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第42 讲 基因工程以及生物技术的安全性和伦理问题
目录
01 课标达标练
【题型一】重组DNA 技术的基本工具
【题型二】基因工程的基本操作程序
【题型三】基因工程的应用
【题型四】蛋白质工程的原理和应用
【题型五】生物技术的安全性与伦理问题
02 能力突破练 (新考法+新情境)
03 高考溯源练 (含2025 高考真题)
题型一 重组DNA 技术的基本工具
1．下列各项科学研究成果，不能作为基因工程直接理论基础的是（ ）
A．DNA 双螺旋结构模型的建立
B．孟德尔遗传规律的发现
C．遗传密码的破译
D．中心法则的确立
【答案】B
【详解】A、DNA 双螺旋结构模型的建立属于基因工程直接理论基础，A 不符合题意；
B、孟德尔遗传规律的发现不属于基因工程直接理论基础，B 符合题意；
C、遗传密码的破译属于基因工程直接理论基础，C 不符合题意；
D、中心法则的确立明确了的生物界共用一套密码子，是基因工程直接理论基础，D 不符合题意。
故选B。
2．下列关于DNA 聚合酶、限制酶、DNA 连接酶有关的叙述，错误的是（ ）
A．都是由脱氧核苷酸连接而成的多聚体
B．都能降低相应化学反应所需的活化能
C．催化活性都要受温度、pH 等的影响
D．其合成过程都需经过转录和翻译阶段
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【答案】A
【详解】A、DNA 酶、限制酶、DNA 连接酶的化学本质都是蛋白质，都是由氨基酸连接而成的多聚体，A
错误；
B、酶能降低化学反应所需的活化能，因此这三种酶都能降低相关化学反应所需的活化能，B 正确；
C、酶的作用条件温和，温度、pH 等都会影响酶活性，故这三种酶的作用过程都要受温度、pH 等的影响，
C 正确；
D、三种酶的化学本质都是蛋白质，蛋白质的合成需经过转录和翻译阶段，D 正确。
故选A。
3．大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核 DNA 就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布
在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒 DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．可利用 DNA 在酒精中溶解度较大的特点来提取质粒 DNA
B．凝胶中的 DNA 分子通过染色，可在 300nm 的紫外灯下被检测出来
C．将提取的 DNA 溶于 0.2mol/L NaCl 溶液后，可用二苯胺试剂进行鉴定
D．根据电泳结果，质粒上没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，有限制酶Ⅲ的切割位点
【答案】B
【详解】A、蛋白质可溶于酒精，而DNA 在冷酒精中溶解度很低，所以在提取DNA 时加入酒精，使溶于
酒精的蛋白质等物质溶解，而让DNA 析出，A 错误；
B、凝胶中的DNA 分子通过染色，可在紫外灯下出现一定的颜色特征，从而被检测出来，B 正确；
C、由于DNA 在2 mol/L NaCl 溶液中溶解度较大，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色，所以将提取的DNA 溶
于2 mol/L NaCl 溶液后，可用二苯胺试剂在沸水条件进行鉴定，C 错误；
D、因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个切割
位点，也可能没有切割位点，D 错误。
故选B。
4．下列关于基因工程工具酶的叙述，正确的是（ ）
A．大多限制酶的识别序列由6 个核苷酸组成
B．限制酶可切割特定核苷酸序列之间的氢键
C．DNA 聚合酶和DNA 连接酶都是构建重组DNA 的关键酶
D．T4DNA 连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端
【答案】A
【详解】A、限制酶通常识别双链DNA 的特异序列，大多数限制酶的识别序列由6 个核苷酸组成，A 正确；
B、限制酶切割的是磷酸二酯键，而非氢键（氢键由解旋酶断开），B 错误；
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C、DNA 连接酶用于连接DNA 片段间的磷酸二酯键，是构建重组DNA 的关键酶；而DNA 聚合酶用于将
单个脱氧核苷酸连接到链上（如DNA 复制），不直接参与重组DNA 的连接，C 错误；
D、T4 DNA 连接酶可连接黏性末端和平末端，D 错误。
故选A。
5．几种限制酶的识别序列和切割位点如表所示。下列相关叙述正确的是（ ）
限制酶
识别序列和切割位点
BamHI
5'-G↓GATCC-3'
Sau3AI
5'-↓GATC-3'
Acc65I
5'-G↓GTACC-3′
A．3 种限制酶切割形成的末端中，既有黏性末端又有平末端
B．经Acc65I 酶切后得到的黏性末端序列为5'-GTAC-3′
C．能用Sau3AI 酶切的DNA 序列亦可被BamHI 酶切
D．目的基因和质粒分别用BamHI 和Sau3AI 酶切后，用DNA 连接酶连接形成的重组质粒可被BamHI
酶切
【答案】B
【详解】A、由表可知，BamHI 识别序列为5′−G↓GATCC−3′，Sau3AI 识别序列为5′−↓GATC−3′ ，Acc65I
识别序列为5′−G↓GTACC−3′ ，这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端，没有平末端，A 错误；
B、Acc65I 的识别序列是 5'-G↓G TACC-3'，切割位点在 G 和 G 之间，经Acc65I 酶切后得到的黏性末
端序列为5'-GTAC - 3'，B 正确；
C、BamHI 的识别序列是5'-G↓GATCC-3'，Sau3AI 的识别序列是5'-GATC - 3'，能被Sau3AI 酶切的 DNA
序列不一定能被BamHI 酶切，因为BamHI 识别的序列是特定的，C 错误；
D、目的基因和质粒分别用BamHI 和Sau3AI 酶切后，用DNA 连接酶连接形成的重组质粒可被Sau3AI 酶
切，但不一定能被BamHI 酶切，D 错误。
故选B。
题型二 基因工程的基本操作程序
6．进行PCR 时，若设计的引物过短，则会出现对应不良情况。下列不属于对应不良情况的是（ ）
A．引物与特异性位点结合的正确率降低
B．PCR 后出现多条非特异性子链
C．引物与模板链结合的稳定性增强
D．引物之间发生互补配对的概率增大
【答案】C
【详解】A、引物过短，与模板的特异性匹配位点减少，结合正确率降低（易结合非目标序列），属于不
良情况，A 不符合题意；
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B、引物特异性差，会导致 PCR 扩增时结合多个非目标区域，产生多条非特异性子链，属于不良情况，B
不符合题意；
C、引物与模板的结合稳定性取决于互补碱基数量（长度越长，互补碱基越多，稳定性越强）。引物过短，
互补碱基少，结合稳定性减弱，而非 “增强”，因此该表述不属于引物过短的不良情况，C 符合题意；
D、引物过短，自身或引物之间更易发生互补配对（形成 “引物二聚体”），导致引物无效，属于不良情
况，D 不符合题意。
故选C。
7．香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。为生产较多的香树脂醇，通过PCR 技术快
速扩增相关基因是关键的步骤之一。下列关于PCR 技术的叙述错误的是（ ）
