文档内容
重难点 19 基因工程
知识点一：与DNA有关的酶的比较
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段
将两个DNA片段连接为一
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段
个DNA分子
DNA聚合酶或热稳定 将单个脱氧核苷酸依次连
磷酸二酯键 脱氧核苷酸
DNA聚合酶(Taq酶) 接到DNA单链末端
将DNA片段水解为单个脱
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 DNA
氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋
解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA
为单链，形成两条长链
将单个核糖核苷酸依次连
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸
接到RNA单链末端
.图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破
坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中
PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因
和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
知识点二：几种获取目的基因方法的比较
项目 从基因文库中获取 人工合成
方法 从基因组文库中获取 从cDNA文库中获取 化学合成法 反转录法
供体细胞中的DNA 目的基因的 蛋白质的氨 目的基因的
↓限制酶 mRNA 基酸序列 mRN A
许多DNA片段 ↓反转录 ↓推测 ↓反转录
过
↓插入 单链DNA mRNA的核 单链DNA
程
载体 ↓合成 苷酸序列 ↓合成
↓导入 双链DNA ↓推测 双链DNA
受体菌群(基因组文库) ↓插入 基因的核苷 (即目的载体
↓
↓导入
外源DNA扩增，产生特 酸序列
受体菌群
定性状 ↓化学合成 基因)
(cDNA文库)
↓分离 目的基因
↓分离
目的基因
目的基因
适用于片段较
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导 小，核苷酸序
以RNA为模
说 入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有 列已知的目的
板，需要逆转
明 这种生物的不同的基因，称为基因文库，包括 基因；利用
录酶
基因组文库和cDNA文库 DNA合成仪合
成
PCR技术相关分析
(1)PCR技术的过程
关于引物的2点提醒：①引物是一小段单链的DNA或RNA，作为新子链的合成起点，只能结
合在母链的3′端；②只有通过引物，DNA才可以开始进行复制。
(2)PCR技术和DNA复制的比较
知识点三：．基因表达载体构建过程若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：目的基因与目的基因的连
接、目的基因与质粒的连接、质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。
知识点四：其它知识点
1、动物反应器
(1)外源基因：药用蛋白基因。
(2)表达条件：药用蛋白基因＋乳腺蛋白基因的启动子等。
(3)受体生物——牛、山羊等动物。
(4)种类：乳腺生物反应器和膀胱反应器。
2、工程菌
(1)概念：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。
(2)外源基因：控制合成抗体、疫苗、激素等的基因。
(3)受体细胞：微生物细胞。
(4)特点：细菌内没有内质网、高尔基体等，产生的药物可能没有活性。
(5)药物提取：从微生物细胞中提取。
3、体外基因治疗与体内基因治疗的比较
方法
体外基因治疗 体内基因治疗
比较
不 从患者体内获取某种细胞→体外完成基 直接向患者体内组织细胞中转
途径
同 因转移→筛选、细胞扩增→输入体内 移基因
点 特点 操作复杂，但效果可靠 方法较简单，但效果难以控制
都是将外源基因导入靶细胞，以纠正缺陷基因，目前两种方法都处于临
相同点
床试验阶段
4、蛋白质工程与基因工程的比较
项目 蛋白质工程 基因工程
原理 中心法则的逆推、中心法则 基因重组
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所
区 定向改造或生产人类所需的
实质 需的生物类型或生物产品(基因的异体表
别 蛋白质
达)
结果 可生产自然界没有的蛋白质 生产自然界已有的蛋白质
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程，对现有
联系 蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现；
②基因工程所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造基因工程这一章节的考察主要以大题为准，对于基因工程的基本操作程序以及基因工程
中运载体的选择是常考的重难点之一，同时对于运载体的切割以及重组质粒的筛选也是常
见的考点，要求学生对于这一章节必须要融会贯通，加强自己的理解。
（建议用时：30分钟）
一、单选题
1．下列关于质粒的说法正确的是（ ）
A．质粒上需要有复制原点、启动子和终止子
B．细菌的基因只存在于质粒上
C．质粒是存在于拟核外的大型环状DNA分子
D．质粒是基因工程中的重要工具酶之一
【答案】A
【解析】
【分析】
基因工程常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。其中质粒是一种裸露的、
结构简单、独立于细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
【详解】
A、质粒是能够自主复制的环状DNA分子，其上有复制原点、启动子和终止子，A正确；
B、细菌的基因主要位于拟核上，B错误；
C、质粒是存在于拟核外的小型环状DNA分子，C错误；
D、质粒是基因工程常用的运载体，不属于酶，D错误。
故选A。
2． “X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X
基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如下图1所示。
