专题二十七 基因工程和生物技术的安全性与伦理问题
专题检测题组 A 组
1.图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程,①~④表示相关的操作。
若限制酶EcoR Ⅰ识别G↓AATTC,BamHⅠ识别G↓CATCC。下列选项正确的是( )
A.利用PCR技术扩增基因时,反应缓冲溶液中要添加Ca2+来激活DNA聚合酶
B.构建基因表达载体时可使用E.coliDNA连接酶将DNA片段连接起来
C.农杆菌侵染人参细胞后Ti质粒整合到受体细胞的染色体DNA上
D.检测干扰素基因是否导入人参愈伤组织细胞需要利用抗原—抗体杂交
答案 B 利用PCR技术扩增基因时,反应体系中一般要添加Mg2+来激活耐高温的DNA
聚合酶,A错误;由于EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ对目的基因和Ti质粒进行切割产生的是黏性末
端,黏性末端可以用E.coliDNA连接酶进行连接,B正确;农杆菌侵染人参细胞后,整合到宿
主细胞染色体DNA上的是Ti质粒上的T-DNA片段,而不是整个Ti质粒,C错误;检测目
的基因是否导入受体细胞常用分子杂交技术,D错误。
2.荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量,其原理是在PCR体系中每加入
一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针,当耐高温的DNA聚合酶催化
子链延伸至探针处时,会水解探针,使荧光监测系统接收到荧光信号,即每扩增一次,就有
一个荧光分子生成,过程如图所示。下列相关叙述错误的是 ( )
A.引物与探针均具特异性,与模板结合时遵循碱基互补配对原则
B.反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关
C.若用cDNA作模板,上述技术也可检测某基因的转录水平
D.耐高温的DNA聚合酶催化DNA的合成总是从子链的3'端向5'端延伸的
答案 D PCR中,引物是利用目的基因的一部分已知序列设计出来的,探针也是通过待
测序列的一部分设计出来的,均具有特异性,且二者都是通过碱基互补配对原则与模板结
合的,A正确;由题可知,荧光的产生是荧光探针被水解所致,因此起始时的模板DNA含量
越高,与其结合的荧光探针就越多,扩增时水解的探针越多,荧光就越强,B正确;若用cDNA作模板进行转录,水解特异性荧光探针时会发出荧光,根据荧光的强度可确定转录水平,C
正确;耐高温的DNA聚合酶催化DNA的合成,总是从子链的5'端向3'端延伸的,D错误。
3.基因编辑CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白和人工设计的gRNA构成。在gRNA引导下,
Cas9与靶序列结合并将DNA双链切断。通过在Cas9基因中引入突变,获得了只有切割
一条链活性的nCas9,可以实现C→T(G→A)或A→G(T→C)的碱基替换。下列相关说法
不正确的是( )
A.gRNA与靶序列特异性结合遵循碱基互补配对原则
B.利用CRISPR/Cas9系统可以使靶基因发生定点突变
C.可设计gRNA与靶基因的启动子区域互补,从而抑制靶基因复制
D.将CRISPR/Cas9技术应用于人类疾病治疗时,需注意安全性及伦理问题
答案 C 由图示分析可知,gRNA与靶序列特异性结合遵循碱基互补配对原则,A正确。
由题意可知,利用CRISPR/Cas9系统可以使靶基因实现碱基替换,从而发生定点突变,B正
确。启动子位于基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的位点,可驱动基因的转录,故
可设计gRNA与靶基因的启动子区域互补,从而抑制靶基因的转录过程,C错误。
4.如图1表示限制酶SpeⅠ、XbaⅠ的识别序列和切割位点,图2表示基因P(960 bp)、基
因Q(840 bp)的限制酶SpeⅠ或XbaⅠ的酶切图谱和融合基因,图3表示几种基因经限制
酶SpeⅠ或XbaⅠ处理后进行电泳(电泳条带表示特定长度的DNA片段)得到的带谱图,
下列相关分析错误的是 ( )
图1
图2图3
A.基因P经限制酶SpeⅠ处理后进行电泳的结果与图3中的Ⅰ相同
B.基因Q经限制酶XbaⅠ处理后进行电泳的结果与图3中的Ⅱ相同
C.融合基因经限制酶SpeⅠ处理后进行电泳的结果与图3中的Ⅲ相同
D.融合基因经限制酶XbaⅠ处理后进行电泳的结果与图3中的Ⅳ相同
答案 C 根据题意可知,基因P的长度为960 bp,且只有一个限制酶SpeⅠ切割位点,因
此切割后会形成2种片段,且2种片段长度之和为960 bp,结果和图3中的Ⅰ相同,A正确;
基因Q的长度为840 bp,且只有一个限制酶XbaⅠ切割位点,因此切割后会形成2种片段,
且2种片段长度之和为840 bp,结果和图3中的Ⅱ相同,B正确;黏性末端连接后的序列为
—ACTAGA—,融合基因不能被限制酶SpeⅠ或XbaⅠ识别,因此融合基因经限制酶
SpeⅠ或XbaⅠ处理后进行电泳后只存在一条带,因此结果和图3中的Ⅳ相同,C错误,D
正确。
