文档内容
第 34 讲 微生物的培养与应用
内容考情——知考向 核心素养——提考能
1.阐明无菌技术在微生物培养中
的应用 分析培养基的成分及其作
科学
用，比较平板划线法和稀释
2.概述微生物分离和培养的常用 思维
涂布平板法的异同
方法
3.概述测定微生物数量的常用方
内容要
法
求
4.活动：通过配制培养基、灭
菌、接种和培养等实验操作获得
纯化的酵母菌菌落 科学 设计实验探究微生物培养的
探究 条件
5.活动：分离土壤中分解尿素的
细菌，并进行计数
2020·全国卷Ⅰ(37)、2019·全国卷
Ⅰ(37)、2019·全国卷Ⅱ(37)、
近三年 社会 关注对有害微生物的控制及
2019·全国卷Ⅲ(37)、2018·全国卷
考情 责任 宣传健康生活
Ⅰ(37)、2018·全国卷Ⅱ(37)、
2018·全国卷Ⅲ(37)
考点一 微生物的实验室培养
1.培养基
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养
基质。
(2)营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。
提醒 微生物对主要营养物质的需求特点
①自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的 CO ；氮
2
源可由含氮无机盐提供，如硝酸盐等。
②异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，
如糖类、脂肪酸等；氮源也主要由有机物提供，如尿素、牛肉膏等，部分异养
型微生物也可以利用无机氮源。
(3)配制原则
2.无菌技术
(1)含义：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
(2)常用方法
3.大肠杆菌的纯化培养
(1)原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细菌，使其长成单个的菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。
(2)常用接种方法：
①平板划线法
②稀释涂布平板法
将菌液进行一系列的梯度稀释后，将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培
养基表面，进行培养
系列稀释操作
涂布平板操作
(3)菌种的保存方法
1.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？提示 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面湿度也比较高，将平板
倒置，既可以防止培养基表面的水分过快地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落
入培养基，造成污染。
2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个
平板还能用来培养微生物吗？为什么？
提示 不能。因为空气中的微生物可能在皿盖和皿底之间的培养基上滋生，可
能会造成污染。
3.平板划线法在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的
末端开始划线？目的是什么？
提示 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的
末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单
个细菌繁殖而来的菌落。这样做的目的是将聚集的菌种逐步稀释分散以便获得
单个菌落。
1.常见物品的消毒或灭菌方法
(1)消毒方法及适用对象(2)灭菌方法及适用对象
2.选择培养基与鉴别培养基的区别
种类 制备方法 原理 用途 举例
从众多微
加入青霉素，
选择培 培养基中加入某 依据某些微生物对某些 生物中分
分离得到酵母
养基 些化学物质 物质的抗性而设计 离所需的
菌和霉菌
微生物
依据微生物产生的某种
培养基中加入某 代谢产物与培养基中的 鉴别不同 伊红美蓝培养
鉴别培
种指示剂或化学 特定指示剂或化学药品 种类的微 基可以鉴别大
养基
药品 反应，产生明显的特征 生物 肠杆菌
变化而设计
3.平板划线法和稀释涂布平板法的比较考向1 无菌操作技术
1.(2018·全国卷Ⅱ，37)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避
免杂菌的污染。回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可
以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两
种方法的优点是__________________________________________。
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能
________________________。在照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸
钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到
相应温度，最可能的原因是____________________________________________。
答案 (1)可以 (2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少 (3)破坏DNA
结构 消毒液 (4)氯气 (5)未将锅内冷空气排尽
解析 (1)在实验室中，能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属
材质的实验器具等可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(2)巴氏消毒法或高温
瞬时消毒法与煮沸消毒法相比，其优点表现在达到消毒目的的同时，营养物质
损失较少。(3)紫外线照射能消毒的原因是其能够破坏微生物细胞中的 DNA分
子。在利用紫外线照射前，适量喷洒消毒液，可强化消毒效果。(4)自来水通常
采用氯气消毒。(5)使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而温度未达
到相应要求，最可能的原因是没有排尽高压蒸汽灭菌锅内的冷空气。
考向2 微生物的培养与纯化
2.(2020·江苏卷，31)产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母
菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：
(1)常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是________(填编号)。
编号 ① ② ③ ④
物品 培养基 接种环 培养皿 涂布器
灭菌方法 高压蒸汽 火焰灼烧 干热 臭氧
(2)称取1.0 g某土壤样品，转入99 mL无菌水中，制备成菌悬液，经________后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中
10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含
酵母菌________个。
(3)为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行
________育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以________为唯一碳源的固体培
养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径________的
菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。
(4)在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价
A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株
________进行后续相关研究，理由是_________________________________。
答案 (1)④ (2)梯度稀释 4.6×105(或460 000) (3)诱变 脂肪(或油脂) 较
大 (4)B 该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪能力强，净化效
果好
解析 (1)涂布器一般用干热灭菌法或灼烧灭菌法进行灭菌。(2)99 mL无菌水中
加入1.0 g土壤制成的菌悬液为100 mL，取稀释10倍后的菌悬液0.1 mL涂布平
板，平板上的平均菌落数为 46，则每克土壤约含酵母菌 46÷0.1×10×100＝
4.6×l05(个)。(3)辐射可以提高基因突变的频率，利用射线辐照进行的育种为诱
变育种。本实验的目的是筛选产脂肪酶的菌株，所用的培养基应该以脂肪(或油
脂)为唯一碳源；最终形成的菌落直径越大，形成该菌落的菌株分解脂肪(或油脂)的能力越强，生产脂肪酶的能力也越大。(4)由图可知，相对于菌株A，菌株
B的增殖速度更快，降解脂肪能力更强；根据题干信息“在处理含油废水的同
时，可获得单细胞蛋白”可进一步推知菌株B处理含油废水时可得到更多的单
细胞蛋白，故菌株B更适合作为后续研究的材料。
3.(2020·清华大学中学生标准学术能力诊断)最新调查显示手机每平方厘米就约
驻扎了12万个细菌，这个数字足以令马桶坐垫上的细菌队伍“汗颜”。某生物
兴趣小组的同学，利用手机表面的细菌进行了相关的培养研究。
(1)培养微生物的培养基一般含有的成分有________________，另外还需满足对
pH、特殊营养物质以及氧气的需求。
(2)若想获取不同菌的菌落形态，需用固体培养基培养，培养基配制的基本步骤：
计算→______________________。上述操作完成，待培养基冷却凝固后需将平
板倒置，这样做的目的是 。
(3)为研究手机表面微生物的种类，用稀释涂布平板法进行细菌的纯化和分离。
如图四种菌落分布情况中，哪些选项是通过稀释涂布平板法得到的？________。
(4)研究小组用琼脂扩散法测定玫瑰精油对手机表面细菌的抑制情况。该方法的
操作步骤如下：首先制备牛肉膏蛋白胨平板，用涂布器将5种细菌分别接种到5
个平板上，得到细菌平板。然后制备直径为 5 mm的滤纸圆片，采用________
灭菌法处理，将灭菌的滤纸片分别放入________________________中浸泡 10
min，后将滤纸片放在5个细菌平板表面。最后将平板放入________中倒置培养
48小时。通过测量________________来检测玫瑰精油对5种细菌的抑制效果。
答案 (1)水、碳源、氮源、无机盐 (2)称量→溶化→调 pH→灭菌→倒平板
避免水分蒸发过快，防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染 (3)ABC (4)干
热 适宜浓度的玫瑰精油和无菌水 恒温培养箱 透明圈的直径(抑菌圈的直径)
解析 (1)培养微生物的培养基一般含有水、碳源、氮源和无机盐，除上述几种
主要营养物质外，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气
的需求。(2)制备固体培养基的基本步骤：计算→称量→溶化→调pH→灭菌→倒
平板。等平板冷却凝固后，应将平板倒置，这样做的目的是避免水分蒸发过快，
防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面对培养基造成污染。(3)由图
分析可知，A、B、C为通过稀释涂布平板法得到的菌落，D为通过平板划线法
得到的菌落。(4)因滤纸需吸附玫瑰精油，故需保持滤纸的干燥，灭菌时应用干
热灭菌法，不宜采用高压蒸汽灭菌法。将灭菌的滤纸片分别放入适宜浓度的玫
瑰精油和无菌水(对照)中浸泡10 min，再将滤纸片放在5个细菌平板表面，最后
将平板放入恒温培养箱中倒置培养48 h。通过测量透明圈直径(抑菌圈直径)可判
断玫瑰精油对5种细菌的抑制效果，抑菌圈越大，说明抑制作用越强。
4.(2021·山西高三适应考试)自然界里有多种微生物，将其进行合理的筛选、培
养和应用，能给医药和化工等生产领域带来巨大经济效益。回答下列问题：
(1)对培养基进行灭菌时，多采取________法，而对接种环或涂布器灭菌时则用
________法，若要将微生物采用平板划线法进行分离操作，在固体培养基表面
连续进行了5次划线，则需要对接种环灼烧________次。平板划线在做第二次
及其后的划线操作时，要从上次划线的________开始划线，最后一次划的线不能与第一次划的线________。
(2)将接种后的固体培养基和一个未接种的固体培养基放入恒温箱中________培
养，以减少培养基中水分的挥发。
其中，培养未接种的固体培养基是为了________________________________。
长期保存菌种时，应将培养的菌液与________充分混匀后，放在－20 ℃的冷冻
箱中保存。
(3)甲、乙两组同学用稀释涂布平板法测定某种微生物的数量，在同一稀释倍数
下每隔一段时间记录数据(统计时间内微生物总数小于环境容纳量)，得到如表
结果：
培养时间/小时 24 48 72 96
甲组菌落均值/个 18 25 36 32
乙组菌落均值/个 20 28 38 32
据表可知，计数时最好取培养________小时记录的菌落数作为实验结果，一方
面 是 由 于 培 养 时 间 较 短 ， 会 遗 漏 菌 落 数 目 ， 另 一 方 面 是 由 于
______________________________________________。
答案 (1)高压蒸汽灭菌 灼烧灭菌 6 末端 相连 (2)倒置 作为对照组，
排除培养基被杂菌污染 甘油 (3)72 培养时间过长，两个或多个菌落连成一
个菌落
解析 (1)对培养基进行灭菌时，多采取高压蒸汽灭菌法，而对接种环或涂布器
灭菌时则用灼烧灭菌法。接种环在每次接种前都要灼烧灭菌，最后一次接种完
也要灭菌，所以在固体培养基表面连续进行了 5次划线，需要对接种环灼烧6
次。平板划线在做第二次及其后的划线操作时，要从上次划线的末端开始划线，
使菌体的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终获得由单个菌体形成的单
个菌落。最后一次划的线不能与第一次划的线相连。(2)将接种后的固体培养基和一个未接种的固体培养基放入恒温培养箱中倒置培养，以减少培养基中水分
的挥发。培养未接种的固体培养基是为了作为对照组，排除培养基被杂菌污染。
长期保存菌种时，应将培养的菌液与甘油充分混匀后，放在－20 ℃的冷冻箱保
存。(3)根据表中数据可知，甲组和乙组中的菌落数都在72小时达到最大，由此
推知最好取72小时记录的菌落数作为实验结果，原因：①培养时间不足会遗落
菌落数目；②培养时间过长会导致两个或多个菌落连成一个菌落，使计数不准
确。
考点二 微生物的筛选和计数
1.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)实验原理
(2)实验流程(3)统计细菌数目的方法
①显微镜直接计数法
即稀释涂布平板法
②间接计数法——活菌计数法
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀
释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多
