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专题06 生物技术与工程相关实验
实验一 制作传统发酵食品
核心知识回顾
一、制作果酒和果醋
1．制作原理：许多新鲜水果(如葡萄)的果皮表面附着有大量的不同种类的野生酵母菌。在它们的作用下，
水果可以发酵成果酒。在有氧条件下，果酒经醋酸菌的作用还可以进一步发酵成果醋。
2．方法步骤
器具消毒—将发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，晾干备用。止
污染发酵液
冲洗葡萄—取新鲜葡萄，用清水冲洗1~2 次，再去除枝梗和腐烂的籽粒，沥干
防止冲洗掉葡萄皮上野生的酵母菌；防止污染发酵液
榨汁——用榨汁机榨取葡萄汁，并装入发酵瓶中，留有大约1/3 的空间，盖好瓶盖
防止发酵液溢出，并且酵母菌可以进行有氧呼吸大量繁殖
酒精发酵—发酵温度控制在18~30℃,时间控制在10~12d,每隔12 h 左右将瓶盖拧松一次
创造无氧环境进行酒精发酵，并可以防止好氧型微生物污染发酵液
醋酸发酵—葡萄酒制作完成后，打开瓶盖，盖上一层纱布，发酵温度为30~35 ℃,时间为7~8 d
创造有氧环境进行醋酸发酵
3.发酵反应式
果酒制作
果醋制作
4．结果分析与评价
(1)在制作果酒和果醋的过程中，发酵液分别有哪些变化？
项目
酒精发酵
醋酸发酵
气味和味道
酒味
酸味
气泡和泡沫
有
无
发酵液颜色
颜色加深变成深红色(以紫葡萄作原料)
浑浊，液面形成白色菌膜
(2)如何防止其他微生物对果酒发酵的影响：在制作果酒的过程中，除了酵母菌，果酒中还有乳酸菌、醋
酸菌等微生物。乳酸菌可能分解果酒中的糖等，从而使果酒变质。可以通过改变发酵的温度、果酒的
pH
等
实验概览
目录索引
实验一：制作传统发酵食品
实验二：酵母菌的纯培养
实验三：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
实验四：菊花的组织培养
实验五：DNA 的粗提取与鉴定
实验六：DNA 片段的扩增及电泳鉴定
核心知识回顾
核心知识辨析
深化拓展提能
题组专项训练（高考真题感知+针对训
练）
1
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控制乳酸菌的含量。醋酸菌可以将糖或乙醇转化为乙酸，由于醋酸菌在有氧的条件下才能进行旺盛的代谢
活动，因此在制作果酒的过程中尽量减少氧气含量，可以抑制醋酸菌的生长繁殖。此外，通过改变发酵的
温度、果酒的
pH
等同样可以控制醋酸菌的含量。
5．请分析果酒、果醋制作中发酵装置图中各结构的作用。
装置图
结构
作用
充气口
①乙酸发酵时连接充气泵，输入无菌空
气；
②制果酒时关闭充气口
排气口
用来排出CO2
长而弯曲的胶管
防止空气中微生物的污染
出料口
便于取料，及时监测发酵进行的情况
二、制作泡菜
1．制作原理
利用植物体表面天然的乳酸菌进行发酵。发酵期间，乳酸不断积累。当乳酸的质量分数为0.4%～0.8%时，
泡菜品质、口味最佳。
2．方法步骤
配制盐水
↓
原料加工
↓
装坛
↓
封坛发酵
↓
成品
【核心归纳】
(1)配制盐水时以下物质或操作的作用或目的：
①盐的作用：调味、抑制微生物生长，所以盐含量过低会造成细菌污染。
②煮沸的目的：杀菌
( 杀灭水中的微生物及除去水中氧气
) 。
③冷却的目的：为了不影响乳酸菌等微生物的生命活动。
（2）泡菜发酵过程中乳酸菌数量、乳酸含量和亚硝酸盐含量的变化情况
发酵
时期
乳酸菌数量
乳酸含量
亚硝酸盐含量
初期
少(O2抑制乳酸菌活动)
少
增加(硝酸盐还原菌的作用)
中期
最多(乳酸抑制其他微生
物活动)
增多
开始下降(硝酸盐还原菌受抑
制，部分亚硝酸盐被分解)
后期
减少(乳酸积累，pH 下
继续增多，最后保
继续下降，最后相对稳定(硝酸
2
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降，抑制乳酸菌活动)
持稳定
盐还原菌被完全抑制)
曲线
3．制作泡菜的注意事项
(1)用于制作泡菜的蔬菜应新鲜，若放置时间过长，蔬菜中的亚硝酸盐含量相对较高。
(2)用清水和食盐配制质量分数为5%～20%的盐水。食盐的用量过高，乳酸发酵受抑制，泡菜风味差；用
量过低，杂菌易繁殖，导致泡菜变质。盐水要煮沸后冷却，煮沸的作用：一是除去水中的氧气，二是杀灭
盐水中的其他微生物。
(3)控制严格的厌氧条件的措施
①选择合适的发酵容器，如泡菜坛，这是一种既科学又简单的厌氧发酵容器。
②盐水煮沸后冷却待用。
③装坛时压实，使盐水没过全部菜料。
④泡菜坛用水封口不让空气进入，创造一个封闭无氧的环境，发酵期间不宜开盖，并注意在发酵过程中经
常向水槽中补充水。
(4)控制适宜的发酵温度：温度过高易导致杂菌滋生；温度过低不利于乳酸发酵，会使发酵时间延长。
(5)控制发酵时间：一般在腌制10 天后，亚硝酸盐含量开始下降。但泡菜发酵时间并不是越长越好，一方
面，发酵时间过长，可能会产生其他有害物质；另一方面，发酵时间过长，乳酸含量过高，口味不佳。
核心知识辨析
1．果酒及果醋的制作均可通过气泡的产生情况判断发酵进展程度( )
【答案】错
【详解】当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解为醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为
乙醛，再将乙醛变为醋酸，果醋的制作过程中不会产生气体，无法通过观察气泡的产生来判断果醋的制作
是否完成；通常采用观察是否产生菌膜、闻气味和测定对比发酵前后的pH 来判断。可通过气泡的产生情况
判断酒精发酵进展程度。
2．果醋制作时，需用温水对醋酸菌进行活化处理( )
【答案】错误
【详解】果醋制作时，醋酸菌不需要进行活化处理。
3．酿酒过程中密封的时间越长，酵母菌产生的酒精量就越多( )
【答案】错误
【详解】酵母菌无氧呼吸产生的酒精，一段时间内，密封的时间延长，酒精量就越多，但随着环境条件变
恶劣，反过来抑制无氧呼吸产生酒精的速度。
4．果酒发酵过程中，每隔12 h 左右将瓶盖打开一次进行排气。（选择性必修3 P7）( )
【答案】错误
【详解】果酒发酵过程中，因为酵母菌无氧呼吸产生酒精的同时，也会产生二氧化碳，所以每隔12h 左右
要将瓶盖拧松一次，排除多余的二氧化碳，但又不能打开瓶盖，以防止氧气和有害杂菌进入。本说法错误。
3
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5．制作果酒、果醋时，取新鲜葡萄，应先去除枝梗，再用清水冲洗1～2 次。（选择性必修3 P7）( )
【答案】错误
【详解】制作果酒、果醋时，取新鲜葡萄，应该先清水冲洗1～2 次，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时
引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。
6．多种微生物参与了豆腐的发酵，如酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是曲霉。( )
【答案】错误
【详解】参与豆腐发酵的微生物有青霉、酵母、曲霉、毛霉等多种，其中起主要作用的是毛霉，毛霉等微
生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶可将脂肪分解成甘油和脂肪酸.
7．在制作葡萄酒的过程中，应先去除葡萄的枝梗，再进行反复冲洗，这样才可以洗得彻底( )
【答案】错误
【详解】为避免杂菌污染，需要先先去除葡萄的枝梗，再进行冲洗，不需要反复冲洗，防止将附着于葡萄
皮上的酵母菌冲洗掉。
高考真题剖析
（2023·浙江·统考高考真题）阅读下列材料，完成下面小题。
小曲白酒清香纯正，以大米、大麦、小麦等为原料，以小曲为发酵剂酿造而成。小曲中所含的微生物主要
有好氧型微生物霉菌、兼性厌氧型微生物酵母菌，还有乳酸菌、醋酸菌等细菌。酿酒的原理主要是酵母菌
在无氧条件下利用葡萄糖发酵产生酒精。传统酿造工艺流程如图所示。
1．小曲白酒的酿造过程中，酵母菌进行了有氧呼吸和无氧呼吸。关于酵母菌的呼吸作用，下列叙述正确
的是（ ）
A．有氧呼吸产生的[H]与O2结合，无氧呼吸产生的[H]不与O2结合
B．有氧呼吸在线粒体中进行，无氧呼吸在细胞质基质中进行
C．有氧呼吸有热能的释放，无氧呼吸没有热能的释放
D．有氧呼吸需要酶催化，无氧呼吸不需要酶催化
2．关于小曲白酒的酿造过程，下列叙述错误的是（ ）
A．糖化主要是利用霉菌将淀粉水解为葡萄糖
B．发酵液样品的蒸馏产物有无酒精，可用酸性重铬酸钾溶液检测
C．若酿造过程中酒变酸，则发酵坛密封不严
D．蒸熟并摊晾的原料加入糟醅，立即密封可高效进行酒精发酵
【答案】1．A 2．D
【分析】1．A、有氧呼吸产生的[H]在第三阶段与O2 结合生成水，无氧呼吸产生的[H]不与O2 结合，A 正
确；
B、有氧呼吸的第一阶段在细胞质基质中进行，第二和第三阶段分别在线粒体基质和线粒体内膜中进行，
无氧呼吸的两个阶段都在细胞质基质中进行，B 错误；
C、酵母菌有氧呼吸和无氧呼吸过程中释放的能量均大多以热能散失，但无氧呼吸是不彻底的氧化分解过
4
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程，大部分能量存留在酒精，C 错误；
D、有氧呼吸和无氧呼吸过程都需要酶的催化，只是酶的种类不同，D 错误。
2．A、由于酿酒酵母不能直接利用淀粉发酵产生酒精（乙醇），故糖化过程主要是利用霉菌分泌的淀粉酶
将淀粉分解为葡萄糖，以供发酵利用，A 正确；
B、发酵液样品的蒸馏产物有无酒精，可用酸性重铬酸钾溶液检测，若存在酒精，则酒精与酸性的重铬酸
钾反应呈灰绿色，B 正确；
C、酿造过程中应在无氧条件下进行，若密封不严，会导致醋酸菌在有氧条件下发酵产生醋酸而使酒变酸，
C 正确；
D、蒸熟并摊晾的原料需要冷却后才可加入糟醅，以免杀死菌种，且需要在有氧条件下培养一段时间，让
酵母菌大量繁殖，此后再密封进行酒精发酵，D 错误。
限时训练
A 组(选择题为单选)
1．泡菜制作的步骤主要包括①沸盐水冷却后倒入坛中，浸没全部菜料，装至八成满；②盖好坛盖后，向
坛盖边沿的水槽中注满水；③在发酵过程中注意经常向水槽中补充水；④检测泡菜中亚硝酸盐的含量。相
关叙述正确的是（ ）
A．①过程中装入的蔬菜需要经过灭菌处理
B．②过程是为了让坛内形成绝对无氧的环境
C．各地都能制作泡菜，温度对发酵时间没有影响
D．④的结果通常是亚硝酸盐含量先升高后降低
【答案】D
【详解】A、①过程中装入的蔬菜不需要经过灭菌处理，A 错误；
B、盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水，主要是为了隔绝空气，为乳酸菌提供无氧环境，但坛内形
成不了绝对无氧的环境，B 错误；
C、温度会对发酵时间造成影响，C 错误；
D、④检测泡菜中亚硝酸盐的含量，腌制泡菜过程中亚硝酸盐的含量先增多后减少，D 正确。
2．绍兴是黄酒之乡，“麦曲酶长，酵米复芳；白梅酒娘，伴淋寒香；压滤琼浆，煎煮陈藏”是对绍兴黄
酒精致复杂酿造工艺的描述。在黄酒的主发酵过程中，“开耙”（搅拌）是极为关键的一步。下列相关叙
述错误的是（ ）
A．陈藏需要在低温、密闭环境中进行，形成更芳香的酒
B．接种麦曲有利于淀粉的糖化，有利于“酒娘”菌种发酵
C．发酵过程中“开耙”可适当提供O2，增加酵母菌数量，活化酵母
D．煎煮的目的是除去发酵产品中的杂菌，利于酵母菌繁殖
【答案】D
【详解】A、“陈藏”是将榨出的酒放入罐内存放，需要在低温、密闭环境中进行，可以使酒存放时间长，
同时此过程有利于黄酒中醇与酸发生酯化反应，使酒更加芳香，A 正确；