A．引物的作用是使DNA 聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
B．设计引物时，可先从基因序列数据库中查询该基因的编码序列
C．引物的长度通常为20-30 个核苷酸，且引物对之间的碱基序列要互补
D．引物的5'端通常需要添加限制酶的识别序列，便于基因表达载体的构建
【答案】C
【详解】A、引物提供3'端羟基，作为DNA 聚合酶延伸DNA 链的起点，因此引物的作用是使DNA 聚合酶
从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，A 正确；
B、设计引物需依据目标基因的序列，基因编码序列是PCR 扩增的常用模板，因此查询基因编码序列合理，
B 正确；
C、引物对之间的碱基序列互补会导致引物相互结合（形成引物二聚体），降低扩增效率，因此引物对的
碱基序列不应互补，C 错误；
D、在基因表达载体构建时，常需在引物的5'端添加限制酶识别序列，以便后续切割和连接，D 正确。
故选C。
8．下列关于PCR 扩增DNA 片段及电泳鉴定的叙述，正确的有（ ）
A．PCR 扩增过程中双链DNA 解旋是通过加热实现的
B．用于PCR 扩增的Taq 酶是一种耐高温的逆转录酶
C．PCR 反应体系中需加入适量ATP 溶液来驱动子链延伸
D．扩增循环按顺序一般分复性、变性、延伸三步
【答案】A
【详解】A、PCR 扩增中双链DNA 解旋通过高温（约95℃）实现，称为变性，无需解旋酶，A 正确；
B、Taq 酶是耐高温的DNA 聚合酶，而非逆转录酶（逆转录酶用于以RNA 为模板合成DNA），B 错误；
C、PCR 反应中由dNTP 提供原料和能量，无需额外添加ATP，C 错误；
D、PCR 循环的正确顺序为变性→复性→延伸，D 错误。
故选A。
9．科学家从美国黄石国家公园热泉的嗜热菌中成功分离出耐高温的DNA 聚合酶（TaqDNA 聚合酶），这
一成果为PCR 的实现奠定了基础。下列说法正确的是（ ）
A．嗜热菌细胞质中含有DNA 和RNA，其遗传物质主要是DNA
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B．嗜热菌在无丝分裂过程中利用TaqDNA 聚合酶催化形成磷酸二酯键
C．可利用DNA 和蛋白质在酒精中的溶解度差异分离嗜热菌DNA
D．相较于普通的细菌，嗜热菌DNA 中的GC 碱基对比例更低
【答案】C
【详解】A、嗜热菌为原核生物，其遗传物质是DNA，不存在“主要是DNA”的说法（原核生物的遗传物
质只有DNA），A 错误；
B、无丝分裂是真核生物的细胞分裂方式，嗜热菌作为原核生物通过二分裂增殖，且DNA 聚合酶的作用是
催化脱氧核苷酸连接形成磷酸二酯键，但分裂方式描述错误，B 错误；
C、DNA 不溶于体积分数为95%的冷酒精，而蛋白质可能溶解，利用此差异可分离DNA，C 正确；
D、GC 碱基对含3 个氢键，比AT 对更稳定。嗜热菌生活在高温环境中，其DNA 中GC 比例应更高以维持
结构稳定性，D 错误；
故选C。
10．如图是利用基因工程技术培育抗除草剂作物的部分过程，其中Pst I、Sma I、EcoR I、Apa I 为四种限
制酶，且切割DNA 分子后形成的末端均不同。下列说法正确的是（ ）
A．图示质粒分子在Sma I 切割前后分别含有0 或1 个游离的磷酸基团
B．培育抗除草剂作物的核心是将含bar 基因的表达载体导入受体细胞
C．可选用Pst I 和EcoR I 切割质粒和bar 基因，确保目的基因正确插入
D．利用PCR 技术可从分子水平检测bar 基因是否翻译出抗除草剂蛋白
【答案】C
【详解】A、质粒为环状DNA，Sma I 切割后形成线性DNA，含2 个游离磷酸基团，A 错误；
B、基因工程核心是构建基因表达载体，B 错误；
C、Pst I 和EcoR I 切割可避免质粒自身环化和目的基因反向连接，C 正确；
D、PCR 检测目的基因是否导入，抗原-抗体杂交检测是否翻译，D 错误。
故选C。
11．土壤农杆菌天然Ti 质粒的结构如图所示。当植物受伤后会释放酚类物质，可激活农杆菌Vir 基因，其
中Vir 基因是一组基因，可编码virA、virB、virC 等一系列对T-DNA 转移及整合必不可少的蛋白质；冠瘿
碱为农杆菌提供碳源和氮源，可诱导植物产生瘤状结构。Ti 质粒需经过改造才能广泛应用于植物基因工程，
下列对于Ti 质粒功能及改造过程的推断，不合理的是（ ）
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A．农杆菌中的Ti 质粒作为遗传物质，侵染植物细胞时并不是整个Ti 质粒进行转移
B．当农杆菌附着在植物细胞表面后，Ti 质粒vir 区基因便会被激活和表达，从而发挥作用
C．冠瘿碱合成基因只能在宿主植物体内表达，表达产物会被农杆菌利用
D．需要在T-DNA 区域和T-DNA 之外的区域加上不同的标记基因，为便于后续筛选
【答案】B
【详解】A、农杆菌侵染植物时，仅 Ti 质粒中的 T-DNA 区域转移并整合到植物染色体，并非整
个质粒转移，A 符合题意；
B、Vir 基因的激活需要植物受伤释放酚类物质，而非农杆菌附着在植物细胞表面就会激活，B 不
符合题意；
C、冠瘿碱合成基因在植物体内表达后，可诱导植物产生瘤状结构，其产物可为农杆菌提供碳源和
氮源，C 符合题意；
D、需要在T-DNA 区域和T-DNA 之外的区域加上不同的标记基因，T-DNA 区域加标记基因 ，筛选出T-
DNA 整合到植物染色体上的细胞，T-DNA 之外的区域加上不同的标记基因，在重组 Ti 质粒构建时，
筛选成功导入质粒的农杆菌，D 符合题意。
故选B。
12．下列关于基因文库的叙述，正确的是（ ）
A．cDNA 文库中的基因可以在不同物种间进行交流
B．水稻基因组文库中的每个受体菌都含有水稻全部的基因
C．部分基因文库克隆数越多，从中筛选出目的基因越容易
D．构建基因组文库时需要使用逆转录酶、限制酶和DNA 连接酶
【答案】A
【详解】A、cDNA 文库中的基因可以在不同物种间进行交流，A 正确；
B、水稻基因组文库中的每个受体菌重组DNA 只含有部分水稻基因，B 错误；
C、部分基因文库克隆数越多，从中筛选出目的基因越难，C 错误；
D、构建基因组文库时，首先需用限制酶切割DNA 和质粒，然后用DNA 连接酶将两者连接起来形成重组
质粒，最后将不同的DNA 片段分别导入不同的受体菌群，形成基因组文库，D 错误。
故选A。
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题型三 基因工程的应用
13．基因编辑技术是一种新兴的基因工程技术，可对生物体的基因组进行定点修饰。下列关于基因编辑技
术的叙述，正确的是（ ）
A．基因编辑技术只能改变生物体的单个基因
B．基因编辑技术可用于治疗某些遗传性疾病
C．基因编辑技术不会对生物体的其他基因造成影响
D．基因编辑技术培育的生物个体不会产生新的性状
【答案】B
【详解】A、基因编辑技术通过特定工具（如CRISPR-Cas9）可对目标基因进行定点修饰，但技术上可设
计多个向导RNA 同时编辑多个基因，因此“只能改变单个基因”的说法错误，A 错误；
B、某些遗传性疾病是由特定基因缺陷引起的，基因编辑技术可通过定点修复缺陷基因，用于治疗这些遗
传性疾病，B 正确；
C、基因编辑技术虽为定点修饰，但仍可能对生物体的其他基因或基因组结构造成一定影响（如脱靶效应
等），C 错误；
D、基因编辑技术通过修饰基因，可能使生物体产生新的性状（如修复致病基因后获得正常性状，或引入
新基因后产生新性状），D 错误。
故选B。
14．生物的变异在育种中有重要作用，下列关于变异和育种的说法，不正确的是（ ）
A．太空育种主要通过宇宙射线诱导基因突变和染色体变异，选育新品种
B．杂交水稻的培育过程中，雄性不育株的出现可以简化育种流程
C．多倍体育种利用秋水仙素在有丝分裂后期抑制纺锤体形成，使染色体加倍