5.科学家拟培育转人溶菌酶基因山羊以大规模生产人溶菌酶(从乳汁中提取),部分过程如
图所示。质粒S中的标记基因Leu控制合成亮氨酸,标记基因GFP控制合成绿色荧光蛋
白;四种限制酶的识别序列及切割位点见表。
限制酶 BamHⅠ BglⅡ HindⅢ XbaⅠ
识别序
G↓GATC
列和切 A↓GATCTA↓AGCTT T↓CTAGA
C
割位点
依据题目信息,下列能成功筛选出含重组质粒T的成纤维细胞的说法是 ( )
A.培养基中不加亮氨酸,培养一段时间后观察,细胞不显示出绿色荧光
B.培养基中加入亮氨酸,培养一段时间后观察,细胞不显示出绿色荧光
C.培养基中加入亮氨酸,培养一段时间后观察,细胞显示出绿色荧光
D.培养基中不加亮氨酸,培养一段时间后观察,细胞显示出绿色荧光
答案 A 根据图示可知,要使切割质粒S后形成和目的基因切割后相同的黏性末端,应
当用限制酶BamHⅠ、Hind Ⅲ切割质粒S,切割后经连接酶连接形成的重组质粒T含有
标记基因Leu,GFP基因被切割失去遗传效应,而标记基因Leu控制合成亮氨酸。故培养
基中不加亮氨酸,培养一段时间后观察,细胞不显示出绿色荧光的成纤维细胞是含有重组
质粒T的细胞,A正确。6.环境中常检出残留的四环素类抗生素,科学家采用基因工程技术构建出一种能高效降
解四环素的基因工程菌,如图所示。将四环素降解酶基因tetX经过PCR扩增后,与经过酶
切的质粒pET28a融合,构建重组质粒并导入大肠杆菌BL21,筛选后得到工程菌
ETD-1,ETD-1可通过发酵工程大量生产四环素降解酶并应用于生产实践。SapⅠ、
HindⅢ、BamHⅠ、NdeⅠ是几种不同的限制酶。回答下列问题:
(1)利用PCR技术扩增tetX基因需要设计引物,引物的作用是 ;若扩增n次,
需要的引物数量至少是 。
(2)图中pET28a的启动子和终止子的作用分别是
。
(3)为了将tetX基因准确地整合到质粒的插入位点,在对tetX基因进行扩增时,需在A、B
两端引入限制酶 的识别序列,原因是
。
(4)将重组质粒导入大肠杆菌之前,需要用一定浓度的Ca2+处理大肠杆菌BL21,使细胞处
于 。筛选工程菌ETD-1的培养基中需加入的抗生素是 。
答案 (1)使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 2n+1-2
(2)RNA聚合酶的识别和结合位点,驱动tetX基因的转录;使转录在需要的地方停下来
(3)BamHⅠ、NdeⅠ 在tetX基因的两端引入这两种酶的酶切位点,不会破坏tetX基因本
身的碱基序列,同时引入这两种酶的酶切位点可以使tetX基因定向插入启动子和终止子
之间 (4)感受态 卡那霉素
解析 (1)PCR过程中引物的作用是使耐高温的DNA聚合酶能从引物的3'端开始连接脱
氧核苷酸。DNA的复制是半保留复制,扩增过程中引物的数量和子链的数量是相同的,
因此若扩增n次,需要引物的数量是2n+1-2个。(2)质粒上的启动子是RNA聚合酶的识别
和结合位点,作用是启动转录过程,终止子的作用是终止转录过程。(3)为了将tetX基因准
确地整合到质粒的插入位点,在对tetX基因进行扩增时,需在A、B两端引入限制酶
BamH Ⅰ、Nde Ⅰ的识别序列,其原因是Sap Ⅰ和Hind Ⅲ限制酶会破坏目的基因,且
BamH Ⅰ和Nde Ⅰ位于启动子和终止子之间。(4)一定浓度的Ca2+处理大肠杆菌BL21
的目的是使细胞处于感受态,使重组质粒更容易进入。重组质粒上的卡那霉素抗性基因
可作为标记基因,因此可以在筛选工程菌ETD-1的培养基中加入卡那霉素以便筛选。
专题检测题组 B 组
1.下列有关洋葱在高中生物学实验中的使用,最佳的一项是 ( )
选项 实验名称 选材部位
叶绿体中色素的提
A 洋葱鳞片叶的外表皮
取与分离DNA的粗提取和
B 洋葱鳞片叶
鉴定
探究植物细胞的吸
C 洋葱鳞片叶的内表皮
水和失水
观察植物细胞的有
D 洋葱鳞片叶
丝分裂
答案 B 叶绿体中色素的提取与分离实验常选取叶绿体含量高的实验材料,不适合选
用洋葱鳞片叶的外表皮,A不符合题意;洋葱鳞片叶细胞含有DNA,可用于DNA的粗提取
和鉴定,B符合题意;洋葱鳞片叶的内表皮没有颜色,细胞失水和吸水不容易观察到,不适宜
作“探究植物细胞的吸水和失水”的实验材料,C不符合题意;洋葱鳞片叶细胞为成熟的
细胞,不再分裂,无法观察植物细胞的有丝分裂,D不符合题意。
2.(不定项)原产地为美国的白蛾、南美洲普拉塔河流域的福寿螺、北美的草地贪夜蛾、
加拿大的一枝黄花等30余种外来物种给我国工、农业生产带来了极大的灾难。下列有
关外来物种的叙述正确的是 ( )
A.外来物种入侵或引种不当可使侵入地食物链遭到严重破坏
B.外来物种大量繁殖主要是侵入地缺少天敌,其种群数量在一段时间内呈“J”形增长
C.科学家赋予了转基因生物的某些特殊功能,增强了其生存能力,转基因植物有可能像
“入侵的外来物种”
D.可利用外来物种的捕食者、竞争者或寄生物控制其危害
答案 ABCD 若外来物种入侵或引种到没有天敌且环境条件良好、空间充足的环境,
其种群数量在入侵初期会呈“J”形增长,外来物种数量增多后会影响侵入地物种的生存,
导致侵入地的食物链遭到严重破坏,A、B正确;转基因生物导入外源基因,生存能力增强,