B、淀粉属于生物大分子，淀粉糖化为小分子糖有利于发酵过程中酵母菌对糖类的利用，B 正确；
C、“开耙”（搅拌）是为了提供O2，让酵母菌进行有氧呼吸，增加酵母菌的数量，有利于活化酵母，C 正
确；
5
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D、煎煮是进行消毒，除去发酵产品中的酵母菌等微生物，利于储藏，D 错误。
3．酸笋是螺蛳粉的灵魂，腌酸笋季节在春季。当竹子出笋后，长出约30cm 高时便可砍下，剥去笋壳，切
成块或是切成笋丝、笋片，放于陶罐中，清水过面，撒上适量食盐，置于阴凉处一个月左右，酸味即出，
便可随食随取。下列相关叙述错误的是（ ）
A．制作酸笋所需菌种的代谢类型为异养厌氧型
B．为保证发酵成功，需将鲜笋和陶罐用沸水泡烫片刻
C．“清水过面”是为了创造无氧环境，减少杂菌污染
D．在制作酸笋时若加入“陈酸笋水”可加速发酵进程
【答案】B
【详解】A、腌制过程中产酸的细菌主要是乳酸菌，利用的是乳酸菌的无氧呼吸，需要厌氧环境，其代谢
类型为异养厌氧型，A 正确；
B、鲜笋不能用沸水泡烫，因为制作酸笋的乳酸菌来自于鲜笋表面，B 错误；
C、“清水过面”可以创造无氧环境，利于乳酸菌生存繁殖，同时减少杂菌污染，C 正确；
D、“陈酸笋水”含有乳酸菌，在制作酸笋时若加入“陈酸笋水”可加速发酵进程，D 正确。
4．酱油起源于我国，迄今已有3000 多年的历史。 由于风味独特、营养价值丰富，酱油已成为我国饮食中
不可或缺的调味品。制作时用大豆、小麦或麸皮为原料，利用多种微生物发酵而成。酱油发酵的大致过程
如下图所示。下列相关叙述错误的是（ ）
A．接种冷冻保存的酵母菌前要对其进行扩大培养
B．发酵产生的多种代谢产物构成酱油独特的风味
C．在加入酵母菌或乳酸菌前，需要对第一阶段的发酵产物进行灭菌处理
D．酵母菌、乳酸菌的发酵产物以及食盐均能起到抑制杂菌、终止发酵的作用
【答案】B
【详解】A、工业发酵罐的体积一般为几十到几百立方米，接入的菌种总体积需要几立方米到几十立方米。
所以，在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养，A 正确；
B、发酵酱油独特的风味是来自外界加入的辅料，而不是代谢产物，B 错误；
C、发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种，一旦有杂菌污染，可能导致产量大大下降，因此，培养基和
发酵设备都必须经过严格的灭菌，C 正确；
D、盐水能具有抑制杂菌的生长作用，乳酸菌的发酵产物乳酸使环境呈酸性，也能抑制杂菌的生长，D 正确。
5．葡萄酒开启后，敞口时间稍长或将余酒倒回酒瓶中，贮存温度在30℃左右，葡萄酒会缓慢“变成”葡
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萄醋。下列相关叙述错误的是（ ）
A．酿造葡萄酒和葡萄醋所利用微生物的主要区别是有无以核膜为界限的细胞核
B．酿造葡萄酒和葡萄醋所利用的微生物都能通过线粒体进行需/有氧呼吸
C．把葡萄酒缓慢“变成”葡萄醋的微生物可能来自空气
D．葡萄酒变成了葡萄醋是因为乙醇通过醋酸菌的有氧呼吸作用下生成了醋酸
【答案】B
【详解】A、酿造葡萄酒的菌种是酵母菌，属于真核生物，酿制葡萄醋所需的菌种是醋酸菌，属于原核生
物，真核生物与原核生物的主要区别是有无以核膜为界限的细胞核，A 正确；
B、酿制葡萄醋所需的菌种是醋酸菌，属于原核生物，原核生物无线粒体，B 错误；
C、把葡萄酒缓慢“变成”葡萄醋的微生物是醋酸菌，醋酸菌可能来自空气，C 正确；
D、葡萄酒变成了葡萄醋是因为乙醇在醋酸菌的作用下生成了醋酸：此时缺少糖源，醋酸菌将乙醇变为乙
醛，再将乙醛变为醋酸，D 正确。
6．下列关于传统发酵技术的说法，正确的是（ ）
A．制作腐乳过程中主要利用毛霉将蛋白质分解成肽和氨基酸
B．制作泡菜过程中先将蔬菜装至八成满，然后迅速倒入煮沸冷却的盐水
C．当缺少糖源时醋酸菌进行无氧呼吸将乙醇转化为乙醛，再将乙醛转化为醋酸
D．制作果酒过程中应先将去除枝梗的葡萄用清水冲洗1～2 次，然后晾干备用
【答案】A
【详解】A、制作腐乳过程中主要利用毛霉产生的蛋白酶将蛋白质分解成肽和氨基酸，产生的脂肪酶将脂
肪分解为甘油和脂肪酸，A 正确；
B、制作泡菜过程中先将蔬菜装至半坛，然后倒入煮沸后冷却的盐水，B 错误；
C、醋酸菌为需氧型细菌，进行有氧呼吸，当缺少糖源时醋酸菌将乙醇转化为乙醛，再将乙醛转化为醋酸，
C 错误；
D、制作果酒过程中应该先用清水冲洗1~2 次，然后再去除葡萄的枝梗，D 错误。
B 组(选择题为不定项)
1．山西老陈醋含有多种营养成分，具有调节血脂、保护肝脏等功效，其制作工艺如下图。下列叙述正确
的是（ ）
高粱→蒸煮→拌大曲→酒精发酵→醋酸发酵→熏醅→淋醋→陈酿
注：以大麦、豌豆等原料制成的大曲，含有多种与发酵有关的微生物。
A．蒸煮可杀死高粱中的微生物，再通过拌大曲加入发酵所需菌种
B．酒精发酵起主要作用的是酵母菌，通常前期通气后期密封发酵
C．醋酸发酵起主要作用的是醋酸菌，较前一阶段需适当降低温度
D．醋酸发酵过程发生的主要反应为乙醇先转化为乙醛再生成乙酸
【答案】ABD
【详解】A、蒸煮可杀死高粱中原有的微生物，拌大曲可提供发酵所需菌种，A 正确；
B、酒精发酵起主要作用的是酵母菌，通常前期通气使酵母菌进行有氧呼吸，以便大量繁殖，后期密封使
酵母菌进行无氧呼吸产生酒精，B 正确；
C、醋酸发酵起主要作用的是醋酸菌，醋酸菌生长的最适温度较酵母菌高，因此需适当升高培养温度，C 错；
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D、先进行酒精发酵，糖类被转化为乙醇，再进行醋酸发酵，主要反应为乙醇先转化为乙醛再生成乙酸，D
正确。
2．红酸汤颜色鲜红、气味清香、味道酸爽，利于人体肠道益生菌生长。制作时选用西红柿洗净晒干搅成
茸泥，加入剁碎的仔姜、大蒜和辣椒，一定量的食盐、糯米和白酒，混合拌匀装坛后密封发酵。下列相关
叙述正确的有（ ）
A．食盐、大蒜和辣椒等既可调味又可抑制杂菌生长
B．发酵时常加入成品红酸汤，可增加醋酸菌含量，缩短制作时间
C．装坛时必须装满并在盖上坛盖后水封，以实现密封发酵
D．出坛后的酸汤若不及时食用，会因酵母菌繁殖长出一层白膜
【答案】AD
【详解】A、食盐、大蒜和辣椒等既可调味又可抑制杂菌生长，制作红酸汤时可适当加入上述物质，可以
起到抑菌和改善风味的效果，A 正确；
B、红酸汤中的酸味物质主要是乳酸菌产生的乳酸，发酵时常加入成品红酸汤，可增加乳酸菌含量，缩短
制作时间，B 错误；
C、装坛时坛口要留有一点空间，而不能装满，目的是防止番茄发酵后液体膨胀外溢，C 错误；
D、出坛后的酸汤，若不及时食用，一段时间后会在其表面出现一层白膜，这是产膜酵母菌大量繁殖形成
的，D 正确。
3．利用卷心菜发酵制作泡菜的过程中，乳酸菌、酵母菌细胞数量和pH 的变化如图所示。下列叙述正确的
是（ ）
A．酵母菌和乳酸菌均有由核膜包被的细胞核B．发酵初期乳酸菌建立了明显的菌种优势
C．前6 天pH 下降主要由乳酸菌代谢引起D．发酵中期酵母菌通过无氧呼吸获取能量
【答案】BCD
【详解】A、酵母菌属于真核细胞，具有核膜包被的细胞核；而乳酸菌属于原核细胞，不具有核膜包被的
细胞核，A 错误；
B、由曲线图分析可知，发酵初期由于pH 的迅速下降，其他杂菌的生长受到了严重影响，乳酸菌的数量快
速增加，成为优势种群，B 正确；
C、乳酸菌能够将葡萄糖分解为乳酸，前6 天pH 下降主要由乳酸菌代谢引起，C 正确；
D、酵母菌属于兼性厌氧微生物，也能够进行无氧呼吸，发酵中期酵母菌通过无氧呼吸获取能量，D 正确。
4．甜酒，又称江米酒，主要原料是糯米，其口味香甜醇美，乙醇含量极少，因此深受人们喜爱。发酵菌
主要是根霉菌和酵母菌，其中根霉菌能将糯米中的淀粉转化为麦芽糖和葡萄糖，酵母菌能将葡萄糖转化为
酒精。下列相关叙述正确的是（ ）
A．根霉菌能将淀粉转化成麦芽糖和葡萄糖，原因是其能产生淀粉酶
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B．酵母菌通过无氧呼吸将葡萄糖转化成酒精和二氧化碳，酿酒酵母最适生长温度约为28℃
C．可用斐林试剂和酸性重铬酸钾溶液检验甜酒是否制作成功
D．制作甜酒的过程中，发酵早期无CO2产生，发酵后期有CO2产生
【答案】ABC
【详解】A、根霉菌可以产生淀粉酶，能够将淀粉水解为麦芽糖，并最终水解为葡萄糖，作为发酵的原料，
A 正确；
B、酵母菌无氧呼吸能将葡萄糖分解为酒精和二氧化碳，温度是影响酵母菌生长的重要因素，酿酒酵母的
最适生长温度为28°C，B 正确；
C、酸性的重铬酸钾溶液会与还原性糖如葡萄糖以及酒精发生颜色反应，加斐林试剂可检测反应是否进行
完全，避免还原性糖如葡萄糖干扰酸性重铬酸钾溶液对酒精的检测，因此可用斐林试剂和酸性重铬酸钾溶
液检验甜酒是否制作成功，C 正确；
D、制作果酒初期酵母菌进行有氧呼吸产生CO2，制作果酒后期发酵液中为无氧环境，酵母菌进行无氧呼吸
也能产生CO2，D 错误。
5．某醋厂和啤酒厂的工艺流程如图所示。酒曲含有霉菌、酵母菌、乳酸菌；醋醅含有醋酸菌；糖化即淀
粉水解过程。下列相关叙述正确的有（ ）
A．糯米“蒸熟”与大米“蒸煮”的目的是利于糖化和灭菌
B．发酵原理是利用真菌的无氧呼吸与细菌的有氧呼吸
C．醋酸发酵过程中经常翻动发酵物，可控制发酵温度和改善通气状况
D．啤酒酿造流程中适当增加溶解氧可缩短发酵时间
【答案】ACD
【详解】A、糯米“蒸熟”与大米“蒸煮”的目的均有利于灭菌和糖化过程，A 正确；
B、图中制酒用到了酒曲，酒曲含有霉菌、酵母菌、乳酸菌，霉菌属于真菌，其为需氧型，该过程霉菌产
生的淀粉酶有利于将糯米中的淀粉分解，其中的乳酸菌进行的是无氧呼吸，酵母菌主要进行无氧呼吸过程
完成酿酒的过程，醋酸发酵过程中主要利用了醋酸杆菌的有氧呼吸进行醋酸发酵，B 错误；
C、醋酸发酵过程中利用了醋酸菌的有氧呼吸，在发酵过程中经常翻动发酵物，有利于散热，可控制发酵
温度和改善通气状况，C 正确；
D、啤酒酿造流程中利用的原理是酵母菌的无氧呼吸产生酒精的过程，若适当增加溶解氧有利于酵母菌有
氧呼吸产生更多的能量满足酵母菌自身增殖的需要，因而可缩短发酵时间，D 正确。
6．2022 年3 月15 日晚，央视3·15 晚会曝光不良企业采购“土坑酸菜”冒充老坛酸菜，而且卫生质量低劣，
备受人们关注。其实泡菜的制作对工艺流程要求非常高，如图为某食品公司安检人员所记录的检测结果，
下列相关叙述正确的是（ ）
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A．泡菜制作过程中，pH 呈下降趋势，是酵母菌无氧呼吸所致
B．据图可知食盐浓度和腌制时间均会影响亚硝酸盐的含量变化
C．亚硝酸盐的含量达到峰值后会逐渐降低，可能与乳酸菌产生的亚硝酸还原酶量增多有关
D．泡菜制作过程中泡菜坛内出现的白膜由乳酸菌大量繁殖形成
【答案】BC
【详解】A、泡菜制作的原理是乳酸菌的无氧呼吸，无氧呼吸过程中产生了乳酸(即发酵的第二阶段)，导
致pH 呈下降趋势，A 错误；
BC、据图可知，食盐浓度和腌制时间均会影响亚硝酸盐的含量变化，亚硝酸盐含量达到峰值后下降，是因
为缺氧和酸性环境抑制杂菌生长，使亚硝酸盐的产生量降低，同时乳酸菌产生亚硝酸还原酶会将亚硝酸盐
分解，BC 正确；
D、泡菜制作过程中泡菜坛内出现的白膜由酵母菌大量繁殖形成，D 错误。
7．鱼茶味酸而微咸，甘香可口，是海南黎族的一种传统发酵食品。鱼茶富含多种人体所需的氨基酸和蛋
白质，具有润肺清肠、促进消化、养颜美肤和缓解血管硬化等作用。其制作方法是：将生鱼开膛洗净，去
头去尾，加盐、姜、蒜等处理后，拌入煮熟的米饭，在特定条件下发酵一段时间后，开坛即可食用，并且