D．基因工程育种定向改造生物的性状，其原理是基因重组
【答案】C
【详解】A、太空育种利用宇宙射线诱导基因突变和染色体结构变异，属于诱变育种，A 正确；
B、雄性不育株可省去人工去雄步骤，简化杂交育种流程，B 正确；
C、秋水仙素通过抑制有丝分裂前期纺锤体的形成，使染色体数目加倍，C 错误；
D、基因工程育种通过人为导入目的基因定向改变生物的性状，原理为基因重组，D 正确。
故选C。
15．基因工程在农牧业、医药卫生领域、食品工业方面都有广泛的应用，以下叙述错误的是（ ）
A．目前利用基因工程技术可以生产细胞因子、抗体和疫苗等
B．将药用蛋白基因导入奶牛乳腺细胞可构建乳腺生物反应器
C．用基因工程技术获得的工业用酶纯度高、生产成本显著降低
D．将来源于某些病毒、真菌的抗病基因导入植物中，可培育转基因抗病植物
【答案】B
【详解】A、利用基因工程技术可以将相关基因导入微生物，通过培养微生物来生产细胞因子、抗体和疫
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苗等，A 正确；
B、通过显微注射的方法将基因表达载体导入哺乳动物的受精卵中，再将受精卵培育为转基因动物，构建
乳腺生物反应器，B 错误；
C、相比从天然产物中提取的酶，用基因工程技术获得的工业用酶纯度更高，而且生产成本显著降低，生
产效率较高，C 正确；
D、将来源于某些病毒、真菌的抗病基因导入植物中，利用植物组织培养技术，可培育转基因抗病植物，D
正确。
故选B。
题型四 蛋白质工程的原理和应用
16．利用蛋白质工程对干扰素进行改造，可在一定条件下延长其保存时间。下列叙述错误的是（ ）
A．天然蛋白质合成的过程按照中心法则进行，蛋白质工程与之相反
B．利用蛋白质工程对干扰素进行改造时，操作对象是干扰素
C．经改造后的干扰素基因能通过工程菌的繁殖实现遗传
D．对干扰素的改造遇到的最大难题是干扰素的高级结构十分复杂
【答案】B
【详解】A、天然蛋白质的合成遵循中心法则（DNA→RNA→ 蛋白质）；蛋白质工程是从预期蛋白质功
能出发，反向推导基因序列（蛋白质→氨基酸序列→基因），与中心法则方向相反，A 正确；
B、蛋白质工程的操作对象是基因（通过修饰或合成基因来改造蛋白质），而非蛋白质（干扰素）本身。
若直接操作蛋白质，无法实现可遗传的改造，B 错误；
C、经改造的干扰素基因可导入工程菌，工程菌繁殖时会复制该基因，从而实现基因的遗传（进而持续表
达改造后的干扰素），C 正确；
D、蛋白质的高级结构（空间结构）十分复杂，而蛋白质工程需精准设计蛋白质的空间结构以实现预期功
能，这是改造过程中面临的最大难题之一，D 正确。
故选B。
17．科学家通过对相关基因进行改造，使T4 溶菌酶的第3 位异亮氨酸变成了半胱氨酸，于是在该半胱氨酸
与第97 位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，T4 溶菌酶的耐热性得到了提高。下列说法错误的是
（ ）
A．若利用微生物生产T4 溶菌酶，可采用显微注射技术将重组质粒导入受体细胞
B．该技术需要从预期的蛋白质功能出发，推测应有的氨基酸序列
C．该技术属于蛋白质工程，合成的蛋白质不是自然界中已存在的
D．改造后T4 溶菌酶的氨基酸序列和空间结构都不同于天然溶菌酶
【答案】A
【详解】A、利用微生物生产T4 溶菌酶，可以使用
处理的方法将目的基因导入受体细胞，A 错误；
B、该技术需要从预期的蛋白质功能出发，推测应有的氨基酸序列，属于蛋白质工程，B 正确；
C、该技术属于蛋白质工程，合成的蛋白质不是自然界中已存在的，C 正确；
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D、改造后T4 溶菌酶的氨基酸序列与天然溶菌酶不同，由于新形成了二硫键，其空间结构也不同于天然蛋
白质，D 正确。
故选A。
18．人工智能加速了蛋白质工程的发展进程，利用人工智能分析海量抗原-抗体结合数据并构建预测模型，
从而辅助设计出具有特定功能的全新抗体。下列叙述正确的是（ ）
A．抗原-抗体结合数据的建立遵循碱基互补配对原则
B．通过直接改造蛋白质的结构可获得大量人工智能所设计的抗体
C．与杂交瘤技术相比，蛋白质工程可以生产自然界中不存在的抗体
D．根据人工智能设计的氨基酸序列只能推测出一种对应的脱氧核苷酸序列
【答案】C
【详解】A、抗原与抗体的结合基于空间结构的特异性识别，属于蛋白质间的相互作用，而碱基互补配对
原则是核酸复制、转录等过程中的规律，A 错误；
B、蛋白质工程通过改造或合成基因来间接获得目标蛋白质，直接改造蛋白质结构无法实现大量生产（蛋
白质无法自我复制），B 错误；
C、杂交瘤技术生产的单克隆抗体来源于天然存在的B 淋巴细胞，而蛋白质工程可设计并合成自然界中不
存在的新型抗体，C 正确；
D、由于密码子的简并性（多个密码子编码同一种氨基酸），同一氨基酸序列可能对应多种脱氧核苷酸序
列，D 错误。
故选C。
19．科研人员依据下图对绿色荧光蛋白进行改造和设计，下列叙述错误的是（ ）
A．绿色荧光蛋白是由基因控制合成的
B．图中的a 和b 分别指多肽链和mRNA
C．蛋白质工程能够制造自然界中不存在的蛋白质
D．蛋白质工程的操作对象是蛋白质，不需要对基因进行操作
【答案】D
【详解】A、绿色荧光蛋白是由绿色荧光蛋白基因控制合成的，A 正确；
B、蛋白质工程需要根据预期功能设计蛋白质三维结构，推导出多肽链，进而推出mRNA 序列和DNA 序
列，所以图中的a 和b 分别指多肽链和mRNA，B 正确；
C、蛋白质工程是指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对
现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，故蛋白质工程可合成天然不存在的蛋白质，C 正确；
D、蛋白质工程是通过改造或修饰基因来实现的，可见蛋白质工程是通过对基因操作实现的，D 错误。
故选D。
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题型五 生物技术的安全性与伦理问题
20．生物技术是一把“双刃剑”，在生物安全层面，基因编辑工具的滥用可能导致不可逆的生态风险；在
伦理维度，技术的越界挑战了人类对生命本质的认知。面对这些挑战，唯有将科学探索置于伦理与安全的
共同基石之上，生物技术才能真正成为推动人类文明进步的可持续力量。下列叙述错误的是（ ）
A．将α-淀粉酶基因与目的基因一同转入植物可防止基因污染
B．我国对转基因技术的方针是研究上要大胆创新、推广要慎重
C．彻底禁止和销毁生物武器是全世界爱好和平人民的共同期望
D．生殖性克隆人与治疗性克隆研究所面临的伦理问题完全相同
【答案】D
【详解】A、将α-淀粉酶基因与目的基因一同转入植物，可能通过该基因在花粉中的表达破坏花粉活性，
阻止转基因植物通过花粉传播基因，从而减少基因污染，A 正确；
B、我国对转基因技术的方针是“研究上大胆创新，推广上慎重”，强调科学研究与安全应用并重，B 正
确；
C、《禁止生物武器公约》明确要求禁止生物武器的研发、生产及储存，彻底销毁生物武器是全球共识，C
正确；
D、生殖性克隆涉及创造完整人类个体的伦理争议（如人权、身份问题），而治疗性克隆以获取干细胞为
目的，主要争议在于胚胎的使用，两者伦理问题性质不同，D 错误。
故选D。
1．cDNA 文库是以特定组织或细胞在某一发育阶段表达的mRNA 为模板，通过逆转录酶合成互补DNA
（cDNA），再将其克隆至载体构建的基因集合。该文库仅包含表达基因的编码序列，反映特定条件下的
转录信息。利用该文库便于筛选功能基因，广泛应用于基因克隆、功能研究、真核生物基因表达及差异表
达分析，下列叙述正确的有几项（ ）
①水稻cDNA 文库中的基因不含有启动子所对应的序列
②水稻cDNA 文库中的基因不含有终止密码子所对应的序列