经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，下列叙述错误的是（ ）A．第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个
B．第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个
C．第三轮复制得到8个DNA分子，其中有2个等长的，也就是有2个X基因
D．第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因
【答案】D
【解析】
【分析】
1、PCR技术扩增的原理是DNA双链复制，其扩增时由两种引物决定所扩增的片段的特定
序列，上一轮复制的产物为下一轮复制的模板。
2、DNA复制为半保留复制。
【详解】
A、据图分析可知，第一轮复制形成2个DNA分子，即①②各一个，A正确；
B、第二轮复制得到22=4个DNA分子：①复制得①和③、②复制得②和④，即得到
①②③④各一个，B正确；
C、第三轮复制得到23=8个DNA分子：①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和
④、④复制得④和⑤。所以共有①②各1个，③④各2个，⑤2个（等长），也就是有2
个X基因（⑤），C正确；
D、第四轮复制得到24=16个DNA分子：①复制得①和③、2个③复制得2个③和2个⑤、
2个④复制得2个④和2个⑤，2个⑤得到4个⑤。所以第四轮复制得到16个DNA分子中
有8个⑤（X基因），D错误。
故选D。
3．下列不属于基因工程成果的是（ ）
A．乳腺生物反应器生产药用蛋白 B．培育抗除草剂的作物新品种
C．利用微生物生产重组人干扰素 D．用高产青霉菌生产青霉素
【答案】D
【解析】
【分析】1、植物基因工程的应用：（1）抗虫转基因植物；（2）抗病转基因植物；（3）抗逆转基
因植物；（4）转基因改良植物品质。总之基因工程在农业上用于生产高产、稳产和具有优
良品质的品种，能产生抗逆性品种。
2、动物基因工程的成果：（1）提高动物的生长速度：外源生长激素基因；（2）改善畜产
品的品质；（3）转基因动物生产药物；（4）转基因动物作器官移植的供体；（5）基因工
程药物，如人胰岛素、细胞因子、抗体、疫苗、生长激素、干扰素等。
3、基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。
【详解】
A、乳腺生物反应器生产药用蛋白属于动物基因工程技术的应用，A不符合题意；
B、培育抗除草剂的作物新品种属于植物基因工程技术的应用，B不符合题意；
C、利用微生物生产重组人干扰素属于基因工程技术的应用，C不符合题意；
D、用高产青霉菌生产青霉素属于诱变育种，不属于基因工程成果，D符合题意。
故选D。
4．下列有关基因工程及其应用的相关叙述，正确的是（ ）
A．可利用转基因细菌降解有毒有害的化合物
B．DNA连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成氢键
C．基因工程常用的运载体质粒中含有两个游离的磷酸基团
D．转基因技术培育的抗虫棉自交产生的子代一定都抗虫
【答案】A
【解析】
【分析】
基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③
将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。构建基因表达载体时，需要用同种
限制酶切割含有目的基因的DNA和运载体DNA，再用DNA连接酶连接形成重组DNA分
子。
【详解】
A、在环境保护方面，可利用转基因细菌降解有毒有害的化合物，处理工业废水等，A正
确；
B、DNA连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成磷酸二酯键，B错误；
C、质粒是环状DNA分子，其中不含游离的磷酸基团，C错误；
D、若转基因技术将抗虫基因导入到一条染色体上，则该植株细胞中含有一个携带抗虫基
因的DNA片段，因此可以把它看作是杂合子（记作Aa），则理论上，该转基因植株自交
产生的F 代中，仍具有抗虫特性的植株（A_）占总数的3/4，D错误。
1
故选A。
5．利用菜花进行“DNA的粗提取与鉴定”实验中，下列有关叙述正确的是（ ）
A．在切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤后弃去滤液
B．利用高温能使蛋白质变性，却对DNA没有影响的特性，也可将DNA与蛋白质分离C．粗提取DNA时观察到丝状物偏少，可能是向2mol·L-1NaCl溶液中加入蒸馏水过多
D．将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后震荡，观察颜色变化
【答案】C
【解析】
【分析】
DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度
NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA
对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会
被染成蓝色。
【详解】
A、在切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤后保留滤液，因为此时
DNA溶解在滤液中，A错误；
B、高温能使蛋白质变性（永久性变性），对DNA也有影响（高温使DNA双螺旋结构打
开），B错误；
C、粗提取DNA时观察到丝状物偏少，可能是向2mol•L-1NaCl溶液中加入蒸馏水过多，导
致部分DNA析出后再溶解，因此过滤后得到的DNA含量偏少，C正确；
D、将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后需要沸水浴加热才能观察到颜色
变化，D错误。
故选C。
6．脱氧核苷三磷酸(dNTP)和双脱氧核苷三磷酸(ddNTP，ddN-P ~P ~P)的结构均与核苷三
α β γ
磷酸(NTP)类似，其中dNTP核糖的第2位碳原子上的羟基(—OH)被氢原子取代而ddNTP
核糖第2位和第3位碳原子上的羟基均被氢原子取代。DNA复制时，ddNTP可以与dNTP
竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA片段的延伸。现有一些序列为5’—
GCCTAAGATCGTA—3’的DNA分子单链片段，拟通过PCR获得被32P标记且以碱基“A”
为末端(3’为碱基A)、不同长度的子链DNA。在反应管中加入单链模板、引物、底物、
TaqDNA聚合酶、Mg2+及缓冲溶液。下列叙述正确的是（ ）