发酵后的鱼肉蛋白质更容易消化、吸收。已知鱼茶的发酵菌群主要是乳酸菌。回答下列有关问题：
(1)写出乳酸菌分解葡萄糖产生乳酸的反应简式： 。根据乳酸菌的代谢特点，制作鱼茶时发酵装置的充
气口应 （填“打开”或“关闭”）。
(2)不能将煮熟的米饭立即与处理后的生鱼混合并搅拌，原因是 。
(3)下图1 是某生物科研小组绘制的鱼茶发酵过程中各菌种数量及发酵液 pH 的变化曲线。
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①鱼茶发酵初期，各菌种的种间关系主要是 ，发酵6 天后醋酸菌消失的主要原因可能是 ，8 天后
酵母菌消失的主要原因可能是
②用稀释涂布平板法统计菌种数量时，统计的菌落数往往 （填“多于”或“少于”）稀释液中的活菌
数，原因是 。若其中 个平板的菌落分布如图2 所示，推测该同学接种时可能的操作失误是 。
【答案】(1)
关闭
(2)温度过高会杀死乳酸菌，造成发酵失败
(3) 种间竞争 醋酸菌为好氧细菌，发酵装置中 O2 耗尽 酵母菌较乳酸菌耐酸性弱，不能适
应发酵液的酸性环境 少于 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
涂布不均匀
【详解】（1 ）乳酸菌在无氧条件下能将葡萄糖分解成乳酸，其反应简式为：
。乳酸菌是厌氧菌，制作鱼茶时发酵装置的充气口应关闭。
（2）高温会杀死乳酸菌，造成发酵失败，故不能将煮熟的米饭立即与处理后的生鱼混合并搅拌，应自然
冷却后再混匀装入坛中。
（3）①发酵过程中各菌种为争夺资源和生存空间而发生种间竞争。随着发酵的进行，发酵装置中的O2 逐
渐被消耗，醋酸菌是好氧菌，因不能在无氧或低氧条件下生存而被抑制。 发酵液 pH 逐渐降低，酵母菌
因不能适应发酵液的酸性环境而被抑制。
②用稀释涂布平板法统计菌种数量时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，故
统计的菌落数往往少于稀释液中的活菌数。 由图2 可知，平板上菌落比较集中，没有很好地分散开来，可
能是涂布不均匀所致。
实验二 酵母菌的纯培养
核心知识回顾
(一)原理：微生物群分散或稀释成单个细胞，单个细胞繁殖成单个菌落。
菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞
群体，这就是菌落。
(二)方法：采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌
落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
(三)步骤
(1)制备培养基
配制培养基―→灭菌―→倒平板。
倒平板注意事项：①温度：50 ℃左右；②操作：在酒精灯火焰附近；③冷凝后平板倒置。
(2)接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线
后培养，可以分离得到单菌落。
(3)培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28 ℃左右的恒
温培养箱中培养24～48 h。
【核心归纳】
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1．配制培养基的注意事项
(1)如果需要调节培养基的pH，应该在定容完成之后，灭菌之前进行操作。
(2)培养基灭菌后要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。其原因是琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44
℃以下凝固，倒平板时温度高于50 ℃会烫手，低于50 ℃时，若不及时操作，琼脂会凝固。
(3)倒平板时，要使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
(4)平板冷却凝固后，要将平板倒置。
(5)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微
生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
2．平板划线法接种菌种时，可防止杂菌污染的操作
(1)接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。
(2)划线操作在酒精灯火焰旁进行。
(3)接种环蘸取菌液前后，要将试管口通过火焰。
(4)划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划线，划线后及时盖上皿盖。
3．实验结果的分析
(1)培养未接种的培养基的目的是检测培养基是否被杂菌污染(或检查培养基制备是否合格)。未接种的培
养基表面若有菌落生长，则说明培养基被污染，应该重新制备；若无菌落生长，则说明未被污染。
(2)在接种酵母菌的培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色、形状和大小上相似，酵母菌菌落一
般表面光滑，多呈乳白色。
(3)若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌液不纯，混入其他杂菌，或在实验操作过程中被
杂菌污染。
4.灼烧接种环的目的
灼烧时期
目的
取菌种前
杀死接种环上原有的微生物
每次划线前
杀死上次划线时残留的菌种，使下一次划线的菌种直接来源于上次划线
的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
接种结束后
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
核心知识辨析
1．配制培养基时应先灭菌再调pH。 ( )
【答案】错误
【详解】制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的基本过程为计算、称量、溶化、调pH、灭菌、倒平板。故错误。
2．平板划线法中每一次划线前要将接种环灼烧。 ( )
【答案】正确
【详解】平板划线法的操作时，每次划线前都要灼烧接种环（杀死接种环上的微生物），这样达到稀释菌
种的目的。故正确。
3．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上。 ( )
【答案】错误
【详解】倒平板时，不能将培养皿盖完全打开，而应只打开一条稍大于瓶口的缝隙，防止空气中的杂菌污
染培养基，该说法错误。
4．无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料（如培养基、接种环等）都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭
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菌。( )
【答案】错误
【详解】高压蒸汽灭菌法常用于无菌操作中培养基的灭菌，但没有生物活性的材料（如培养基、接种环
等）都可采用高压蒸汽灭菌法。在含有高温条件下会被破坏或分解的物质及需要保持干燥的物质，不能用
高压蒸汽灭菌法灭菌，该说法错误。
5．划线结束时即可看到划线末端出现不连续单菌落( )
【答案】错误
【详解】划线结束后，将培养皿倒置放在一定温度的恒温培养箱中培养一定时间后，可看到划线末端出现
不连续单菌落。
6．用平板划线法进行酵母菌的分离时，必须一次连续划线完成接种操作( )
【答案】错
【详解】用平板划线法进行酵母菌的分离时，每次划线完成后都需要灼烧，杀死上一次残留的菌种，
高考真题剖析
1．（2023·浙江·统考高考真题）某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸菌，进行了如下实验：取泡菜汁样品，
划线接种于一定NaCl 浓度梯度的培养基，经培养得到了单菌落。下列叙述正确的是（ ）
A．培养基pH 需偏碱性
B．泡菜汁需多次稀释后才能划线接种
C．需在无氧条件下培养
D．分离得到的微生物均为乳酸菌
【答案】C
【详解】A、因为乳酸菌经过无氧呼吸产生乳酸，故其生活的环境是酸性，培养基pH 需偏酸性，A 错误；
B、平板划线接种时不需要稀释，B 错误；
C、乳酸菌是厌氧型微生物，所以需在无氧条件下培养，C 正确；
D、参与泡菜发酵的微生物有乳杆菌、短乳杆菌和明串珠菌等，所以分离得到的微生物除了乳酸菌，还会
有其他耐高盐的微生物，D 错误。
限时训练
A 组(选择题为单选)
1．某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出高效降解原油的菌株。 如图为某同学接种后培养得到的结果，
推测该同学的接种方法及操作失误是（ ）
A．稀释涂布平板法，菌液浓度过高
B．平板划线法，接种环未灼烧灭菌
C．稀释涂布平板法，菌液未涂布均匀
D．平板划线法，菌液未涂布均匀
【答案】C
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【详解】据图可知，该同学使用的接种方法是稀释涂布平板法，菌落主要出现在培养基的一边，推测可能
是在使用涂布器的时候未将菌液涂布均匀。ABD 错误，C 错误。
2．高浓度的铵盐对海水养殖中的对虾有一定的毒害作用，是制约其大规模养殖的环境因素之一，具有高
降解能力的硝化细菌可有效净化水体中铵盐，降低对虾的死亡率。科研人员从当地对虾养殖池塘中筛选出
对铵盐降解率高且稳定的硝化细菌菌株，将等量的三种候选菌甲、乙、丙分别接入等浓度的含铵盐培养液
中，在适宜条件下培养一段时间后检测培养液中的铵盐浓度，操作流程如图1 所示，结果如图2 所示。下
列叙述正确的是（ ）
A．图1 中M 培养基上进行的是利用平板划线法纯化菌种，该过程中接种环需要灼烧5 次
B．图1 中将候选菌接入含铵盐培养液的目的是对硝化细菌扩大化培养，需要不断振荡
C．据图2 分析，应选择候选菌甲作为菌种进行后续培养
D．当配制选择培养基时，需要以铵盐为唯一氮源从而筛选出硝化细菌
【答案】D
【详解】A、采用平板划线法接种微生物时，每次划线前后都要灼烧接种环，图1 所示的操作过程中划线5
次，故接种环需要灼烧6 次，A 错误；
B、图1 中将等量的三种候选菌甲、乙、丙分别接入等浓度的含铵盐培养液中，目的是检查候选菌甲、乙、
丙对铵盐的降解能力，B 错误；
C、据图2 分析，乙的铵盐浓度最低，说明乙菌种对铵盐的降解效果最好，应选择候选菌乙作为菌种进行后
续培养，C 错误；
D、为了筛选出对铵盐降解率高且稳定的硝化细菌菌株，在配制选择培养基时，需要以铵盐为唯一氮源，D
正确。
3．科研人员将生活在滨海盐渍土的野生大豆的根瘤研磨，将研磨液置于酵母甘露醇肉汤（YMB）培养液
中培养，获得耐盐固氮菌株。取普通大豆幼苗若干，甲组用菌株悬液接种，乙组不接种，用150mmol/
LNaC1 处理两组幼苗，观察比较两组大豆生长状况。相关叙述错误的是（ ）
培养基
成分及含量（g/L）
pH
酵母甘露醇肉汤
（YMB）
酵母提取物20.0、甘露醇5.0、K2HPO45.0，MgSO40.5、NaCl0.186、
CaCO31.2
6.8-7.2
A．YMB 培养基高压蒸汽灭菌完成后需要调节pH
B．YMB 培养基的作用是筛选和富集耐盐固氮菌
C．本实验目的是研究耐盐固氮菌能否改善盐胁迫下普通大豆的生长状况
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D．若甲组大豆生长状况明显优于乙组，则耐盐固氮菌可用于提高盐碱地的利用率
【答案】A
【详解】A、YMB 培养基应该先调节好pH 再进行高压蒸汽灭菌，A 错误；