③构建cDNA 文库过程中需使用逆转录酶、限制酶和 DNA 聚合酶等
④从不同组织细胞中提取的mRNA 建立的cDNA 文库不完全相同
⑤通过定向改变cDNA 序列进而改造蛋白质结构属于蛋白质工程
A．四项
B．三项
C．一项
D．零项
【答案】A
【详解】①启动子是DNA 上的序列，用于启动基因转录，而cDNA 文库是以mRNA 为模板逆转录形成的，
mRNA 是转录的产物，不包含启动子对应的序列，所以水稻cDNA 文库中的基因不含有启动子所对应的序
列，①正确；
②终止密码子在mRNA 上，cDNA 是由mRNA 逆转录而来，所以水稻cDNA 文库中的基因含有终止密码子
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所对应的序列，②错误；
③构建cDNA 文库时，首先用逆转录酶以mRNA 为模板合成cDNA 单链，再用DNA 聚合酶合成cDNA 双
链，之后用限制酶切割载体和cDNA 片段，以便将cDNA 片段插入载体，所以构建cDNA 文库过程中需使
用逆转录酶、限制酶和DNA 聚合酶等，③正确；
④不同组织细胞中基因是选择性表达的，即转录出的mRNA 不同，那么以这些不同的mRNA 为模板建立
的 cDNA 文库不完全相同，④正确；
⑤蛋白质工程是通过改造基因（包括cDNA 序列）来定向改造蛋白质结构，所以通过定向改变cDNA 序列
进而改造蛋白质结构属于蛋白质工程，⑤正确。
综上所述②错误，①③④⑤正确，正确的叙述有四项。
故选A。
2．为使水稻获得抗除草剂性状，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入水稻植株，获得抗草甘
膦转基因水稻。如图所示，下列叙述正确的是（ ）
注:GUS 基因表达产物经染色能从无色变成蓝色
A．构建重组质粒需要限制酶和DNA 聚合酶
B．农杆菌的拟核DNA 与水稻基因发生重组
C．转基因的抗草甘膦转基因水稻具有潮霉素抗性基因
D．诱导幼胚脱分化形成愈伤组织的培养基中需添加植物激素
【答案】D
【详解】A、构建重组质粒时，需要用限制酶切割目的基因和运载体，使它们产生相同的黏性末端或平末
端，然后用DNA 连接酶将目的基因和运载体连接起来，而不是DNA 聚合酶，A 错误；
B、农杆菌转化法的原理是农杆菌中的Ti 质粒上的T-DNA 可转移至受体细胞，并整合到受体细胞（水稻细
胞）的染色体DNA 上，并非农杆菌的拟核DNA 与水稻基因发生重组，B 错误；
C、由图可知，潮霉素抗性基因未被转移到水稻植株中，C 错误；
D、在植物组织培养过程中，诱导幼胚脱分化形成愈伤组织的培养基中需要添加植物激素（如生长素和细
胞分裂素等），以调节脱分化等过程，D 正确。
故选D。
3．研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员
利用大肠杆菌制备了巨噬细胞表面标志蛋白 CD14 蛋白，基因 CD14 的转录方向为从左到右，下图为构
建目的基因及载体的相关示意图。下列有关叙述错误的是（ ）
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A．若 B 链为转录的模板链，则构建基因表达载体时 B 链的 3'端与启动子相连
B．用 Xho I 和 Sal I 双酶切 CD14 基因和载体，经 DNA 连接酶连接后，可用限制酶 Xho I 和 Sal I
对 CD14 基因的连接方向进行鉴定
C．PCR 扩增 CD14 基因，DNA 聚合酶
化引物的 5'端与加入的脱氧核苷酸的 3'端形成磷酸二酯键
D．将重组 DNA 分子导入受体细胞时，可用 Ca2+处理大肠杆菌，使其处于能吸收环境中 DNA 分子
的状态
【答案】C
【详解】A、启动子的作用是启动转录，子链的延伸方向5'到3'，故若B 链为转录的模板链，则构建基因
表达载体时B 链的3'端与启动子相连，A 正确；
B、可进一步用限制酶XhoⅠ和SalⅠ对CD14 的连接方向进行鉴定，是因为正向连接的重组DNA 有这两种
酶切位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的重组DNA 会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点
（没有限制酶的识别序列），B 正确；
C、DNA 聚合酶催化引物的3'端与加入的脱氧核苷酸的5'端形成磷酸二酯键，C 错误；
D、将重组DNA 分子导入受体细胞时，可用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于容易吸收环境中的DNA 分子的
状态，因而提高转化率，D 正确。
故选C。
4．启动子包括组成型启动子（在不同组织、部位都能持续表达）和诱导型启动子（只有在激活
物存在时才表达）。为快速检测水体中的污染物S，科研人员构建了下图所示的基因表达载体（部分结
构），将其导入大肠杆菌，通过检测红色荧光的强度即可估计待测水体中S 的相对浓度。已知调控蛋白可
与S 结合。下列说法错误的是（ ）
A．可通过序列数据库获取红色荧光蛋白基因的碱基序列
B．构建上述基因表达载体时需要使用限制酶和DNA 连接酶
C．启动子1 和启动子2 应分别选择诱导型启动子和组成型启动子
D．若想实现S 的动态清除，可将红色荧光蛋白基因换成S 的降解基因
【答案】C
【详解】A、在基因工程中，对于已知基因（如红色荧光蛋白基因），可以通过序列数据库获取其碱基序
列，然后根据该序列进行引物设计等后续操作，A 正确；
B、构建基因表达载体时，需要用限制酶切割目的基因（红色荧光蛋白基因等）和载体，以获得相同的黏
性末端或平末端，然后再用DNA 连接酶将目的基因和载体连接起来，形成重组表达载体，B 正确；
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C、调控蛋白需持续表达以感知S 的存在，故其启动子1 应为组成型启动子(持续表达)；红色荧光蛋白需在
S 存在时才表达，故其启动子2 应为诱导型启动子(仅调控蛋白+S 时激活)，C 错误；
D、若想实现S 的动态清除，可将红色荧光蛋白基因换成S 的降解基因。这样当水体中有S 时，
调控蛋白与S 结合启动S 的降解基因表达，对S 进行降解，从而实现S 的动态清除，D 正确。
故选C。
5．研究人员将PCR 扩增得到的毒物诱导型启动子S（箭头表示转录方向）插入图中载体P 区，构建表达
载体，转入大肠杆菌，获得能够检测水中毒物的大肠杆菌。下列叙述错误的是（ ）
A．用Ca2+处理大肠杆菌以便于转入构建好的表达载体
B．PCR 扩增时，应在启动子两侧引入EcoR I、BamH I 识别序列
C．可通过转基因大肠杆菌的荧光情况判断水中是否含有毒物
D．在添加氨苄青霉素的培养基上存活的菌株不一定为所需菌株
【答案】B
【详解】A、用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于易于吸收周围环境DNA 分子的状态，便于转入构建好的表达
载体，A 正确；
B、据图可知，目的基因中存在Sma Ⅰ和EcoR Ⅰ两种酶的识别序列，若用这两种酶会破坏目的基因，因此
为防止目的基因和质粒自身环化和正确连接，因此质粒和目的基因应该用Xho Ⅰ、BamH I 切割，因此PCR
扩增启动子S 时，图中引物Ⅰ、Ⅱ应分别加入Xho Ⅰ、BamH I 的识别序列，B 错误；
C、绿色荧光蛋白也是标记基因，可通过转基因大肠杆菌的荧光情况判断水中是否含有毒物，C 正确；
D、氨苄青霉素抗性基因是标记基因，可使用添加氨苄青霉素的培养基筛选转入重组质粒的菌株，在添加
氨苄青霉素的培养基上存活的菌株不一定为所需菌株，也可能只是导入了质粒，D 正确。
故选B。
6．科研人员采用PCR 技术扩增人胰岛素基因，并进行电泳鉴定。图示为某基因表达载体中目的基因结构