可能会威胁其他本地生物的生存,带来像“入侵的外来物种”相似的危害,C正确;可利用
外来物种的捕食者、竞争者或寄生物等限制外来物种的生存和繁殖,进而控制其危害,D
正确。
3.(不定项)新冠肺炎轻型病例在连续两次病毒核酸检测(采样时间至少间隔24小时)N基
因和ORF基因的Ct值均≥35时,即可解除隔离管理。将某目的基因与过量的荧光素混
合后放入PCR反应体系中,随PCR产物的积累,荧光信号逐渐增强,将荧光信号达到设定
阈值时所经历的循环次数称为Ct值。下列说法错误的是 ( )
A.利用荧光定量PCR方法测N基因和ORF基因的Ct值时,需要用到逆转录酶、解旋酶、
耐高温的DNA聚合酶
B.采样标本中的N基因和ORF基因数量与Ct值呈负相关
C.PCR过程中每次循环都要经历各不相同的一次升温和一次降温
D.PCR过程中添加的镁离子可以提高Taq DNA聚合酶的活性
答案 AC PCR是体外扩增DNA的技术,N基因和ORF基因是新冠病毒的基因,本质是
RNA片段,故利用荧光定量PCR方法测N基因和ORF基因的Ct值时,应先通过逆转录
得到N基因和ORF基因对应的cDNA序列,此过程需要用到逆转录酶,再以cDNA为模
板进行扩增,此过程需要耐高温的DNA聚合酶,不需要解旋酶(高温可使双链DNA解旋),
A错误;荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数称为Ct值,样本中N基因和ORF基
因数量越多,荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数就越小,Ct值就越低,B正确;PCR
每次循环可分为变性、复性、延伸三步,包括两次升温和一次降温,C错误;镁离子可以激
活Taq DNA聚合酶,D正确。4.NK603是通过基因工程将抗草甘膦基因转入玉米体内获得的一种转基因玉米。这种
玉米对草甘膦除草剂“Roundup”具有抗药性,因此种植这种转基因玉米的农民可以放心
使用Roundup,既不会对作物造成影响,又能节省费用。根据所学知识回答下列问题:
(1)重组DNA技术的基本操作需要用到的工具酶有 。
(2)基因工程的操作程序主要包括四个步骤,其核心步骤是 。
(3)对玉米进行转基因时,可将目的基因插入Ti质粒的 上,通过农杆菌的转化作
用,使目的基因整合到受体细胞染色体的DNA上。
(4)选用玉米体细胞作为受体细胞而不选用玉米的受精卵作为受体细胞的原因是
,将玉米体细胞培育成植株需要经历 和 过程。
(5)在个体水平上鉴定转基因玉米NK603是否培育成功的措施是
。
答案 (1)限制酶(限制性内切核酸酶)和DNA连接酶 (2)基因表达载体的构建 (3)T-
DNA (4)体细胞比受精卵易获取(常见) 脱分化 再分化 (5)给转基因玉米喷施草甘
膦除草剂,观察转基因玉米NK603抗除草剂效果
解析 (1)重组DNA技术基本操作需要用到的工具酶有限制酶(限制性内切核酸酶)和
DNA连接酶。(2)基因工程的基本操作程序中核心步骤是基因表达载体的构建。(3)用限
制性内切核酸酶和DNA连接酶将获取的抗草甘膦基因插入Ti质粒的T-DNA上,然后将
重组Ti质粒转入农杆菌,农杆菌侵染受体细胞时,T-DNA可转移到受体细胞并整合到受
体细胞的染色体DNA上。(4)玉米(植物)体细胞具有全能性,有发育成完整个体的潜能,且
比受精卵更容易获取。将玉米体细胞培育成植株需要经历脱分化和再分化过程。(5)转
基因玉米NK603是否培育成功,从个体水平上可通过抗除草剂实验来检测,即给转基因
玉米NK603喷施草甘膦除草剂,观察其抗除草剂效果。
5.7岁的哈桑患有一种罕见皮肤疾病,他的皮肤非常脆弱,轻微摩擦就会导致皮肤破损,继
而感染各种病原微生物。医生检测发现哈桑的LAMB3基因有2个碱基对错误,导致无法
表达正常的层黏连蛋白。研究团队对哈桑进行了基因治疗,取下哈桑的一小块皮肤,在体
外大量培养。然后利用逆转录病毒载体将正常的LAMB3基因插入细胞的基因组内,筛选
出成功导入目的基因的细胞后,继续培养这些细胞,形成若干块单层“人造皮肤”,对哈桑
进行皮肤移植,最后哈桑终于过上正常人的生活。(1)哈桑经常感染各种病原微生物的原因是
。
(2)图中①表示 过程。过程②将gag、pol、env等分离后需构建重组表达载体,
并将其导入小鼠胚胎细胞。过程②④中用到的工具酶有 ,过程⑤
常用的导入方法是 。
(3)天然的逆转录病毒RNA上有3组序列,A序列含有调节基因和启动子,调控病毒RNA
的转移及表达;B序列编码逆转录酶、外壳蛋白等病毒蛋白质;C序列是包装信号序列,能
被病毒蛋白识别,引发病毒的组装。操作②中保留的LTR属于 序列。过程⑤中导
入病毒的gag、pol、env序列的目的是 。这种逆转录病毒载体作为
一种基因表达载体,其优点是 。
答案 (1)皮肤是人体的第一道防线,可阻挡病原体入侵机体,若被破坏则各种病原微生物
容易入侵人体 (2)逆转录 限制酶、DNA连接酶 显微注射法 (3)A 合成组装病毒
的蛋白质 能将目的基因整合到受体细胞染色体中,使得目的基因能够稳定存在,并能表
达和遗传给子代细胞
解析 (1)皮肤是人体的第一道防线,可阻挡病原体入侵机体,若被破坏则各种病原微生物
容易入侵人体,哈桑皮肤容易破损,所以会经常感染各种病原微生物。(2)逆转录病毒的遗