B、根据题干信息，野生大豆的根瘤研磨液置于YMB 培养液中培养，获得耐盐固氮菌株，说明该培养基的作
用就是筛选和富集耐盐固氮菌，B 正确；
C、本实验甲组用菌株悬液接种，乙组不接种，自变量是是否接种耐盐固氮菌株，因变量是大豆植株的生
长状况。通过这样的实验设计可以看出该实验的目的是研究耐盐固氮菌能否改善盐胁迫下普通大豆的生长
状况，C 正确；
D、结合C 选项，若甲组大豆生长状况明显优于乙组，说明耐盐固氮菌可以改善盐胁迫下普通大豆的生长状
况，那么就可以将该固氮菌用于提高盐碱地的利用率，D 正确。
4．超市中酸奶的配料表显示其有乳杆菌、嗜热链球菌等乳酸菌。研究小组计划将酸奶中的不同乳酸菌进
行分离纯化，下列操作的顺序正确的是（ ）
①高压蒸汽灭菌、倒固体平板
②将酸奶进行系列稀释
③准备水、培养皿并配制培养基
④挑取单菌落接种到斜面培养基
⑤用涂布器涂布并进行37℃厌氧培养
A．①→②→③→④→⑤
B．③→①→②→⑤→④
C．①→③→②→⑤→④
D．②→③→①→④→⑤
【答案】B
【详解】微生物的分离纯化的操作顺序为：
准备水、培养皿并配制培养基
高压蒸汽灭菌、到固体平板
将酸奶进行系列稀释
用涂布器涂布并进
行37℃厌氧培养
挑取单菌落接种到斜面培养基。
故顺序③→①→②→⑤→④，ACD 错误，B 正确。
5．L-天冬酰胺酶由细菌和真菌合成，可分解天冬酰胺释放出氨，然后与奈斯勒试剂反应呈棕色。为筛选
获得L-天冬酰胺酶高产菌株，设计了如下固体培养基。固体培养基：主要成分有牛肉膏、蛋白胨、水、
NaCl、琼脂、奈斯勒试剂。实验结果如下图。下列叙述错误的是（ ）
A．根据实验结果可知，接种时采用的是稀释涂布平板法
B．应选择菌落C 作为高产L-天冬酰胺酶菌株进行大量培养
C．该培养基从功能来看属于选择培养基，其中充当氮源的成分是牛肉膏
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D．无菌技术还可以避免操作者被有害微生物感染，实验结束后的培养基不能直接丢弃
【答案】C
【详解】A、从接种结果来看，菌落分布较为均匀，应该采用的是稀释涂布平板法，A 正确；
B、菌落B 和菌落C 周围棕色圈的直径相同，但C 的菌落直径更小，因此菌落C 的单个细胞产生的L-天冬酰
胺酶更多，应选择菌落C 作为高产L-天冬酰胺酶菌株进行大量培养，B 正确；
C、培养基中加入有奈斯勒试剂，若微生物能产生L-天冬酰胺酶则菌落周围会出现棕色圈，因此该培养基
从功能来看属于鉴别培养基，其中充当氮源的成分是牛肉膏和蛋白胨，C 错误；
D、无菌技术可用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染，还可以避免操作者被有害微生物感染，
但实验结束后为避免环境污染，培养基在丢弃前要进行灭菌处理，D 正确。
6．在器械灭菌时，通常会在高压蒸汽灭菌锅中放置生物指示剂来检验灭菌效果，自含型生物指示剂如图
所示。为检验生物指示剂是否出现阳性变化，需用工具在塑料瓶外挤破安瓿瓶，使菌片浸没在培养液内。
最终根据灭菌与未灭菌的生物指示剂的阳性变化情况，判断器械灭菌效果。下列叙述错误的是（ ）
A．安瓿瓶中培养液的作用是使芽孢复苏
B．菌片中芽孢的耐热性大于器械上的可能污染菌
C．挤破安瓿瓶后，需培养一段时间再观察是否出现阳性变化
D．若灭菌与未灭菌的生物指示剂均不出现阳性变化，则说明灭菌效果良好
【答案】D
【详解】A、检验生物指示剂是否出现阳性变化时，有活性的芽孢呈阳性，因此需要培养液使芽孢复苏，A
正确；
B、芽孢是细菌的休眠体，芽孢壁厚，含水量极低，代谢缓慢，抗逆性强，能经受高温紫外线，电离辐射
以及多种化学物质灭杀。可以帮助细菌度过不良环境。因此菌片中芽孢的耐热性大于器械上的可能污染菌，
B 正确；
C、芽孢复苏需要时间，所以挤破安瓿瓶后，需培养一段时间再观察是否出现阳性变化，C 正确；
D、若灭菌与未灭菌的生物指示剂均不出现阳性变化，则说明灭菌则说明灭菌前无有活性芽孢，也就无法
说明灭菌效果，D 错误。
B 组(选择题为不定项)
1．某地土壤有机物X 污染严重，为改善土壤环境，研究人员从土壤中分离出可高效降解有机物X 的细菌
菌株。以下是研究人员分离细菌菌株的示意图。下列说法错误的是（ ）
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A．制备降解X 的细菌初筛平板时，调节pH、湿热灭菌后分装到培养皿
B．实验结果显示E 是降解X 较理想的菌株，可将其进一步划线纯化
C．接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D．纯化培养时应用涂布器从盛有菌液的试管中蘸取菌液均匀涂布于平板上
【答案】CD
【详解】A、培养基配制过程为：称量→溶解→调pH 值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→倒平板，
因此制备降解X 的细菌初筛平板时，先调节pH，再湿热灭菌，最后进行倒平板分装到培养皿中，A 正确；
B、据图可知，实验结果显示A-E 五种菌株中，E 菌株的透明圈面积最大，说明其水解有机物X 的能力最强，
故E 是降解X 最理想的菌株，可将其进一步划线纯化，B 正确；
C、接种后未长出菌落的培养基，也可能有少量微生物，所以不能直接丢弃，C 错误；
D、用稀释涂布平板法进行纯化培养时，应该用微量移液器从盛有菌液的试管中取0.1mL 菌液，再用涂布器
涂布，D 错误。
2．某同学在实验室进行了酵母菌的纯培养实验，酵母菌培养基的配方如下表所示。下列有关该实验的叙
述正确的是（ ）
组分
马铃薯滤
液
葡萄糖
琼脂
加水定容至
含量
200g
20g
15g
1000mL
A．该培养基是选择培养基，葡萄糖不是酵母菌生长繁殖的唯一碳源
B．含培养基的锥形瓶、培养皿用牛皮纸包扎后进行干热灭菌法灭菌
C．若以平板划线法纯化酵母菌菌种，接种环的灼烧次数与划线次数相同
D．倒平板冷却后的培养皿和接种酵母菌的平板都要倒置在恒温培养箱中
【答案】AD
【详解】A、葡萄糖不是酵母菌生长繁殖的唯一碳源，马铃薯滤液也能为酵母菌提供碳源、氮源和无机盐
等营养成分，A 正确；
B、含培养基的锥形瓶用牛皮纸包扎后不能采用干热灭菌法灭菌，而要采用高压蒸汽灭菌法灭菌，B 错误；
C、若以平板划线法纯化酵母菌菌种，每次划线前后均要对接种环灼烧灭菌，因此接种环的灼烧次数比划
线次数多一次，C 错误；
D、倒平板冷却后的培养皿和接种酵母菌的平板都要倒置在恒温培养箱中，既能防止培养皿盖上的水珠落
在培养基表面造成污染，又能防止培养基中的水分过快蒸发，D 正确。
3．营养缺陷型菌株是突变后某些酶被破坏，导致代谢过程中某些合成反应不能进行的菌株。下图是科研
人员利用影印法（用无菌绒布轻盖在已长好菌落的原培养基上，然后不转动任何角度，“复印”至新的培
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养基上）初检某种氨基酸缺陷型菌株的过程。相关说法正确的是（ ）
A．①过程接种方法为稀释涂布平板法，接种后的培养皿不能立即进行倒置培养
B．紫外线处理的目的是提高菌种突变率且一定能产生目标菌
C．进行②过程的顺序是先将丝绒布“复印”至完全培养基上，再“复印”至基本培养基上
D．完全培养基上的菌落A 在基本培养基对应位置不存在，说明其为氨基酸缺陷型菌落
【答案】AD
【详解】A、据图分析,接种后的菌落均匀分布，据此推测该过程接种的方法为稀释涂布平板法，接种后的
培养皿不能立即进行倒置培养，A 正确；
B、基因突变具有不定向性，紫外线处理的目的是提高菌种突变率但不一定能产生目标菌，B 错误；
C、进行②过程培养时，为了防止将完全培养基中特定营养成分带入基本培养基，应先将丝绒布先转印至
基本培养基上再“复印”至完全培养基上，C 错误；
D、在基本培养基中氨基酸缺陷型菌株不能生长，而在完全培养基中能够生长，完全培养基上的菌落A 在基
本培养基对应位置不存在，说明其为氨基酸缺陷型菌落，D 正确。
4．生长图形法是一种测定微生物营养需求的简便方法。为探究某嗜热菌所需生长因子的种类，研究小组
把该菌的悬浮液与不含任何生长因子但含有其他必需营养物质的培养基混合后倒成平板，然后在平板上划
分数区，将甲、乙、丙三种生长因子分别添加到不同区域，培养结果如图所示，下列说法正确的是
（ ）
A．倒成平板后直接培养可判断有无污染
B．制备平板时，培养基需先灭菌再倒平板
C．生长图形法还可用于某些菌种的筛选
D．图示结果表明该菌需要生长因子乙或丙
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【答案】ABC
【详解】A、平板上不含任何生长因子，若倒成平板后直接培养，出现菌落，说明已被杂菌感染，因为该
嗜热菌不能在缺乏生长因子的培养基中生长，A 正确；
B、制备平板时，先灭菌再倒平板，B 正确；
C、不同菌种所需生长因子不同，可利用生长图形法筛选菌种，C 正确；
D、图中菌落生活在乙丙区域之间，说明同时需要生长因子乙和丙，D 错误。
5．将酵母菌接种在装有10mL 培养液的试管中，放在适宜条件下连续培养七天，每天定时取样，稀释100
倍，用25（中方格）×16 的血细胞计数板对酵母菌计数，最终构建酵母菌种群数量变化曲线模型。下列说
法正确的是（ ）
A．估算酵母菌的数量可以采用抽样检测法和稀释涂布平板法
B．试管中酵母菌种群数量达到K 值前，密度对其增长的制约逐渐减弱
C．给营养充足的培养液中通入氧气不会影响酵母菌种群的K 值
D．若每个中方格中酵母菌平均数量为30 个，则10mL 培养液中的酵母菌数量为7．5×109个
【答案】AD
【详解】A、估算酵母菌的数量可采用抽样检测法（利用血球计数板计数），或将酵母菌培养液进行梯度
稀释后涂布平板，即利用稀释涂布平板法进行计数，A 正确；
B、试管中酵母菌种群数量达到K 值前，其种群数量越来越大，故密度对其增长的制约逐渐增强，B 错误；
C、当生物生存的环境改善，K 值会上升，故给营养充足的培养液中通入氧气会使酵母菌种群的K 值增大，
C 错误；
D、若每个中方格中酵母菌平均数量为30 个，则10mL 培养液中的酵母菌数量=30×25×104×100×10=7．
5×109 个，D 正确。
6．鲜牛奶容易被金黄色葡萄球菌污染，该菌高度酎盐，可引起人类肺炎等疾病。在血平板（培养基添加
适量血液）上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色，下图为检测鲜牛奶被金黄色葡萄球菌污染的
操作流程，下列叙述正确的是（ ）
A．使用后的液体培养基可以直接丢弃
B．肉汤培养基加入一定量NaCl 的目的是维持微生物细胞的渗透压
C．振荡培养可以使微生物与营养物质充分接触，更有利于微生物的生长
D．血平板上的接种方法是平板划线法，血平板上出现周围透明的溶血圈
【答案】BCD
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【详解】A、鲜牛奶用巴氏消毒法，使用后的液体培养基需要用高压蒸汽灭菌法灭菌后再丢弃，防止对环
境造成污染，A 错误；
B、NaCl 属于无机盐，无机盐在培养基中具有调节和维持微生物细胞的渗透压的作用，因此肉汤培养基加
入一定量NaCl 的目的是维持微生物细胞的渗透压，B 正确；
C、振荡培养的目的是使微生物与营养物质充分接触，增加O2 浓度，更有利于微生物生长，C 正确；
D、根据图示可知，利用接种环接种，故接种方法是平板划线法，金黄色葡萄球菌可破坏菌落周围的红细
胞，产生透明的溶血圈，D 正确。
7．自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构
使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。