及4 种引物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）的结合位点，箭头方向表示引物延伸的方向。下列叙述正确的是（ ）
A．体外扩增目的基因时，应选用的引物组合为引物Ⅰ与引物Ⅳ
B．体外扩增目的基因时，第三轮循环即可获得符合要求的目的基因
C．为确定目的基因是否成功插入质粒，应选择引物Ⅱ与引物Ⅲ进行PCR
D．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA 分子的具体位置
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【答案】B
【详解】A、体外扩增目的基因时，应选用的引物组合为引物Ⅱ与引物Ⅲ，A 错误；
B、因目的基因位于表达载体中间，需要第三轮循环才能获得等长的符合要求的目的基因，B 正确；
C、为确定目的基因是否成功插入质粒，应选择引物Ⅰ与引物Ⅳ进行PCR，C 错误；
D、凝胶电泳中，凝胶载样缓冲液中的指示剂只是用来显示电泳前沿的位置和监控电泳进程，并不能指示
DNA 分子的具体位置，D 错误。
故选B。
7．我国一科研团队在水稻细胞中发现一个能提高水稻产量并缩短生长期的转录因子(OsDREB1C
基因)，将该基因转移到大豆细胞内，获得了转基因高产大豆新品种。下列相关分析，错误的是（ ）
A．为保证 OsDREB1C 基因在大豆细胞中能够高效表达，载体上应含有特定的启动子
B．培养转基因大豆植株的基本程序是含OsDREB1C 基因的大豆细胞培养→愈伤组织 诱导分化⇒植株
C．检测目的基因是否整合到大豆基因组，可提取受体细胞mRNA 经PCR 技术进行基因扩增
D．将转基因幼苗种植在大田中，进行产量测试，可用非转基因植株作为对照
【答案】C
【详解】A、启动子是RNA 聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录。为使OsDREB1C 基因在大豆中高
效表达，载体需携带适合大豆的启动子（如大豆自身或通用型启动子），A 正确；
B、转基因植株的培育需通过植物组织培养技术：含目的基因的细胞经脱分化形成愈伤组织，再诱导分化
成植株。选项描述“培养→愈伤组织→诱导分化→植株”符合流程，B 正确；
C、检测目的基因是否整合到大豆基因组应提取受体细胞DNA 进行PCR，而非mRNA。mRNA 检测用于
确认基因是否转录，C 错误；
D、转基因植株的产量测试需设置空白对照（非转基因植株），以排除其他因素干扰，D 正确。
故选C。
8．RNA 干扰原理是指mRNA 与其它RNA 分子形成局部互补结构后阻断mRNA 翻译。野生型油
菜中的PEP 基因表达会降低油菜籽的含油量。我国科学家将启动子置于PEP 基因的下游，终止子置于PEP
基因的上游构建基因表达载体，并将该基因表达载体导入野生型油菜细胞中获得转基因油菜。下列相关叙
述错误的是（ ）
A．转基因油菜中既有自身的PEP 基因又有反向连接的PEP 基因
B．转基因油菜中的PEP 基因只能转录出一种mRNA
C．转基因油菜中存在RNA 干扰
D．与野生型油菜相比，转基因油菜的油菜籽含油量更高
【答案】B
【详解】A、转基因油菜中原有的PEP 基因未被删除，同时导入了反向连接的PEP 基因（启动子位于下游，
终止子位于上游），因此同时存在两种PEP 基因，A 正确；
B、反向连接的PEP 基因在启动子驱动下会转录出与原有PEP 基因mRNA 互补的RNA，而原有PEP 基因
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仍可正常转录，因此会生成两种RNA，B 错误；
C、互补的RNA 与原有mRNA 结合形成局部双链结构，阻断翻译过程，符合RNA 干扰原理，C 正确；
D、RNA 干扰抑制了PEP 基因的表达，减少其对含油量的负面影响，因此转基因油菜含油量更高，D 正确。
故选B。
9．下图为利用定点突变技术改造基因的过程示意图，相关叙述正确的是（ ）
A．上述技术流程属于蛋白质工程的范畴
B．通过电泳检测，可确认基因突变是否成功
C．上述过程需要人工设计核糖核苷酸片段作为引物
D．导入受体细胞后复制产生的子代 DNA 大多为突变型
【答案】A
【详解】A、蛋白质工程是通过修改基因或创造合成新基因来改变生物的遗传和表型性状，合成新的蛋白
质，上述技术流程属于蛋白质工程的范畴，A 正确；
B、电泳可用于检测PCR 产物或质粒大小，但确认突变需结合测序或限制性酶切分析，仅凭电泳无法直接
确认突变，B 错误；
C、定点突变通常使用脱氧核糖核酸（DNA）作为引物，C 错误；
D、定点突变通常通过PCR 或质粒复制实现，但子代DNA 是否为突变型取决于突变效率和筛选方式，若
未特别筛选，据图示过程，野生型和突变型可能相等，D 错误。
故选A。
10．增强子是可促进基因转录的一小段特殊DNA 序列，现用PCR 扩增增强子和Bt 基因，然后重叠延伸使
两片段融合，以实现对 Bt 基因表达的调控，如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．增强子中含多个起始密码子以促进基因转录
B．引物B、C 的序列需一致以促进两片段融合
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C．DNA 单链B、C 混合后才能延伸出融合片段
D．为获得大量融合片段可用引物A、D 扩增融合片段
【答案】D
【详解】A、起始密码子位于mRNA 上，增强子是DNA 序列，不含起始密码子，A 错误；
B、引物B、C 的序列需互补，这样才能使扩增出的增强子和Bt 基因片段在混合后通过引物部分互补结合，
进而延伸融合，不是序列一致，B 错误；
C、DNA 分子延伸过程中，子链合成方向是5 端→3 端，故DNA 单链A、D 混合后才能延伸出融合片段
（可为DNA 聚合酶提供3'端），C 错误；
D、融合片段的两端分别是引物A 和引物D 对应的序列，所以为获得大量融合片段可用引物A、D 进行
PCR 扩增，D 正确。
故选D。
1．（2025·四川·高考真题）下列以土豆为材料的实验描述，错误的是（ ）
A．土豆DNA 溶于酒精后，与二苯胺试剂混合呈蓝色
B．向土豆匀浆中加入一定量的碘液后，溶液会呈蓝色
C．利用土豆匀浆制备的培养基，可用于酵母菌的培养
D．土豆中的过氧化氢酶可用于探究pH 对酶活性的影响
【答案】A
【详解】A、DNA 的鉴定需在沸水浴条件下与二苯胺试剂反应呈蓝色，题目中未提及沸水浴步骤，无法显
色，A 错误；
B、碘液可以将淀粉染成蓝色，所以向土豆匀浆中加入一定量的碘液后，溶液会呈蓝色，B 正确；
C、利用土豆匀浆制备的培养基，含有碳源、氮源、水、无机盐和其他酵母菌生长需要的物质，所以可用
于酵母菌的培养，C 正确；
D、过氧化氢酶的活性受到pH 的影响，所以土豆中的过氧化氢酶可用于探究pH 对酶活性的影响，D 正确。
故选A。
2．（2025·天津·高考真题）老师检查同学们的生物实验报告时，发现其中有误的是（ ）
A．电泳分离DNA 片段时，需用缓冲液配制琼脂糖凝胶
B．检测酵母是否产生酒精时，需向培养液滤液中加入酸性重铬酸钾
C．提取和分离菠菜叶中的色素时，用层析液进行提取，用无水乙醇进行分离
D．为维持有丝分裂样品最佳观察状态，需在分裂旺盛时剪取根尖，用卡诺氏液固定
【答案】C
【详解】A、电泳分离 DNA 片段时，缓冲液可维持电泳环境的 pH 稳定，保证 DNA 片段正常分离，需
用缓冲液配制琼脂糖凝胶，A 正确；
B、酸性重铬酸钾与酒精反应会由橙色变为灰绿色，检测酵母是否产生酒精时，需向抽取的培养液滤液中
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加入酸性重铬酸钾，B 正确；
C、提取菠菜叶中的色素时用无水乙醇，分离色素时用层析液，C 错误；
D、有丝分裂旺盛的根尖细胞便于观察有丝分裂过程，卡诺氏液可固定细胞形态，为维持有丝分裂样品最
