电泳从南美白对虾体内分别获得四种抗菌肽基因Pen1、Pen2、
Pen3 和Pen4，并设计了自剪切肽LP4-2a 基因（自剪切肽具有独特的自剪切特性），构建表达四种抗菌肽
的人工编码基因PEN1234，其结构如图1 所示。其中在基因PEN1234 中的自剪切肽LP4-2a 基因的作用是
。
(2)科研人员利用水稻种子胚乳细胞中的启动子PosG2 构建基因表达载体，部分结构如图2。使用启动子
PosG2 目的是 。PEN1234 基因的部分碱基序列及限制酶Nco I 和BstEⅡ识别序列、切割位点如图3。
用这两种限制酶切割PEN1234 基因后，基因两端的黏性末端序列分别为5’- -3’和5’- -3’。
12
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
(3)科研人员为探究转基因水稻种子胚乳的抗菌肽活性。用野生型水稻种子、转基因水稻种子、大肠杆菌菌
液、LB 固体培养基（常用细菌培养基）等材料设计实验，实验思路是 。
【答案】(1) PCR 技术 将基因表达产物进行剪切获得4 种抗菌肽
(2) 使PEN1234 基因在水稻种子胚乳细胞中特异性表达 CATG GTGAC
(3)答案1：先将大肠杆菌菌液均匀涂布在LB 固体培养基上，再将野生型水稻种子和转基因水稻种子依次
埋入培养基中，置于适宜环境培养一段时间，观察并比较各种子周围的抑菌圈直径大小。答案2：先将野
生型水稻种子和转基因水稻种子的提取液分别滴在小圆滤纸片上，再将小圆滤纸片置于已均匀涂布大肠杆
菌菌液的LB 固体培养基上，置于适宜环境培养一段时间，观察各小圆滤纸片周围的抑菌圈直径大小。
【详解】（1）PCR 可快速扩增DNA，所以获取基因通常采用PCR 技术对目的基因进行扩增。自剪切肽
LP4 - 2a 基因位于四种抗菌肽基因（Pen1、Pen2、Pen3、Pen4）之间，其作用是使基因表达产物进行剪切，
从而获得 4 种独立的抗菌肽，确保每种抗菌肽能单独发挥作用。
（2）启动子是启动基因转录的，使用启动子PosG2 的目的是使PEN1234 基因在水稻种子胚细胞中特异性
表达。 根据图3 中NcoⅠ和BstEⅡ的识别序列和切割位点，NcoⅠ识别序列为 - CCATGG - ，切割后5'端黏
性末端为 - CATG - ；BstEⅡ识别序列为 - GGTGAAC - ，切割后5'端黏性末端为 - GTGAC- 。
（3）要探究转基因水稻种子的抗菌肽活性，需要设置对照实验，以大肠杆菌菌液为抗菌对象，观察种子
周围抑菌圈大小来判断抗菌肽活性。 答案1：先将大肠杆菌菌液均匀涂布在LB 固体培养基上，再将野生
型水稻种子和转基因水稻种子依次埋入培养基中，置于适宜环境培养一段时间，观察并比较种子周围的抑
菌圈直径大小。此方案直接将种子埋入含菌培养基，观察抑菌圈。 答案2：先将野生型水稻种子和转基因
水稻种子的提取液分别滴在小圆滤纸片上，再将小圆滤纸片置于已均匀涂布大肠杆菌菌液的LB 固体培养
基上，置于适宜环境培养一段时间，观察并比较滤纸片周围的抑菌圈直径大小。此方案提取种子中的物质，
用滤纸片承载来观察抑菌圈。
15．我国是世界上最大的水稻生产国，水稻的栽培历史源远流长。在水稻育种方面，转基因技术已成为新
品种培育的一条崭新途径，研究人员运用基因工程技术进行转基因水稻的研究。图1 是研究人员利用T-
DNA 将目的基因导入水稻的一条染色体DNA 局部示意图。
13
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
注：①图中灰色部分为带有目的基因的T-DNA 片段。
②酶切位点及引物2-5 位于T-DNA 末端区域。
回答下列问题：
(1)由于该T-DNA 长度过长，PCR 无法扩增完整序列，为检测植株是否含有目的基因，应选取的引物是
（从引物2~引物5 中选择），进行PCR 及电泳检测，得到结果，如图2。其中，1 和2 分别为野生型和已
知转基因植株作为对照， 为转基因植株。
(2)反向PCR 技术是一种用于扩增已知序列侧翼未知DNA 序列的技术。为进一步确定含目的基因的T-DNA
插入染色体的具体位置，研究人员利用图2 转基因植株2 的染色体DNA 检测，流程如图3。
通过过程Ⅰ、Ⅱ获得环状DNA 后，过程Ⅲ应选取图1 中的引物 扩增。为了验证T-DNA 的定位，
根据过程Ⅳ测序结果设计引物6，选取引物3 和6，以植株2 的染色体DNA 为模板，进行PCR 扩增，电泳
结果获得扩增产物，说明植株2 的T-DNA 整合在 区域。利用引物3 和6 检测其他转基因植物，电
泳结果显示仅部分转基因植物有PCR 扩增产物，则说明 。
(3)对植株2 自交所得子代植株DNA 进行PCR 检测，得到结果如图4。结合图1 推测：子代PCR 时除了使
用了引物2 和6 组合外，还使用了引物 组合，根据PCR 结果可以确定 为所需纯合转基因
植株。
【答案】(1) 2 和5 3-7
(2) 3 和4 靠近引物6 对应序列的染色体区域 T-DNA 整合到染色体DNA 上的位置是随机的
14
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
（不是唯一的）
(3) 1 和6 4
【详解】（1）引物的作用是使DNA 聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸，即子链延伸的方向是5'→3'端，
根据DNA 分子的方向可知，应选取的引物是引物2 和引物5。1 和2 分别为野生型和已知转基因植株作为
对照，3-7 都有与2 相同的条带，可知3-7 为转基因植株。
（2）反向PCR 技术是一种用于扩增已知序列侧翼未知DNA 序列的技术，因是需对位置序列进行扩增，需
选用引物3 和引物4。植株2 为转基因植株，选取引物3 和6，电泳结果获得扩增产物，说明目的基因存在
于未知序列，即靠近引物6 对应序列的染色体区域。利用引物3 和6 检测其他转基因植物，电泳结果显示
仅部分转基因植物有PCR 扩增产物，说明部分与植株 2 的 T‐DNA 插入位点相同，其他株系则插入在不同
位置，即T-DNA 整合到染色体DNA 上的位置是随机的。
（3）由图可知，电泳检测两种条带，一种是野生型，一种是转基因条带，引物2 和6 组合可扩增出转基因
条带，引物1 和6 可扩增出野生型条带。仅有转基因条带而无野生型条带者，即可确定为所需的纯合转基
因植株，即4 为所需纯合转基因植株。
题型三 基因工程的应用、蛋白质工程
16．组织型纤溶酶原激活物（t-PA）能激活纤溶酶原转化为纤溶酶，将沉积在血管内外的纤维蛋白溶解，
从而保持血管畅通。T-PA 进入血浆后大部分与纤溶酶原激活剂抑制物形成复合物，并迅速失去活性。科学
家对其进行改造，增加溶栓效能、减少药用剂量和降低副作用等。下列叙述错误的是（ ）
A．改造t-PA 可通过改造基因或合成基因来实现
B．改造t-PA 的过程不需要构建基因表达载体
C．需根据t-Pa 氨基酸序列合成出相应的基因
D．利用蛋白质工程生产的改造t-PA 在自然界中不存在
【答案】B
【详解】A、改造蛋白质需要改造基因或合成基因来实现，A 正确；
B、通过蛋白质工程改造t-PA 的过程仍需要构建基因表达载体，B 错误；
C、根据中心法则逆推以确定目的基因的碱基序列：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有
氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因），故推测出改造t-PA 应有的氨基酸序列之后，需要根据
其氨基酸序列合成相应DNA，C 正确；
D、利用蛋白质工程生产的蛋白质是自然界中不存在的蛋白质，D 正确。
故选B。
17．我国拥有自主知识产权的基因工程药物——重组人胰岛素已经研制成功并得到广泛应用，研究人员利
用酵母菌表达、分泌该蛋白，通过分离纯化，制备胰岛素原料药。下列说法正确的是（ ）
A．酵母蛋白表达系统可以对胰岛素进行加工修饰
B．利用PCR 技术从酵母菌基因组中获取目的基因
C．发酵过程中先通气再密闭可以提高胰岛素产量
15
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
D．发酵结束后通过离心收集沉淀物来提纯胰岛素
【答案】A
【详解】A、酵母菌是真核生物，其蛋白表达系统（细胞内的内质网、高尔基体等）可以对胰岛素进行加
工修饰，A 正确；
B、胰岛素基因是人体细胞中的基因，并非酵母菌基因组中的基因，不能从酵母菌基因组中利用PCR 技术
获取目的基因，B 错误；
C、酵母菌在有氧条件下进行有氧呼吸大量繁殖，在无氧条件下进行无氧呼吸产生酒精，而利用酵母菌表
达、分泌重组人胰岛素，需要酵母菌大量繁殖来提高产量，先通气有利于酵母菌有氧呼吸大量繁殖，后密
闭不利于其大量繁殖，所以发酵过程中应持续保证含氧量才能提高胰岛素产量，C 错误；
D、胰岛素是分泌蛋白，发酵结束后胰岛素存在于发酵液中，应通过离心收集上清液，然后进一步分离纯
化来提纯胰岛素，而不是收集沉淀物，D 错误。
故选A。
18．科研人员以β-甘露葡萄糖酶为核心研究材料，在其N 端找到了两个关键的氨基酸位点，将这两个位点
的组氨酸和脯氨酸分别替换为脯氨酸后，其热稳定性得到了显著提高。下列说法正确的是（ ）
A．细胞内合成改造后的高热稳定性蛋白质的过程不遵循中心法则
B．替换蛋白质中的氨基酸实际可通过改造基因中的碱基序列实现
C．在分子水平上，可利用PCR 等技术检测细胞内是否合成新的目的蛋白质
D．制备过程中应先获得目标蛋白质的三维结构，再预期其生物学功能
【答案】B
【详解】A、细胞内蛋白质的合成过程要经过转录和翻译，遵循中心法则，A 错误；
B、蛋白质是DNA 经过转录、翻译得到的，所以替换蛋白质中的氨基酸实际可通过改造基因中的碱基序列
实现，B 正确；
C、PCR 等技术能检测目的基因是否导入细胞或是否转录，检测细胞内是否合成新的蛋白质可使用抗原—
抗体杂交法，C 错误；
D、蛋白质工程的制备过程中要先预期目标蛋白质的生物学功能，再设计获得该蛋白质的三维结构，D 错
误。
故选B。
19．糖化血红蛋白（HbA1c）含量是糖尿病诊断标准之一，其含量测定需要蛋白酶、果糖氨基酸氧化酶
（FPOX）的参与，但FPOX 会降低蛋白酶的催化效果，影响诊断结果。科学家利用蛋白质工程对FPOX
进行改造，提升了诊断的准确性和效率。下列叙述正确的是（ ）
A．改造后的FPOX 在自然界中也存在
B．改造后的FPOX 蛋白的合成过程不遵循中心法则
C．可通过基因修饰或合成基因来实现对FPOX 的改造
D．根据改造后的FPOX 氨基酸序列可得到一种脱氧核苷酸序列
【答案】C
