曲一线 2023版《5年高考3年模拟》B版
专题 27 基因工程和生物技术的安全性与伦理问题
高频考点
考点1 基因工程的工具与操作
该考点的基础层级训练内容为基因工程的工具与操作程序,重难、综合层级试题常考查
PCR技术的操作及应用。
限时30分钟,正答率: /8。
基础
1.(2021湖北,7,2分)限制性内切酶EcoRⅠ识别并切割 双链DNA,用
EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为(
)
A.6 B.250 C.4 000 D.24 000
答案 C
2.(2018北京理综,5,6分)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶)
分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是(
)
图1 酶切位点图
图2 电泳结果示意图
A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B.图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C.泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA
答案 D
重难
3.(2021湖北,16,2分)某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带
(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应
中非特异条带的产生,以下措施中有效的是( )
A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度
答案 D
4.(2020山东,15,2分)新型冠状病毒的检测方法目前主要有核酸检测法和抗体检测法。
下列说法错误的是( )
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A.抗体检测法利用了抗原与抗体特异性结合的原理
B.感染早期,会出现能检测出核酸而检测不出抗体的情况
C.患者康复后,会出现能检测出抗体而检测不出核酸的情况
D.感染该病毒但无症状者,因其体内不能产生抗体不适用抗体检测法检测
答案 D
综合
5.(2022全国乙,38,15分) 新冠疫情出现后,病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥
了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒,检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。这
种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA,这一过程需要的酶是
,再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病
毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性,在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中
的
来进行。PCR过程每次循环分为3步,其中温度最低的一步
是 。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体),若核
酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性,说明 (答出1种情况即
可);若核酸检测和抗体检测结果均为阳性,说明 。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白
S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗,可以通过基因工程技术获得
大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是
。
答案 (1)逆转录酶 (2)特定核苷酸序列 复性 (3)曾经感染过新冠病毒但已康复 已
感染新冠病毒,还未康复(或为患者) (4)蛋白S基因的获取→构建蛋白S基因表达载体
→导入受体细胞(微生物)→蛋白S基因的检测与鉴定(检测受体能否产生蛋白S)
6.(2022广东,22,12分)“绿水逶迤去,青山相向开”,大力发展低碳经济已成为全社会的共
识。基于某些梭菌的特殊代谢能力,有研究者以某些工业废气(含CO 等一碳温室气体,
2
多来自高污染排放企业)为原料,通过厌氧发酵生产丙酮,构建一种生产高附加值化工产
品的新技术。
回答下列问题:
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对 ,利用PCR技术,在优化反
应条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k,用于在梭菌中建立多基因组合表达库,经筛选
后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等,其中抗生素
抗性基因的作用是 ,终止子的作用是 。
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(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时,出现了生长迟缓的现象,推测其原因
可能是 ,此外丙酮的积累会伤害细胞,需要进一
步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术,实现了 ,体现了循环经济特点。
从“碳中和”的角度看,该技术的优势在于 ,具有广泛的应用前景和良好
的社会效益。
答案 (1)引物 (2)便于筛选含有目的基因的受体细胞 使转录在所需要的地方停下
来 (3)酶蛋白的大量合成消耗了大量物质和能量 (4)废弃物的资源化 减少了碳排放
7.(2021全国乙,38,15分)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合
人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性核酸内切酶(限
制性内切核酸酶)的切割位点如图所示。
回答下列问题:
(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T DNA连接酶。上图中
4
酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中
酶切割后的DNA片段可以用T DNA连接酶连接。
4
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点,可
以保证质粒在受体细胞中能 ;
质粒DNA分子上有 ,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记
基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是
。
(4)表达载体含有启动子,启动子是指 。