少活菌。
注意 ①一般选用相差不大的平板计算平均值，选用保证菌落数在 30～300的
稀释度下的平板进行计数。
②设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，设置三
个以上。
③当两个或多个细胞连在一起时，培养后平板上观察到的只是一个菌落，所以
统计的菌落数往往比活菌的实际数目小，因此统计结果一般用菌落数而不是用
活菌数来表示。
(4)实验结果分析与评价2.土壤中分解纤维素的细菌的分离
(1)纤维素酶组成及作用
(2)纤维素分解菌的培养基成分及鉴定原理
(3)实验流程
(4)分离纤维素分解菌所用两种培养基的比较
分离纤维素分解菌的实验中先用选择培养基，再用鉴别培养基。
①选择培养基为液体培养基，以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长。
②鉴别培养基含琼脂，为固体培养基，细菌可在该培养基上形成肉眼可见的菌
落。
③刚果红染色法应用于鉴别(填“选择”或“鉴别”)培养基。
1.想一想，如何根据平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？
提示 统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板
上菌落数的平均值，然后按教材旁栏的公式即每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M
进行计算。
2.为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？
提示 由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解
菌的含量相对较高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。
1.微生物的筛选与鉴别方法
(1)微生物的筛选方法
(2)微生物的鉴别方法2.选择培养基四种常见制备方法或实例
(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)
(2)改变培养基的营养成分
(3)利用培养基“特定化学成分”分离
(4)通过某些“特殊环境”分离
考向1 选择培养基成分及配制方法的分析
1.(2020·全国卷Ⅰ，37)[生物——选修1：生物技术实践]某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有
某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解 S
的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和
S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：
(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用________的方法进行灭菌。乙培养
基中的Y物质是________。甲、乙培养基均属于________培养基。
(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107 个/mL，若要在每个平板上涂
布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至
少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。
(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S
的降解量反而下降，其原因可能是________________________________(答出1
点即可)。
(4)若要测定淤泥中能降解 S 的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：
_________________________________________。
(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生
长提供4类营养物质，即________________________________________。
答案 (1)高压蒸汽灭菌 琼脂 选择 (2)104 (3)S的浓度超过某一值时会抑制
菌株的生长 (4)取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养
后计数 (5)水、碳源、氮源和无机盐
解析 (1)实验过程中，对盛有水或培养基的摇瓶进行灭菌时，常采用高压蒸汽
灭菌法。据题图分析可知，乙培养基为固体培养基，与甲培养基相比，其特有
的组分Y物质应是凝固剂琼脂。甲、乙培养基均只允许能利用物质 S作为氮源和碳源的微生物生长，因此均为选择培养基。(2)据题意，假设至少将摇瓶M中
的菌液稀释X倍，才能保证稀释后的100 μL菌液中细菌细胞数不超过200个，
初步估测摇瓶 M中细菌细胞数为 2×107个/mL，则稀释之前 100 μL 菌液中有
2×106个细菌，可得2×106×(1/X)＝200，则X＝104，因此至少应将摇瓶M中
的菌液稀释104倍。(3)在筛选过程中，若培养基中 S浓度过高，可能会导致细
胞失水，进而抑制菌株的生长。(4)将含有能降解S的细菌的淤泥加入无菌水中，
进行适当稀释后，利用稀释涂布平板法，取适量的菌液涂布到乙培养基上，在
适宜条件下进行培养，一段时间后，统计菌落数，即可估算出淤泥中能降解 S
的细菌细胞数。(5)本实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都
能为细菌的生长提供的营养物质是水、碳源、氮源和无机盐。
2.(2021·河南省九师联盟联考)下表为某生物兴趣小组的同学在培养某种微生物
时制定的培养基组分，回答下列问题：
KH PO Na HPO MgSO ·7H O KNO 蒸馏水
2 4 2 4 4 2 3
1.4 g 2.1 g 0.2 g 2.0 g 定容至100 mL
(1)该培养基缺少的营养成分是________，只能用来培养________微生物，若要
分 离 土 壤 中 的 尿 素 分 解 菌 ， 对 该 培 养 基 中 成 分 需 进 行 的 调 整 是
________________________。
(2)在接种前，某同学随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，结果
发现空白平板上出现了5个菌落，请分析两种可能的原因：
。(3)某同学取10 g土壤样品加90 mL无菌水制成稀释液，在对应稀释倍数为105
的溶液中取0.1 mL接种到3个正常的细菌培养基上，该过程需要使用的接种工
具是________，培养一段时间后，统计出平板上的细菌菌落数分别为 156、178
和191，则每克土壤样品中的细菌数量约为________，统计的菌落数往往比活
菌的实际数目低，原因是 。
答案 (1)碳源 自养型 加入尿素、葡萄糖、琼脂，去掉 KNO (2)培养基灭
3
菌不合格；倒平板过程中被污染 (3)涂布器 1.75×108 当两个或多个细胞连
在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
解析 (1)分析表格中的成分可知，该培养基的成分缺少碳源，只能用来培养自
养型微生物，若要分离土壤中的尿素分解菌，需要使用以尿素为唯一氮源的培
养基，且需要加入碳源和琼脂，同时去掉表中含氮物质KNO 。(2)培养基配制
3
完成后需要先进行灭菌，然后检测是否灭菌合格，方法为取若干灭菌后的空白
平板在适宜条件下培养一段时间，如果平板上出现菌落，说明培养基灭菌不合
