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重难点 19 基因工程
知识点一：与DNA有关的酶的比较
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段
将两个DNA片段连接为一
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段
个DNA分子
DNA聚合酶或热稳定 将单个脱氧核苷酸依次连
磷酸二酯键 脱氧核苷酸
DNA聚合酶(Taq酶) 接到DNA单链末端
将DNA片段水解为单个脱
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 DNA
氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋
解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA
为单链，形成两条长链
将单个核糖核苷酸依次连
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸
接到RNA单链末端
.图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破
坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中
PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因
和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
知识点二：几种获取目的基因方法的比较
项目 从基因文库中获取 人工合成
方法 从基因组文库中获取 从cDNA文库中获取 化学合成法 反转录法
供体细胞中的DNA 目的基因的 蛋白质的氨 目的基因的
↓限制酶 mRNA 基酸序列 mRN A
许多DNA片段 ↓反转录 ↓推测 ↓反转录
过
↓插入 单链DNA mRNA的核 单链DNA
程
载体 ↓合成 苷酸序列 ↓合成
↓导入 双链DNA ↓推测 双链DNA
受体菌群(基因组文库) ↓插入 基因的核苷 (即目的载体
↓
↓导入
外源DNA扩增，产生特 酸序列
受体菌群
定性状 ↓化学合成 基因)
(cDNA文库)
↓分离 目的基因
↓分离
目的基因
目的基因
适用于片段较
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导 小，核苷酸序
以RNA为模
说 入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有 列已知的目的
板，需要逆转
明 这种生物的不同的基因，称为基因文库，包括 基因；利用
录酶
基因组文库和cDNA文库 DNA合成仪合
成
PCR技术相关分析
(1)PCR技术的过程
关于引物的2点提醒：①引物是一小段单链的DNA或RNA，作为新子链的合成起点，只能结
合在母链的3′端；②只有通过引物，DNA才可以开始进行复制。
(2)PCR技术和DNA复制的比较
知识点三：．基因表达载体构建过程若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：目的基因与目的基因的连
接、目的基因与质粒的连接、质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。
知识点四：其它知识点
1、动物反应器
(1)外源基因：药用蛋白基因。
(2)表达条件：药用蛋白基因＋乳腺蛋白基因的启动子等。
(3)受体生物——牛、山羊等动物。
(4)种类：乳腺生物反应器和膀胱反应器。
2、工程菌
(1)概念：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。
(2)外源基因：控制合成抗体、疫苗、激素等的基因。
(3)受体细胞：微生物细胞。
(4)特点：细菌内没有内质网、高尔基体等，产生的药物可能没有活性。
(5)药物提取：从微生物细胞中提取。
3、体外基因治疗与体内基因治疗的比较
方法
体外基因治疗 体内基因治疗
比较
不 从患者体内获取某种细胞→体外完成基 直接向患者体内组织细胞中转
途径
同 因转移→筛选、细胞扩增→输入体内 移基因
点 特点 操作复杂，但效果可靠 方法较简单，但效果难以控制
都是将外源基因导入靶细胞，以纠正缺陷基因，目前两种方法都处于临
相同点
床试验阶段
4、蛋白质工程与基因工程的比较
项目 蛋白质工程 基因工程
原理 中心法则的逆推、中心法则 基因重组
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所
区 定向改造或生产人类所需的
实质 需的生物类型或生物产品(基因的异体表
别 蛋白质
达)
结果 可生产自然界没有的蛋白质 生产自然界已有的蛋白质
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程，对现有
联系 蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现；
②基因工程所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造基因工程这一章节的考察主要以大题为准，对于基因工程的基本操作程序以及基因工程
中运载体的选择是常考的重难点之一，同时对于运载体的切割以及重组质粒的筛选也是常
见的考点，要求学生对于这一章节必须要融会贯通，加强自己的理解。
（建议用时：30分钟）
一、单选题
1．下列关于质粒的说法正确的是（ ）
A．质粒上需要有复制原点、启动子和终止子
B．细菌的基因只存在于质粒上
C．质粒是存在于拟核外的大型环状DNA分子
D．质粒是基因工程中的重要工具酶之一
2． “X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X
基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如下图1所示。
经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，下列叙述错误的是（ ）
A．第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个
B．第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个
C．第三轮复制得到8个DNA分子，其中有2个等长的，也就是有2个X基因
D．第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因
3．下列不属于基因工程成果的是（ ）
A．乳腺生物反应器生产药用蛋白 B．培育抗除草剂的作物新品种
C．利用微生物生产重组人干扰素 D．用高产青霉菌生产青霉素
4．下列有关基因工程及其应用的相关叙述，正确的是（ ）
A．可利用转基因细菌降解有毒有害的化合物B．DNA连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成氢键
C．基因工程常用的运载体质粒中含有两个游离的磷酸基团
D．转基因技术培育的抗虫棉自交产生的子代一定都抗虫
5．利用菜花进行“DNA的粗提取与鉴定”实验中，下列有关叙述正确的是（ ）