A．实验结束后最多可得到3种被32P标记的子链DNA
B．反应底物是dCTP、dGTP、dTTP和γ位32P标记的ddATP
C．ddNTP与dNTP竞争的延长位点是脱氧核苷酸链的5’末端
D．TaqDNA聚合酶在PCR中的作用是形成氢键和磷酸二酯键
【答案】A
【解析】
【分析】
ATP是腺苷三磷酸的英文名称缩写，其结构可以简写成A—P~P~P，其中A代表腺苷，P代
表磷酸基团，~代表一种特殊的化学键。由于两个相邻的磷酸基团都带负电荷而相互排斥等
原因，使得这种化学键不稳定，末端磷酸基团有一种离开ATP而与其他分子结合的趋势，
也就是具有较高的转移势能。分析题意可知，dNTP和ddNTP具有与ATP（NTP）相似的结构，ATP中的糖是核糖，
dNTP中的糖是脱氧核糖，而ddNTP中的糖是双脱氧核糖。进行DNA复制时，dNTP作为
原料参与DNA的复制，同时能提供能量，而ddNTP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点，
导致DNA片段延伸终止，即阻断DNA的复制。题干中要对模板DNA分子单链片段通过
PCR进行扩增，且要获得3’为碱基A的不同长度的DNA分子，说明需要ddATP作为竞争
底物参与PCR过程。
【详解】
A、分析题意可知，5’—GCCTAAGATCGTA—3’的DNA分子单链片段共有四个碱基
“A”，内部有三个碱基“A”，因此利用PCR反应体系，最多可得到3种被32P标记的子链
DNA，A正确；
B、结合分析可知，反应底物是α位32P标记的dCTP、dGTP、dTTP和ddATP，B错误；
C、DNA复制时，由5’端向3’端延伸，因此ddNTP与dNTP竞争的延长位点是脱氧核苷酸
链的3’末端，C错误；
D、TaqDNA聚合酶能够催化脱氧核苷酸在DNA的3’端延伸，故在PCR中的作用是形成磷
酸二酯键，D错误。
故选A。
7． 下列利用菜花进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A．根据DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，可去除部分杂质
B．在切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤后弃去滤液
C．用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14mol/L，DNA的溶解度最大
D．将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡，观察颜色变化
【答案】A
【解析】
【分析】
DNA的粗提取与鉴定的实验原理：
①DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度变化而改变的，当氯化钠的物质的
量浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低，利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中
的DNA析出；
②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液．利用这一原理，可
以进一步提取出含杂质较少的DNA；
③洗涤剂能瓦解细胞膜但是对DNA没有影响；
④蛋白质不能耐受较高温度，在80℃条件下会变性，而DNA对温度的耐受性较高；
⑤DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
【详解】
A、由于DNA在不同氯化钠溶液中的溶解度不同，因此可以采用不同浓度的NaCl溶液反
复溶解与析出DNA的方法可去除部分杂质，A正确；
B、在切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，DNA溶解在滤液中，过滤后不能丢弃滤液，B错误；
C、用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14mol/L的浓度下，DNA析出，溶解度最小，C错误；
D、将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，需要水浴加热观察染色变化，D
错误。
故选A。
8． 关于PCR反应体系中所加物质作用的描述，不正确的是（ ）
A．耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成
B．引物使Taq酶能从引物的3′端延伸DNA链
C．目标DNA母链用作合成DNA复制的模板
D．解旋酶用于打开DNA双链
【答案】D
【解析】
【分析】
PCR全称为聚合酶链式反应，PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，
原理是DNA复制，前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物，
条件还包括模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶），具
体过程有①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温
延伸：合成子链．PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
【详解】
A、通过PCR技术扩增目的基因时，需要用耐高温的DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸聚
合形成DNA长链，A正确；
B、在复制时，引物与DNA母链通过碱基配对结合后，DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸
DNA链，因此DNA合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，B正确；
C、PCR技术的原理是DNA复制，DNA复制时两条链均作为复制的模板，C正确；
D、PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开，D错误。
故选D。
9． PCR技术（荧光PCR法），又称qPCR法，是指在反应体系中加入荧光物质，通过专
门仪器实现实时荧光检测，以荧光强度来测定PCR循环后产物中的核酸水平，是病毒核酸
检测的主流方法。IgM和IgG均属于免疫球蛋白家族，是机体在抗原物质刺激下由浆细胞
产生的抗体，IgM/IgG联合检测（胶体金法）是新冠抗体检测试剂盒主要采用的技术。下