格或者在倒平板过程中被污染。(3)根据题意可知，该同学使用的是稀释涂布平
板法进行接种，因此接种工具为涂布器，培养一段时间后，统计出平板上的细
菌菌落数分别为156、178和191，则每克土壤样品中的细菌数量约为(156＋178
＋191)÷3×105÷0.1＝1. 75×108。稀释涂布平板法是根据菌落数量进行计数的，
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此导致统计
的菌落数往往比活菌的实际数目低。考向2 土壤中分解尿素细菌的分离
3.(2017·全国卷Ⅰ，37)某些土壤细菌可将尿素分解成CO 和NH ，供植物吸收
2 3
和利用。回答下列问题：
(1) 有 些 细 菌 能 分 解 尿 素 ， 有 些 细 菌 则 不 能 ， 原 因 是 前 者 能 产 生
________________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO 作为碳源，
2
原因是___________________________________，但可用葡萄糖作为碳源，进入
细菌体内的葡萄糖的主要作用是_______________________________(答出两点
即可)。
(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”
“NH NO ”或“尿素＋NH NO ”)作为氮源，不选择其他两组的原因是
4 3 4 3
______________________________________________________。
(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有 KH PO 和 Na HPO ，其作用有
2 4 2 4
________________________________________(答出两点即可)。
答案 (1)脲酶 分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO 来合成有机物 为
2
细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料 (2)尿素 其他两组都
含有NH NO ，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用 NH NO ，不
4 3 4 3
能起到筛选作用 (3)为细菌生长提供无机盐离子，作为缓冲剂保持细胞生长过
程中pH的稳定
解析 (1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。能分解尿素的细菌是一种分
解者，属于异养型生物，不能以尿素的分解产物 CO 作为碳源。能分解尿素的
2
细菌可以以葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是一方面可氧
化分解为细胞生命活动提供能量，另一方面其代谢中间产物可为多种有机物的
合成提供原料。
(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择以尿素作为唯一氮源的选择培养基，而其他两组都含有含氮物质 NH NO ，能分解尿素的细菌和不
4 3
能分解尿素的细菌都能利用NH NO ，不能起到筛选作用。
4 3
(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH PO 和Na HPO ，既可维持培养基
2 4 2 4
pH的相对稳定，又能为微生物生长提供无机盐离子。
考向3 微生物筛选、计数的综合运用
4.(2019·全国卷Ⅱ，37)物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中
达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解 W的
细菌(目标菌)。回答下列问题。
(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是________。
(2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并
形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择________菌落进一步纯化，
选择的依据是__________________________________________。
(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步
确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结
果和结论，即_______________________________________________________。
(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的
酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，
请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加
含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加________，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若 C 处没有出现透明圈，说明
________________ ； 若 A 、 B 处 形 成 的 透 明 圈 直 径 大 小 相 近 ， 说 明
__________________________________________。答案 (1)W
(2)乙 乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W
(3)将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利
用空气中的氮气作为氮源
(4)①缓冲液 ②缓冲液不能降解W 酶E与天然酶降解W的能力相近
解析 (1)要从土壤中分离出能降解含氮有机物W的目标菌，所用选择培养基应
以该特定物质W为氮源。(2)图示信息显示，在乙菌落周围出现透明圈，说明乙
菌能降解W，若要得到目标菌，应该选择乙菌落进一步纯化。(3)若要通过设计
实验确定甲、乙两种细菌能否利用空气中的氮气作为氮源，需将甲、乙菌分别
接种在无氮源培养基上，若某细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气
作为氮源。(4)①实验应遵循单一变量原则，故C处应滴加缓冲液。②一段时间
后，测量透明圈的直径。若 C处没有出现透明圈，说明缓冲液不能降解 W；若
A、B处形成的透明圈大小相近，说明酶E与天然酶降解W的能力相近。
5.(2021·江苏重点中学考试)某生物兴趣小组试图探究山羊的瘤胃中的微生物对
尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能降解尿素的细菌(目的
菌)。培养基成分如表所示，实验步骤如图所示。请分析回答问题：KH PO 1.4 g
2 4
Na HPO 2.1 g
2 4
MgSO ·7H O 0.2 g
4 2
葡萄糖 10 g
尿素 1 g
琼脂 15 g
溶解后用蒸馏水定容到1 000 mL
(1)该实验中所用培养基在成分上的特殊要求是________________。培养基中的
葡萄糖可以为细菌提供________。
(2)实验中所用锥形瓶、试管都必须进行灭菌，常用的灭菌方法是________。图
中接种的方法为________法。