答案 (1)EcoRⅠ、PstⅠ EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ (2)磷酸二酯键 (3)自
我复制 限制酶切割位点 将待筛选的宿主细胞接种到含该抗生素的培养基中,能够生
长的是含有质粒载体的宿主细胞 (4)RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段
8.(2020江苏,33,8分)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已
知序列两侧的序列,具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例):
请据图回答问题:
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(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种 酶,它通过识别特定的 切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成
;PCR循环中,升温到95 ℃是为了获得 ;Taq DNA聚合酶的作用是催化
。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须
是 (从引物①②③④中选择,填编号)。
DNA序列(虚线处省略了
部分核苷酸序列)
已知
序列
①5'-AACTATGCGCTCATGA-3'
PCR ②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'
引物 ③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'
④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'
(4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省
略了部分核苷酸序列),结果正确的是 。
A.5'-AACTATGCG…………AGCCCTT-3'
B.5'-AATTCCATG…………CTGAATT-3'
C.5'-GCAATGCGT…………TCGGGAA-3'
D.5'-TTGATACGC…………CGAGTAC-3'
答案 (1)限制性核酸内切(新教材为限制性内切核酸)(或限制) 核苷酸序列 (2)磷酸
二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 (3)②④ (4)B
考点2 基因工程的应用与蛋白质工程
该考点的基础层级训练内容为蛋白质工程与基因工程的应用,重难、综合层级试题常结
合生活实践、学习探索等情境考查基因工程的应用。
限时25分钟,正答率: /6。
基础
1.(2021辽宁,14,2分)腈水合酶(N )广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高
0
温,利用蛋白质工程技术在N 的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型
0
腈水合酶(N )。下列有关叙述错误的是( )
1
A.N 与N 氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
1 0
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N 的过程需要进行转录和翻译
1
D.检测N 的活性时先将N 与底物充分混合,再置于高温环境
1 1
答案 D
2.(2021江苏启东期中,15)纤维素酶广泛应用于医药、食品发酵、造纸、废水处理等领
域。研究人员利用蛋白质工程将细菌纤维素酶的第137、179、194位相应氨基酸替换
为赖氨酸后,纤维素酶热稳定性得到了提高。下列有关该技术说法错误的是( )
A.经改造后的纤维素酶热稳定性提高这一性状可遗传
B.对纤维素酶的改造是通过直接改造mRNA实现的
C.改造纤维素酶也需要构建基因表达载体
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D.改造后的纤维素酶和原纤维素酶不是同一种酶
答案 B
重难
3.(2022湖南,22,15分)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要
成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活
性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是 ,物质b是 。在生产过程中,
物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是
。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有
、 和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血
活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的
(填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是
。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝
血活性差异,简要写出实验设计思路
。
答案 (1)多肽链 mRNA mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性 (2)从基因文
库中获取 人工合成 DNA半保留复制 (3)种类 酶处理后形成的肽中氨基酸的种类、
数目和排列顺序不同 (4)在相同条件下,将蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶
解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较三组血液凝固所需时间长短,所需时间越
长说明其抗凝血活性越大
4.(2021广东,22,12分)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法,在细胞外构建多酶催
化体系,获得目标产物的新技术,其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计
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了4步酶促反应的非细胞合成路线(如图),可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料),
以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题,并可以提高产率。
回答下列问题:
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外,获得酶基
因的方法还有 。(答出两种即可)
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模
板时必须除去蛋白,方法有 。(答出两种即可)