佳观察状态，需在分裂旺盛时剪取根尖，用卡诺氏液固定，D 正确。
故选C。
3．（2025·福建·高考真题）紫杉醇是红豆杉的代谢产物，会干扰纺锤体的正常功能。科研人员利用农杆菌
将紫杉醇合成的相关基因导入烟草中，实现了紫杉醇前体物质的合成。下列叙述错误的是（ ）
A．农杆菌转化前应先使用Ca2+处理烟草细胞
B．紫杉醇合成的相关基因会整合到烟草染色体DNA 上
C．紫杉醇因干扰肿瘤细胞的有丝分裂而具有抗癌作用
D．该技术的突破有利于红豆杉天然资源的保护
【答案】A
【详解】A、转化是指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。农杆菌转化前，
需要将含目的基因的重组Ti 质粒转入农杆菌中，此时应先使用Ca2+处理农杆菌细胞，使农杆菌细胞处于一
种能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态，A 错误；
B、农杆菌的Ti 质粒上的T-DNA 可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 中，因此紫杉醇
合成的相关基因会随T-DNA 整合到烟草染色体DNA 上，B 正确；
C、紫杉醇会干扰纺锤体的正常功能，通过抑制纺锤体的形成，阻碍肿瘤细胞的有丝分裂，从而发挥抗癌
作用，C 正确；
D、利用转基因技术生产紫杉醇前体，可减少对天然红豆杉的依赖，有利于保护其资源，D 正确。
故选A。
4．（2025·福建·高考真题）质粒P 含有2 个EcoRⅠ、1 个SacⅠ和1 个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知
BamHⅠ位点位于2 个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3 种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其
中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3 种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下
列叙述正确的是（ ）
A．DNA 分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极
B．可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物
C．泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物
D．泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数
【答案】C
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【详解】A、因为DNA 分子带负电，在凝胶中会向电源正极迁移，所以其迁移方向是从电源负极到正极，
并非从电源正极到负极，A 错误；
B、质粒P 有2 个EcoR I、1 个Sac I、1 个BamH Ⅰ酶切位点。EcoR I 有2 个酶切位点，单酶切会产生2 个
片段，片段较小，Sac I 有1 个酶切位点，单酶切会产生1 个线性片段，长度为质粒总长（①条带），观察
电泳图谱，②和③都是一个条带，而②的条带大于①条带，因此图中泳道②不可能是Sac Ⅰ酶切产物，③条
带可能是EcoR Ⅰ的单酶切产物（单酶切产生2 个片段大小相同），B 错误；
C、EcoR I 有2 个酶切位点，单酶切会产生2 个片段，Sac I 有1 个酶切位点，单酶切会产生1 个线性片段。
Sac I 和EcoR I 双酶切，会产生3 个片段，观察电泳图谱，泳道⑤有3 个条带，可推测泳道⑤为Sac I 和
EcoR I 酶切产物，C 正确；
D、酶切只是将质粒的环状结构切开，变成线性等结构，碱基总数不会改变，D 错误。
故选C。
5．（2025·江西·高考真题）为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含有抗病基因D 的重组Ti
质粒(如图)，通过农杆菌转化法将D 基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正
确的是
A．水稻愈伤组织细胞中RNA 聚合酶无法识别U6 启动子
B．在含重组Ti 质粒的农杆菌中U6 启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达
C．农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素
D．愈伤组织再分化获得的含有D 基因的幼苗属于抗病植株
【答案】B
【详解】A、将T - DNA 整合到水稻愈伤组织的染色体DNA 后，若要使D 基因表达并使水稻植株表现出抗
病性状。那么D 基因上游的U6 启动子需被水稻愈伤组织细胞中RNA 聚合酶识别， A 错误；
B、启动子是一段有特殊序列结构的DNA 片段，位于基因的上游，它是RNA 聚合识别和结合的部位，并
能够驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质。由图得出，上述重组Ti 质粒中的U6 启动子并非位于卡
那霉素抗性基因的上游，因而不能驱动卡那霉素抗性基因的表达， B 正确；
C、愈伤组织多指将植物体的某一组织、器官置于特定培养基中培养，诱导产生的无定形的组织团块，当
农杆菌侵染愈伤组织后，T - DNA 整合到水稻细胞染色体的DNA 中 ，通常情况下，若D 基因能表达，那
么T - DNA 上的潮霉素抗性基因也能表达，从而使得导入T - DNA 的水稻愈伤组织具有潮霉素抗性基因；
卡那霉素抗性基因不位于T - DNA 上，不会发生上述生理过程。因此，在农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛
选培养基中需加入潮霉素， C 错误；
D、 检测是否成功获得转基因品种一般需要经历两个阶段，首先是分子水平的检测，包括检测目的基因是
否导入宿主细胞、检测在宿主细胞中目的基因是否转录出mRNA 或最终表达出蛋白质，其次，还需要进行
个体生物学水平的鉴定。因此愈伤组织再分化获得的含有D 基因的幼苗不一定是抗病植株， D 错误。
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故选B。
6．（2024·天津·高考真题）胰岛素的研发走过了：动物提取—化学合成—重组胰岛素—生产胰岛素类似物
生产等历程。有关叙述错误的是（ ）
A．动物体内胰岛素由胰岛B 细胞合成并胞吐出细胞
B．氨基酸是化学合成胰岛素的原料
C．用大肠杆菌和乳腺生物反应器生产胰岛素需相同的启动子
D．利用蛋白质工程可生产速效胰岛素等胰岛素类似物
【答案】C
【详解】A、胰岛素在动物体内由胰岛B 细胞合成后，经过胞吐作用释放出细胞，A 正确；
B、胰岛素属于蛋白质激素，所以化学合成胰岛素的原料是氨基酸，B 正确；
C、用大肠杆菌和乳腺生物反应器生产胰岛素不需要使用相同的启动子，因为两者属于不同的表达系统，
大肠杆菌是原核生物表达系统，而乳腺生物反应器属于真核生物表达系统，启动子要求不同，C 错误；
D、利用蛋白质工程技术可以对胰岛素进行改造，生成具有不同作用特性的胰岛素类似物，包括速效胰岛
素，D 正确。
故选C。
7．（2025·福建·高考真题）为建立一种效率高、毒性小的基因敲除系统，将图1 所示的质粒1 和质粒2 导
入大肠杆菌，质粒2 中的sgRNA 基因依据目的基因设计，其转录的短链RNA 通过与目的基因碱基互补配