(3)实验结果如下表，其中________倍的稀释倍数比较适合用于观察统计。用该
方法统计的细菌数目与实际数目相比________(填“偏大”“基本相同”或“偏
小”)，其原因是 。
稀释倍数 103 104 105 106 107
菌落数 >500 367 248 36 18
答案 (1)以尿素作为唯一氮源 碳源(和能源) (2)干热灭菌(或高压蒸汽灭菌)
法 稀释涂布平板 (3)106或105 偏小 当两个或多个细胞连在一起时，平板
上观察到的只是一个菌落(一个菌落可能是一个或多个菌体增殖形成的)
解析 (1)要筛选到能降解尿素的细菌，所用培养基在成分上的特殊要求是以尿
素作为唯一氮源；培养基中的葡萄糖可以为细菌提供碳源。(2)实验中所用锥形
瓶、试管都必须进行灭菌，常用的灭菌方法是干热灭菌或高压蒸汽灭菌法。图中接种的方法为稀释涂布平板法。(3)观察并统计菌落数时应选择菌落数在 30～
300之间的培养皿进行统计，根据表格数据可知，选择 106或105倍的稀释倍数
比较合适。用稀释涂布平板法统计的细菌数目比实际数目偏小，其原因是当两
个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
重温真题 经典再现
1.(2019·全国卷Ⅲ，37)回答下列与细菌培养相关的问题。
(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是________(填“蛋白
胨”“葡萄糖”或“NaNO ”)。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同
3
来调节培养基的pH，其原因是__________________________________________。
硝化细菌在没有碳源的培养基上________(填“能够”或“不能”)生长，原因
是_______________________________________________________。
(2)用平板培养细菌时一般需要将平板________(填“倒置”或“正置”)。
(3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜
色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是_____________________________。
(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过________处理，这种处理可以杀死丢
弃物中所有的微生物。
答案 (1)蛋白胨 不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同 能够 硝化细菌可
以利用空气中的CO 作为碳源
2
(2)倒置
(3)在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
(4)灭菌
解析 (1)细菌培养时常用牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏能提供碳源、氮源、磷
酸盐、维生素，蛋白胨能提供碳源、氮源、维生素，而葡萄糖不能提供氮源，NaNO 不能为微生物提供碳源。不同细菌生长繁殖所需要的最适 pH是不同的，
3
应该根据培养细菌的不同来调节培养基的pH。硝化细菌是化能自养型细菌，可
以利用空气中的CO 为碳源，因此在没有碳源的培养基上能够生长。(2)在平板
2
培养基上培养细菌时，一般需将平板倒置，这样可以防止皿盖上的水珠落入培
养基造成污染。(3)不同种类的细菌所形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜
色、硬度、透明度等方面具有一定的特征，不同种细菌在一定培养条件下表现
出各自稳定的菌落特征，可以作为菌种鉴定的重要依据。(4)使用后的培养基在
丢弃前需进行灭菌处理，以免污染环境。
2.(2019·全国卷Ⅰ，37)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会
造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。
Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。
Ⅱ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。
Ⅲ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。
回答下列问题。
(1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是________________。Ⅱ、Ⅲ号培养
基中为微生物提供碳源的有机物是________________________。
(2)若将土壤悬液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细
菌比例会____________，其原因是_____________________________________。
(3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标
菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是________________。
(4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮
酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供________________和_____________________________________________________。
答案 (1)牛肉膏、蛋白胨 X
(2)下降 不能降解X的细菌因缺乏碳源而不能增殖，能降解X的细菌能够增殖
(3)稀释涂布平板法
(4)能量 合成其他物质的原料
解析 (1)牛肉膏蛋白胨培养基中，牛肉膏、蛋白胨为微生物提供了氮源，而Ⅱ
号、Ⅲ号培养基中除X外的其他物质均不含碳，所以能为微生物提供碳源的有
机物是X。(2)因为Ⅱ号培养基中碳源只有X，相当于是选择培养基，只有能降
解X的细菌才能增殖，不能降解X的细菌因缺乏碳源而不能增殖。(3)要对菌落
进行计数，应采用稀释涂布平板法进行接种。(4)在有氧条件下，丙酮酸参与细
菌的有氧呼吸，可以为该菌的生长提供能量和合成其他物质的原料。
3.(2018·全国卷Ⅰ，37)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃
薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到
M培养基。
回答下列问题：
(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制________的生
长，加入了链霉素的培养基属于________培养基。
(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类
型除氮源外还有__________________________________________(答出两点即
可 ) 。 氮 源 进 入 细 胞 后 ， 可 参 与 合 成 的 生 物 大 分 子 有
________________________(答出两点即可)。
(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后
可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是________，该