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的
表达。表达载体转化大肠杆菌时,首先应制备 细胞。为了检测目的基因是否成功
表达出酶蛋白,需要采用的方法有 。
(4)依图中所示流程,在一定的温度、pH等条件下,将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成
一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同,可能导致的结果是
。在分子水平上,可以通过改变 ,从而改变蛋白质的结构,实现对酶特性的改造
和优化。
答案 (1)从基因文库中获取、用化学方法人工合成 (2)蛋白酶水解法、盐析法、高
温变性法 (3)感受态 抗原—抗体杂交 (4)部分酶失活,无法获得肌醇 基因结构
5.(2021河北,24,15分)采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。
利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内,进行后续处理(例如,收集植物组织器
官异地妥善储存),可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力,研
究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物,并检测了相关指标。
回答下列问题:
(1)为获取YCF1基因,将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接,导入受体菌的
群体中储存,这个群体称为 。
(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,所需要的两种酶是 。构
建的重组基因表达载体中必须含有标记基因,其作用是
。
(3)进行前期研究时,将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜,采用最
多的方法是 。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系,采用不
育株系作为实验材料的目的是 。
(4)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中,半年后测定植株干重
(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知,与野生型比,转基因植株对Cd具有更强
的 (填“耐性”或“富集能力”);据图2可知,对转基因植株的 进行后
续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
图1
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图2
(5)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析,转基因杨树比野生型
能更好地适应高Cd环境的原因是 。
相较于草本植物,采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于
(写出两点即可)。
答案 (1)基因文库 (2)限制酶和DNA连接酶 鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从
而将含有目的基因的细胞筛选出来 (3)农杆菌转化法 防止YCF1基因随花粉扩散,给
生态系统带来风险 (4)耐性 叶 (5)转基因杨树液泡膜上的Cd转运蛋白可将细胞质
基质中的Cd转运至液泡贮存,降低Cd对细胞代谢的影响 乔木比草本生物量大,与外界
物质交换能力强
6.(2020山东,25,11分)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉,直链淀粉所占比例越小糯性
越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻,实现了对直链淀粉合
成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑,从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,所需的酶是
,重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为 。
(2)根据启动子的作用推测,Wx基因启动子序列的改变影响了 ,
从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比,3个突变品系中Wx基因控制合成
的直链淀粉合成酶的氨基酸序列 (填:“发生”或“不发生”)改变,原因是
。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响,科研人员需要检测Wx基因转录产生的
mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA,经 过程
获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA,原因
是 。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示,据图推测糯性最强的品系为 ,原因
是 。
答案 (1)限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶)和DNA连接酶 转化 (2)RNA聚合
酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子
(3)逆转录(或:反转录) 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或:引物能与
Wx基因的cDNA特异性结合) (4)品系3 品系3的Wx mRNA最少,控制合成的直链
淀粉合成酶最少,直链淀粉合成量最少,糯性最强
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考点3 生物技术的安全性与伦理问题
该考点的基础层级训练内容为生物技术的安全性与伦理问题,重难、综合层级试题常结
合基因工程、克隆技术、胚胎工程进行综合考查。
限时10分钟,正答率: /3。
基础
1.(2021湖北七市教研协作体一模,2)当面对日常生活中与转基因技术有关的话题时,我们
需要理性地表明观点和参与讨论。下列不属于理性看待转基因技术的是( )
A.要靠确凿的证据和严谨的逻辑来思考转基因技术的影响
B.只要有证据表明某转基因产品有害,就应该禁止转基因技术的应用
C.经济、文化和伦理道德观念等的差异,人们对转基因技术有不同的看法
D.要在清晰地了解转基因技术的原理和操作规程的基础上来讨论转基因技术的相关问
题
答案 B
2.(2022江苏连云港二模,6)近日,我国研究团队利用一种新方法将人的多能干细胞在体外
诱导转化为全能性的8细胞期胚胎样细胞,类似于受精卵发育3天时的状态。下列说法
正确的是( )
A.该胚胎样细胞处于囊胚期阶段,理论上可以进行胚胎分割并移植
B.该成果将助力实现人体器官的体外再生,解决器官短缺、移植排斥反应等问题