对，与Cas9 蛋白共同作用，敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。
回答下列问题：
(1)大肠杆菌LacZ 基因的表达产物可催化X-gal 生成蓝色物质从而使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将质
粒1 与含LacZ 基因相应sgRNA 基因的质粒2 同时转化到大肠杆菌中，涂布到含抗生素
的平板（含有X-gal）上进行培养。若长出的是 色菌落则为LacZ 基因被敲除的大肠杆菌。
(2)Cas9 基因的表达量会影响敲除效率，但其过量表达会对大肠杆菌有毒。为评估毒性和敲除效率，用5 种
启动子（A、B、C、D 和E）启动Cas9 的转录，相应检测结果如图2 所示。结果表明，启动子 对
细胞毒性最小；综合考量毒性和敲除效率，应选用启动子 用于该系统。
(3)含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养，少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1 和质粒2 的特
点，在成功敲除LacZ 基因的大肠杆菌中消除质粒1 和质粒2，实验流程如图3 所示。
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①培养12 小时后，图3 试管1 中大部分的大肠杆菌 （填选项）。
A．含质粒1 和质粒2 B．只含质粒1 C．只含质粒2 D．无质粒1 和质粒2
②若要从图3 平板上筛出质粒1 和质粒2 均被消除的大肠杆菌，简要写出实验思路和预期结果：
。
【答案】(1)卡那霉素和四环素 白
(2)C A
(3)B 将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养，两者均不生长则为筛出的大
肠杆菌
【详解】（1）质粒2 中含有与LacZ 基因对应的sgRNA 基因，其转录出来的短链RNA 与目的基因（LacZ
基因）发生碱基互补配对，使其不能表达，因而不能使X-gal 分解产生蓝色物质，将质粒1 和质粒2 导入
大肠杆菌，因此在含四环素和卡那霉素且含X-gal 的培养基中，筛选白色的菌落即为LacZ 基因成功敲除的
菌落。
（2）Cas9 的表达量过高对大肠杆菌产生毒性，使其数量减少，结合图示可知，启动子C 对应的菌落数最
高，因此启动子C 对细胞毒性最小。结合菌落数和敲除率可知，启动子A 的菌落数和敲除率均较高，因此
综合考虑，应选择启动子A 作用于该系统。
（3）①质粒2 为温度敏感型质粒，在37℃下不能进行复制，培养12 小时后，试管1 中大部分大肠杆菌为
只有质粒1，B 正确，ACD 错误。
故选B。
②试管2 加入蔗糖，质粒1 中的SacB 基因表达的SacB 蛋白能将蔗糖转化为有毒化合物，抑制大肠杆菌的
生长繁殖，因此试管2 含质粒2 的大肠杆菌较少，为进一步筛选质粒1 和质粒2 均消除成功的大肠杆菌，
实验设计思路和预测实验结果为：将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养，在
无抗生素平板上可以生长，在含抗生素平板上均不生长的则为筛出的大肠杆菌。
8．（2025·广西·高考真题）CAR-T 是指通过基因工程技术表达CAR 基因的T 细胞。CAR-T 能更好地识别
肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T 过程见图，回答下列问题：
(1)构建含CAR 基因的重组质粒，选用的限制酶组合是 。
(2)将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原
因是 。
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(3)将获得的重组质粒导入T 细胞并成功表达后，为了研究CAR-T 识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，
除了有CAR-T 与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有
，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有 （至少写出2
点）。
(4)研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1 与CAR-T 表达的PD-1 结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，
可采取的策略有抑制PD-1 与PD-L1 的结合以及 。同时，肿
瘤周围组织过于致密会使CAR-T 难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1 启动的抑
制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用
可提高降解效率；与PD-1 连接的生物开关，在该PD-1 与PD-L1 结合后会被打开，释放P 因子激活P 启动
子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T 细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是
，②是 ，③是 ，④是 。
【答案】(1)EcoR Ⅰ、Not Ⅰ
(2)便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落
(3)肿瘤细胞单独培养、不含CAR 基因的T 细胞（正常T 细胞）与肿瘤细胞共同培养 肿瘤细胞的体积、
肿瘤细胞死亡数和存活数等
(4)减少CAR-T 细胞表面PD-1 的表达 抑制PD-1 基因表达的基因序列 终止子 溶解酶基因序
列 多种酶基因序列
【详解】（1）构建含CAR 基因的重组质粒，为了避免质粒和目的基因自连、目的基因反向插入，常采用
双酶切法；目的基因CAR 基因需要插入质粒的启动子和终止子区域，而限制酶Cla Ⅰ和Hind Ⅲ位于启动
子和终止子区域之外，且CAR 基因片段中间含有BamH Ⅰ识别序列，故应该选用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ分别切割
CAR 基因和质粒。
（2）固体培养基通常是在液体培养基中添加一定量的凝固剂制成的。在固体培养基上，人们可以清楚地
观察到在培养基表面由单个细胞生长繁殖成的菌落，质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，将连接产物导入
Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养的目的是便于含有质粒的大肠杆菌形成单
菌落，方便后续筛选出重组质粒。
（3）研究目的是探究CAR-T 识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，自变量为是否含有CAR 基因的T 细胞，
而因变量抗肿瘤效果，即肿瘤细胞凋亡率的检测指标为肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等；实
验组为CAR-T 与肿瘤细胞共同培养，对照组为肿瘤细胞单独培养、不含CAR 基因的T 细胞（正常T 细
胞）与肿瘤细胞共同培养。
（4）肿瘤细胞高表达的PD-L1 与CAR-T 表达的PD-1 结合会启动免疫抑制，为了阻断免疫抑制，可采取
的策略有抑制PD-1 与PD-L1 的结合，使用PD-1 抗体、PD-L1 抗体分别与PD-1、PD-L1 的结合，或减少
CAR-T 细胞表面PD-1 的表达；根据题干信息：与PD-1 连接的生物开关，在该PD-1 与PD-L1 结合后会被