【详解】A、利用蛋白质工程生产的蛋白质是自然界中不存在的蛋白质，A 错误；
16
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
B、改造后的FPOX 蛋白的合成过程仍遵循中心法则，B 错误；
C、改造蛋白质需要通过改造基因或合成基因来实现，C 正确；
D、密码子具有简并性，一种氨基酸序列可能对应多种脱氧核苷酸序列，D 错误。
故选C。
20．控制合成凝血因子Ⅷ的基因主要在肝脏中表达，A 型血友病是凝血因子Ⅷ基因发生突变，导致凝血因
子Ⅷ含量降低或功能异常所致。研究人员发现，用丝氨酸替换凝血因子第309 位的丙氨酸，可以增加凝血
因子Ⅷ的分泌量，从而达到基因治疗的目的。下列相关说法错误的是（ ）
A．对凝血因子Ⅷ的改造属于蛋白质工程，需要在分子水平对基因进行操作
B．基因工程和上述改造工程的相同点之一是均只能生产自然界存在的蛋白质
C．进行基因治疗时需要将改造后的凝血因子Ⅷ基因构建的表达载体导入患者肝细胞中
D．通过选择肝脏特异性启动子，可以实现凝血因子Ⅷ基因只在肝细胞中特异性表达
【答案】B
【详解】A、分析题意，用丝氨酸替换凝血因子第309 位的丙氨酸，可以增加凝血因子Ⅷ的分泌量，由此
可知对凝血因子Ⅷ的改造属于蛋白质工程，需要在分子水平对基因进行操作，A 正确；
B、对凝血因子Ⅷ的改造属于蛋白质工程，该工程能生产自然界不存在的蛋白质，B 错误；
C、分析题意，控制合成凝血因子Ⅷ的基因主要在肝脏中表达，由此可知进行基因治疗时需要将改造后的
凝血因子Ⅷ基因构建的表达载体导入患者肝细胞中，C 正确；
D、选择肝细胞特异性的启动子，可使凝血因子Ⅷ基因表达严格限于肝细胞，D 正确。
故选B。
1．毕赤酵母（能以甲醇为唯一碳源）可作为生产抗原蛋白的工程菌。研究人员以图1 所示质粒
为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白基因HBsAg 的重组质粒，导入大肠杆菌中进行扩增后，再经酶
切后导入毕赤酵母，经同源重组整合到其染色体DNA 上，其中的T 启动子是一种甲醇诱导型启动子。图
1、图2 中的限制酶酶切位点对应的碱基序列如图3 所示。下列说法错误的是（ ）
A．利用PCR 技术获取HBsAg 基因时，引物A 结合的单链是b 链
B．构建重组载体后，导入大肠杆菌，在含有氨苄青霉素的培养基上进行培养，与含空白质粒的大肠杆
菌菌落相比，含有重组质粒的菌落具有不能发绿色荧光的特征
C．科研人员利用限制酶和E．coliDNA 连接酶将HBsAg 基因正确插入图1 所示质粒时，应选用SmaⅠ、
17
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
BclⅠ酶对质粒进行酶切处理
D．将大肠杆菌中获取的HBsAg 基因导入毕赤酵母后，转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需
要向其中加入甲醇，其目的是诱导HBsAg 基因表达，同时也为毕赤酵母提供碳源
【答案】C
【详解】A、转录的模板链在b 链，即b 链左侧为3′端，右侧为5′端。利用PCR 技术获取HBsAg 基因时，
引物是与模板链的3′端结合，因此，引物A 结合的单链是b 链，A 正确；
B、重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，因此构建重组载体后，导入大肠杆菌，在含有氨苄青霉素的培
养基上进行培养，没有导入质粒和没有导入重组质粒的大肠杆菌均不能存活。空白质粒含有绿色荧光蛋白
基因而重组质粒上绿色荧光蛋白基因被破坏，因此不能发绿色荧光，B 正确；
C、在构建重组DNA 分子时，需要获得具有相同黏性末端的目的基因和质粒，为保证目的基因的完整性，
结合图2 分析，需要使用BamHⅠ和XmaⅠ识别并切割。再结合图2 目的基因的转录方向以及质粒的转录方
向分析，质粒应选择BclⅠ和XmaⅠ进行酶切，因为BamHⅠ和BclⅠ酶切所产生的黏性末端相同，SmaⅠ和
XmaⅠ限制酶识别序列是一样的，只是切割位点不一样，因此质粒上SmaⅠ识别序列可以被XmaⅠ酶切，获
得和目的基因一端相同的黏性末端。综上所述，质粒上SmaⅠ限制酶识别序列用XmaⅠ酶切，与目的基因用
XmaI 酶切获得的黏性末端一侧相连；质粒用BclⅠ酶切获得的黏性末端和目的基因用BamHⅠ酶切获得的黏
性末端相连，因此科研人员利用限制酶和E.coliDNA 连接酶将HBsAg 基因正确插入图1 所示质粒时，应选
用XmaⅠ、BclⅠ酶对质粒进行酶切处理，C 错误；
D、将大肠杆菌中获取的HBsAg 基因导入毕赤酵母后，转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向
其中加入甲醇。加入甲醇的作用有两点：一是提供碳源，促进酵母菌的生长和代谢；二是启动甲醇代谢相
关的基因表达，从而启动目的基因的表达，D 正确。
故选C。
2．环境雌激素来源于各种农药及其代谢物、防晒剂等，并通过污水排放和地表水径流进入水体环境，进
入人体内的环境雌激素对人类健康产生了极大的危害。在环境雌激素的诱导下，斑马鱼表达卵黄蛋白原的
水平与环境雌激素的浓度呈正相关。若向斑马鱼体内转入荧光蛋白基因，在特定条件下能发出荧光。科研
人员欲利用基因工程技术，构建能够监测环境中雌激素污染物的转基因荧光斑马鱼，实验部分流程如图1
所示。图2 所示pEGFP-1 是一种无启动子的绿色荧光蛋白（EGFP）载体，其中KanR 为卡那霉素抗性基因，
ori 为复制起点，poly（A）为终止子序列，BamHⅠ、HindⅢ、StuⅠ、KasⅠ所指位置分别是4 种限制酶的切割
位点。回答下列问题：
(1)基因工程的核心环节是 。已知卵黄蛋白原启动子序列中无上述四种酶的识别序列，扩增时应在引
18
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
物的 端添加相应的碱基序列。DNA 复制时需要引物的原因是 。
(2)依据pEGFP-1 的结构，应选择 两种酶对质粒进行切割，再利用DNA 连接酶将其与卵黄蛋白原启
动子序列缝合。不选用另外两种酶切割的理由是 （答出两点）。
(3)构建重组质粒后，通过 法导入斑马鱼的胚胎中，并从个体水平检测转基因斑马鱼是否表现出绿色
荧光。为避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，可考虑采取的措施是 （答1 点）。
【答案】(1) 基因表达载体的构建 5′ 使DNA 聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
(2) HindⅢ和BamHⅠ 会破坏标记基因；目的基因位于终止子的下游，影响目的基因的表达
(3) 显微注射 导入不育基因、导入仅导致生殖细胞凋亡的基因等
【详解】（1）基因工程的核心环节是基因表达载体的构建。已知卵黄蛋白原启动子序列中无上述四种酶
的识别序列，扩增时应在引物的5'端添加相应的碱基序列。DNA 复制时需要引物的原因是使DNA 聚合酶
能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
（2）据题干信息可知，ori 为复制起点，poly（A）为终止子序列，在构建基因表达载体时，目的基因应插
入在终止子序列之前，依据pEGFP-1 的结构，应选择HindⅢ和BamHⅠ两种酶对质粒和卵黄蛋白原启动子
序列进行切割，再利用DNA 连接酶缝合其中的磷酸二酯键。KanR 为卡那霉素抗性基因，KasⅠ会破坏卡那
霉素抗性基因，故不选用另外两种酶StuⅠ、KasⅠ切割的理由是会破坏标记基因，且目的基因位于终止子的
下游，影响目的基因的表达。
（3）目的基因导入动物细胞常用显微注射法，因此通过显微注射法将重组质粒导入斑马鱼的胚胎中。为
避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，可考虑导入不育基因、导入仅导致生殖细胞凋亡的基因等措施。
3．平滑肌细胞（SMC）是高等动物血管壁的重要组成，其功能障碍会导致主动脉瘤的发生。与
肌肉收缩相关的M 蛋白（由M 基因控制合成）在SMC 中含量较高，而在其他细胞中几乎不存在。小括博
士科研团队为获得血管SMC 被特异性标记的模型鼠进行了系列实验。
(1)获得融合基因：如图1 所示，利用 技术获得Cre 重组酶基因和雌激素受体基因的融合基因
（CE）。欲得到大量完整的CE 基因，该技术的最后一个环节应选用引物 。
(2)构建基因表达载体：为保证CE 在SMC 中特异性表达，需将CE 插入小鼠的 基因的启动子之后。
已知CE 基因（融合基因）的连接处有XbaI 的识别序列，图2 为用于构建融合基因表达载体的质粒的部分
示意图。据图可知，可用 限制酶对载体质粒进行双酶切，在CE 融合基因的两端分别添加
限制酶的识别序列。将经筛选后构建成功的表达载体通过显微注射法导入小鼠的 作为受体细胞，
培养之后获得小鼠A。同时构建含Stop 和tdT 的表达载体并获得小鼠B，让小鼠A 与B 进行杂交，获得同
时含有以上基因的CE 杂合小鼠C（图3）。
19
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
(3)在外源药物T 的诱导下，定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核，而Cre 重组酶能导致loxP 位点间的
序列丢失。用药物T 饲喂小鼠C 后，借助一定的技术手段可观察到 。
【答案】(1) PCR P1、P4
(2) M XbaI、EcoRI SpeI、EcoRI 受精卵
(3)SMC 发出红色荧光
【详解】（1）如图1 所示，可以利用PCR 技术获得Cre 重组酶基因和雌激素受体基因的融合基因(CE)。
欲得到大量完整的CE 基因，需要将两个基因均复制，而DNA 聚合酶只能从引物的3'-末端延伸子链，因
此该技术的最后一个环节应选用引物P1、P4。
（2）构建基因表达载体:由于M 蛋白在SMC 中含量高，因此为保证CE 在SMC 中特异性表达，需将CE 插
入小鼠的M 基因的启动子之后。图2 为用于构建融合基因表达载体的质粒的部分示意图。据图可知，可用
Xbal、EcoRI 限制酶对载体质粒进行双酶切，不能用Spel 酶和BamHI 酶，因为会切割标记基因；不能使用
SmaⅠ，因为其切割后产生的是平末端，连接效率较低。已知CE 基因(融合基因)的连接处有Xbal 的识别序
列，故不能用Xbal 切割目的基因，依据表达载体使用的限制酶、启动子的位置以及各限制酶的识别序列可