传物质是RNA,在构建逆转录病毒载体时,需先获得含逆转录病毒遗传信息的cDNA,由
图知,经过程①单链RNA变为了双链结构,故过程①为逆转录;过程②和过程④涉及DNA
的切割和DNA片段的连接,需要用到限制酶、DNA连接酶;将目的基因导入动物细胞的
常用方法是显微注射法。(3)构建好的逆转录载体可以让目的基因插入宿主细胞的染色
体中,并且正常表达,据题干可知A序列含有调节基因和启动子,调控病毒RNA的转移及
表达,故需要将目的基因插入A序列之间,题图中目的基因位于两个LTR之间,故LTR属
于A序列。经过程⑤小鼠胚胎细胞中含gag、pol、env序列,LTR及目的基因LAMB3等
拼接成的序列。由图知,LTR及目的基因LAMB3等拼接成的序列可转录形成重组病毒
核酸,图中还含有病毒蛋白质,推测gag、pol、env属于B序列,可以合成组装病毒的多种蛋白质。逆转录病毒载体与农杆菌Ti质粒的T-DNA作用类似,都能将目的基因整合到
受体细胞染色体中,使得目的基因能够稳定存在,并能表达和遗传给子代细胞。
6.2022年1月7日,美国马里兰州的医生首次将基因编辑猪的心脏移植到人类患者身上。
如果异种移植可以实现,将可明显缓解器官紧缺的问题。请回答下列问题:
(1)进行器官移植手术后,免疫系统会把来自其他人的器官当作 成分进行攻击,这
就是器官移植容易失败的原因。在免疫排斥中起主要作用的是 免疫。
(2)为了更好地减少免疫排斥反应,研究者在猪的培育过程中,进行了基因编辑。敲除了三
个和人类可能会产生排斥的基因,同时添加了6个帮助人类免疫系统接受猪心脏的基因。
常用的基因编辑系统是CRISPR/Cas9基因编辑系统。该系统主要包含向导
RNA(sgRNA)和Cas9蛋白两部分:sgRNA能特异性识别特定的DNA序列,能引导Cas9蛋
白到相应位置切割DNA,最终实现对靶基因序列定点编辑。
①科学家运用基因工程删除了猪细胞中和人产生排斥的基因,添加了6个帮助人类免疫
系统接受猪心脏的基因。从变异的角度看,这种变异属于 (填“可遗传
变异”或“不可遗传变异”)。
②CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”,sgRNA的识别序
列越短,基因编辑的脱靶率越高。请分析原因: 。
答案 (1)“非己”/抗原 细胞 (2)①可遗传变异 ②sgRNA的识别序列短,特异性差,
容易与其他片段结合造成编辑出错
解析 (1)进行器官移植手术后,免疫系统会把来自其他人的器官当作抗原进行攻击,在免
疫排斥中起主要作用的是细胞免疫。(2)①该变异删除了某些基因,又添加了6个基因,属
于可遗传变异。②CRISPR/Cas9基因编辑技术中,sgRNA能通过碱基互补配对特异性识
别特定的DNA序列,sgRNA的识别序列越短,特异性越差,更容易与其他片段结合造成编
辑出错。
7.三氯生是一种抑菌物质,具有优异的贮存稳定性,可以替代抗生素用于基因工程中筛选
含目的基因的受体细胞。已知fabV(从霍乱弧菌中发现的烯脂酰ACP还原酶)基因可以
使大肠杆菌抵抗三氯生。
(1)通过PCR方法扩增fabV基因时,先要根据 设计两种特异性引
物序列,以确保Taq DNA聚合酶从引物的3'端延伸DNA链,至少需要经过 次扩增
才能获得8个双链等长的目的基因。
(2)基因工程的核心步骤是 ;某科研团队将可以受温度调控的基因插
入上述选出的重组质粒中,构建了温度调控表达质粒(如图2)。其中C基因在低温下会抑制P ,R基因在高温下会抑制P 如果将lacZ基因和GFP(绿色荧蛋白)基因插入图2质粒,
2 1,
使得最后表现为低温下只表达GFP蛋白,而高温下只表达lacZ蛋白。则lacZ基因插在
之间,GFP基因的插入位置及注意点是
。
(3)若以大肠杆菌为受体细胞,筛选上述插入了GFP基因的受体细胞的依据是大肠杆菌能
在含 的培养基上生长,且 。
答案 (1)目的基因(fabV基因)两端碱基序列 4 (2)基因表达载体的构建 P →T 插
2 2
在P →T 之间,且不破坏C基因和R基因 (3)三氯生 低温下有绿色荧光,高温下无绿色
1 1
荧光
解析 (1)PCR体外扩增时,先要有一对与已知目的基因的核苷酸序列互补的短链引物,因
此需要根据目的基因(fabV基因)两端的碱基序列设计两种特异性引物。至少经过3次扩
增才出现2个双链等长的目的基因,经过4次扩增才能获得8个双链等长的目的基因,经
过n次扩增,可获得2n-2n个双链等长的目的基因。(2)基因工程的核心步骤是基因表达载
体的构建,由题干可知C基因在低温下会抑制P ,R基因在高温下会抑制P ,说明启动子P
2 1 2
在高温下可以启动转录;启动子P 在低温下可以启动转录。要使高温下只表达lacZ蛋白,
1
低温下只表达GFP蛋白,则lacZ基因要插在P →T 之间;GFP基因要插在P →T 之间,且
2 2 1 1
不能破坏C基因和R基因。(3)因为fabV基因可以使大肠杆菌抵抗三氯生,故若大肠杆菌
能在含三氯生的培养基上生长,则说明大肠杆菌插入了重组质粒,因题述大肠杆菌中的
GFP基因只在低温下表达,故可根据低温下有绿色荧光,高温下无绿色荧光筛选插入了
GFP基因的受体细胞。
8.新冠病毒(RNA病毒)引起的疫情仍在一些国家和地区肆虐,新冠检测技术、新冠预防