(1)用于分离细菌的固体培养基包含水、葡萄糖、蛋白胨和琼脂等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供
和维生素等。
(2)A 菌通常被用做溶菌对象。研究者将含有一定浓度A 菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成
薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊（如图），表明 。
(3)为分离出具有溶菌作用的细菌，需要合适的菌落密度，因此应将含菌量较高的湖泊水样 后，
依次分别涂布于不同的浑浊薄层上，涂布过程中，涂布器用 的方法灭菌。培养一段时间后，
能溶解A 菌的菌落周围会出现 。采用这种方法，研究者分离、培养并鉴定出P 菌。
(4)为探究P 菌溶解破坏A 菌的方式，请提出一个假设，该假设能用以下材料和设备加以验证（主要实验材
料和设备：P 菌、A 菌、培养基、圆形滤纸小片、离心机和细菌培养箱） 。
【答案】(1)氮源、碳源
(2)A 菌能在培养平板中生长繁殖
(3) 稀释 灼烧灭菌 溶菌圈
(4)假设P 菌通过分泌某种化学物质使A 菌溶解破裂
【详解】（1）蛋白胨主要为细菌提供氮源、碳源和维生素等。
（2）将含有一定浓度A 菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变
浑浊，表明A 菌能在培养平板中生长繁殖。
（3）为分离出具有溶菌作用的细菌，需要合适的菌落密度，因此应将将含菌量较高的湖泊水样稀释后，
依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。涂布器要用灼烧灭菌的方法来灭菌。培养一段时间后，能溶解A 菌的
菌落周围会出现溶菌圈。
（4）根据实验实验材料和设备，圆形滤纸小片可用于吸收某种物质，离心机可用于分离菌体和细菌分泌
物，为探究P 菌溶解破坏A 菌的方式，可假设P 菌通过分泌某种化学物质使A 菌溶解破裂。
实验三 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
核心知识回顾
1．实验设计
(1)土壤取样
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①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。
②取样部位：距地表约3 ～
8 cm
的土壤层。
(2)样品的稀释
测定土壤中细菌的数量，一般选用1×10
4 、
1×10
5 和
1×10
6 倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这
个实验时可以将稀释的范围放宽一点。
(3)微生物的培养与观察
①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。细菌一般在30
～
37
℃的温度下培养1
～
2 d。
②观察
a．观察方法：每隔24 h 统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
b．记录菌落的特征：包括菌落的形状、大小和颜色等。
2．操作提示
(1)无菌操作
①取土样的用具在使用前都需要灭菌。
②实验操作均应在酒精灯火焰旁进行。
(2)做好标记：本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养
皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
3.计数公式：C÷V×M。C:平均菌落数；V：稀释液体积；M：稀释倍数。
【核心归纳】
1.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数操作中需注意的问题
(1)为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300 的平板进行计数。
(2)恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。
(3)为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组，目的是排除实验中偶然
因素对实验结果的影响。
(4)分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
(5)为防止培养时间不足导致菌落遗漏，在菌落计数时，每隔24 h 统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定
时的记录作为结果。
(6)统计的菌落数目往往比活菌的实际数目少。
核心知识辨析
1．用来分离产脲酶的细菌的平板上，能产生脲酶的菌体呈红色( )
【答案】错误
【详解】产脲酶的细菌能够将尿素分解为氨气，呈碱性，会使培养基中存在的酚红指示剂变成红色，即菌
落周围会出现红色透明圈，而非菌体呈红色。
2．筛选分解尿素的细菌时，培养基中唯一的营养物质是尿素( )
【答案】错
【详解】从土壤中分离以尿素为氮源的细菌的实验流程：土壤取样→样品的稀释→将稀释液涂布到以尿素
为唯一氮源的培养基上→挑选能生长的菌落→鉴定。
3．分离以尿素为氮源的微生物实验中所需的土样可以从有鸟类排泄物的地方获取( )
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【答案】错误
【详解】分离以尿素为氮源的微生物实验中所需的土样不能从有鸟类排泄物的地方获得，因为鸟类排泄物
中多含有尿酸，极少情况下含有尿素。
4．分泌脲酶的微生物是将脲酶分泌到细胞外，所以脲酶是胞外酶，需要内质网、高尔基体对其进行加工(
)
【答案】错误
【详解】有脲酶是幽门螺杆菌合成和分泌的，由于幽门螺杆菌为原核生物，其细胞中不含内质网和高尔基
体，因此该脲酶不需要内质网、高尔基体加工。
5．在分离以尿素为氮源的微生物实验中，碳源是培养基中琼脂糖( )
【答案】错
【详解】在分离以尿素为氮源的微生物实验中，碳源是培养基中葡萄糖，同时葡萄糖还可提供能源，错误。
6．测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同( )
【答案】√
【详解】土壤中各类微生物的数量不同，为了获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，
可见，测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释度范围也不同。
7．当牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显小于选择培养基上的菌落数目时，说明选择培养基已筛选出
一些细菌菌落( )
【答案】错
【详解】验证选择培养基是否具有选择作用，需设立牛肉膏蛋白陈培养基作为对照，若牛肉膏蛋白陈培养
基上的菌落数明显大于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基已筛选出一些菌种，所以该表述错误。
高考真题剖析
1．（2022·江苏·统考高考真题）下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是（ ）
A．选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B．在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C．适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D．可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌
【答案】D
【详解】A、农田或公园土壤中含有较多的含脲酶的微生物，A 正确；
B、为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，含脲酶的微生物在该培养基上
能生长，B 正确；
C、当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C 正确；
D、在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH 升高，酚红指示
剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D 错误。
限时训练
A 组(选择题为单选)
1．在鉴别培养基中添加适量的溴甲酚紫可用于分离和筛选产生代谢酸（有机酸）的微生物。如果培养基
的颜色由紫色变成了黄色则说明其中的微生物能产生代谢酸。下列相关分析与实际相符的是（ ）
A．将泡菜水加入含溴甲酚紫的鉴别培养基后在恒温有氧的条件下培养48h 后会出现紫色→黄色的颜色
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变化
B．将醋酸菌接种在含溴甲酚紫的鉴别培养基后在恒温有氧的条件下培养 48 h 后会出现紫色→黄色的
颜色变化
C．将土壤中的尿素分解菌接种在含溴甲酚紫的鉴别培养基后在恒温且严格无氧的条件下培养 48 h 后
会出现紫色→黄色的颜色变化
D．将酵母菌接种在含溴甲酚紫的鉴别培养基后在有氧或无氧条件下培养 48 h 都会出现紫色→黄色的
颜色变化
【答案】B
【详解】A、泡菜水中的产酸菌是乳酸菌，有氧条件下其代谢很弱，很难出现颜色变化，A 错误；
B、醋酸杆菌是产酸的需氧型细菌，接种在含溴甲酚紫的鉴别培养基后在恒温有氧的条件下培养48h 后会出
现紫色→黄色的颜色变化，B 正确；
CD、尿素分解菌和酵母菌都不是产酸菌，将他们接种在含溴甲酚紫的鉴别培养基后有氧或无氧培养都不会
出现相应的颜色变化，CD 错误。
2．如下图为研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的意图，有关叙述不正确的是（ ）
A．步骤③纯化分解尿素的细菌的原理是将聚集的细菌分散，以获得单细胞形成的菌落
B．配制步骤②、③的培养基都要进行严格灭菌
C．步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力
D．步骤③采用涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
【答案】D
【详解】A、以尿素为唯一氮源的培养基，利用涂布分离法将聚集的细菌分散，以获得单细胞形成的菌落
是纯化分解尿素的细菌的原理，A 正确；
B、配制步骤②、③的培养基时，为防止杂菌污染，应进行严格灭菌，B 正确；
C、经过③筛选、纯化分解尿素的细菌，但不同菌分解尿素的能力不同，因此需要挑取③中的不同种的菌
落接种于④中，比较细菌分解尿素的能力，C 正确；
D、要筛选出能高效分解尿素的细菌，所选用的培养基要以尿素为唯一氮源，但牛肉膏和蛋白胨中都含有
氮源，因此步骤③所用的培养基中不能含有牛肉膏、蛋白胨，D 错误。
3．幽门螺杆菌（Hp）生存于人体胃的幽门部位，能够引起慢性胃炎等胃部疾病。尿素在酶的作用下分解
产生NH3和CO2。体检时常用
14C 呼气试验来诊断测试者是否感染Hp，测试者口服含
14C 标记的尿素胶囊，
一段时间后通过测定呼出的气体是否含有
14CO2来诊断是否感染Hp。医务工作者也可以采集胃病患者样本
进行微生物的纯化操作，判断是否感染Hp。下列相关分析错误的是（ ）
A．呼气试验的前提是Hp 能合成和分泌脲酶，从而催化尿素分解.