C.该研究涉及生殖性克隆,需通过伦理审查,严格遵循我国法规和伦理准则
D.该过程中发生了细胞分化,体现了动物细胞核具有全能性
答案 B
3.(2022山东聊城一模,15)克隆技术可用于生殖性克隆和治疗性克隆,治疗性克隆有希望
最终解决供体器官短缺和器官移植出现的排异反应,如图表示治疗性克隆的过程。下列
叙述正确的是( )
A.上述过程利用了核移植和胚胎移植技术
B.①、②过程不进行DNA复制和蛋白质的合成
C.胚胎干细胞和诱导出的各种细胞都需在CO 培养箱中进行培养
2
D.治疗性克隆解决了器官移植的排异反应,已成为目前器官移植的常用手段
答案 C
易混易错
易错 DNA的粗提取与鉴定
1.(2020海南,10,2分)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是( )
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A.羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料
B.提取植物细胞的DNA时,需要加入一定量的洗涤剂和食盐
C.预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性,防止DNA水解
D.在沸水浴条件下,DNA与二苯胺反应呈现蓝色
答案 A
2.(2021山东,13,2分)粗提取DNA时,向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过滤
后所得滤液进行下列处理后再进行过滤,在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出
DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是( )
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B.37~40 ℃的水浴箱中保温10~15分钟
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D.加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L
答案 A
疑难 基因编辑技术
3.(2022江苏苏州期中,13)CRISPR/Cas13d技术是一项以向导RNA(gRNA)引导Cas13d
蛋白定向作用于靶向RNA的新兴技术。研究人员设计了若干个gRNA,分别靶向新冠病
毒RNA基因组的不同肽编码区,但不影响人体细胞的RNA,作用机理如图所示。下列相
关叙述错误的是( )
A.gRNA通过与靶向RNA碱基互补配对将Cas13d蛋白引导至特定位点
B.Cas13d蛋白能定向切开相邻两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键
C.与限制性内切核酸酶相比,Cas13d蛋白不具有特异性识别能力
D.该技术有望成为一种能定向、灵活治疗RNA病毒感染的新方法
答案 B
4.(2022山东临沂开学考,23)(不定项)CRISPR/Cas9基因编辑技术可简单、准确地进行基
因定点编辑,其原理是由一条单链向导RNA引导Cas9蛋白到一个特定的基因位点对特
定的DNA序列进行切割。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列,Cas9蛋白可人
为选择DNA上的目标位点进行切割。下列相关叙述错误的是( )
A.Cas9蛋白具有限制酶的作用和特性
B.Cas9蛋白借助向导RNA对目标分子进行定位依赖于碱基互补配对
C.对不同目标基因进行编辑时可能使用相同的Cas9蛋白和不同的向导RNA
D.Cas9蛋白切割的位点是氢键
答案 AD
题型模板
模型一 限制酶的选择
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典型模型
限制酶选择的基本原则
模型特征:基因工程的试题往往会考查限制酶的选择,做题时要结合目的基因和质粒综
合考虑选择哪些限制酶。
1.(2021辽宁,24节选,3分)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物
PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因,研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因
编码序列(简称phb2基因),大小为0.9 kb (1 kb=1 000碱基对),利用大肠杆菌表达该蛋白。
回答下列问题:
图1为所用载体图谱示意图,图中限制酶的识别序列及切割位点见表。为使phb2基
因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接,在扩增的phb2基因两端
分别引入 和 两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2
基因和载体进行连接时,可选用 (填 “E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA
连接酶”)。
图1
相关限制酶的识别序列及切割位点
注:箭头表示切割位点
答案 PvuⅡ EcoRⅠ T4 DNA连接酶
2.(2022浙江百校联盟联考,37节选)钙依赖蛋白激酶(CDPK)在植物的信号传导和提高植
物抗性方面发挥着重要作用。科学家通过将CDPK基因导入拟南芥(双子叶植物)中,来
获得具有抗性的新品种。如图为某种质粒表达载体和含CDPK基因的DNA片段示意图,
图中标记了限制酶的切割位点。据此回答下列问题:
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通过基因工程,将CDPK基因导入拟南芥中,获得具有抗性的新品种的育种原理是
。为了使CDPK基因插入质粒中,应选取 (两种限制酶)分别切割质粒和含
目的基因的DNA片段,不选取另两种限制酶的理由是
。
答案 基因重组 SmaⅠ和XbaⅠ Hind Ⅲ可切断目的基因(CDPK基因),EcoRⅠ可切
断标记基因(卡那霉素抗性基因)
变式模型
变式 特殊情况下的限制酶选择
模型特征:在某些特殊情况下,如载体和目的基因上的限制酶不同时,可以考虑选择同
尾酶(识别序列不同但切出的DNA片段具有相同的黏性末端);质粒和目的基因都能进行
转录,且转录方向是确定的,在将目的基因插入质粒时,要考虑选择哪种限制酶才能使二者
的转录方向一致。
3.(2021山东,25,12分)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,
该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对
γ基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不
同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定BCL11A蛋
白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
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(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限制酶识