知，在CE 融合基因的两端分别添加Spel（该酶切割后形成的粘性末端与Xbal 相同）、EcoRI 限制酶的识
别序列。将经筛选后构建成功的表达载体通过显微注射法导入小鼠的受精卵中，因为受精卵的全能性最高，
可以发育成完整的动物个体，因此适于作为受体细胞，培养之后可以获得小鼠A。同时构建含Stop 和tdT
20
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
的表达载体并获得小鼠B，让小鼠A 与B 进行杂交，获得同时含有以上基因的CE 杂合小鼠C。
（3）在外源药物T 的诱导下，定位于细胞质中的雌激素受体进入细胞核，而Cre 重组酶能导致1oxP 位点
间的序列丢失。用药物T 饲喂小鼠C 后，借助一定的技术手段可观察到SMC 发出红色荧光。
一、单选题
1．（2025·福建·高考真题）紫杉醇是红豆杉的代谢产物，会干扰纺锤体的正常功能。科研人员利用农杆菌
将紫杉醇合成的相关基因导入烟草中，实现了紫杉醇前体物质的合成。下列叙述错误的是（ ）
A．农杆菌转化前应先使用Ca2+处理烟草细胞
B．紫杉醇合成的相关基因会整合到烟草染色体DNA 上
C．紫杉醇因干扰肿瘤细胞的有丝分裂而具有抗癌作用
D．该技术的突破有利于红豆杉天然资源的保护
【答案】A
【详解】A、转化是指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。农杆菌转化前，
需要将含目的基因的重组Ti 质粒转入农杆菌中，此时应先使用Ca2+处理农杆菌细胞，使农杆菌细胞处于一
种能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态，A 错误；
B、农杆菌的Ti 质粒上的T-DNA 可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 中，因此紫杉醇
合成的相关基因会随T-DNA 整合到烟草染色体DNA 上，B 正确；
C、紫杉醇会干扰纺锤体的正常功能，通过抑制纺锤体的形成，阻碍肿瘤细胞的有丝分裂，从而发挥抗癌
作用，C 正确；
D、利用转基因技术生产紫杉醇前体，可减少对天然红豆杉的依赖，有利于保护其资源，D 正确。
故选A。
2．（2025·福建·高考真题）科研人员将光合系统相关基因整合到大肠杆菌后，该菌能在无碳源培养基中生
长繁殖。下列叙述错误的是（ ）
A．必需整合光反应和暗反应系统的相关基因
B．暗反应所需的所有能量来源于细胞中的ATP
C．改造成功的大肠杆菌可用
作为唯一碳源
D．该菌在无碳源培养基中生长繁殖一定需要光照
【答案】B
【详解】A、光反应生成ATP 和NADPH，暗反应利用这些物质固定CO₂，两者缺一不可，因此必须整合光
反应和暗反应相关基因，A 正确；
B、暗反应的能量不仅来源于ATP，还需NADPH 提供能量且作为还原剂，B 错误；
C、改造后的大肠杆菌通过暗反应固定CO₂ 合成有机物，CO₂ 可作为唯一碳源，C 正确；
D、光反应需要光照提供能量，若培养基无碳源，菌体必须依赖光反应进行自养，因此生长繁殖需要光照，
21
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
D 正确。
故选B。
3．（2025·福建·高考真题）质粒P 含有2 个EcoRⅠ、1 个SacⅠ和1 个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知
BamHⅠ位点位于2 个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3 种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其
中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3 种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下
列叙述正确的是（ ）
A．DNA 分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极
B．可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物
C．泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物
D．泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数
【答案】C
【详解】A、因为DNA 分子带负电，在凝胶中会向电源正极迁移，所以其迁移方向是从电源负极到正极，
并非从电源正极到负极，A 错误；
B、质粒P 有2 个EcoR I、1 个Sac I、1 个BamH Ⅰ酶切位点。EcoR I 有2 个酶切位点，单酶切会产生2 个
片段，片段较小，Sac I 有1 个酶切位点，单酶切会产生1 个线性片段，长度为质粒总长（①条带），观察
电泳图谱，②和③都是一个条带，而②的条带大于①条带，因此图中泳道②不可能是Sac Ⅰ酶切产物，③条
带可能是EcoR Ⅰ的单酶切产物（单酶切产生2 个片段大小相同），B 错误；
C、EcoR I 有2 个酶切位点，单酶切会产生2 个片段，Sac I 有1 个酶切位点，单酶切会产生1 个线性片段。
Sac I 和EcoR I 双酶切，会产生3 个片段，观察电泳图谱，泳道⑤有3 个条带，可推测泳道⑤为Sac I 和
EcoR I 酶切产物，C 正确；
D、酶切只是将质粒的环状结构切开，变成线性等结构，碱基总数不会改变，D 错误。
故选C。
4．（2023·福建·高考真题）关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”(实验I)和“DNA 的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的
实验操作，下列相关叙述正确的是（ ）
A．实验I 中，PCR 实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理
B．实验I 中，将扩增得到的PCR 产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源
C．实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
22
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
D．实验Ⅱ中，将白色丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴，用于鉴定DNA
【答案】C
【详解】A、实验Ⅰ中，PCR 实验所需的枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理，移液器不需要进行高压
蒸汽灭菌处理，A 错误；
B、实验Ⅰ中，将扩增得到的PCR 产物进行凝胶电泳，应先加样后接通电源，B 错误；
C、实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，由于DNA 不溶于酒精溶液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的
DNA，C 正确；
D、实验Ⅱ中，将丝状物溶于2mol/L 的NaCl 溶液后加入二苯胺试剂，在沸水浴条件下，DNA 遇二苯胺会
被染成蓝色，用于鉴定DNA，D 错误。
故选C。
5．（2025·江西·高考真题）为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含有抗病基因D 的重组Ti
质粒(如图)，通过农杆菌转化法将D 基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正
确的是
A．水稻愈伤组织细胞中RNA 聚合酶无法识别U6 启动子
B．在含重组Ti 质粒的农杆菌中U6 启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达
C．农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素
D．愈伤组织再分化获得的含有D 基因的幼苗属于抗病植株
【答案】B
【详解】A、将T - DNA 整合到水稻愈伤组织的染色体DNA 后，若要使D 基因表达并使水稻植株表现出抗
病性状。那么D 基因上游的U6 启动子需被水稻愈伤组织细胞中RNA 聚合酶识别， A 错误；
B、启动子是一段有特殊序列结构的DNA 片段，位于基因的上游，它是RNA 聚合识别和结合的部位，并
能够驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质。由图得出，上述重组Ti 质粒中的U6 启动子并非位于卡
那霉素抗性基因的上游，因而不能驱动卡那霉素抗性基因的表达， B 正确；
C、愈伤组织多指将植物体的某一组织、器官置于特定培养基中培养，诱导产生的无定形的组织团块，当
农杆菌侵染愈伤组织后，T - DNA 整合到水稻细胞染色体的DNA 中 ，通常情况下，若D 基因能表达，那
么T - DNA 上的潮霉素抗性基因也能表达，从而使得导入T - DNA 的水稻愈伤组织具有潮霉素抗性基因；
卡那霉素抗性基因不位于T - DNA 上，不会发生上述生理过程。因此，在农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛
选培养基中需加入潮霉素， C 错误；
D、 检测是否成功获得转基因品种一般需要经历两个阶段，首先是分子水平的检测，包括检测目的基因是
否导入宿主细胞、检测在宿主细胞中目的基因是否转录出mRNA 或最终表达出蛋白质，其次，还需要进行
个体生物学水平的鉴定。因此愈伤组织再分化获得的含有D 基因的幼苗不一定是抗病植株， D 错误。
故选B。
23
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
6．（2025·全国卷·高考真题）琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4 的电泳结果如图所示
（“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知样品1 和2 中的DNA 分子分别是甲和乙，甲只有限制酶
R 的一个酶切位点，样品3 和4 中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（ ）