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B．对样本进行微生物的纯化操作时，一般采用固体培养基
C．筛选Hp 的培养基应以尿素为唯一氮源，能抑制杂菌生长
D．在培养基中可加入醋酸洋红液来鉴定是否分离得到了Hp
【答案】D
【详解】A、幽门螺杆菌（Hp）要能产生脲酶，14C 标记的尿素进入胃后才能在其产生的脲酶的催化下能分
解生成NH3 和14CO2，一段时间后通过测定呼出的气体是否含有14CO2 才能诊断是否感染Hp，A 正确；
B、对Hp 进行纯化需要得到Hp 单菌落，所以需要用到固体培养基，B 正确；
C、培养基应以尿素作为唯一氮源，可以允许能分解尿素的微生物（Hp）在此培养基中生长，同时抑制或
阻止其他不能利用尿素的微生物的生长，C 正确；
D、细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚
红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素，D 错误。
4．尿素分解菌体内的脲酶能够把尿素（CH4N2O）分解为氨（NH3）和CO2，进而利用氨合成一些所需的
物质。尿素分解菌的分离与纯化的培养基通常只需要将细菌的完全培养基中的氮源作一些调整。下列有关
叙述正确的是（ ）
A．尿素分解菌为自养生物，属于生产者
B．尿素能为尿素分解菌提供碳源和氮源
C．尿素分解菌的分离纯化需以尿素为唯一氮源
D．其他杂菌无法在分离纯化残留的培养基上生长
【答案】C
【详解】A、尿素分解菌体内的脲酶能够把尿素（CH4N2O）分解为氨（NH3）和CO2，进而利用氨合成一些
所需的物质，尿素是有机物，即尿素分解菌利用有机物合成其他物质，而不是利用无机物合成有机物，其
为异养生物，不属于生产者，A 错误；
B、尿素（CH4N2O）被分解为氨（NH3）和CO2，尿素分解菌利用氨合成一些所需的物质，说明尿素能为尿
素分解菌提供氮源，而不能提供碳源，B 错误；
C、尿素分解菌的分离纯化需以尿素为唯一氮源，对应的培养基为选择培养基，C 正确；
D、在分离纯化残留的培养基上有尿素分解菌的代谢产物，可能有些杂菌能在分离残留的培养基上生长，D
错误。
5．长期放置的酒表面会出现一层膜，这层膜是醋酸菌在液体表面繁殖形成的( )
【答案】正确
【详解】由于醋酸菌是好氧菌，长期放置的酒表面会出现一层膜，这层膜是醋酸菌在液体表面繁殖形成的。
故正确。
6．下列与某实验小组分离产脲酶菌的实验设计相关的说法，不合理的是（ ）
A．可选择富含尿素的土壤作为样品来分离目的菌株
B．能分解酚红指示剂使其褪色的是产脲酶菌株
C．富集培养的目的是增加目的菌的浓度
D．在选择培养基中添加尿素作为唯一氮源
【答案】B
【详解】AD、为了筛选可分解尿素的细菌，可选择富含尿素的土壤作为样品来分离目的菌株，尿素作为唯
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一氮源，含脲酶的微生物在该土壤能生长，AD 正确；
B、在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH 升高，酚红指示
剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，B 错误；
C、富集培养的目的是增加目的菌的浓度，以增加目的菌种数量，C 正确。
7．下列有关土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验描述错误的是（ ）
A．土壤中的细菌，绝大多数分布在距离地表约3～8cm 的土壤中，取样时一般铲去表层土
B．测定土壤中细菌的数量，一般选用102、103、104倍数的稀释液进行平板培养
C．取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌
D．在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作
【答案】B
【详解】A、土壤中的细菌，绝大多数分布在距离地表约3～8cm 的土壤中，因此在取样时一般要铲去表层
土，A 正确；
B、土壤中细菌比真菌多，在测定土壤中细菌的数量时，一般选用104、105 和106 倍的稀释液进行平板培
养，B 错误；
C、为了防止杂菌污染，取土壤用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要灭菌，C 正确；
D、在稀释土壤溶液的过程中，为了防止杂菌污染，每一步都要在火焰旁操作，D 正确。
B 组(选择题为不定项)
1．下列有关“探究1g 土壤中有多少能分解尿素的细菌的实验”叙述正确的是（ ）
A．一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养，初次做实验范围可放宽
B．证明选择培养基起到了选择作用，则需要接种了的牛肉膏蛋白胨培养基做对照
C．证明选择培养基未被污染，则需要设置空白培养基做对照
D．通过选择培养基筛选出来的细菌都能分解尿素
【答案】ABC
【详解】A、一般选用1×104、1×105 和1×106 倍稀释的稀释液进行平板培养，能得到在30-300 范围的
有效数据，初次做实验范围可放宽，A 正确；
B、要证明选择培养基起到了选择作用，则需要接种了的牛肉膏蛋白胨培养基做对照，如果两个培养基上
长的菌落不同，则说明选择培养基有选择作用，B 正确；
C、证明选择培养基未被污染，则需要设置空白培养基做对照，如果空白对照平板上不长菌，说明没有被
污染，C 正确；
D、通过选择培养基筛选出来的细菌也有可能是利用了空气中N2 作N 源的菌，D 错误。
2．下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释过程示意图。请据图分析，下列说法
正确的是（ ）
A．用涂布平板法不仅可以对微生物进行计数，也可以用于接种微生物
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B．用⑤号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落，涂布平板所用的培养基可以用牛肉膏蛋白胨培养
基
C．⑤号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为1.7×109个
D．还可以用血细胞计数板统计细菌数目，此方法统计结果往往偏小
【答案】AC
【详解】A、微生物常见的接种的方法有平板划线法和稀释涂布平板法等，其中稀释涂布平板法可以对微
生物进行计数，A 正确；
B、由题意可知，该实验的目的是为了筛选出土壤中分解尿素的细菌并计数，所以要接种在以尿素为唯一
氮源的培养基上，不能用牛肉膏蛋白胨培养基，B 错误；
C、⑤号试管对土样稀释了106 倍，所以⑤号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为（168+175+167）
÷3÷0.1×106=1.7×109 个，C 正确；
D、利用显微镜进行直接计数也是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法，该方法统计的结果一
般是活菌数和死菌数的总和，所以此方法统计结果往往偏大，D 错误。
3．如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素的细菌的过程示意图，有关叙述错误的是（ ）
A．在配制步骤②、③的培养基时，都应添加琼脂
B．步骤③纯化分解尿素的细菌的原理是将聚集的细菌分散，可以获得单细胞菌落
C．步骤③采用涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D．步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，可通过比较溶液pH 的变化大小来比较细菌分解尿素的能
力
【答案】AC
【详解】A、②培养基是液体培养基，不需要添加琼脂，A 错误；
B、步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌通过涂布平板法分散，获得单细胞菌落，B 正确；
C、步骤③筛选分解尿素的细菌，培养基中应以尿素为唯一氨源，不能加入牛肉膏蛋白胨（含有氮源），C
错；
D、步骤④鉴定细菌分解尿素的能力时，挑取③中不同种的菌落分别接种，分解尿素能力高的会产生更多
NH3，溶液pH 更高，所以可通过溶液pH 的变化大小来比较细菌分解尿素的能カ，D 正确。
4．下列有关土壤中微生物的分离与计数的说法，错误的是（ ）
A．每个稀释度下做一个菌落数目在30～300 的平板，则说明稀释操作比较成功
B．牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显小于选择培养基的数目，说明选择培养基起到了选择作用
C．每个稀释度下要做一个空白平板，且可以在下次实验时重复使用，以节省成本
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D．有时不用改变培养基的成分，也能筛选出所需的微生物
【答案】ABC
【详解】A、每个稀释度下得到两个或两个以上菌落数目在30～300 的平板，则说明稀释操作比较成功，A
错误；
B、牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基起到了选择作用，B 错误；
C、每个稀释度下要做一个空白平板，作为空白对照，以排除培养基是否被杂菌污染，但是不能重复使用，
C 错误；
D、有时不用改变培养基的成分，也能筛选出所需的微生物，例如在筛选耐高温的菌种时，不需要改变培
养基的成分，只需要提高培养环境温度即可，D 正确。
5．金黄色葡萄球菌是一种常见的病原菌，在血平板（完全培养基中添加适量血液）上生长时，可破坏菌
落周围的红细胞，使其褪色。某研究小组利用微生物选择培养技术，测定了某处土壤中金黄色葡萄球菌数
量。下列说法正确的是（ ）
A．从功能上分类，血平板属于选择培养基
B．倒平板前待培养基冷却至室温后加入血液，以免高温破坏血细胞
C．待涂布的菌液被培养基吸收后应倒置培养，防止水分过度蒸发
D．应将菌液稀释合适的倍数以获得菌落数在30-300 的平板进行计数
【答案】CD
【详解】A、根据题干信息“金黄色葡萄球菌在血平板上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色”
可知：血平板属于鉴别培养基，A 错误；
B、倒平板后待培养基冷却至室温后加入血液，以免高温破坏血细胞，B 错误；