别序列。据图可知,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ,在R末端添加
的序列所对应的限制酶是 。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程
共需要 种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产
物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7
与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。
(3)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,而含
F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应
的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列,据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位
于 ,理由是
。
答案 (1)SalⅠ EcoRⅠ 6 (2)F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不
表达 (3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判
断,F1~F4与R扩增产物上均有结合位点,因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游
(右侧);F5~F6与R扩增产物上均无结合位点,可知结合位点位于F5所对应调控序列的上
游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
模型二 PCR技术及应用
典型模型
PCR技术
模型特征:基因工程中,PCR技术是获取和扩增目的基因的重要手段,PCR技术的条件、
步骤及结果是最常见的命题落脚点。
1.(2022江苏南通如皋中学阶段考,19)(多选)农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机
插入被侵染植物的染色体DNA上。研究者将如图中被侵染植物的DNA片段连接成环,
并以此环为模板,利用PCR技术扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列,以此可确定T-
DNA插入的具体位置。下列说法正确的是 ( )
A.进行PCR扩增的依据是DNA分子双链复制的原理
B.进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和热稳定的DNA聚合酶
C.利用图中的引物②、③组合可扩增出两侧的未知序列
D.通过与受体细胞的基因组序列比对,可确定T-DNA的插入位置
答案 AD
2.(2022山东济南十一校联考,15)为减少引物与模板之间的非特异性配对,人们在常规
PCR技术的基础上进行了改良,发明了巢式PCR技术。其原理是利用两套PCR引物进
行两轮PCR扩增,首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在DNA进行15~30个循环
的扩增;第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板,利用第二对引物(内引物或巢式引物)进行
15~30个循环的扩增,具体过程如图所示。下列叙述错误的是( )
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A.巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同,但扩增产物比常规PCR特异性更强
B.两套引物需进行两次PCR,由于和两套引物都互补的靶序列较少,因此大大提高了扩增
的特异性
C.内引物扩增的模板是外引物扩增后的产物,第二阶段反应能否进行,也是对第一阶段反
应正确性的鉴定
D.如果第一次扩增产生了错误片断,则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概
率将会增加
答案 D
变式模型
变式1 定点突变技术
模型特征:定点突变是指通过PCR等方法向目的DNA片段中引入所需变化,包括碱基
的添加、删除、点突变等。常用的技术手段有重叠延伸PCR技术、大引物PCR技术等。
3.(2022江苏百校联考,18)(多选)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠
的部分互相搭桥、互为模板,经过多次PCR扩增,获得目的基因的方法。该技术在扩增
较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应
用前景,如图表示利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列叙述正确的是(
)
A.引物中G+C的含量越高,引物与模板DNA结合的稳定性越高
B.在第一阶段由于引物2和引物3发生碱基互补配对,因此两者置于不同反应系统中
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C.引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制后,共产生4
种双链DNA分子
D.在引物1、2组成的反应系统中,经第一阶段要形成图示双链DNA,至少要经过3次复
制
答案 AB
4.(2021湖北十堰外国语学校二模,20)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变
导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR即可获得,第一轮加诱变引物
和侧翼引物,第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物,过程如图所示。下列叙述正确的
是( )
A.第一轮PCR过程中退火所用的温度与第二轮PCR退火的温度是一样的
B.PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状,该定点
诱变产物需具备起始密码、终止密码等结构才能进行转录和翻译
C.第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链
D.将某功能蛋白的第17位Cys(UGU)改造成Ser(UCU),属于蛋白质工程
答案 D
变式2 荧光定量PCR技术
模型特征:荧光定量PCR技术是指在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与
某条模板链互补的荧光探针,当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处时,会水解
探针,使荧光监测系统接收到荧光信号,即每扩增一次,就有一个荧光分子生成。