方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是________________________________。(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同
一稀释倍数下得到以下结果：
甲同学涂布了 3 个平板，统计的菌落数分别是 110、140 和 149，取平均值
133；乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是 27、169和176，取平均值
124。有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是
___________________________________________________。
答案 (1)细菌 选择 (2)碳源、无机盐 蛋白质、核酸 (3)碘液 淀粉遇碘液
显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈 (4)乙同学的结果中，
1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差
解析 (1)在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他
种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。若M培养基是用于真菌的筛选，
则应加入链霉素以抑制细菌的生长，其属于选择培养基。(2)马铃薯浸出液中含
有淀粉、蛋白质、脂质、无机盐、水等多种物质，因此，除氮源外其中还有微
生物生长所需要的碳源、无机盐等营养要素。进入细胞的氮源可参与合成蛋白
质、核酸(DNA、RNA)等含氮的生物大分子。(3)加入显色剂碘液后，淀粉遇碘
变蓝，而淀粉的水解产物则不发生这种反应。若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，
接种土壤滤液并培养，土壤中能产生淀粉酶的微生物可将淀粉分解，菌落周围
就会出现透明圈，这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选能产淀粉酶的
微生物了。(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，结果的重复性太差，不能简单地将3个平板的
计数值用来求平均值。
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1.(2021·河北张家口质量监测)配制培养基时可根据某一种或某一类微生物的特
殊营养要求，加入某些物质或除去某些物质以抑制其他微生物的生长，也可以
根据某些微生物对一些物理、化学因素的抗性，设置特殊培养条件或在培养基
中加入某种化学物质，从而筛选出特定的微生物，这种培养基叫做选择培养基。
根据有关内容回答以下问题：
(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的一般步骤是：计算、称量、溶化、________、
________。
(2)某同学在做微生物实验时，不小心把大肠杆菌和酵母菌混合在了一起。请回
答有关分离得到纯度较高的大肠杆菌和酵母菌的实验的问题：
主要步骤：
①制备两种培养基：一种________的培养基，一种加青霉素的培养基。两种培
养基分别分成两份，依次标上A、A′、B、B′备用。培养基应采用________法灭
菌。
②分别向A、B培养基中接种________。
③接种后，放在恒温箱中培养3～4天。试说明观察到的培养结果：
。
④从A、B培养基的菌落中挑取生长良好的两种目的菌种，分别接种到 A′、B′
培养基中。
⑤接种后，把A′、B′培养基放入恒温箱中培养3～4天。第④⑤两个步骤的目的
是 。
答案 (1)灭菌 倒平板 (2)①加伊红美蓝 高压蒸汽灭菌 ②混合菌 ③加伊
红美蓝的培养基上有黑色大肠杆菌菌落，加青霉素的培养基上只有酵母菌菌落
⑤获得纯度较高的大肠杆菌和酵母菌解析 (1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的一般步骤是：计算、称量、溶化、灭
菌、倒平板。(2)青霉素不影响酵母菌的生长繁殖，但会抑制大肠杆菌的生长繁
殖，大肠杆菌的代谢产物能与伊红美蓝发生特定的颜色反应，使菌落呈黑色，
所以应一种培养基中加入伊红美蓝，一种培养基中加入青霉素。培养基采用高
压蒸汽灭菌法灭菌。分别向A、B培养基中接种混合菌，培养后加伊红美蓝的
培养基上的黑色菌落是大肠杆菌菌落，加青霉素的培养基上生长的菌落是酵母
菌菌落。从A、B培养基的菌落中挑取生长良好的两种目的菌种，分别接种到
A′、B′培养基中培养，目的是获得纯度较高的大肠杆菌和酵母菌。
2.(2021·江西南昌十中期末)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该
河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：
(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。在涂布接种前，随机取若
干空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是________________________；
然后，将1 mL水样稀释100倍，在4个平板上用涂布法分别接入 0.1 mL稀释
液；经适当培养后，4个平板上的菌落数分别为29、39、38和37，据此可得出
每升水样中的活菌数为________。
(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过________灭
菌。
(3)图A和B中，________表示的是用平板划线法接种培养后得到的结果。能够
得到单菌落的是图示________。(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另
一部分进行振荡培养。结果发现振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。
分析其原因是：振荡培养能提高培养液中________的含量，同时可使菌体与培
养液充分接触，提高营养物质的利用率。
(5)得到图B所示结果所用的接种工具是________。测定土壤中细菌的数量时，
一般稀释倍数为________倍。
答案 (1)检测培养基灭菌是否合格 3.8×107 (2)灼烧 (3)A AB (4)溶解氧
(5)涂布器 104、105、106
解析 (1)在微生物培养过程中应该进行无菌操作，配制的培养基要进行高压蒸
汽灭菌，可以将未接种的空白平板进行培养以检测培养基灭菌是否彻底、合格；
由题意知1 mL水样中的活菌数是(39＋38＋37)÷3÷0.1×100＝3.8×104(个)，每
升水样中的活菌数是3.8×104×103＝3.8×107(个)。(2)对接种环常用的灭菌方法
是灼烧灭菌。(3)分析题图可知，图A表示用平板划线法接种培养后得到的结果，
图B表示用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果，二者都能得到单菌落。
(4)振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快，其原因是振荡培养提高了培
养液中溶解氧的含量，同时使菌体与培养液充分接触，提高了营养物质的利用
率。(5)图B表示用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果，接种工具是涂布器。
测定土壤中细菌的数量时，为了保证培养基平板上菌落的数目为 30～300，一