A．在切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤后弃去滤液
B．利用高温能使蛋白质变性，却对DNA没有影响的特性，也可将DNA与蛋白质分离
C．粗提取DNA时观察到丝状物偏少，可能是向2mol·L-1NaCl溶液中加入蒸馏水过多
D．将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后震荡，观察颜色变化
6．脱氧核苷三磷酸(dNTP)和双脱氧核苷三磷酸(ddNTP，ddN-P ~P ~P)的结构均与核苷三
α β γ
磷酸(NTP)类似，其中dNTP核糖的第2位碳原子上的羟基(—OH)被氢原子取代而ddNTP
核糖第2位和第3位碳原子上的羟基均被氢原子取代。DNA复制时，ddNTP可以与dNTP
竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA片段的延伸。现有一些序列为5’—
GCCTAAGATCGTA—3’的DNA分子单链片段，拟通过PCR获得被32P标记且以碱基“A”
为末端(3’为碱基A)、不同长度的子链DNA。在反应管中加入单链模板、引物、底物、
TaqDNA聚合酶、Mg2+及缓冲溶液。下列叙述正确的是（ ）
A．实验结束后最多可得到3种被32P标记的子链DNA
B．反应底物是dCTP、dGTP、dTTP和γ位32P标记的ddATP
C．ddNTP与dNTP竞争的延长位点是脱氧核苷酸链的5’末端
D．TaqDNA聚合酶在PCR中的作用是形成氢键和磷酸二酯键
7． 下列利用菜花进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A．根据DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，可去除部分杂质
B．在切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤后弃去滤液
C．用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14mol/L，DNA的溶解度最大
D．将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡，观察颜色变化
8． 关于PCR反应体系中所加物质作用的描述，不正确的是（ ）
A．耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成
B．引物使Taq酶能从引物的3′端延伸DNA链
C．目标DNA母链用作合成DNA复制的模板
D．解旋酶用于打开DNA双链
9． PCR技术（荧光PCR法），又称qPCR法，是指在反应体系中加入荧光物质，通过专
门仪器实现实时荧光检测，以荧光强度来测定PCR循环后产物中的核酸水平，是病毒核酸
检测的主流方法。IgM和IgG均属于免疫球蛋白家族，是机体在抗原物质刺激下由浆细胞
产生的抗体，IgM/IgG联合检测（胶体金法）是新冠抗体检测试剂盒主要采用的技术。下
列说法不正确的是（ ）
A．利用PCR技术进行新冠病毒核酸检测的前提是新冠病毒的一段核酸序列已知
B．利用PCR技术扩增新冠病毒的核酸用到的酶有逆转录酶、Taq酶等C．IgM/IgG检测试剂盒的原理是抗原—抗体特异性结合
D．利用IgM/IgG试剂盒检测为阳性，一定为新冠肺炎患者
10． 荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量。其原理是在PCR体系中每加
入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针
处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生
成。相关叙述错误的是（ ）
A．引物与探针均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则
B．反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关
C．若用cDNA作模板，上述技术也可检测某基因的转录水平
D．Taq酶催化DNA的合成方向总是从子链的3'端向5'端延伸
二、非选择题
11． 全球新冠疫情盛行，研究发现，新冠病毒是一种新型RNA冠状病毒。科研人员利用
基因工程技术，以病毒表面S蛋白作为主要的病毒抗原，研制疫苗用于接种预防，设计过
程如图所示。回答下列问题：
(1)新冠病毒是RNA病毒，在提取新冠病毒的RNA后，可在_____________酶的作用下，
合成一段DNA分子。以新冠病毒的RNA为模板合成的DNA分子中含有编码新冠病毒表
面刺突蛋白（简称为“S蛋白”）的S基因，可用特定的_________酶将该基因从DNA分
子上切割下来。
(2)基因表达载体的构建是基因工程的核心，一个基因表达载体的组成包括
____________________（答出三个）。复制原点和标记基因等，其中标记基因的作用是
____________________。
(3)进行步骤③时，常用____________处理大肠杆菌，一般不能直接用未处理的大肠杆菌作
为受体细胞，原因是_____________________。
(4)为了验证表达的S蛋白与病毒S蛋白有相同的免疫反应特性，请从分子水平设计一个简单的检测方案并預期检测结果。
方案：______________________。
结果：______________________。
12、某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合
实验流程回答下列问题：
(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞______，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序
列，否则将导致______。
③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各
成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确
的有______
A．Taq酶最适催化温度范围为50～60℃
B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，
然后降温以促进______，形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中
的DNA聚合酶及______酶等，完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在______。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，
然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是______。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含lag标签，说明______，后续实验可借
助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