列说法不正确的是（ ）
A．利用PCR技术进行新冠病毒核酸检测的前提是新冠病毒的一段核酸序列已知
B．利用PCR技术扩增新冠病毒的核酸用到的酶有逆转录酶、Taq酶等
C．IgM/IgG检测试剂盒的原理是抗原—抗体特异性结合
D．利用IgM/IgG试剂盒检测为阳性，一定为新冠肺炎患者
【答案】D
【解析】【分析】
1、PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生
物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、dNTPs；而体外PCR反应
同样需要类似的成分，有模板、引物、PCRBuffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计
的特定序列，实现对特定位置的扩增。
2、免疫学的临床应用有两个方面：一是应用免疫理论来阐明许多疾病的发病机制和发展规
律；二是应用免疫学原理和技术来诊断和防治疾病。免疫学原理主要是抗原抗体特异性结
合的原理。
【详解】
AB、PCR是扩增DNA的一种方法，如果是RNA病毒，首先要转化成DNA，也就是反
（逆）转录；利用PCR技术进行新冠病毒核酸检测时，引物是病毒的一小段DNA片段，
如果样本存在目标病原体，就会因为引物的特异性，扩增出相应的目标基因片段，由此判
断是否为阳性，A，B正确；
C、IgM和IgG均属于免疫球蛋白家族，是机体在抗原物质刺激下由浆细胞产生的抗体，该
抗体可以与新冠病毒的表面抗原结合，其检测原理是抗原―抗体特异性结合，C正确；
D、利用IgM/TgG试剂盒检测为阳性，可能感染新冠病毒，但不一定患病，D错误。
故选D。
10． 荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量。其原理是在PCR体系中每加
入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针
处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生
成。相关叙述错误的是（ ）
A．引物与探针均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则
B．反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关
C．若用cDNA作模板，上述技术也可检测某基因的转录水平
D．Taq酶催化DNA的合成方向总是从子链的3'端向5'端延伸
【答案】D
【解析】
【分析】
PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。荧光定
量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量的原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，
使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成，实现了荧光信
号的累积与PCR产物的形成完全同步。
【详解】
A、引物与探针均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则，A正确；
B、题干中提出“每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针”，并且
“每扩增一次，就有一个荧光分子生成”，因此反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA
含量呈正相关，B正确；
C、由于cDNA是以某基因转录形成的mRNA为模板逆转录形成的，所以若用cDNA作模
板，上述技术也可检测某基因的转录水平，C正确；
D、由图可知，Taq酶催化DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸，D错误。
故选D。
二、非选择题
11． 全球新冠疫情盛行，研究发现，新冠病毒是一种新型RNA冠状病毒。科研人员利用
基因工程技术，以病毒表面S蛋白作为主要的病毒抗原，研制疫苗用于接种预防，设计过
程如图所示。回答下列问题：
(1)新冠病毒是RNA病毒，在提取新冠病毒的RNA后，可在_____________酶的作用下，
合成一段DNA分子。以新冠病毒的RNA为模板合成的DNA分子中含有编码新冠病毒表
面刺突蛋白（简称为“S蛋白”）的S基因，可用特定的_________酶将该基因从DNA分
子上切割下来。
(2)基因表达载体的构建是基因工程的核心，一个基因表达载体的组成包括
____________________（答出三个）。复制原点和标记基因等，其中标记基因的作用是
____________________。
(3)进行步骤③时，常用____________处理大肠杆菌，一般不能直接用未处理的大肠杆菌作
为受体细胞，原因是_____________________。
(4)为了验证表达的S蛋白与病毒S蛋白有相同的免疫反应特性，请从分子水平设计一个简
单的检测方案并預期检测结果。
方案：______________________。
结果：______________________。
【答案】(1) 逆转录 限制性内切
(2) 目的基因（S蛋白基因）、启动子、终止子 鉴别受体细胞中是否含有目的基因
(3) 氯化钙 未 处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力弱。
(4) 方案：用表达的S蛋白与新冠病毒肺炎康复患者血清进行抗原一抗体杂交
实验结果：出现杂交带
【解析】
【分析】
1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导
入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞
最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交
技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成
蛋白质--抗原-抗体杂交技术。
个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、据图可知，①表示逆转录过程，需要的酶是逆转录酶，原料是四种脱氧核苷酸；②是构
建基因表达载体，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；③是将目
的基因导入受体细胞；④是目的基因的检测与鉴定。