A．配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B．该实验条件下甲、乙两种DNA 分子均带负电荷
C．甲、乙两种DNA 分子所含碱基对的数量可能不同
D．据图推测样品3 可能是甲被酶R 完全酶切后的产物
【答案】D
【详解】A、配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲溶液，可维持电泳过程中体系的pH 稳定，保证核酸分子正常
泳动，A 正确；
B、电泳时，样品向+极移动，说明在该实验条件下甲、乙两种 DNA 分子均带负电荷，符合核酸分子在电
泳中的带电特性，B 正确；
C、电泳中，DNA 分子的迁移速率与分子大小、电荷的多少等多种因素有关。甲、乙电泳条带位置虽然相
同，但影响DNA 分子的迁移速率的因素很多，所以碱基对的数量可能不同，C 正确；
D、甲只有限制酶R 的一个酶切位点，若被酶R 完全酶切，只会得到2 种DNA 片段（2 个条带），这两个
条带的碱基数量比甲要少，电泳跑的距离要比甲更远，所以据图推测样品4 才是甲被酶R 完全酶切后的产
物，D 错误。
故选D。
二、非选择题
7．（2025·福建·高考真题）为建立一种效率高、毒性小的基因敲除系统，将图1 所示的质粒1 和质粒2 导
入大肠杆菌，质粒2 中的sgRNA 基因依据目的基因设计，其转录的短链RNA 通过与目的基因碱基互补配
对，与Cas9 蛋白共同作用，敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。
24
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
回答下列问题：
(1)大肠杆菌LacZ 基因的表达产物可催化X-gal 生成蓝色物质从而使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将质
粒1 与含LacZ 基因相应sgRNA 基因的质粒2 同时转化到大肠杆菌中，涂布到含抗生素 的平板（含有
X-gal）上进行培养。若长出的是 色菌落则为LacZ 基因被敲除的大肠杆菌。
(2)Cas9 基因的表达量会影响敲除效率，但其过量表达会对大肠杆菌有毒。为评估毒性和敲除效率，用5 种
启动子（A、B、C、D 和E）启动Cas9 的转录，相应检测结果如图2 所示。结果表明，启动子 对细
胞毒性最小；综合考量毒性和敲除效率，应选用启动子 用于该系统。
(3)含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养，少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1 和质粒2 的特
点，在成功敲除LacZ 基因的大肠杆菌中消除质粒1 和质粒2，实验流程如图3 所示。
①培养12 小时后，图3 试管1 中大部分的大肠杆菌 （填选项）。
A．含质粒1 和质粒2 B．只含质粒1 C．只含质粒2 D．无质粒1 和质粒2
②若要从图3 平板上筛出质粒1 和质粒2 均被消除的大肠杆菌，简要写出实验思路和预期结果： 。
【答案】(1) 卡那霉素和四环素 白
(2) C A
(3) B 将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养，两者均不生长则为筛
出的大肠杆菌
【详解】（1）质粒2 中含有与LacZ 基因对应的sgRNA 基因，其转录出来的短链RNA 与目的基因（LacZ
基因）发生碱基互补配对，使其不能表达，因而不能使X-gal 分解产生蓝色物质，将质粒1 和质粒2 导入
大肠杆菌，因此在含四环素和卡那霉素且含X-gal 的培养基中，筛选白色的菌落即为LacZ 基因成功敲除的
菌落。
（2）Cas9 的表达量过高对大肠杆菌产生毒性，使其数量减少，结合图示可知，启动子C 对应的菌落数最
高，因此启动子C 对细胞毒性最小。结合菌落数和敲除率可知，启动子A 的菌落数和敲除率均较高，因此
综合考虑，应选择启动子A 作用于该系统。
（3）①质粒2 为温度敏感型质粒，在37℃下不能进行复制，培养12 小时后，试管1 中大部分大肠杆菌为
只有质粒1，B 正确，ACD 错误。
故选B。
②试管2 加入蔗糖，质粒1 中的SacB 基因表达的SacB 蛋白能将蔗糖转化为有毒化合物，抑制大肠杆菌的
生长繁殖，因此试管2 含质粒2 的大肠杆菌较少，为进一步筛选质粒1 和质粒2 均消除成功的大肠杆菌，
实验设计思路和预测实验结果为：将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养，在
无抗生素平板上可以生长，在含抗生素平板上均不生长的则为筛出的大肠杆菌。
8．（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR 来应对感染。麻
25
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要
受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46 转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。
回答下列问题：
(1)利用PCR 技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。
(2)将hCD46 接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体
内，应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。
(3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c 的子宫中，应选用
桑葚胚的原因是 。
(4)利用PCR 技术对子代小鼠进行hCD46 基因检测，应设置不加DNA 模板的对照组，目的是 。
(5)若能进一步构建既表达hCD46 受体又敲除IFNAR 基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原
因是 。
【答案】(1)两种引物分别与含hCD46 基因的两条模板链结合
(2) EcoRⅠ和NotI AgeⅠ和HindⅢ
(3) 超数排卵 桑葚胚易于在小鼠子宫着床
(4)排除PCR 体系中外源DNA 的污染
(5)该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR 以应对感染
【详解】（1）利用PCR 技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的变化是两种引物分别与解开的两条
模板链进行碱基互补配对，为子链的延伸做准备，即表现为两种引物分别与含hCD46 基因的两条模板链结
合
（2）结合图示可知，质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoRⅠ和NotI 的识别序列，且这两个序列位
于启动子和终止子之间，因此，将hCD46 接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotI。为提高转基因效
率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用AgeⅠ和HindⅢ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA，因为
这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段。
（3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其超数排卵，为获取大量的供体胚胎做准备。将
胚胎移植到小鼠c 的子宫中，通常选用桑葚胚的原因是因为桑葚胚易于在小鼠子宫着床，进而可以提高胚
胎的存活率。
（4）利用PCR 技术对子代小鼠进行hCD46 基因检测，应设置不加DNA 模板的对照组作为空白对照，这
26
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
样可以排除PCR 体系中外源DNA 的污染，提高实验结果的可信度。
（5）若能进一步构建既表达hCD46 受体又敲除IFNAR 基因的小鼠，则该转基因小鼠能接受抗原刺激，进
而机体会分泌干扰素，但干扰素无法与相应的受体结合，因为转基因小鼠的受体IFNAR 无法表达，因而干
扰素无法起作用，因此，该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。
9．（2023·福建·高考真题）菊花是两性花，LFY 基因是控制植物花分生组织形成的基因。过量表达LFY
导致植物提早开花。为使菊花花期提前，科学家制备了含有拟南芥过量表达的LFY 基因的转基因菊花。重
组Ti 质粒的部分信息及实验流程如图1 所示。启动子均为真核细胞启动子。
一、将重组Ti 质粒导入农杆菌中，利用农杆菌转化法转化并筛选LFY 转基因菊花。
(1)根据图中的信息，加入潮霉素是为了筛选 ，步骤①培养过程一般 （填“需要”或“不需要”）
光照，流程图中的Ⅰ是 。
(2)通过调整过程②和③中 的浓度和比例，可诱导菊花根和芽的形成，进而培养LFY 转基因菊花。
(3)以 为模板、选用与LFY 基因特异性结合的引物，利用PCR 技术鉴定菊花细胞是否存在LFY 基因。
再选用 技术检测转基因菊花的LFY 蛋白的表达水平，进一步筛选LFY 转基因菊花。
二、为了避免潮霉素抗性基因对环境造成污染，请优化以上实验。利用携带双T-DNA 的Ti 质粒（如图2）
培养转基因植物。
(4)已知Ti 质粒携带双T-DNA 时，每个T-DNA 都可以独立地整合到植物细胞的染色体DNA 上。请设计培
育转基因植物和杂交育种相结合的实验方案，筛选出只表达LFY 转基因菊花 。（写出实验思路即可）
【答案】(1) 转入LFY 基因的菊花细胞 不需要 愈伤组织
(2)生长素和细胞分裂素
(3) 菊花染色体DNA 抗原-抗体杂交
(4)将LFY 基因和潮霉素抗性基因分别克隆到Ti 质粒的两个T-DNA 上，构建重组Ti 质粒；利用农杆菌转化
法转化并筛选同时表达LFY 基因和潮霉素抗性基因的菊花；将转基因菊花自交，在子代中筛选出只表达
FLY 的转基因菊花