C、平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以减少使
培养基中的水分过快地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染，C 正确；
D、实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30～300、适于计数的平
板。在同一稀释度下，应至少对3 个平板进行重复计数，然后求出平均值，D 正确。
6．亚磷酸盐是一种特殊的磷源，下图是研究人员筛选、检测并保存高效利用亚磷酸盐细菌的过程。相关
叙述正确的是（ ）
A．图中所用的培养基都应以亚磷酸盐为唯一磷源，并加入琼脂
B．步骤①的目的是便于精确计算土壤中能利用亚磷酸盐的微生物数量
C．步骤②采用涂布平板法接种，根据菌落的形态、大小、颜色等对菌种做初步鉴定
D．步骤③检测细菌利用亚磷酸盐的能力，步骤④将优良菌种保存于斜面培养基上
【答案】CD
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【详解】A、图中所用的培养基都应以亚磷酸盐为唯一磷源，即选择培养基，但③过程用的液体培养基，
没有加入琼脂，A 错误；
B、利用稀释涂布平板法统计微生物的数量，得到的是估计值，B 错误；
C、菌落的形态、大小、颜色等可反映微生物的特征，可做初步鉴定，C 正确；
D、步骤③复筛的过程目的是检测细菌利用亚磷酸盐的能力，步骤④将优良菌种保存于斜面培养基上，以
便后期利用，D 正确。
7．I 某学校生物兴趣小组验证牛的成熟红细胞吸收葡萄糖的方式为协助扩散，而非主动运输。现提供如下
材料：牛的成熟红细胞若干、培养瓶、葡萄糖浓度测试仪、蒸馏水、5%的葡萄糖溶液、5mL 葡萄糖载体抑
制剂和5mL 呼吸抑制剂等，请完善如下实验过程。
实验原理：主动运输需要载体和消耗能量，协助扩散需要载体和具有浓度差。
(1)实验步骤：
①取三个培养瓶，编号A、B、C，向三个培养瓶中分别加入等量的牛的成熟红细胞和5%的葡萄糖溶液。
② 。③ 。
(2)请写出预期结果和实验结论。
结果
实验结论
II 某生物活动小组为探究当地农田土壤中分解尿素的细菌的数量，进行了随机取样、系列梯度稀释、涂布
平板、培养、计数等步骤，实验操作过程如下：
请分析并回答下列问题：
(3)该实验中含有琼脂的培养基从物理性质来说，属于 培养基，培养基中只选择了 作为唯一氮源。
(4)分解尿素的细菌能产生脲酶，将尿素分解为 。
(5)在采用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，需要进行梯度稀释的原因是 。
(6)实验结果：6 号试管涂布的三个平板的菌落数为550、501、688，7 号试管涂布的三个平板的菌落数为
58、73、97，8 号试管涂布的三个平板的菌落数为8、15、28．该10 g 土壤样品中含有分解尿素的细菌的
估算数目是 个。
【答案】(1) 向A 瓶中加入5mL 蒸馏水，向B 瓶中加入5mL 葡萄糖载体抑制剂，向C 瓶中加入5mL 呼吸
抑制剂 在相同且适宜的培养条件下培养一定时间后，利用葡萄糖浓度测试仪测定各培养瓶中葡萄糖
的含量
(2) 预期结果：A 瓶和C 瓶中葡萄糖含量大致相等且小于B 瓶。 实验结论：牛的成熟红细胞吸收
葡萄糖的方式为协助扩散，而非主动运输。
(3) 固体 尿素
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(4)NH3 和CO2
(5)只有在稀释度足够高时，聚集在一起的微生物才被分散成单个细胞，并形成单个菌落；但稀释度过高
时，得到的平板菌落数太少，实验的偶然性太大。进行梯度稀释时，取菌落数为30～300 个的平板进行计
数，所得的实验结果最准确（合理即可）
(6)7．6×1011
【详解】（1）实验要验证牛的成熟红细胞吸收葡萄糖的方式为协助扩散，而非主动运输，由于主动运输
需要载体和消耗能量，而协助扩散需要载体，不消耗能量，能量是由细胞呼吸提供，故实验步骤②向A 瓶
中加入5mL 蒸馏水，向B 瓶中加入5mL 葡萄糖载体抑制剂，向C 瓶中加入5mL 呼吸抑制剂；步骤③在相同
且适宜的培养条件下培养一定时间后，利用葡萄糖浓度测试仪测定各培养瓶中葡萄糖的含量。
（2）预期结果：A 瓶和C 瓶中葡萄糖含量大致相等且小于B 瓶。实验结论：牛的成熟红细胞吸收葡萄糖的
方式为协助扩散，而非主动运输。
（3）琼脂是凝固剂，因此含有琼脂的培养基是固体培养基；为了筛选和分离土壤中分解尿素的细菌，培
养基中需要添加尿素作为唯一氮源。
（4）分解尿素的细菌能产生脲酶，将尿素分解为NH3 和CO2。
（5）只有在稀释度足够高时，聚集在一起的微生物才被分散成单个细胞，并形成单个菌落；但稀释度过
高时，得到的平板菌落数太少，实验的偶然性太大。进行梯度稀释时，取菌落数为30～300 个的平板进行
计数，所得的实验结果最准确，故在采用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，需要进行梯度稀释。
（6）进行梯度稀释时，取菌落数为30～300 个的平板进行计数，所得的实验结果最准确，因此选择7 号试
管进行计数，且7 号试管的稀释度为108，涂布的三个平板的菌落数为58、73、97，则该10 g 土壤样品中
含有分解尿素的细菌的估算数目是（58+73+97）
3
0.1×108 10=7．6×1011。
实验四 菊花的组织培养
核心知识回顾
1．植物组织培养的理论基础：植物细胞的全能性。
2．植物组织培养的条件：(1)离体；(2)无菌；(3)培养基；(4)适宜的培养条件。
3.体现细胞全能性的条件
材料
离体的细胞、组织或器官
培养基
种类齐全、比例合适的营养物质及一定比例的植物激素
外界条件
(1)无菌操作；
(2)光照：诱导愈伤组织时一般不需要光照，再分化时需要光照
4.实验步骤
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5.生长素和细胞分裂素用量的比例对植物细胞发育方向的影响
生长素用量与细胞分裂
素用量的比值
结果
比值高
有利于根的分化，抑制芽的形成
比值低
有利于芽的分化，抑制根的形成
比值适中
促进愈伤组织的形成
核心知识辨析
1．试管苗在移栽时不需要在培养间进一步培养( )
【答案】错
【详解】试管苗在移栽时需要在培养间进一步培养，该过程称为练苗，该表述错误。
2．菊花组织培养过程中从外植体的分割到炼苗都需要在无菌条件下进行( )
【答案】错
【详解】在移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日，该过程
为练苗，不是在无菌条件下进行的，该表述错误。
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3．培养基质中的蛭石和珍珠岩要用高压蒸汽灭菌锅灭菌，冷却待用( )
【答案】正确
【详解】培养基质中的蛭石和珍珠岩要用高压蒸汽灭菌锅灭菌，冷却待用，避免影响移栽后幼苗的正常活
性，故该说法正确。
4．脱分化需要适宜光照，再分化不需要光照( )
【答案】错
【详解】脱分化阶段一般不需要光照，愈伤组织再分化到一定阶段，形成叶绿体，能进行光合作用，需要
弱光照射，该表述错误。
5．对外植体进行消毒时，消毒剂的选择以及处理时间应以“能杀死外植体表面的微生物，且对植物细胞
的伤害尽量小”为原则( )
【答案】正确
【详解】消毒剂种类及消毒时间的选择应以“能杀死外植体表面的微生物，且对植物细胞的伤害尽量小”
为原则，尽可能保证外植体的活性，该表述正确。
6．植物组织培养的脱分化和再分化过程一般需要调控植物激素的种类( )
【答案】错
【详解】植物组织培养的脱分化和再分化过程一般需要调控植物激素的比例，脱分化的阶段，细胞分裂素
与生长素比例约为1，分化生成芽阶段，细胞分裂素与生长素的比值大于1，分化生根阶段，细胞分裂素与
生长素比例小于1，故该说法错误。
7．植物的每个细胞在植物体内和体外都能表现出全能性( )
【答案】错
【详解】植物细胞具有全能性的原因是植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，离体时具备着发
育着发育成完整植株的潜能，而植物体内的细胞在特定的时间和空间条件下选择性表达，并不能表现出全
能性，故该说法错误。
高考真题剖析
1．（2022·浙江·高考真题）下列关于菊花组织培养的叙述，正确的是（ ）
A．用自然生长的茎进行组培须用适宜浓度的乙醇和次氯酸钠的混合液消毒
B．培养瓶用专用封口膜封口可防止外界杂菌侵入并阻止瓶内外的气体交换
C．组培苗锻炼时采用蛭石作为栽培基质的原因是蛭石带菌量低且营养丰富
D．不带叶片的菊花幼茎切段可以通过器官发生的途径形成完整的菊花植株
【答案】D
【详解】A、 自然生长茎段的消毒属于外植体消毒，先用70%酒精，再用无菌水清洗，再用5%次氯酸钠消
毒处理，最后再用无菌水清洗，A 错误；
B、培养瓶用专用封口膜封口的目的是防止杂菌污染，并不影响气体交换，B 错误；
C、组培苗锻炼时采用蛭石作为栽培基质的原因是蛭石比较松软，持水性也较好，有利于幼苗的生根和叶
片的生长，C 错误；
D、不带叶片的菊花茎的切段可通过植物组织培养分化出芽和根这种器官发生的途径形成完整的菊花植株，
D 正确。
限时训练
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A 组(选择题为单选)
1．铁皮石斛是非常好的药材，但因为铁皮石斛自然繁殖力极弱，生长缓慢，再加上人们掠夺式采挖，资
源已接近枯竭，植物组织培养技术为铁皮石斛的繁殖提供了新思路。下列相关叙述正确的是（ ）
A．利用铁皮石斛的体细胞进行组织培养的过程中发生了染色体数目的变异
B．诱导愈伤组织形成和后续培养过程中，每日需要给予适当时间和适当强度的光照
C．为获得无菌培养物，除了要无菌操作外，还需要对铁皮石斛的外植体进行严格灭菌
D．植物组织培养过程中用适当诱变因素处理，可能筛选到高产的突变体进而培养成新品种
【答案】D
【详解】A、利用铁皮石斛的体细胞进行组织培养的过程中可能会发生染色体数目的变异，A 错误；
B、诱导愈伤组织期间不需要光，后续培养过程中，为了诱导叶绿素的形成，每日需要给予适当时间和适
当强度的光照，B 错误；
C、需要对外植体进行消毒，不能进行灭菌处理，以保持外植体的活性，C 错误；
D、植物组织培养过程中，由于培养的细胞一直处于不断的分生状态，容易受到培养条件和外界压力的影
响而发生突变，因此植物组织培养过程中用适当诱变因素处理，可能筛选到高产的突变体进而培养成新品
种，D 正确。
2．植物组织培养技术常用于商业化生产，其过程一般为：建立无菌培养物→培养物增殖→生根培养→试
管苗移栽及鉴定。下列相关叙述错误的是（ ）
A．建立无菌培养物时需分别用酒精和次氯酸钠溶液对叶片、茎尖、花药等进行消毒处理