和治疗试剂的研制在疫情防控中发挥了关键作用。
Ⅰ.科研工作者研制的新冠病毒核酸检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)为新冠肺炎疫情防
控提供了快速、简便、精准的核酸检测方案。RT-PCR荧光探针法即实时荧光定量
PCR技术,通过荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,通过检测待测样本荧
光信号的累积来确定样本中是否有病毒核酸。新冠病毒检测的具体操作过程如图一所
示。回答下列问题:
(1)若要得到正确的检测结果,正确的操作步骤是 (用数字序号表示)。
①从病人组织样本中提取RNA;②利用PCR扩增DNA片段;③分析PCR扩增结果;④采
集病人组织样本;⑤逆转录获得cDNA
(2)PCR中的每次循环可分为变性、复性和 三步,其中复性的目的是
;PCR过程中子链的合成方向是 。(3)采集新冠肺炎疑似患者的咽部细胞样本提取核酸进行上述RT-PCR过程,每一个扩增
出来的DNA序列,都可与预先加入的一段荧光标记探针结合,产生荧光信号,扩增出来的
目的基因越多,观察到的荧光强度就越 。
Ⅱ.研究发现,新冠病毒外壳中的S蛋白具有很强的抗原性,可利用其制备单克隆抗体,制
备流程如图二所示,相关限制酶及其识别序列如表所示。
限制酶 识别序列和切割位点
EcoRⅠ G↓AATTC
BamHⅠ G↓GATCC
BglⅡ A↓CATGT
SatⅠ G↓TCCAC
(4)检测④过程是否成功的方法是 ,⑥过程常用的方法是
。
(5)利用PCR技术扩增无限增殖调控基因时,科研人员设计了如图三所示的一对引物(部
分序列),其中下划线部分序列的设计依据是 ,方框部分
序列的设计目的是 。
GAATTCGACCTCAAATCAGGTAGG 和TTGCATTGACTTACACCTAGG
图三
答案 (1)④①⑤②③ (2)延伸 让两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合(或
引物与单链相应互补序列结合) 5'→3' (3)大 (4)抗原―抗体杂交技术 显微注射法
(5)无限增殖调控基因两端的序列 使扩增出的DNA序列两端含有限制酶EcoR Ⅰ和
BamH Ⅰ的识别序列,便于酶切
解析 (1)利用PCR技术检测样本中是否有新冠病毒核酸的步骤:采集病人组织样本→从
病人组织样本中提取RNA→逆转录获得cDNA→利用PCR扩增DNA片段→分析PCR
扩增结果,即④①⑤②③。(2)PCR中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步,其中复性
的目的是让两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。由于脱氧核苷酸只能接
在引物的3'端,因此PCR过程中子链的延伸方向是5'→3'。(3)由于每一个扩增出来的
DNA序列,都可与预先加入的一段荧光标记探针结合,产生荧光信号,因此扩增出来的目
的基因越多,观察到的荧光强度就越大。(4)④表示基因表达得到新冠病毒S蛋白,蛋白质
产物的检测常用抗原—抗体杂交技术,若出现杂交带,则证明成功;⑥过程是把含有无限
增殖调控基因的表达载体导入细胞X(动物细胞)中,常用显微注射法。(5)引物是根据已
知的核苷酸序列设计的,且一对引物是分别从两条DNA单链的两端开始结合的,因此下
划线部分序列的设计依据是无限增殖调控基因两端的序列;据表可知,限制酶EcoRⅠ的
识别序列是G↓AATTC,限制酶BamHⅠ的识别序列是G↓GATCC,与方框中序列相同,故
方框部分序列的设计目的是使扩增出的DNA序列两端含有限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ
的识别序列,便于酶切。专题检测题组 C 组
1.热启动PCR可提高扩增效率,其基本方法是进行反应之前将热稳定的DNA聚
合酶、dNTP和引物等先不要加入样品管内,而是将样品加热,待温度升到70 ℃以
上时,再将上述试剂加入,开始PCR扩增。下列叙述正确的有(多选) ( )
A.热稳定的DNA聚合酶最适催化温度范围为50~60 ℃
B.与常规PCR相比,热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C.两条子链合成一定都是从5'端向3'端延伸
D.PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了热稳定的DNA聚合酶的特异性
答案 BC 热稳定的DNA聚合酶的最适催化温度为70 ℃左右,A错误;分析题
意可知,热启动PCR进行反应之前将热稳定的DNA聚合酶、dNTP和引物等先
不要加入样品管内,可减少反应起始时引物错配形成的产物,B正确;DNA分子两
条链反向平行,PCR扩增时引物加到模板链的3'端,复制时子链只能从5'端向3'端
的方向延伸,C正确;PCR产物DNA碱基序列的特异性是碱基互补配对的结果,不
能体现热稳定的DNA聚合酶的特异性,D错误。
2.B基因存在于水稻基因组中,其仅在体细胞(2n)和精子(n)中正常表达,但在卵细
胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响,设计了如图实验(Luc基因表达
的荧光素酶能催化荧光素产生荧光,融合基因表达的蛋白质能保留两种蛋白质各
自的功能)。相关叙述正确的是(多选)( )A.由于DNA聚合酶不能合成使B基因在水稻卵细胞中不能转录
B.T-DNA以单链形式整合到受体细胞的染色体DNA上
C.过程②转化筛选水稻愈伤组织时,需在培养基中加入潮霉素
D.可通过检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光鉴定B基因是否表达
答案 CD DNA聚合酶与DNA复制有关,而转录需要的酶是RNA聚合酶,A错
误;T-DNA以双链形式整合到受体细胞的染色体DNA上,B错误;由于重组质粒上
含有潮霉素抗性基因且该基因位于T-DNA上,因此可以在培养基中加入潮霉素
来筛选转化成功的水稻细胞,C正确;Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生
荧光,融合基因表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能,B-Luc融合基因表达,
会使加入荧光素的卵细胞发出荧光,D正确。
3.CRISPR/Cas13d技术是一项以向导RNA(gRNA)引导Cas13d蛋白定向作用于靶
向RNA的新兴技术。研究人员设计了若干个gRNA,分别靶向新冠病毒RNA基
因组的不同肽编码区,但不影响人体细胞的RNA,作用机理如图所示。下列相关
叙述错误的是 ( )
A.gRNA通过与靶向RNA碱基互补配对将Cas13d蛋白引导至特定位点
B.Cas13d蛋白能定向切开相邻两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键
C.与限制性内切核酸酶相比,Cas13d蛋白不具有特异性识别能力
D.该技术有望成为一种能定向、灵活治疗RNA病毒感染的新方法答案 B CRISPR/Cas13d技术是一项以向导RNA(gRNA)引导Cas13d蛋白定向
作用于靶向RNA的新兴技术,因此gRNA通过与靶向RNA碱基互补配对将
Cas13d蛋白引导至特定位点,Cas13d蛋白能定向切开相邻两个核糖核苷酸之间
的磷酸二酯键,且与限制性内切核酸酶相比,Cas13d蛋白不具有特异性识别能力,
A、C正确,B错误;向导RNA可定向作用于靶向RNA,因此该技术有望成为一种
能定向、灵活治疗RNA病毒感染的新方法,D正确。
4.近日,我国研究团队利用一种新方法将人的多能干细胞在体外诱导转化为全能
性的8细胞期胚胎样细胞,类似于受精卵发育3天时的状态。下列说法正确的是
( )
A.该胚胎样细胞处于囊胚期阶段,理论上可以进行胚胎分割并移植
B.该成果将助力实现人体器官的体外再生,解决器官短缺、移植排斥反应等问题
C.该研究涉及生殖性克隆,需通过伦理审查,严格遵循我国法规和伦理准则
D.该过程中发生了细胞分化,体现了动物细胞核具有全能性
答案 B 8细胞期胚胎样细胞类似于受精卵发育3天时的状态,此时处于卵裂期
阶段,A错误;生殖性克隆的目的是获得新个体,本题涉及的是治疗性克隆,C错误;
该过程是由多能干细胞诱变为全能干细胞,没有体现动物细胞核具有全能性,D错
误。
5.重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为
模板,经过多次PCR扩增,获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的
DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前
景,如图表示利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列叙述正确的是
(多选) ( )A.引物中G+C的含量越高,引物与模板DNA结合的稳定性越高
B.在第一阶段由于引物2和引物3发生碱基互补配对,因此两者置于不同反应系
统中
C.引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制后,
共产生4种双链DNA分子
D.在引物1、2组成的反应系统中,经第一阶段要形成图示双链DNA,至少要经过
3次复制
答案 AB C与G之间有三个氢键,A与T之间有两个氢键,因此引物中G+C的
含量越高,引物与模板DNA结合的稳定性越高,A正确;由题图可知,引物2和引物
3分别作用于同一段DNA的两条链,二者会发生碱基互补配对,因此需将它们置
于不同反应系统中,B正确;引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系
统中均进行一次复制后,共产生2种双链DNA分子,C错误;在引物1、2组成的反
应系统中,经第一阶段要形成题图所示双链DNA,至少要经过2次复制,D错误。6.在乙肝病毒(HBV)的结构蛋白中,与疫苗有关的主要是HBsAg蛋白,HBsAg基因
已在不同的生物体系中成功表达。如图1表示研究人员用农杆菌转化法培育出
转基因番茄的过程,用于生产可口服的乙肝病毒疫苗,根据所学知识回答下列问题:
图1
(1)可利用PCR技术扩增HBsAg基因片段,PCR需要用到 酶,还需要
根据HBsAg基因两端已知的序列合成引物,扩增过程中应选择图2中的引物
(填字母)与HBsAg基因片段结合。
图2
(2)基因工程最核心的步骤是 ,由图1可知,过程①用到的限制酶是
,目的基因HBsAg要插入农杆菌Ti质粒的 中, 在培养农杆菌的培养基中
添加 可筛选得到含重组质粒的农杆菌。
(3)将含有HBsAg基因的农杆菌导入番茄细胞时,受损的番茄组织更有利于农杆菌
的侵染,其原因是当番茄植株受到损伤时,伤口处的细胞会分泌大量的,吸引农杆菌移向这些细胞,HBsAg基因在番茄植株中遗传信息传递的一般规律为
(用流程图表示)。
(4)转基因番茄的细胞具有全能性,在一定的营养、激素以及无菌、适宜的pH和
温度等条件下,可以形成愈伤组织,该过程称为 ,然后通过 形成
试管苗。用该植株结出的番茄果实饲喂小鼠,若在小鼠的血清中检测到
,则说明转基因疫苗口服有效。
答案 (1)热稳定的DNA聚合 B、C (2)构建基因表达载体(或基因表达载体的
构建) Hind Ⅲ和Xho Ⅰ T-DNA 卡那霉素 (3)酚类物质
(4)脱分化 再分化 乙肝病毒抗
体
解析 (1)利用PCR技术扩增目的基因片段时,需要热稳定的DNA聚合酶。DNA
聚合酶催化DNA链延伸的方向是5'→3',即从引物的3'端开始催化延伸DNA链,
因此要扩增目的基因,应选用图2中的B和C作为引物。(2)基因工程最核心的步
骤是构建基因表达载体(基因表达载体的构建),由图1可知,含有目的基因的外源
DNA分子中含有限制酶HindⅢ、SmaⅠ和XhoⅠ的切割位点,但其中限制酶
SmaⅠ的切割位点位于目的基因内部,因此过程①所用的限制酶是HindⅢ和
XhoⅠ。目的基因HBsAg要插入农杆菌Ti质粒的T-DNA中,用上述两种限制酶
切割后会破坏抗四环素基因,但不会破坏抗卡那霉素基因,因此在培养农杆菌的培
养基中添加卡那霉素可筛选得到含有重组质粒的农杆菌。(3)将含有HBsAg基因
的农杆菌导入番茄细胞时,受损的番茄组织更有利于农杆菌的侵染,其原因是受损
的番茄会分泌大量的酚类物质,吸引农杆菌移向这些细胞。HBsAg基因在番茄植株中遗传信息传递的一般规律见答案。(4)转基因番茄的细胞具有全能性,在一定
的营养、激素以及无菌、适宜的pH和温度等条件下,可以形成愈伤组织,该过程
称为脱分化,然后通过再分化形成试管苗。用该植株结出的番茄果实饲喂小鼠,若
在小鼠的血清中检测到乙肝病毒的抗体,则说明转基因疫苗口服有效。
7.一种天然蛋白t-PA能高效降解因血浆纤维蛋白凝聚而成的血栓,是心梗和脑血
栓的急救药,但是心梗患者注射大剂量的t-PA会诱发颅内出血。研究证实,将t-
PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,能显著降低其诱发出血的副作用。据此,
先对天然t-PA基因的碱基序列进行改造,然后再采取传统的基因工程方法表达该
改造后的基因,可制造出性能优异的改良t-PA蛋白。如图1表示相关的目的基因、
载体及限制酶识别序列和切割位点,pCLY11为质粒,请回答下列问题:
(1)可以先提取细胞的 来合成总cDNA,再从cDNA文库中获取t-PA基因。
通过改造t-PA基因制造出性能优异的改良t-PA蛋白的技术被称为 工程。
(2)若改造后的t-PA基因的黏性末端如图1所示,则需要选用限制酶
切割质粒pCLY11,保证质粒与t-PA改良基因高效连接。再用DNA连接酶催化
形成 键,构建重组质粒。(3)以大肠杆菌作为受体细胞,在含新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞并非都
是目的菌株,原因是 。成功获取能生产改良t-PA蛋
白的工程菌株后,利用 (填“固体”或“液体”)培养基在发酵罐中进行
大量生产。
(4)除了用工程菌株,还可以用下列方法从转基因牛乳汁中获得改良t-PA蛋白:
过程②常用的方法是 ;在过程④前需要取囊胚的 细胞做
DNA分析进行性别鉴定;为了保证t-PA改良基因能在乳腺细胞中表达,构建基因
表达载体需要将其与 等调控元件重组在一起。
答案 (1)(总)RNA(或mRNA) 蛋白质 (2)Xho Ⅰ和Bgl Ⅱ 磷酸二酯 (3)导
入未连目的基因的质粒(或pCLY11或空质粒或普通质粒)的大肠杆菌也可以在这
种培养基上生长 液体 (4)显微注射法 滋养层 乳腺中特异表达的基因的启
动子(或乳腺蛋白基因的启动子)
解析 (1)构建cDNA文库主要包括从组织细胞中提取mRNA,逆转录成cDNA,与
适当载体连接后转化宿主,这种包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称
为该组织细胞的cDNA文库。对天然的t-PA基因进行改造,以制造出性能优异的
改良t-PA蛋白的技术称为蛋白质工程。(2)根据碱基互补配对原则,t-PA基因的
左端黏性末端为CCGG—,为Xho Ⅰ酶切得到,t-PA基因的右端黏性末端为
CTAG—,为Bgl Ⅱ酶切得到,质粒需要用相同的酶进行酶切以得到与目的基因相
同的黏性末端,因此质粒pCLY11需选用限制酶Xho Ⅰ和Bgl Ⅱ切割。通过DNA连接酶连接两种不同DNA分子片段之间的磷酸二酯键,构建重组质粒。(3)