般稀释倍数为104、105、106倍。3.(2021·福建毕业班质检)硒是一种生命必需的微量元素。亚硒酸钠对细菌的生
长有明显的毒害作用，土壤中的一些富硒细菌可将其还原为红色单质硒。如图
为土壤中富硒细菌的筛选和纯化过程。回答下列问题。
(1)若②中出现________的现象，则说明培养基中的亚硒酸钠被细菌还原。
(2)梯度稀释的目的是________________________。将细菌从④接种至⑤应采用
________法。
(3)研究人员筛选出一种富硒菌株，现欲通过观察菌落来判断菌株对亚硒酸钠的
耐受值，请将下列实验补充完整：
①配制系列浓度梯度的亚硒酸钠________(填“液体”或“固体”)培养基；
②向培养基中分别接种________的该菌株菌液，在适宜条件下培养一段时间；
③观察菌落的生长情况，________的培养基对应的最高亚硒酸钠浓度即为该菌
株对亚硒酸钠的最高耐受值。
答案 (1)培养基变红 (2)使聚集在一起的细胞分散成单个细胞，从而能在培养
基表面形成单个的菌落 平板划线 (3)①固体 ②等量 ③有菌落生长
解析 (1)据题意可知，土壤中的一些富硒细菌可将亚硒酸钠还原为红色单质硒，
因此若②中培养基变红，则说明培养基中的亚硒酸钠被细菌还原。(2)梯度稀释
的目的是使聚集在一起的细胞分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个
的菌落；从④中挑取菌种接种至⑤应采用平板划线法。(3)由题意可知，研究人
员筛选出了一种富硒菌株，若要通过观察菌落来判断菌株对亚硒酸钠的耐受值，
步骤如下：①配制系列浓度梯度的亚硒酸钠固体培养基；②向培养基中分别接种等量的该菌株菌液，在适宜条件下培养一段时间；③观察菌落生长情况，有
菌落生长的培养基对应的最高亚硒酸钠浓度即为该菌株对亚硒酸钠的最高耐受
值。
4.(2021·云南昆明三中测试)某些菌可将尿素分解成 CO 和NH 。欲从土壤中分
2 3
离能分解尿素的细菌，某研究小组利用成分为KH PO 、Na HPO 、葡萄糖、琼
2 4 2 4
脂、尿素的培养基进行了相关实验。请回答：
(1)在土壤微生物的培养过程中，培养基中的 KH PO 与Na HPO 除了可以作为
2 4 2 4
________被细菌利用外，它们还具有的功能为________________________。
(2)该培养基对土壤中的微生物具有选择作用，理由是_____________________。
微生物能分解尿素的原因是其能合成________。
(3)为获得目的菌的单菌落，常对土壤样液做________处理。为便于确认目的菌，
可在培养基中加入________指示剂，接种并培养菌种后，可根据菌落周围
________判断出该菌能分解尿素。
答案 (1)无机盐 维持培养基的pH相对稳定 (2)尿素为该培养基中的唯一氮
源，只有能以尿素为氮源的微生物才能在此培养基上生长、增殖 脲酶 (3)稀
释 酚红 出现红色
解析 (1)培养基中的KH PO 与Na HPO 除可作为无机盐被细菌利用外，还可
2 4 2 4
构成缓冲液，维持培养基的pH相对稳定，利于微生物的生长与增殖。(2)该培
养基中的尿素为唯一氮源，只有能以尿素为氮源的微生物才能在此培养基上生
长、增殖，所以该培养基对土壤中的微生物具有选择作用。微生物能分解尿素
的原因是其能合成脲酶，脲酶可将尿素分解为氨。(3)为获得目的菌的单一菌落，常用无菌水对土壤样液做稀释处理。尿素分解菌合成的脲酶可将尿素分解成氨，
氨可使培养基的pH升高，进而使酚红指示剂变红，所以为便于确认目的菌，
可在培养基中加入酚红指示剂，接种并培养菌种后，可根据菌落周围出现红色
判断出该菌能分解尿素。
5.(2021·江苏无锡期末)土壤中含有能将难溶性磷酸盐转变成植物可以吸收和利
用的可溶性磷的优良解磷菌株Q。如图1表示制备固体培养基过程中的某操作，
图2是科研人员从土壤中分离出菌株Q的部分过程示意图。
请回答下列问题：
(1) 图 1 所示操作 称为 ________，待平板冷凝后需 ________，以防止
________________________。
(2)图2所示接种方法是________________。在3个平板上分别接入0.1 mL稀释
液，经适当培养后，3个平板上菌落数分别是38、42、40，则1 g土壤中的活菌
数约为________。
(3)图3是某同学利用不同于图2的方法分离菌株Q的示意图。下列对其操作及
结果的叙述错误的有________。图3
a.操作前用无水乙醇对双手进行消毒处理
b.划线时将沾有菌种的接种环插入培养基
c.只有在⑤区域中才能得到所需菌落
d.整个过程需要对接种环进行6次灼烧
(4)固体培养基中难溶性磷酸盐在菌株Q的作用下溶解，会在菌落周围形成透明
圈(图4)，透明圈直径(D)与菌落直径(d)的比值(D/d)代表微生物溶解难溶性磷酸
盐的能力大小。下表是初步筛选出的三种优良解磷菌株。
图4
菌株 透明圈直径(D) 菌落直径(d)
M－3－01 18.8 12.3
B3－5－6 20.7 8.0
T－4－01 9.1 6.5
根据实验结果分析溶解难溶性磷酸盐能力最强的菌株是________。该菌种分离
纯化后，常用________法进行长期保存。
答案 (1)倒平板 倒置 皿盖上的冷凝水落入培养基 (2)稀释涂布平板法
4×107 (3)a、b、c (4)B3－5－6 甘油管藏
解析 (1)图1所示操作称为倒平板，待平板冷凝后倒置，以防止皿盖上的冷凝
水落入培养基，造成污染。(2)图2所示接种方法是稀释涂布平板法。称取1 g
土壤，按如图所示方法溶解和稀释后，在三个平板上分别接入 0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别是38、42、40，据此可计算出每克土
样中的活菌数为×103×100÷0.1 ＝4.0×107。(3)图3是平板划线的接种操作。操
作前应用70%的乙醇溶液对接种人员的双手进行消毒处理，a错误；划线操作
时将菌种涂抹在培养基表面，b错误；在5个区域中，只要有单个活细菌，通过
培养都可获得所需菌落，c错误；在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，接
种环的灭菌方法应是在火焰上灼烧，整个过程需要对接种环进行6次灼烧，d正
确。故选a、b、c。(4)根据实验原理中“透明圈直径(D)与菌落直径(d)的比值
(D/d)代表微生物溶解难溶性磷酸盐的能力大小”，结合表格中数据可以确定解
磷能力最强的菌株是B3－5—6。该菌种分离纯化后，常用甘油管藏法进行长期
保存。
6.(2021·山东青岛期末)污水的有效处理是人民群众健康生活的保障。请回答相
关问题：
(1)微生物絮凝剂具有絮凝沉降废水的作用。科研人员通过生物技术筛选稳定、
高效的絮凝剂产生菌。取少量活性污泥，向其中加入________制成菌液，将菌
液接种到培养基中进行富集培养，再接种到________(填物理性质)培养基上，
数天后，挑选出生长较好、表面光滑带黏性的________。
(2)初选菌在培养液中扩大培养后，测定其对高岭土悬液的絮凝效果，并与天然
有机高分子絮凝剂作比较。实验组加入含有初选菌的培养液，对照组应该设置
两组，它们分别是 。答案 (1)无菌水 固体 菌落 (2)加入天然有机高分子絮凝剂组，加入不含初
选菌的培养液组
解析 (1)制作菌液需要向活性污泥中加入无菌水，富集培养后为了获得目的菌
株，需要将菌液接种到固体培养基中，挑选出目的菌落。(2)由于需要与天然有
机高分子絮凝剂作比较，所以一组对照组选择加入天然有机高分子絮凝剂，另
一组加入不含初选菌的培养液作为空白对照。
7.(2021·广东七校联考)测定水样是否符合饮用水的卫生标准，常用滤膜法测定
大肠杆菌的总数。大肠杆菌在含有伊红美蓝的固体培养基(EMB琼脂培养基)上
长出的菌落呈黑色。滤膜法的大致流程如图所示：用滤膜过滤待测水样→水样
中的细菌留在滤膜上→将滤膜转移到EMB琼脂培养基上培养→统计菌落数目。
据图回答问题：