【详解】（1）重组质粒中含有潮霉素抗性基因，能表达出潮霉素抗性物质，故本实验中潮霉素的作用是
筛选转入LFY 基因的菊花细胞。步骤①为脱分化形成愈伤组织过程，一般不需要光照，图中Ⅰ为愈伤组织。
27
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
（2）步骤②和步骤③为再分化形成根和芽的过程，愈伤组织分化的方向与生长素和细胞分裂素的浓度和
比例有关，故调整步骤②和步骤③培养基中生长素和细胞分裂素的浓度和比例可诱导菊花芽或根的形成。
（3）利用农杆菌转化法转化时，其LFY 基因与菊花染色体DNA 进行了重组，故以菊花染色体DNA 为模
板，选用LFY 基因特异性引物，用PCR 检测LFY 基因是否导入菊花细胞中。检测目的基因是否翻译成蛋
白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交。因此，可用抗原-抗体杂交
方法检测转基因菊花中LFY 蛋白的表达水平，进一步筛选转基因菊花。
（4）将两个Ti 质粒存在双T-DNA 独立整合进植物细胞染色体DNA 中制备转基因菊花，最后根据是否表
达FLY 来筛选转基因菊花。具体方案为：将LFY 基因和潮霉素抗性基因分别克隆到Ti 质粒的两个T-DNA
上，构建重组Ti 质粒；利用农杆菌转化法转化并筛选同时表达LFY 基因和潮霉素抗性基因的菊花；将转
基因菊花自交，在子代中筛选出只表达FLY 的转基因菊花。
10．（2025·广西·高考真题）CAR-T 是指通过基因工程技术表达CAR 基因的T 细胞。CAR-T 能更好地识
别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T 过程见图，回答下列问题：
(1)构建含CAR 基因的重组质粒，选用的限制酶组合是 。
(2)将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原
因是 。
(3)将获得的重组质粒导入T 细胞并成功表达后，为了研究CAR-T 识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，
除了有CAR-T 与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有 ，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有
（至少写出2 点）。
(4)研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1 与CAR-T 表达的PD-1 结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，
可采取的策略有抑制PD-1 与PD-L1 的结合以及 。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T 难以接
触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1 启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决
上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1 连接的生物
开关，在该PD-1 与PD-L1 结合后会被打开，释放P 因子激活P 启动子。依据上述特性构建新的重组质粒
并使其在T 细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是 ，②是 ，③是 ，④
是 。
【答案】(1)EcoR Ⅰ、Not Ⅰ
28
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
(2)便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落
(3) 肿瘤细胞单独培养、不含CAR 基因的T 细胞（正常T 细胞）与肿瘤细胞共同培养 肿瘤细胞
的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等
(4) 减少CAR-T 细胞表面PD-1 的表达 抑制PD-1 基因表达的基因序列 终止子 溶解酶
基因序列 多种酶基因序列
【详解】（1）构建含CAR 基因的重组质粒，为了避免质粒和目的基因自连、目的基因反向插入，常采用
双酶切法；目的基因CAR 基因需要插入质粒的启动子和终止子区域，而限制酶Cla Ⅰ和Hind Ⅲ位于启动
子和终止子区域之外，且CAR 基因片段中间含有BamH Ⅰ识别序列，故应该选用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ分别切割
CAR 基因和质粒。
（2）固体培养基通常是在液体培养基中添加一定量的凝固剂制成的。在固体培养基上，人们可以清楚地
观察到在培养基表面由单个细胞生长繁殖成的菌落，质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，将连接产物导入
Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养的目的是便于含有质粒的大肠杆菌形成单
菌落，方便后续筛选出重组质粒。
（3）研究目的是探究CAR-T 识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，自变量为是否含有CAR 基因的T 细胞，
而因变量抗肿瘤效果，即肿瘤细胞凋亡率的检测指标为肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等；实
验组为CAR-T 与肿瘤细胞共同培养，对照组为肿瘤细胞单独培养、不含CAR 基因的T 细胞（正常T 细
胞）与肿瘤细胞共同培养。
（4）肿瘤细胞高表达的PD-L1 与CAR-T 表达的PD-1 结合会启动免疫抑制，为了阻断免疫抑制，可采取
的策略有抑制PD-1 与PD-L1 的结合，使用PD-1 抗体、PD-L1 抗体分别与PD-1、PD-L1 的结合，或减少
CAR-T 细胞表面PD-1 的表达；根据题干信息：与PD-1 连接的生物开关，在该PD-1 与PD-L1 结合后会被
打开，释放P 因子激活P 启动子，且需要减弱原有PD-1 启动的抑制通路，可知新的重组质粒中①是抑制
PD-1 基因表达的基因序列；溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率，且P 启动子是
双向启动子，可知②是终止子，③是溶解酶基因序列，④是多种酶基因序列。
11．（2025·江西·高考真题）流行病学调查在传染病防治中具有重要意义。AB 基因编码的AB 蛋白是致病
菌W 的一种特异性分泌蛋白。为构建快速检测致病菌W 感染的血清学诊断技术(一种抗原抗体特异性反应
技术)，研究人员从致病菌W 中克隆AB 基因，构建表达载体，导入原核宿主E，诱导后，分析表达情况
(如表)。
细胞
AB 基因的mRNA
AB 蛋白
致病菌W
十
十
宿主E
—
—
工程菌
十
—
注：“十”表示有检出，“—”表示未检出
回答下列问题：
(1)根据中心法则，结合表中数据判断，AB 基因在工程菌中能进行 ，但不能进行有效的
。
(2)分析发现，致病菌W 合成AB 蛋白时，某些氨基酸使用的部分密码子在宿主E 中的使用频率低(称为该
29
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
物种的稀有密码子，如表中密码子CGG 在宿主E 中为稀有密码子)。从蛋白质合成条件的角度分析，形成
这一现象的原因是宿主E 中缺乏 。
精氨酸的密码子
密码子使用频率(10-3)
致病菌W
宿主E
CGA
7.2
4.3
CGC
28.5
26.0
CGG
24.7
4.1
CGU
8.5
21.1
AGA
1.3
1.4
AGG
3.2
1.6
(3)进一步分析发现，宿主E 缺乏高效表达GC 含量过高的外源基因所需要的机制。已知AB 基因的GC 含
量较高，为在宿主E 中实现AB 蛋白的高效表达，可将精氨酸密码子CGG 的使用进行优化，从第(2)题表
中选择最佳密码子为 。
(4)现有一位体内未检测到致病菌W 的人。为了解此人是否有致病菌W 感染史，设计一个直接利用AB 蛋
白的血清学诊断实验。①简要写出实验思路： ；②预测实验结果： ；③分析实验
结果： 。
【答案】(1) 转录 翻译
(2)该密码子所对应的tRNA
(3)AGA
(4) 取此人血清，与AB 蛋白混合， 观察是否发生抗原-抗体反应（或是否出现沉淀现象） 若发
生抗原-抗体反应（出现沉淀），此人有致病菌W 感染史；若不发生抗原-抗体反应（不出现沉淀），此人
没有致病菌W 感染史 若此人有致病菌W 感染史，血清中存在AB 蛋白的相应抗体，AB 蛋白能与抗
体反应形成沉淀。若此人无致病菌W 感染史，血清中不存在AB 蛋白的相应抗体，不会形成沉淀
【详解】（1）结合表中数据可知，工程菌中含有AB 基因的mRNA，说明AB 基因在工程菌中能进行转录。
工程菌中没有AB 蛋白，说明该基因不能进行有效的翻译。
（2）蛋白质合成过程中，需要tRNA 搬运氨基酸，致病菌W 合成AB 蛋白时，某些氨基酸使用的部分密码
子在宿主E 中的使用频率低，形成这一现象的原因是宿主E 中缺乏该密码子所对应的tRNA。
（3）进一步分析发现，宿主E 缺乏高效表达GC 含量过高的外源基因所需要的机制，AB 基因的GC 含量
较高，精氨酸密码子CGG 的GC 含量高，精氨酸密码子还有AGA（GC 含量降低，可使该基因在在宿主E
中高效表达），要对精氨酸密码子CGG 的使用进行优化，选择最佳密码子为AGA。
（4）血清学诊断是利用抗原-抗体反应，AB 蛋白可作为抗原，若有病菌W 感染史，体内会产生相应抗体，
能与AB 蛋白发生特性结合，并形成沉淀，故实验思路为：取此人血清，与AB 蛋白混合， 观察是否发生
抗原-抗体反应（是否出现沉淀）。若此人有致病菌W 感染史，血清中存在AB 蛋白的相应抗体，AB 蛋白
30
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
能与抗体反应形成沉淀。若此人无致病菌W 感染史，血清中不存在AB 蛋白的相应抗体，不会形成沉淀。
12．（2025·全国卷·高考真题）为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X 的基因（目的基因）插入质
