siRNA产品使用说明

产品简介

常规化学合成siRNA为21～23nt的双链小分子RNA，即用型试剂。

运输与保存

产品以冻干粉的形式，常温运输。收到产品后，请于-20℃～-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。使用前瞬时离心，用RNase-freeH₂O或灭菌ddH₂O配制成20μM储存液，分装保存，避免反复冻融（建议不超过4次）。

表120 μM储存液的配置方法

注：1OD =2.5 nmol≈33μg铭码基因siRNA默认2.5nmol每管分装

使用前须知

siRNA呈很轻的干膜状附在管壁上，形态上可能无法用肉眼可见，此为正常现象，打开管子前先离心，然后再慢慢打开管盖，溶解时请加适量DEPC水溶解（有赠送），然后盖上管盖，震荡溶解。为避免外界因素(包括酶，极端pH或者温度条件等)导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20°C~-80 ℃小心保存。

细胞实验方法

为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性,

建议： 

1)转染实验每组至少3个复孔； 

2)每孔接种的细胞数量尽量保持一致，尽可能使细胞在各孔的表面平均分布。 

1. 转染浓度：

1) 为了获得最佳基因阻断结果，每一种细胞系转染siRNA的量都需要经过预实验确定。如果您是首次转染的细胞系，推荐尝试使用多个转染试剂的用量条件，并且在一定范围内改变siRNA的浓度，以确定达到最佳基因阻断水平所需要的条件。高浓度的siRNA可能具有细胞系依赖性。

2) 在30%-50%细胞融合度时进行转染。通常基因沉默分析至少要在转染后24h-72h进行。低密度转染细胞可以使转染和分析之间的间隙更长，从而使由于细胞过度生长造成的细胞活性损害减少到最低。根据靶基因的特性，高密度转染的细胞可能更加适合条件的优化。

3) 转染时尽量使用无抗生素培养基（非必须，以下说明皆适合），否则可能会降低细胞转染效率。

4) 为达到更好的结果，建议使用低血清培养基稀释转染试剂和siRNA（非必须）。

5）未进行过siRNA转染的细胞可以首先通过FAM荧光标记siRNA做预实验来优化转染条件，正式实验参考预实验结果进行。

2. 转染步骤：以我公司铭码基因品牌的转染试剂（Ms-R）转染24孔板为例，参考表1配置20 μM溶解siRNA的储存液。

1）接种细胞 

A、贴壁细胞：转染前24h，在500 µL无抗生素无血清培养基中接种0.5-2×10⁵个细胞，转染时细胞融合度为30%~50% 。(注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长)

B、悬浮细胞：转染前24 h，在400 µL无抗培养基中接种0.5-2×10⁵个细胞，转染时细胞数量应在4- 8×10⁵ /孔。

2) 转染步骤 

A. siRNA稀释：用10µl 低血清培养基稀释1µl 20µM存储液得siRNA稀释液，轻轻吹吸3 – 5次混匀，室温下静置5 min。 

B.转染试剂稀释：轻轻颠倒混匀转染试剂，用10 µL 低血清培养基稀释1.0 µL Ms-R转染试剂，轻轻吹吸3 – 5次混匀，室温下静置5 min。 

C.混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹吸3 – 5次混匀，室温静置 15-20 min得到转染复合物。 

D. 转染复合物加入到24孔细胞板中，前后轻摇细胞板混合均匀。 

E. 细胞板置于37℃、5% CO₂培养箱中培养18h-48 h，无需更换培养基（对于不易转染的细胞，或者状态没问题的细胞换液时间可以增加至正常细胞换液时间进行）。

表2 铭码基因转染试剂（MA-R）siRNA转染用量参考

注：表中数据仅供参考，对于不同细胞转染试剂用量可进一步优化，不同品牌转染试剂需要参考具体使用说明书，针对培养基推荐使用低血清培养基进行操作（非必须）。

3）效果检测 

转染后24~72小时均可进行siRNA沉默效果检测，最佳检测时间与细胞类型、转染试剂等有关。 

1)RNA水平的检测：mRNA水平是检测siRNA沉默效率的最直接水平，siRNA转染后24~72h即可检测到靶基因mRNA表达明显降低，检测方法宜采用qPCR检测方法。

注：引物设计质量很重要，需要确保检测引物的特异性以及是否可以覆盖目的基因的所有转录本。

2) 蛋白水平的检测：蛋白是RNAi沉默效率的重要指标，其检测手段主要为Western Blot等。检测时间受细胞内蛋白质表达量、半衰期等因素的影响，一般为siRNA转染后48h~96 h。 

3) 功能筛选：应用EdU细胞增殖、EdUTP细胞凋亡等方法进行细胞功能筛选。

动物实验：动物体内实验相对复杂一些，公司可提供动物实验专用的修饰siRNA产品。

修饰方式：由于动物实验对siRNA稳定性的要求较高，尽管未修饰的siRNA也可以进行动物实验，但是以 Chol，OMe，PS修饰的siRNA效果较好。 

给药方式：局部给药：最直接的导入方式，siRNA的导入效率较高，用量少，siRNA能很快被吸收。适用于浅表器官和组织，包括眼、肌肉、皮下组织等。 

系统给药：一些无法通过局部给药方式到达的靶位，如内脏，器官以及一些散列分布的靶位（如淋巴细胞，转移性肿瘤细胞等），可使用系统性注射方式，具有广泛的组织分布，包括心、肝、脾、肺、肾等。