(1)待测水样过滤完之后，还有部分细菌吸附在滤杯杯壁上，将这部分细菌也尽
可能集中到滤膜上的操作为________________________。
(2)将完成过滤之后的滤膜紧贴在 EMB琼脂培养基上，这属于微生物培养中的
________操作。从功能上看，EMB琼脂培养基属于________培养基。
(3)无菌条件下将90 mL无菌水加到10 mL待测水样中，这样就将待测水样稀释
了________倍，将稀释后的菌液通过滤膜法测得EMB琼脂培养基上的菌落数为
45，其中呈黑色的菌落数为5，则1 L待测水样中的大肠杆菌数目为________个。
(4)将放有滤膜的平板置于适宜条件下培养，每隔12 h统计一次菌落数目，应选
取菌落数目稳定时的记录作为结果。用这种方法测定的细菌数量比实际活菌数
量要________，这是因为 。
(5)若要测定待测水样中酵母菌的数目，应更换上述过滤装置中的滤膜，选择孔径________(填“更大”或“更小”)的滤膜。
答案 (1)无菌条件下，用无菌水冲洗滤杯，再次过滤 (2)接种 鉴别 (3)10
500 (4)少(或低) 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌
落 (5)更大
解析 (1)要将吸附在滤杯杯壁上的细菌集中到滤膜上，需在无菌条件下，用无
菌水冲洗滤杯壁，再进行过滤。(2)滤膜上有细菌，将滤膜紧贴在培养基上，相
当于接种操作。EMB琼脂培养基中含有伊红美蓝，伊红美蓝能鉴别大肠杆菌，
该培养基为鉴别培养基。(3)在无菌条件下将90 mL无菌水加到10 mL待测水样
中，待测水样被稀释了10倍。1 L待测水样中含有的大肠杆菌数目为5÷10×1
000＝500(个)。(4)当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌
落，因此用该方法测定的细菌数量比实际活菌数量要低。(5)酵母菌为真核生物，
大肠杆菌为原核生物，真核细胞的直径一般比原核细胞的大，因此若要测定酵
母菌的数目，应选择孔径较大的滤膜。
8.(2021·安徽江南十校检测)土壤中含有多种微生物，某研究小组欲分离能在被
Fe2＋污染的土壤环境下生存的希瓦氏菌，进行了相关研究。回答下列问题：
(1)配制培养基：加入牛肉膏、蛋白胨、琼脂、NaCl、H O及________________
2
等并灭菌；该培养基按功能划分，属于________培养基。
(2)分离希瓦氏菌并计数：将10 g土样溶于90 mL蒸馏水中，再稀释成多个倍数，
取多个稀释倍数的土壤样品液0.1 mL分别接种到若干个上述培养基平板上，这
样做的目的是________________________________；培养一段时间后，A、B研究员在稀释倍数为105的平板上得到的计数结果为：A涂布4个平板，统计的菌
落数分别是 150、178、259、310；B 涂布 4 个平板，统计的菌落数分别是
152、165、175、184。则每克土壤样品中的希瓦氏菌数量最可能为________个。
(3)进一步纯化希瓦氏菌：采用平板划线法接种培养一段时间后，发现第一划线
区域上不间断地长满了菌落，第二划线区域上几乎无菌落，分析出现此现象的
原因可能是 (答出两点)。
(4)研究人员还欲采用测定 ATP含量的方法估算希瓦氏菌数，该方法的依据是
________________________________________，此方法与显微镜直接计数法相
比 ， 得 到 的 希 瓦 氏 菌 数 目 ________( 填 “ 多 ” 或 “ 少 ” ) ， 原 因 是
_______________。
答案 (1)含高浓度Fe2＋的溶液 选择 (2)获得菌落数量合适的平板，排除偶然
因素造成的误差 1.69×108 (3)第一次划线后接种环灼烧后未冷却就划线；第
二次划线时未与第一区域接触 (4)活细胞都能产生ATP，ATP含量可用于估算
希瓦氏菌的数目 少 显微镜直接计数法统计的结果包括死细胞和活细胞的数
目
解析 (1)本实验的目的是分离能在被Fe2＋污染的土壤环境下生存的希瓦氏菌，
所以还应在培养基中添加含高浓度 Fe2＋的溶液，按功能划分，该培养基属于选
择培养基。(2)取多个稀释倍数的土壤样品液各0.1 mL分别接种到若干个培养基
平板上，这样做的目的是获得菌落数量合适的平板，排除偶然因素造成的误差；
对微生物进行计数需要选择菌落数为30～300的平板进行计数，B的结果比较
准确，所以每克土壤样品中希瓦氏菌的数目为×105＝1.69×108(个)。(3)第一划
线区域上不间断地长满了菌落，第二划线区域上几乎无菌落，可能是因为第一次划线后接种环灼烧后未冷却就划线，也可能是因为第二次划线时未与第一区
域接触。(4)活细胞都能产生ATP，可以采用测定ATP含量的方法估算希瓦氏菌
数，死的细菌不能产生ATP，而显微镜直接计数法统计的结果包括死细胞和活
细胞的数目，所以与显微镜直接计数法相比采用测定ATP含量的方法得到的希
瓦氏菌数目少。
9.(2021·湖南名校联盟联考)黄曲霉毒素是由真菌产生的次级代谢产物，其中黄
曲霉毒素B1化学性质稳定，具有很强的致癌性。在自然界中存在许多种能降解
黄曲霉毒素B1的微生物，人类可以从土壤中筛选出能高效降解黄曲霉毒素B1
的微生物。回答下列问题：
(1)黄曲霉毒素B1可引起细胞癌变，其属于________致癌因子。细胞癌变的根
本原因是______________________。
(2)为了筛选能降解黄曲霉毒素B1的微生物，需要配制以黄曲霉毒素B1为唯一
碳源的培养基，从功能上讲，该培养基属于________。接种培养后，在该培养
基上形成的菌落不一定为一个种群，其原因是 。
(3)用平板划线法纯化某菌株时，在第二次及后面几次划线时，总是从上一次所
划线的末端开始划线，这样做的目的是________________________________。
接 种 操 作 需 要 在 酒 精 灯 火 焰 旁 进 行 ， 其 目 的 是
________________________________。
(4)若在一定条件下培养基中的黄曲霉毒素 B1能呈现出一定的颜色，能降解黄
曲霉毒素 B1的微生物将黄曲霉毒素 B1降解会使颜色褪去，则可以通过测定
__________________来确定不同菌株降解黄曲霉毒素B1能力的大小。选择出能
高效降解黄曲霉毒素 B1的微生物后，若要继续探究该微生物降解黄曲霉毒素
B1时的最适温度，请写出实验思路： 。
答案 (1)化学 原癌基因和抑癌基因发生突变 (2)选择培养基 在以黄曲霉毒素B1为唯一碳源的培养基上生长的微生物可能不止一种 (3)将聚集的菌体逐
步稀释以便获得单个菌落 防止环境中的杂菌污染 (4)透明圈的大小(或直径)
比较不同温度下等量的该微生物降解黄曲霉毒素B1的速率，速率最大时所对应
的温度就是该微生物降解黄曲霉毒素B1的最适温度
解析 (1)黄曲霉毒素B1属于微生物产生的化学物质，可引起细胞癌变，其属
于化学致癌因子，细胞癌变的根本原因是原癌基因和抑癌基因发生突变。(2)为
了筛选能降解黄曲霉毒素B1的微生物，需要配制以黄曲霉毒素B1为唯一碳源
的培养基，从功能上讲，该培养基属于选择培养基。接种培养后，由于以黄曲
霉毒素B1为唯一碳源的微生物可能不止一种，所以在该培养基上形成的菌落不
一定为一个种群。(3)用平板划线法纯化某菌株时，在第二次及后面几次划线时，
总是从上一次所划线的末端开始划线，这样做的目的是将聚集的菌体逐渐分离
以便得到单一的菌体。接种操作需要在酒精灯火焰旁进行，其目的是防止杂菌
污染。(4)由于能降解黄曲霉毒素B1的微生物将黄曲霉毒素B1降解会使培养基
中黄曲霉毒素B1所呈现的颜色褪去，故可通过测定透明圈大小来确定不同菌株
降解黄曲霉毒素B1能力的大小，透明圈越大，说明降解能力越强。若要探究该
微生物降解黄曲霉毒素B1时的最适温度，可以通过测定不同温度下等量的该微
生物降解黄曲霉毒素B1的速率，速率最大时所对应的温度就是该微生物降解黄曲霉毒素B1的最适温度。