粒P0，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR 方法验证重组质粒构建成功（引物1~4
结合位置如图所示，→表示引物5＇→3＇方向）。回答下列问题：
(1)PCR 是根据DNA 复制原理在体外扩增DNA 的技术。在细胞中DNA 复制时解开双链的酶是 ，
而PCR 过程中解开双链的方法是 。
(2)PCR 过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有 。
(3)该同学进行PCR 实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作用是： ；②无扩增产物，
原因是 ；③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA 产物分别是 。
管号
①
②
③
④
⑤
⑥
模板
无
P0
Px
无
P0
Px
引物对
引物1 和引物2
引物3 和引物4
(4)设计实验验证大肠杆菌表达的酶X 有活性，简要写出实验思路和预期结果 。
【答案】(1) 解旋酶 高温变性
(2)引物、脱氧核苷三磷酸
(3) 作为对照（或答:鉴定反应体系是否有模板污染） P0不含与引物1 和引物2 互补的碱基序列
目的基因、质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段
(4)提取酶X，催化相应底物（反应物）的反应，检测是否有产物生成。有产物生成，则证明酶X 有活性
【详解】（1）在细胞中，DNA 复制时解开双链的酶是解旋酶。而在 PCR 过程中，是通过高温变性（加
热至 90 - 95℃）的方法使 DNA 双链解开。
（2）PCR 过程中，参与合成反应且不断消耗的组分有引物和 dNTP（脱氧核苷三磷酸）。引物用于引导
DNA 聚合酶合成新的 DNA 链，dNTP 脱去两分子磷酸，产生dAMP，进而为合成新的 DNA 链提供原
料。
（3）实验中①和④的作用是作为对照。①无模板且引物对与②③相同，④无模板且引物对与⑤⑥相同，
可对比说明模板对扩增的影响。②之所以无扩增产物，是因为P0不含与引物1 和引物2 互补的碱基序列，
无法扩增出子链DNA 序列。③以Px为模板，引物1 和引物2 扩增出的是含目的基因的 DNA 片段；⑤以
31
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
P0为模板，引物3 和引物4 扩增出的是质粒P0上一段 DNA 片段；⑥以Px为模板，引物3 和引物4 扩增出
的是含目的基因和部分质粒序列的 DNA 片段。
（4）实验思路：将大肠杆菌培养后，提取酶X，设置一组含有酶X 的反应体系和一组不含酶X 的反应体
系（作为对照），在适宜条件下，加入酶X 的底物，检测底物的消耗情况或产物的生成情况。 预期结果：
含有酶X 的反应体系中底物减少或有产物生成，而不含酶X 的反应体系中底物无明显变化或无产物生成。
13．（2025·贵州·高考真题）番茄细胞中线粒体形态与其自身功能密切相关，并影响番茄果实的成熟过程。
研究者将决定蛋白质在细胞内定位的特定肽链“嫁接”到绿色荧光蛋白（GFP）上，控制GFP 在番茄细胞
内的分布，从而在显微镜下观察线粒体的形态变化。回答下列问题：
(1)根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的 拼接在一起完成“嫁接”，
细胞色素c 氧化酶Ⅳ（COXⅣ）参与有氧呼吸生成水的过程。COXⅣ的一段肽链序列X 决定了COXⅣ在
细胞内的分布，研究者选择将X 与GFP 拼接，理由是 。
(2)拼接好的序列应插入下图中农杆菌T-DNA 的 （填下图字母）处。理由是 。
(3)选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为 。农杆菌侵染后有一定几
率将目的基因整合到番茄细胞的 中，番茄组织培养过程中，芽诱导期需在培养基中添加的植物激素
是 。
【答案】(1) DNA 序列 COXⅣ位于线粒体内膜，它的肽链序列X 能引导GFP 定位到线粒体，
从而通过GFP 来观察线粒体的形态变化
(2) B B 位于启动子下游与终止子上游，目的基因插入B 点才可能转录
(3) 外植体 染色体DNA 生长素和细胞分裂素
【详解】（1）根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的DNA 序列拼接在一
起完成 “嫁接”（蛋白质工程是通过改造基因来改造蛋白质）。COXⅣ 的一段肽链序列X 决定了
COXⅣ 在细胞内的分布，研究者选择将X 与GFP 拼接，理由COXⅣ位于线粒体内膜，它的肽链序列X
能引导GFP 定位到线粒体，从而通过GFP 的荧光来观察线粒体的形态变化（利用X 的定位功能，使GFP
标记线粒体）。
（2）拼接好的序列应插入农杆菌 Ti - DNA 的B 处。B 位于启动子下游与终止子上游，目的基因插入B 点
才可能转录。
（3）选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为外植体（外植体是植物组织
培养中用于培养的离体器官、组织或细胞）。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的染色
体DNA 中（农杆菌的 T - DNA 会整合到植物细胞的染色体 DNA 上）。番茄组织培养过程中，诱导期需
在培养基中添加的植物激素是生长素和细胞分裂素（植物组织培养中，生长素和细胞分裂素的比例会影响
细胞的脱分化和再分化过程，芽诱导期需要这两种激素来启动细胞的分裂和分化）。
14．（2025·重庆·高考真题）绝大多数哺乳动物生来怕辣，而小型哺乳动物树鼩先天不怕辣，喜食含辣椒
素类物质的植物。为探究其原因，我国研究人员进行了系列研究。
(1)研究发现，树鼩的受体蛋白TR1 对辣椒素的敏感性低于其他哺乳动物。为研究树鼩和其他哺乳动物TR1
蛋白的差异，可设计开展如下实验：
32
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
① ；
②将 分别进行酶切并连接；
③将重组DNA 分子导入大肠杆菌；
④分离表达的TR1 蛋白质测定 ，明确蛋白之间的差异。
(2)树鼩及一些哺乳动物的TR1 蛋白存在差异，如图所示。据分析，树鼩对辣椒素的敏感性降低，很可能是
由于TR1 第579 位氨基酸差异造成的，可证实该推测的实验思路是 。
(3)树鼩与其喜食植物的地理分布基本一致，据此可推测树鼩对含辣椒素类物质植物的适应形成的必要条件
是 。
【答案】(1) 克隆树鼩和其他哺乳动物的TR1 基因 目的基因与载体 氨基酸序列
(2)利用基因编辑技术改变树鼩的TR1 基因，使编码的TR1 蛋白的第579 位氨基酸由M 变为T，检测树鼩
对辣椒素的敏感性是否提高。
(3)树鼩群体出现可遗传的变异和含辣椒素类植物对树鼩的定向选择
【详解】（1）基因工程的基本操作程序是目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导
入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。据此分析①为克隆树鼩和其他哺乳动物TR1 蛋白基因。②为将树鼩、
其他哺乳动物TR1 蛋白基因和载体分别进行酶切并连接构建基因表达载体。由(2)中展示的蛋白质之间的差
异推测④为检测树鼩和其他哺乳动物TRI 蛋白质的氨基酸序列。
（2）树鼩TRI 蛋白第579 位氨基酸为M，人和小鼠TR1 蛋白第579 位氨基酸为T，利用基因编辑技术改变
树鼩的TR1 基因，使编码的TR1 蛋白的第579 位氨基酸由M 变为T，若替换后树鼩对辣椒素的敏感性升高，
则可以证实树鼩对辣椒素的敏感性降低是由TRI 蛋白第579 位氨基酸序列差异造成的。
（3）适应形成的必要条件是树鼩群体出现可遗传的变异，含辣椒素类物质的植物可以拓宽树嗣的食物来
源，环境对树鼩进行定向选择，使得树鼩种群中对辣椒素敏感度低的基因频率升高，让树鼩适应含辣椒素
类物质的植物。
15．（2025·甘肃·高考真题）水稻白叶枯病（植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑）由白
叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9 基因组编辑技术，对水稻白叶枯
病的感病基因SWEET（该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻）的启动子区进行了定点“修改”，编辑后
的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株（如下图）。回答下列问题。
33
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
(1)CRISPR-Cas9 重组Ti 质粒构建完成后，可通过 （方法）将该质粒转入植物细胞，并将
整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞，需要在植物组织培养基中添加 。
(2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为 ，对其消毒时需依次使用酒精和
处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素，原因是 。
(3)为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用 技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑；
然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较 来验证
抗病性。
(4)在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为 。
【答案】(1) 农杆菌转化法 Ti 质粒上的T - DNA 潮霉素
(2) 外植体 次氯酸钠 生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素
(3) PCR - 测序 病斑的大小（或病斑面积、发病情况等合理答案）
(4)对感病基因SWEET 的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻。