(1)
新冠病毒是RNA病毒，在提取新冠病毒的RNA后，可在逆转录酶的作用下，合成一段
DNA分子。将S蛋白的S基因从DNA分子上切割下来需要用限制性内切酶。
(2)
基因表达载体的构建是基因工程的核心，该过程需要用到的酶有限制酶和DNA连接酶。
一个基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等，其中
标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因。
(3)
步骤③是将目的基因导入受体细胞，常用氯化钙处理大肠杆菌，一般不能直接用未处理的
大肠杆菌作为受体细胞，原因是未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力弱。
(4)
为了检验表达的S蛋白是否与病毒S蛋白有相同的免疫反应特性，可用表达的S蛋白与新
冠病毒肺炎康复患者血清进行抗原—抗体杂交实验来进行检测，结果会出现杂交带。
12、某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合
实验流程回答下列问题：(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞______，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序
列，否则将导致______。
③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各
成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确
的有______
A．Taq酶最适催化温度范围为50～60℃
B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，
然后降温以促进______，形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中
的DNA聚合酶及______酶等，完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在______。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，
然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是______。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含lag标签，说明______，后续实验可借
助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
【答案】(1) RNA 蛋白M上不含tag标签 BC
(2) 黏性末端碱基配对 DNA连接 基因m的连接处、基因m的内部
(3) 受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因可
以长成菌落 融合基因表达（或融合基因正确解码）
【解析】【分析】
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导
入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞
最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否
插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；
③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、
抗病鉴定、活性鉴定等。
(1)
①以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的mRNA。
②从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若m基因的转录产物mRNA上
有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag序列的转录产物继
续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。
③A、从题干信息可知，“80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增”，故Taq
酶最适催化温度范围为94℃左右，A错误；
B、PCR 反应的最初加热过程中，样品温度上升到70℃之前，在较低的温度下引物可能与
部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA 聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物错
配形成的产物的扩增，影响反应的特异性；热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提
高反应的特异性，B正确；
C、DNA分子复制具有方向性，都是从5′端向3′端延伸，C正确；
D、Taq酶没有特异性，与普通的DNA聚合酶相比，Taq酶更耐高温，D错误。
故选BC。
(2)
①从图上看，载体A只有一个Sma I的酶切位点，故被Sma I切开后，载体由环状变为链
状DNA，将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性
末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对。将A-m结合
体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。
②重组质粒中，载体A被Sma I切开的位置已经与基因m相连，原来的酶切位点已不存在，
若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在基因m的连
接处或基因m内部。
(3)
①筛选目的菌株的机理是：导入了质粒A-m的目的菌株由于含有URA3基因，能在无尿嘧
啶的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则不能存活。②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含lag标签，位于lag标签上游的基因m应
该正常表达，说明融合基因表达（或融合基因正确解码）。
