夜雨聆风
生物传感器
脂质纳米颗粒 (LNP) 广泛用于治疗性 microRNA (miRNA) 的递送，特别是在组合多个靶标以增强治疗效果的复合系统中。然而，LNP 制剂中 miRNA 的同步定量仍然是药物质量控制的主要分析挑战。
这项工作提出了一种双工作电化学生物传感器，用于对封装在 LNP 中的两种 miRNA（miR-4676 和 miR-6503）进行多重、选择性和无扩增定量。该生物传感器通过金电沉积在双工作丝网印刷石墨电极上制造，然后对亚甲基蓝 (MB) 标记的 ss-DNA 探针进行位点特异性固定。表面活性剂介导的 LNP 裂解后，方波伏安法 (SWV) 能够对释放的靶标进行基于杂交的信号关闭检测。该传感器表现出出色的分析性能，miR-4676 的检测限为 0.96 nM，miR-6503 的检测限为 0.98 nM。通过交叉反应实验证实了高选择性。在具有不同 miRNA 比例（1:1 和 2:1）的实际配方中，与标准荧光测定相比，传感器的定量准确度分别为 88% 和 84%。与传统方法不同，该平台能够对复杂混合物中的单个 miRNA 进行定量。本研究引入了一个电化学平台，可在 LNP 内进行多重 miRNA 定量，为基于 miRNA 的制剂的质量控制提供快速、低成本且便携式的解决方案。
Figure 1. Schematic representation of the dual electrochemical biosensing strategy for miRNA quantification in LNPs formulations.
丝网印刷双工作电极上的生物传感器制造
选择石墨丝网印刷双工作电极作为基础传感平台，以实现低成本、一次性和可扩展的设备制造。为了确保在 LNP 破坏所需的含表面活性剂条件下，基于硫醇的探针具有稳健的固定性和信号稳定性，通过金电沉积对石墨工作电极进行了修饰。生物传感器制造的第一步涉及在 25 mM HAuCl4 溶液中通过计时电流法在工作电极 (WE) 上电沉积金。沉积参数为：平衡时间（Teq）为5秒，沉积电位（Edc）为-0.5V，间隔时间（Tint）为0.1秒，总沉积时间（Trun）为300秒。金修饰的工作电极直接用于探针固定。电沉积后无需在酸性介质中进行额外的电化学清洁或活化（例如 H2SO4 循环）。这种选择的合理性在于，传感界面基于石墨丝网印刷基板上新电沉积的纳米结构金，而不是块状金电极。所采用的协议先前已在我们最近的工作中得到验证，提供了适用于生物传感应用的可重复且电化学活性的表面，无需进一步电化学激活。在此步骤之后，根据我们之前研究中优化的方案修改工作电极。最初，MB-ssDNA 探针在黑暗中使用 0.01 M TCEP 进行二硫键 (S−S) 还原 1 小时。还原后，将每个探针（抗 miR-6503 和抗 miR-4676）在 PBS 中从浓度 1000 nM 稀释到浓度 100 nM。然后，将每个探针的 5 μL 液滴分别施加到两个不同的工作电极之一上，确保两滴不会混合。随后在湿度室中孵育 1 小时以促进探针固定。孵育后，用去离子 (DI) 水轻轻冲洗电极。随后，将两个工作电极在湿度室中与 2 mM MCH 溶液一起孵育 1.5 小时，以封闭非特异性结合位点，然后用去离子水进行最终冲洗。
该生物传感器充当信号关闭平台：在存在 miRNA 靶标的情况下，与固定的 MB-DNA 探针的杂交会降低 MB 的电化学可及性，从而导致电流信号减弱。因此，与空白相比，在目标存在的情况下电流响应降低。
所有结果均报告为信号变化百分比，通过比较不存在靶标时的电流与在不同浓度的两个 miRNA 靶标下获得的电流来计算。
Figure 2. (A) Effect of Triton X-100 on the signal change (%) at different concentrations of electrodeposited HAuCl4 (2.5, 10, 25, and 50 mM).Blue bars signal change % obtained in the presence of 20 nM of miRNA target in the absence of Triton X-100, pink bars signal change % obtained in the presence of 20 nM of miRNA target and Triton X-100. The percentage differences between the two conditions are indicated above each pair of bars. All the experiments were conducted in the presence of 100 nM of probe, 0.5% of Triton X-100 and in triplicates. (B) Effect of anti-miR probe concentration (50, 100, and 200 nM) on the electrochemical response of biosensor in the presence of 50 nM target miRNA. Dark-colored bars represent the current recorded after probe immobilization (blank), while light-colored bars correspond to the current measured after hybridization with the miRNA target. The signal change % induced by hybridization is reported above each pair of bars.