5.(2022湖北应城一高一模,15)荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量,其
原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针,当
耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处时,会水解探针,使荧光监测系统接收到荧
光信号,即每扩增一次,就有一个荧光分子生成,过程如图所示。下列相关叙述错误的是(
)
A.引物与探针均具特异性,与模板结合时遵循碱基互补配对原则
B.反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关
C.若用cDNA作模板,上述技术也可检测某基因的转录水平
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D.耐高温的DNA聚合酶催化DNA的合成总是从子链的3'端向5'端延伸的
答案 D
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情境应用
简单情境
1.引物的应用(2022北京朝阳一模,13)PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键碱基,5'端
无严格限制,可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是( )
A.该图表示PCR循环中的变性环节
B.dNTP作为扩增的原料会依次连接到5'端
C.Taq酶催化相邻的dNTP间形成磷酸二酯键
D.用图中引物扩增两个循环后可获得目的产物
答案 C
2.细菌的防御机制(2022辽宁鞍山二模,17)(多选)CRISPR-Cas9是近年来生物学科研的热
门技术,该技术源于细菌的一种防御机制。如图所示,当细菌感知到噬菌体侵入时,会通过
gRNA识别噬菌体DNA,并通过Cas9切断目标DNA,从而起到防御作用。下列关于该机
制的叙述错误的是( )
A.噬菌体DNA的变化体现了基因突变的不定向性
B.gRNA与目标DNA结合片段中最多含有5种核苷酸
C.Cas9可破坏DNA分子的磷酸二酯键
D.高倍光学显微镜可观察到该现象
答案 ABD
复杂情境
3.双脱氧终止法核酸测序(2022天津一模,12)20世纪70年代, Fred sanger发明了双脱氧
终止法对DNA进行测序。其原理如图,在4个试管中分别加入4种脱氧核苷三磷酸
(dNTP)和1种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP);ddNTP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点,
并终止DNA片段的延伸。在4个试管中DNA链将会分别在A、G、C及T位置中止,
并形成不同长度的DNA片段。这些片段随后可被电泳分开并显示出来。下列说法中正
确的是( )
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A.这种测序方法需要引物和耐高温的DNA连接酶
B.电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤结尾
C.测得未知DNA的序列为5'- GATTCGAGCTG-A-3'
D.ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的5'末端
答案 B
复杂陌生情境
4.TALEN靶向基因敲除技术(2022河南孟津一中月考一,23)TALEN技术是一种靶向基
因敲除技术(原理如图1)。TALEN技术使用的基因敲除工具是由DNA识别域和核酸内
切酶两个部分组成的蛋白质。科学家发现了一种细菌蛋白质(TALE),它的二连氨基酸
(NI、NG、HD、NN,其中字母N、I、G、H、D分别代表了一种氨基酸)与四种碱基
(A、G、C、T)有恒定的对应关系:NI识别A,NG识别T,HD识别C,NN识别G。FokⅠ
是一种形成二聚体后具有核酸内切酶活性的蛋白单体。因此,可以利用TALE作为DNA
识别域,用FokⅠ二聚体定点切断DNA。
图1
科学家发现水稻植株无论是否具有光周期敏感蛋白基因P,在短日照条件下均表现为雄
性可育。在长日照条件下,具有光周期敏感蛋白的水稻才表现为雄性可育。基因P只在
单倍体花粉细胞中表达,使其能够合成淀粉。科研人员使用TALEN技术对水稻基因P
进行靶向敲除,以得到光敏雄性不育水稻新品种。
(1)在TALEN技术的设计中,选择使用FokⅠ单体而不直接使用FokⅠ二聚体,这样能减
少对DNA的 切割,保证了基因敲除的靶向性。为了让TALEN技术能用
于各种不同生物、不同基因的敲除,没有与TALE蛋白结合的FokⅠ二聚体对DNA的切
割应 (选填“具有”或“不具有”)类似于限制酶的“限制性”。
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(2)若TALE蛋白左臂所识别的基因P的序列为“—TGACC—”,则TALE蛋白左臂对应
的二连氨基酸序列应为 。用这种方法,可以确定TALE蛋白的氨基酸序列,进而
人工合成TALE蛋白基因。然后将TALE蛋白基因与 基因进行融合,得到融合基
因。
(3)科研人员用图2所示的质粒为载体,其中的潮霉素抗性作为标记基因,作用是
。应选用 酶将该质粒与融合基因构建为重组质粒,并将融合基因设法导
入水稻愈伤组织中,再利用 技术获得T 植株。
0
图2
(4)由于基因靶向敲除成功的概率比较低,因此科研人员培育T 植株时应保证 日
0
照条件,待其自花受粉得到T ,再将T 植株 ,并在开花期随机选择一部分植株的
1 1
花粉进行鉴定,鉴定方法是 ,若观察到某植株的花粉全部未被染成
蓝色,则该植株为所需的纯合光敏雄性不育新品种。
(5)与传统的雄性不育水稻品种相比,光敏雄性不育新品种的优势在于它能实现自交繁殖
并保留雄性不育特性,这是因为 。
答案 (1)非靶向(或“随机”) 不具有
(2)—N N N H H— FokⅠ单体 (3)筛选转化成功的受体细胞 BamHⅠ及DNA连接
GN I DD
植物组织培养 (4)短 在长日照下种植 将花粉用碘液染色后,在显微镜下观察 (5)光
敏雄性不育新品种在短日照条件下雄性可育,可实现自交繁殖;自交后代能保持基因P敲
除的纯合性,使其在长日照条件下雄性不育
审题解题
1.(2022山东淄博一模,5)为确定W基因在染色体上的位置,研究人员进行了如下操作:①
破裂细胞后将染色体固定在玻片上,去除mRNA及染色体上的蛋白质,拍摄染色体得到
显微照片1。②制备32P标记的W基因探针(单链DNA)。③将玻片上的染色体DNA变
性为单链后,置于含W基因放射性探针的杂交溶液中温育一段时间。④洗脱玻片上未杂
交的放射性探针,对玻片进行放射性自显影处理得到照片2。⑤将照片1和照片2叠加,
确定W基因的所在染色体及其位置。下列分析错误的是( )
A.可用A—32P~P~P制备W基因的放射性探针
B.W基因探针的碱基序列与W基因中某条单链的部分碱基序列相同或互补
C.去除染色体上的蛋白质并将DNA变性为单链有利于DNA与探针完成杂交
D.去除mRNA可以防止W基因的mRNA与探针杂交,对实验结果产生干扰
补充设问
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审题方法
设问① 染色体上为什么会有RNA和蛋白质?如何去除?去除RNA有何意义?