【详解】（1）将重组Ti 质粒转入植物细胞常用农杆菌转化法。因为农杆菌中的Ti 质粒上的T - DNA（可
转移DNA）能够整合到植物细胞的染色体DNA 上。利用农杆菌侵染植物细胞，从而将重组Ti 质粒导入植
物细胞。为了筛选出转化成功的细胞，由于重组Ti 质粒上含有潮霉素抗性基因（HygR），所以需要在植物
组织培养的培养基中添加潮霉素，只有成功导入重组Ti 质粒的细胞才能在含有潮霉素的培养基上存活。
（2）在植物组织培养中，离体的植物器官、组织或细胞被称为外植体，所以实验中用到的水稻幼胚被称
为外植体。 对水稻幼胚消毒时需依次使用酒精、次氯酸钠处理。 在植物组织培养诱导形成再生植株的过
程中，生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。不同浓度的生长素和细胞分裂
素的配比可以调控细胞的分裂和分化方向，从而诱导形成根和芽等不同的器官，最终形成再生植株。
（3）为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用PCR - 测序技术检测目标基因的启动子区是否编辑成
功。通过PCR 扩增目标基因的启动子区片段，然后进行测序，与编辑前的序列进行对比，看是否发生了预
期的改变。 在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较病斑的大小
（或病斑面积、发病情况等）来验证抗病性。如果基因编辑后的水稻病斑明显小于野生型水稻，说明其抗
病性增强。
（4）在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为：对感病基因SWEET 的启动子区进行
定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻，从而使水稻获得了抗病性。
34
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
16．（2025·四川·高考真题）杆菌M2 合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与
细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA 进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-
lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。
注：①F1、F2、F3 和F4 为与相应位置的DNA 配对的单链引物，“→”指引物5-3 方向。②密码子对应的
氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。
(1)用PCR 技术从杆菌M2 基因组中扩增lrcA-lrcF 目的基因时，应选用 引物。本研究载体使用了链
霉菌的复制原点，其目的是 。
(2)采用EcoRI 和BamHI 完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 条电泳
条带，电泳检测酶切产物的目的是 。
(3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带 （填氨基酸名称）的tRNA 进入结合位点，
导致 ，最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀
菌活性丧失，可能的原因是 。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一
步研究的问题有 （答出1 点即可）。
【答案】(1) F2、F4 保证载体能在链霉菌细胞中能正常复制
(2) 2 验证重组质粒是否构建成功
(3) 苯丙氨酸或phe 翻译受阻
(4) 目的基因发生突变或变异 发酵条件优化
【详解】（1）引物需要结合到模板的3'端，且与目的基因的部分碱基序列互补配对，子链延伸方向为5'端
→3'端，因此用PCR 技术从杆菌M2 基因组中扩增lrcA-lrcF 目的基因时，应选用F2、F4 引物。载体使用链
霉菌的复制原点，是为了保证载体能在链霉菌细胞中复制，也使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传
给后代。
（2）采用 EcoRI 和 BamHI 完全酶切构建的重组质粒，会得到载体片段和目的基因片段，共 2 条电泳
条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功，若能得到预期的载体片段和目的基因片段
大小的条带，说明酶切成功，重组质粒构建可能成功，但是还需要进一步的鉴定。
（3）观察拉索西丁的作用机制图，结合所给密码子信息，可知拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带苯
丙氨酸的 tRNA 进入结合位点。因为位点 2 对应的密码子是 UUC，编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带
苯丙氨酸的 tRNA 进入结合位点，会导致翻译过程无法正常进行，进而使细菌无法合成蛋白质，最终引起
细菌死亡。
35
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
（4）重组链霉菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是目的基因发生
突变或变异，导致其表达的产物结构改变，从而失去杀菌活性；也可能是目的基因的表达受到抑制等。若
运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有：优化发酵条件，如温度、
pH、溶氧量等；如何提高发酵产物的产量；产物的分离和纯化方法等。
17．（2025·广东·高考真题）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期
两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶
段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2 为模式蛋白。测试质粒功
能。回答下列问题：
(1)研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA 短肽的mKate2，将质粒导入感受态细
胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR 及 检测，筛选
获得重组菌株W1。
(2)将W1 在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 （答一种）。接种
前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强
度快速下降，原因是 。
(3)研究者选用启动子PX、X 基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入
野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2 的生长趋势不变，培养期间荧光强度的
变化趋势为 。
(4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A 活性弱，且
莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在
生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提
出重组生产菌株构建思路： 。
36
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
【答案】(1)mKate2 蛋白或荧光
(2) 细菌计数板计数法 作为mKate2 蛋白的荧光对照 PGro在生长稳定期停止基因转录，且带
有SsrA 短肽的mKate2 被降解
(3)快速生长期荧光值较低，生长稳定期快速增强
(4)先敲除野生菌株中的酶B 基因，再将质粒①中的mKate2 基因替换为酶B 基因，将质粒②中的mKate2 基
因替换为酶A 基因，并将两种质粒导入野生菌株中
【详解】（1）在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，根据质粒中存在红色荧光蛋
白基因，可利用荧光检测，筛选获得重组菌株W1。
（2）检测培养液中细胞密度常用的方法是细菌计数板计数法。接种前检测液体培养基的荧光强度，作用
是作为mKate2 蛋白的荧光对照。进入生长稳定期后，由于PGro在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成
带有SsrA 短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA 短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并
以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。
（3）在重组菌株W2 中，启动子PX 被阻遏蛋白X 阻遏转录。在细胞快速生长阶段，阻遏蛋白X 阻遏
mKate2 基因的表达；随着细胞进入生长稳定器，阻遏蛋白X 停止表达并被降解，对PX 启动子的阻遏作用
降低，mKate2 基因开始表达，荧光强度开始上升，由于原料的限制，最后保持稳定，所以培养期间荧光强
度的变化趋势为快速生长期荧光值较低，生长稳定期快速增强 。
（4）为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，
结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除
酶B 基因；然后将质粒①中的mKate2 基因替换为酶B 基因，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表
达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后该酶降解，减少对莽草酸的转化；同时将质粒②中的mKate2
基因替换为酶A 基因，利用其调控机制在生长稳定期实现莽草酸合成相关基因的稳定表达，从而大量积累