导入未连目的基因的质粒的大肠杆菌也可以在含新霉素的培养基中生长,因此形
成菌落的受体细胞并非都是目的菌株(含有目的基因的大肠杆菌)。培养基按物理
状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基,液体培养基常用于扩大培
养,因此利用液体培养基在发酵罐中进行大量生产。(4)将目的基因导入哺乳动物
细胞常用显微注射法。囊胚期细胞开始出现分化 ,内细胞团将来发育成胎儿的
各种组织,滋养层细胞将发育成胎膜和胎盘,做DNA分析进行性别鉴定时常取囊
胚期的滋养层细胞。为了保证t-PA改良基因能在乳腺细胞中表达,构建基因表达
载体需要将其与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。
8.家畜胚胎的性别鉴定技术对畜牧业的发展具有重要意义。巢式PCR扩增在两
次PCR中使用两组不同引物,先使用外引物对目标区域DNA片段进行第一次
PCR扩增,产生中间产物,然后使用内引物对中间产物进行第二次PCR扩增,产生
目标产物。如图是巢式PCR工作原理示意图,请回答:
(1)巢式PCR体系中需要加入模板、 、 、引物、Mg2+、
缓冲液等。
(2)相比于常规PCR获得的产物而言,巢式PCR获得的产物特异性 ,原因
是如果利用外引物扩增产生了错误片段,再利用内引物扩增在错误片段上进行引
物配对并扩增的概率 。(3)巢式PCR通常在一个试管中进行第一阶段反应,然后将中间产物等转移到第二
个试管中进行第二阶段反应,不在同一试管完成的主要原因是 。
(4)科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增Y染色体上雄性决定基因(SRY)和
常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1),进行早期胚胎的性别鉴定,并将鉴定后的胚胎
进行移植。如表是主要实验步骤,请完成表格:
实验目的 方法步骤要点
胚胎样品DNA提
选取囊胚的① 细胞提取DNA
取
PCR引物的设计和
根据牛的SRY和CSN1S1基因序列设计合成② 对引物
合成
PCR过程 预变性→③ →退火(复性)→延伸
观察扩增结果 电泳分析
受体牛④
对受体牛注射前列腺素
处理
胚胎移植 将筛选出的胚胎移植到受体牛的子宫内
(5)电泳结果如图所示,1~5号为取自不同胚胎的DNA样品进行巢式PCR的产物。
A和B条带中代表CSN1S1的是 条带。可以确定1~5号中 号胚
胎为雌性。
(6)牛胚胎性别的鉴定除了可以利用PCR外,下列方法也可行的有 。
①差速离心法
②核酸探针杂交法
③染色体核型分析法
④H-Y抗血清免疫学法(H-Y抗原编码基因位于Y染色体上)答案 (1)热稳定的DNA聚合酶 dNTP (2)更强 降低 (3)防止引物配对特
异性不强造成的非特异性扩增的污染 (4)①滋养层 ②4 ③变性 ④同期发
情 (5)A 1、2、4 (6)②③④
解析 (1)PCR扩增包括三个基本步骤:模板DNA的变性、模板DNA与引物的退
火(复性)、引物的延伸。PCR体系的成分有引物、热稳定的DNA聚合酶、
dNTP(原料)、模板DNA、Mg2+缓冲液等。(2)巢式PCR通过两轮PCR扩增,使用
两组引物扩增DNA片段,第二对引物称为巢式引物,结合在第一次PCR产物内部,
使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于如果第一次扩
增产生了错误片段,则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率很低,因
此相比于常规PCR获得的产物而言,巢式PCR获得的产物特异性更强。(3)巢式
PCR两次扩增所用的引物是不同的,因此两个阶段反应不在同一试管完成的主要
原因是防止引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。(4)对胚胎进行性
别鉴定时,宜取囊胚期的滋养层细胞。本实验用巢式PCR技术,用的是两轮PCR,
因此扩增一种目的基因片段需要设计2对引物,而扩增两种目的基因片段则需要
设计4对引物。PCR过程一般是预变性→变性→退火(复性)→延伸。在胚胎移植
前需要对受体牛进行同期发情处理,便于移植。(5)题中利用多重巢式PCR技术同
时扩增Y染色体上雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1)并进
行电泳,雌性个体没有SRY,只有一条带,雄性有两条带,因此1、2、4号是雌性,3、
5号是雄性,雌性和雄性共有的是常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1),因此A条带
是CSN1S1,B条带是SRY。(6)①差速离心法可用于分离各种细胞器,不能鉴定性
别;②利用核酸探针杂交法,可以将Y染色体上的雄性决定基因(SRY)制成探针鉴
定性别;③X、Y染色体形态不同,因此可以用染色体核型分析法进行性别鉴定;④H-Y抗血清免疫学法(H-Y抗原编码基因位于Y染色体上),也可以进行性别鉴
定。