解题思路
设问② A—32P~P~P去掉两个磷酸基团后剩下的结构可以合成DNA吗?为什么?
答案 A
补充设问答案 设问① 染色体(质)上的DNA可能正结合RNA聚合酶进行RNA的
转录,染色体主要由DNA和蛋白质构成;可用RNA酶和蛋白酶去除RNA和蛋白质;去除
mRNA可以防止W基因的mRNA与探针杂交,去除蛋白质后,有利于DNA与探针碱基
互补配对。
设问② 不可以。A—32P~P~P去掉两个磷酸基团后剩下的结构为AMP,是构成RNA的
基本单位之一。
2.(2022山东烟台一模,25)2020年8月16日,由我国军事医学研究院陈薇院士团队及康希
诺生物联合申报的腺病毒载体新冠疫苗被授予专利权,是我国首个新冠疫苗专利。全面
接种新冠疫苗,建立免疫屏障,可有效防止新冠病毒大规模传染。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒,通过其表面的S蛋白与宿主细胞膜表面ACE2受体结合
而完成感染。研制疫苗时,通过RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)获取S蛋白基因所需
要的酶是 。据图1分析,选择的引物是 ,其作用是
。
图1
图2
(2)PCR的产物一般通过电泳来鉴定,结果如图2所示。1号泳道为标准(Marker),2号泳道
为阳性对照(提纯的S蛋白基因片段),3号泳道为实验组。标准(Marker)的实质为
,3号泳道的杂带出现的原因一般有 (至少
答出两点)。
(3)腺病毒是一种DNA病毒,基因组中的E1区蛋白与腺病毒的复制有关,对宿主细胞的毒
性很强。科研中将去除E1基因构建的复制缺陷型腺病毒作为运载S蛋白基因的载体,经
过改造后的腺病毒应该具备的特点有 (至
少答出两点)。试说明科研中选用复制缺陷型腺病毒作载体制备新冠疫苗的原因是
。
补充设问
审题方法
设问① 如何判断DNA单链的5'端和3'端?引物只能结合在DNA单链的哪一端?
解题思路
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设问② 电泳鉴定DNA时,如果不止一条条带,分析原因时常从哪几个方面分析?
答题技巧
设问③ 腺病毒基因组中的E1基因去除后的病毒称为什么病毒?该腺病毒还能复制吗?
用去除E1基因的腺病毒作为载体制备DNA疫苗在安全性方面有何优势?
答案 (1)逆转录酶、Taq酶 Ⅱ、Ⅲ 使Taq酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
(2)不同已知长度的DNA片段混合物 模板受到污染;引物的特异性不强;复性温度偏低
(3)能够侵染宿主细胞;具有多个限制酶酶切位点;不能复制 避免人体因重组腺病毒增殖
而感染,进而提高疫苗的安全性。
补充设问答案 设问① “— ”端为DNA单链的5'端,“—OH”端为DNA单链的
3'端。引物只能结合在DNA单链的3'端。
设问② 模板不唯一,可能掺入了其他DNA分子;引物设计不合理,它们与非目的序列有
同源性或容易聚合形成二聚体;复性温度过低,复性的温度取决于引物的长度、碱基组成
等;DNA聚合酶的质量不好等。
设问③ 复制缺陷型腺病毒。不能复制。可以避免腺病毒增殖,提高疫苗的安全性
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