Figure 3. Binding curves obtained in empty LNPs spiked with different concentrations of miRNAs ranging from 0.1 nM to 800 nM. (A) Binding curve obtained testing miR-4676. (B) Binding curve obtained testing miR-6503. The insets of each figure show the signal off voltametric curves corresponding to the increase of miRNAs. All the measurements were performed in triplicate and in the presence of Triton X-100.
Figure 4. (A) Cross-talking study of the sequence-specific DNA probes using different mixtures of miR-4676 (blue bars) and miR-6503 (pink bars). Signal variations observed in mixed-miRNA samples reflect comparable target concentrations rather than probe cross-reactivity. (B) Selectivity study of the miR-4676 probe in the presence of noncomplementary miRNA sequences (20 nM). (C) Selectivity study of the miR-6503 probe in the presence of noncomplementary miRNA sequences (20 nM). All experiments were performed in triplicate.
Figure 5. Comparison between the calibration curves obtained for empty spiked LNPs (black) and for miRNA- loaded LNPs with a concentration ratio of 1:1 and 2:1 formulation (red). (A) miR-4676 in LNPs formulation ratio 1:1; (B) miR6503 in LNPs formulation ratio 1:1; (C) miR-4676 in LNPs formulation ratio 2:1; (D) miR-4676 in LNPs formulation ratio 2:1. All the measurements were performed in the presence of Triton X-100 and in triplicate.
总结
在这项研究中，开发、优化和验证了一种双工作电化学生物传感器，用于多重检测封装在 LNP 制剂中的两种 microRNA（miR-4676 和 miR-6503），用于制药应用。为了使传感器适应石墨基电极并确保与表面活性剂介导的 LNP 破坏兼容，引入并优化了金电沉积，从而在 Triton X100 存在的情况下提高了探针稳定性和信号保留。校准曲线表明所提出的双生物传感器具有出色的分析性能，miR-4676 的检测限为 1.5 nM，miR-6503 的检测限为 1.9 nM。
该系统还表现出高特异性和目标之间可忽略不计的交叉反应性。与 RiboGreen 等标准荧光方法不同，该方法仅提供总 miRNA 浓度，而不区分各个序列，而开发的生物传感器能够对同一 LNP 配方中的每种 miRNA 进行单独定量。在 LNP 制剂中封装的两种不同的 miRNA 混合物（1:1 和 2:1 miR4676:miR-6503）中，电化学测量的总浓度与 RiboGreen 值密切匹配，总体定量准确度高达 88%。尽管 LNP 制剂通常含有微摩尔浓度的 miRNA，但使用受控稀释步骤在信号关闭生物传感器的线性动态范围内操作因此完全符合标准制药质量控制工作流程，并且不会影响分析的相关性或准确性。
这些结果凸显了这种无扩增、小型化和多重电化学生物传感器作为可靠且经济高效的工具的巨大潜力，可用于选择性定量复杂 LNP 配方中的 miRNA。据我们所知，这项工作代表了多重电化学生物传感策略首次应用于对脂质纳米颗粒内共封装的多个 miRNA 靶标进行定量分析，特别是满足药物质量控制需求。该传感器表现出高灵敏度、出色的特异性以及与标准荧光方法的高度一致性，同时还具有区分单个 miRNA、操作简单以及与常规样品处理兼容的额外优势。这些功能使其非常适合集成到研究和工业工作流程中，支持严格的质量控制并加速基于 RNA 的疗法的开发。此外，使用低成本、一次性丝网印刷电极、紧凑型恒电位仪和定制 3D 打印电池，使得该平台本质上适合小型化和在传统实验室环境之外的部署。这些特性，加上多重格式和无扩增操作，使生物传感器成为 LNP 制剂在线或近线质量控制的有前途的候选者，包括在资源有限或快节奏的制造环境中。尽管性能良好，但当前平台的某些方面还可以进一步改进。例如，当前配置需要预处理步骤来破坏 LNP。未来的工作将旨在简化这一过程并将其集成为更加自动化和用户友好的格式。此外，扩大复用能力并用更广泛的生物样品验证生物传感器将进一步增强其临床和制药用途的适用性。
https://doi.org/10.1021/acssensors.5c04840
—END—
内容为【生物传感器】公众号原创
转载请写明来源于【生物传感器】
觉得好看，请点这里↓↓↓