莽草酸，最后将两种质粒导入野生菌株。
17．（2025·河南·高考真题）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应
用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下
列问题：
(1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是 。将培养后的菌液混匀并充分 ，再接
种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG 活性最高的菌种。
(2)为构建携带cg（CG 的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg 的PCR 扩增产物和质粒进行双酶
切，随后用E.coliDNA 连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg 转录模板链的5'端最好含有 酶切
位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA 连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒
分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是 。
37
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
限制酶的识别序列和切割位点如下：
(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 ，随后在含
和 的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
(4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG 的耐热性，研究
人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2
所示。根据分析结果，选择第 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是 。
【答案】(1) 在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释
(2) BamHI 重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列
(3) 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态 卡拉胶 四环素
(4) 44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功
能的影响较小
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的
基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉
38
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大，因此可选择海藻和海
泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得
了CG 活性最高的菌种。
（2）E.coliDNA 连接酶只能连接具有黏性末端的片段，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的
限制酶，即不能选择EcoRV 酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与
XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连、甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只
能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA 形
成的方向是5’→3’，且mRNA 与DNA 的模板链方向相反，因此基因模板链的3’应靠近启动子，故为保证
连接准确性和效率，cg 转录模板链的5'端最好含有BamHI 酶切位点。T4DNA 连接酶既可以连接平末端，
也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4DNA 连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连
接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合
进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA 连接酶重复上述实验，获得的部分重
组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是重组质粒连
接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。
（3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是使细胞处于一种能吸
收周围环境中DNA 分子的生理状态，便于重组DNA 进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶（CG）的
菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因的
大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的
菌株。
（4）据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44 位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容
易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44 位的氨基酸替换成半胱氨酸最
合适。
18．（2025·河南·高考真题）某二倍体植物松散株型与紧凑株型是一对相对性状，紧凑株型适合高密度种
植，利于增产。研究人员获得了一个紧凑株型的植株，为研究控制该性状的基因，将其与纯合松散株型植
株杂交，F1均为松散株型，F2中松散株型：紧凑株型=3：1，控制该相对性状的基因为A/a。回答下列问题：
(1)该紧凑株型性状由 （填“A”或“a”）基因控制。
(2)在A 基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a 基因（图1），a 基因表达的肽链比A 基因表达的肽
链短。造成此现象的原因是 。
39
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
(3)研究人员设计了3 条引物（P1~P3），位置如图1（→表示引物5´→3´方向）。以3 个F2单株（甲、乙、
丙）的DNA 为模板，使用不同引物组合进行PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳结果分别为图2-A 和2-B（不考
虑PCR 结果异常）。
①图2-A 中使用的引物组合是 ；丙单株无扩增条带的原因是 。
②结合图2-A 的扩增结果，在图2-B 中，参照甲的条带补充乙与丙的电泳条带（将正确条带涂黑）
。
③使用图2-A 中的引物组合扩增F2全部样本，有扩增条带松散株型：无扩增条带松散株型= 。
【答案】(1)a
(2)插入序列后，a 基因中编码终止密码子的序列提前，a 基因转录产生的mRNA 提前终止翻译
(3) P2和P3 丙的基因型为AA，无引物P3 的结合序列，利用引物P2 和P3 扩增时，无法得到扩增
产物
2 1∶
【详解】（1）根据题意可知，研究人员获得了一个紧凑株型的植株，为研究控制该性状的基因，将其与
纯合松散株型植株杂交，F1均为松散株型，F2中松散株型∶紧凑株型=3 1∶，说明紧凑株型为隐性性状，由a
基因控制。
（2）在A 基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a 基因（图1），a 基因表达的肽链比A 基因表达的
肽链短，说明终止密码子提前出现，因此推测可能是A 基因内部插入一段序列后，使a 基因中编码终止密
码子的序列提前，a 基因转录产生的mRNA 提前终止翻译。
（3）①子二代中的基因型为AA、Aa、aa，根据图示可知，A 和a 基因上均含有P1和P2引物互补的序列，
而P3引物识别的序列只有a 基因中才存在，若选择引物P1和P2进行扩增，则A 基因和a 基因均能扩增出相
应产物，只是a 基因扩增的产物长度要大于A 基因扩增的产物，即AA 的个体扩增产物的电泳条带与aa 的
个体扩增产物的电泳条带不同，且Aa 的个体扩增产物的电泳条带应为两条，与图A 不符，若选择引物P3
和P2进行扩增，则只有Aa 和aa 的个体中因含有a 基因而能扩增出产物，且扩增出的产物电泳条带相同，
而AA 的个体由于不含与P3引物结合的序列，因此不能扩增出产物，没有对应的电泳条带。即图2-A 中使
40
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考高考-总复习”~~~
用的引物组合是P2和P3，丙的基因型为AA，无引物P3 的结合序列，利用引物P2 和P3 扩增时，无法得到
扩增产物。
②图A 是利用引物P3和P2扩增后电泳的结果，则图B 是利用引物P1和P2扩增的产物电泳的结果，由于a
基因扩增出来的产物长度大于A 基因扩增的产物，因此AA（松散株型）、aa（紧凑株型）基因的个体扩
增的产物电泳时均只有一个条带，且aa 基因的个体扩增的产物电泳时形成的电泳条带距离点样孔近，而
Aa（松散株型）的个体扩增的产物电泳时会出现两个电泳条带，故乙与丙的电泳条带为
。
③使用图2-A 中的引物组合（P3和P2）扩增F2全部样本，由于只有含a 基因的个体才能扩增出相应产物，
且A-为松散株型，而子二代中Aa AA=2 1
∶
∶，所以使用图2-A 中的引物组合扩增F2全部样本，有扩增条带松
散株型（Aa）∶无扩增条带松散株型（AA）=2 1∶。
41