打开，释放P 因子激活P 启动子，且需要减弱原有PD-1 启动的抑制通路，可知新的重组质粒中①是抑制
PD-1 基因表达的基因序列；溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率，且P 启动子是
双向启动子，可知②是终止子，③是溶解酶基因序列，④是多种酶基因序列。
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9．（2025·全国卷·高考真题）为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X 的基因（目的基因）插入质粒
P0，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR 方法验证重组质粒构建成功（引物1~4 结
合位置如图所示，→表示引物5＇→3＇方向）。回答下列问题：
(1)PCR 是根据DNA 复制原理在体外扩增DNA 的技术。在细胞中DNA 复制时解开双链的酶是 ，
而PCR 过程中解开双链的方法是 。
(2)PCR 过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有 。
(3)该同学进行PCR 实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作用是： ；
②无扩增产物，原因是 ；③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA 产
物分别是 。
管号
①
②
③
④
⑤
⑥
模板
无
P0
Px
无
P0
Px
引物对
引物1 和引物2
引物3 和引物4
(4)设计实验验证大肠杆菌表达的酶X 有活性，简要写出实验思路和预期结果
。
【答案】(1)解旋酶 高温变性
(2)引物、脱氧核苷三磷酸
(3)作为对照（或答:鉴定反应体系是否有模板污染） P0不含与引物1 和引物2 互补的碱基序列 目
的基因、质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段
(4)提取酶X，催化相应底物（反应物）的反应，检测是否有产物生成。有产物生成，则证明酶X 有活性
【详解】（1）在细胞中，DNA 复制时解开双链的酶是解旋酶。而在 PCR 过程中，是通过高温变性（加
热至 90 - 95℃）的方法使 DNA 双链解开。
（2）PCR 过程中，参与合成反应且不断消耗的组分有引物和 dNTP（脱氧核苷三磷酸）。引物用于引导
DNA 聚合酶合成新的 DNA 链，dNTP 脱去两分子磷酸，产生dAMP，进而为合成新的 DNA 链提供原
料。
（3）实验中①和④的作用是作为对照。①无模板且引物对与②③相同，④无模板且引物对与⑤⑥相同，
可对比说明模板对扩增的影响。②之所以无扩增产物，是因为P0不含与引物1 和引物2 互补的碱基序列，
无法扩增出子链DNA 序列。③以Px为模板，引物1 和引物2 扩增出的是含目的基因的 DNA 片段；⑤以
P0为模板，引物3 和引物4 扩增出的是质粒P0上一段 DNA 片段；⑥以Px为模板，引物3 和引物4 扩增出
的是含目的基因和部分质粒序列的 DNA 片段。
（4）实验思路：将大肠杆菌培养后，提取酶X，设置一组含有酶X 的反应体系和一组不含酶X 的反应体
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系（作为对照），在适宜条件下，加入酶X 的底物，检测底物的消耗情况或产物的生成情况。 预期结果：
含有酶X 的反应体系中底物减少或有产物生成，而不含酶X 的反应体系中底物无明显变化或无产物生成。
10．（2025·四川·高考真题）杆菌M2 合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与
细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA 进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-
lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。
注：①F1、F2、F3 和F4 为与相应位置的DNA 配对的单链引物，“→”指引物5-3 方向。②密码子对应的
氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。
(1)用PCR 技术从杆菌M2 基因组中扩增lrcA-lrcF 目的基因时，应选用 引物。本研究载体使用
了链霉菌的复制原点，其目的是 。
(2)采用EcoRI 和BamHI 完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 条电泳
条带，电泳检测酶切产物的目的是 。
(3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带 （填氨基酸名称）的tRNA
进入结合位点，导致 ，最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀
菌活性丧失，可能的原因是 。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药
物，除产物活性外还需进一步研究的问题有 （答出1 点即可）。
【答案】(1)F2、F4 保证载体能在链霉菌细胞中能正常复制
(2)2 验证重组质粒是否构建成功
(3)苯丙氨酸或phe 翻译受阻
(4)目的基因发生突变或变异 发酵条件优化
【详解】（1）引物需要结合到模板的3'端，且与目的基因的部分碱基序列互补配对，子链延伸方向为5'端
→3'端，因此用PCR 技术从杆菌M2 基因组中扩增lrcA-lrcF 目的基因时，应选用F2、F4 引物。载体使用链
霉菌的复制原点，是为了保证载体能在链霉菌细胞中复制，也使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传
给后代。
（2）采用 EcoRI 和 BamHI 完全酶切构建的重组质粒，会得到载体片段和目的基因片段，共 2 条电泳
条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功，若能得到预期的载体片段和目的基因片段
大小的条带，说明酶切成功，重组质粒构建可能成功，但是还需要进一步的鉴定。
（3）观察拉索西丁的作用机制图，结合所给密码子信息，可知拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带苯
丙氨酸的 tRNA 进入结合位点。因为位点 2 对应的密码子是 UUC，编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带
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苯丙氨酸的 tRNA 进入结合位点，会导致翻译过程无法正常进行，进而使细菌无法合成蛋白质，最终引起
细菌死亡。
（4）重组链霉菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是目的基因发生
突变或变异，导致其表达的产物结构改变，从而失去杀菌活性；也可能是目的基因的表达受到抑制等。若
运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有：优化发酵条件，如温度、
pH、溶氧量等；如何提高发酵产物的产量；产物的分离和纯化方法等。
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