B．外植体需置于脱分化培养基中，诱导形成不定形的愈伤组织，此组织细胞全能性较高
C．生根培养基中细胞分裂素与生长素的含量比值应大于1，生根培养需给予适当时间的光照
D．若培育的是耐盐植株，则可将获得的试管苗移栽于含高盐土壤中进行筛选后，再推广栽培
【答案】C
【详解】A、建立无菌培养物时需分别用酒精和次氯酸钠溶液对叶片、茎尖、花药等进行消毒处理，A 正确；
B、外植体需置于脱分化培养基中，诱导形成愈伤组织，愈伤组织细胞为脱分化细胞，全能性较高，B 正确；
C、生根培养基中细胞分裂素与生长素的含量之比应小于1，生长素有利于生根，同时生根培养需给予适当
时间和强度的光照，C 错误；
D、若培育的是耐盐植株，则需将获得的试管苗移栽于含高盐土壤（培养液）中进行筛选，筛选出所需的
幼苗后再推广栽培，D 正确。
3．浠水县清泉镇金宝山村通过植物组织培养复壮中药材白芨种苗，带动周边400 多名农民增收致富。下
列有关植物组织培养的说法正确的是（ ）
A．植物组织培养时，对外植体可用75%的酒精进行灭菌
B．取白芨茎尖进行植物组织培养，可获得不带病毒的抗病毒苗
C．植物组织培养一般先诱导生芽后诱导生根
D．诱导愈伤组织形成时需要每日给予适当时间的光照
【答案】C
【详解】A、植物组织培养时，对外植体可用75%的酒精进行消毒，A 错误；
B、可取白芨茎尖进行植物组织培养，获得不带病毒的脱毒苗但并不能获得抗病毒苗，B 错误；
C、在植物组织培养过程中，一般是先诱导形成芽、再诱导生根，C 正确；
32
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D、诱导愈伤组织形成时一般不需要光照，D 错误。
4．某种名贵植物通常用无性繁殖的方式进行繁殖，但容易将感染的病毒传给后代。某技术中心计划获取
该种植物的脱毒苗，技术路线如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．由愈伤组织到脱毒苗需要经过脱分化、再分化等过程
B．外植体可以选择该种植物的茎尖分生组织
C．制备培养基时需要在培养基中添加琼脂等成分
D．生长素/细胞分裂素的值较高时有利于根的分化
【答案】A
【详解】A、由愈伤组织到脱毒苗需要经过再分化过程，由外植体到愈伤组织需要经过脱分化过程，A 错误；
B、外植体可以选择该种植物的茎尖分生组织，经过组织培养后可以获得无毒苗，原因是分生组织中不带
毒或带毒很少，B 正确；
C、植物组织培培养所用的培养基是固体培养基，因此，在制备培养基时需要在培养基中添加琼脂等成分，
C 正确；
D、由于生长素能促进生根，因此，在生长素/细胞分裂素的值较高时有利于根的分化，D 正确。
5．为实现多肉植物的规模化生产，科研人员开展了如下研究。相关叙述错误的是（ ）
A．过程①宜选择幼嫩的叶片，分别用次氯酸钠和70%的酒精消毒处理
B．过程②应避光培养，防止愈伤组织分化成筛管、维管等
C．过程③应配制2 种培养基，其主要目的是满足不同阶段试管苗对特定激素的需求
D．过程④应在珍珠岩基质中添加适量蔗糖，为幼苗生长提供碳源
【答案】D
【详解】A、过程①选取幼嫩的叶片（分化程度相对较低），在70%的酒精浸泡30s 后，立即取出，在无菌
水清洗2～3 次，再用次氯酸钠溶液处理30min 后，立即用无菌水清洗2～3 次，A 正确；
B、过程②诱导愈伤组织期间一般不需要光照，为了防止愈伤组织分化成筛管、维管等，应避光培养，B 对；
C、过程③应配制2 种培养基，其主要目的是满足不同阶段试管苗对特定激素的需求，生长素/细胞分裂素
比值高有利于根的分化、抑制芽的形成，生长素/细胞分裂素比值低有利于芽的分化、抑制根的形成，C 对；
D、过程④将试管苗移植到消过毒的珍珠岩基质中，是为了试管苗适应外界环境，再移栽到土壤中。试管
苗能进行光合作用合成有机物，不需要在珍珠岩基质中添加适量蔗糖作为碳源，D 错误。
6．理论上来说，正常的植物细胞都具有全能性。下列有关植物细胞全能性的叙述，错误的是（ ）
A．植物细胞具有全能性的原因是细胞中含有与发育成完整个体的全部信息
B．一粒玉米种子发育成完整植株的过程体现了植物细胞全能性
C．一般来说，植物体内分化程度越高的体细胞，其全能性越低
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D．花药在体外被诱导成完整的单倍体植株不能体现体细胞全能性
【答案】B
【详解】A、正常的植物体细胞经受精卵有丝分裂产生相同的细胞，这些相同的细胞再经基因的选择性表
达分化成不同功能的细胞，这些细胞仍含有与受精卵相同的本物种生长、发育所需的全部遗传信息；正常
的植物生殖细胞经原始生殖细胞减数分裂产生，仍含有本物种生长、发育所需的全套遗传信息，因此植物
细胞即使分化后仍具全能性，A 正确；
B、玉米种子中含有胚，种子发育成植株是胚发育成个体的过程，是正常的生长发育过程，不能体现细胞
的全能性，B 错误；
C、植物细胞的全能性与植物细胞的分化程度相关，一般来说，分化程度越高，越难体现出细胞的全能性，
C 正确；
D、植物花药在体外被诱导成为完整的单倍体植株，利用的是植物组织培养技术，体现的是生殖细胞的全
能性而不是体细胞全能性，D 正确。
B 组(选择题为不定项)
1．铁皮石斛是我国名贵中药，生物碱是其有效成分之一。下图表示利用铁皮石斛新生营养芽诱导培育出
的拟原球茎(简称PLBs，类似愈伤组织)，在不同条件下生产生物碱的实验结果。下列叙述不正确的是（
）
A．实验前需对实验中使用的培养基和外植体新生营养芽进行消毒处理
B．选用新生营养芽的原因是其分裂能力强、全能性高且几乎不含病毒
C．新生营养芽再分化培育出的PLBs 具有高度液泡化、呈无定形状态的特点
D．由图中曲线分析可知，光照条件下PLBs 的重量与生物碱的含量成正相关
【答案】ACD
【详解】A、植物组织培养时，需要提前对实验中使用的培养基和所有器械灭菌，对外植体进行消毒，A 错；
B、选用新生营养芽的原因是其分裂能力强、全能性高且几乎不含病毒，B 正确；
C、新生营养芽脱分化培育出的PLBs，类似愈伤组织，细胞具有高度液泡化、呈无定形状态的特点，C 错误；
D、据图可知：光照条件下，在15～50 天的时间段内，PLBs 重量与生物碱含量均随培养时间的递增而增加，
但在50～60 天的时间段内，PLBs 重量略有增加，生物碱含量却逐渐下降，说明光照条件下PLBs 的重量与
生物碱含量不成正相关，D 错误。
2．下列与下图有关的说法，正确的是（ ）
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A．①→③过程为有丝分裂，细胞数目增加
B．③→⑤细胞数目没有变化，但细胞体积增大，该过程表示细胞分化
C．①→②和①→④，细胞形态改变，相同形态的细胞形成了组织，所以该过程表示细胞分化
D．⑥⑦⑧表示从②中取出的一个细胞经过植物组织培养，获得了完整的植株，体现了植物细胞的全
能性
【答案】ACD
【详解】A、①→③过程中细胞数目增加，表示有丝分裂，A 正确；
B、③→⑤细胞数目没有变化，但细胞体积增大，该过程表示细胞生长，B 错误；
C、图中①→②和①→④表示细胞分化，该过程中细胞形态改变，相同形态的细胞形成了组织，C 正确；
D、⑥表示脱分化过程；⑦表示再分化过程；⑧表示个体发育，⑥⑦⑧表示从②中取出的一个细胞经过植
物组织培养，获得了完整的植株，体现了植物细胞的全能性，D 正确。
3．愈伤组织形成过程中，生长素和细胞分裂素信号通路相关基因存在DNA 和组蛋白去甲基化现象。研究
者利用桃叶片诱导愈伤组织，在培养基中添加DNA 甲基转移酶抑制剂Aza 或组蛋白去甲基化酶抑制剂
GSK，检测形成愈伤组织的面积，结果如图。据此分析不正确的是（ ）
A．实验器材、培养基和桃叶片等需经高压蒸汽灭菌处理后使用
B．具有特定形态、排列疏松、有大液泡的结构即为桃的愈伤组织
C．DNA 去甲基化和组蛋白甲基化分别促进、抑制愈伤组织形成
D．推测表观遗传影响激素的信号转导过程进而影响脱分化过程
【答案】AB
【详解】A、桃叶片不能用高压蒸汽灭菌处理，A 错误；
B、愈伤组织细胞是由一小团无定形状态的薄壁细胞组成的，即没有特定形态，B 错误；
C、与对照组相比，在培养基中添加DNA 甲基转移酶抑制剂Aza 会使愈伤组织面积增加，说明DNA 甲基转移
酶抑制剂Aza 会促进愈伤组织的形成，而DNA 甲基转移酶抑制剂Aza 可抑制甲基化的形成，因此DNA 去甲
基化可促进愈伤组织的形成，同理，与对照组相比，在培养基中添加组蛋白去甲基化酶抑制剂GSK 会使愈
伤组织面积减小，说明组蛋白甲基化可抑制愈伤组织形成，C 正确；
D、图示加入DNA 甲基转移酶抑制剂Aza 或组蛋白去甲基化酶抑制剂GSK 会影响愈伤组织的形成，而愈伤组
织的形成是脱分化的结果，因此可推测表观遗传影响激素的信号转导过程进而影响脱分化过程，D 正确。
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4．藿香是一种名贵中药，但存在种质退化、易感染病虫害等问题，研究者对组织培养不同阶段的藿香辐
射处理，以期获得性状优良的突变株。据下图分析错误的是（ ）
A．②过程应持续给予光照以促进光合作用色素合成
B．②③过程都需营养物质和激素，无需更换培养基
C．外植体经③过程诱导生芽体现植物细胞的全能性
D．辐射处理可以诱导所培养的材料发生不定向突变
【答案】ABC
【详解】A、②过程为脱分化形成愈伤组织，一般避光处理，A 错误；
B、②为脱分化，③为再分化，二者激素配比不同，需更换培养基，B 错误；
C、外植体经③过程诱导生芽体（不是完整植株）未现植物细胞的全能性，C 错误；
D、突变具有不定向性，辐射处理可以诱导所培养的材料发生不定向突变，D 正确。
5．组培苗的移栽驯化是植物组织培养成功的关键，其主要过程为：炼苗→基质灭菌→育苗盘准备→试管
苗脱瓶→移栽。下列关于该过程中注意事项的叙述，正确的是（ ）
A．炼苗：正午强光和南方光照较强地区需采取阴蓬或温室以避免灼伤小苗
B．基质灭菌：将蛭石、珍珠岩、草木灰混匀，经干热灭菌后取出立即移栽组培苗
C．试管苗脱瓶：组培苗从液体培养基中取出，使根部带上较多培养液，有利于幼苗生长
D．移栽：移栽前需喷雾洒水保持一定的湿度，之后需要逐渐降低湿度和增强光照
【答案】AD
【详解】A、组培苗生存能力较弱，需要进行锻炼，练苗期间在正午强光和南方光照较强地区需要采取阴
蓬或温室以避免灼伤小苗，A 正确；
B、组培苗通常移栽到经过消毒的蛭石、珍珠岩、草木灰材料中，这些材料需要经过高压蒸汽灭菌或干热
灭菌，灭菌后应该冷却才能移栽组培苗，B 错误；
C、试管苗脱瓶过程中，需要将组培苗从液体培养基中取出，沥干后移再栽到土壤等基质中，这样可避免
残留营养物质滋生微生物，C 错误；
D、幼苗移栽至大田前还需“炼苗”，移栽前需喷雾洒水保持一定的湿度，之后需要逐渐降低湿度和增强
光照，以逐渐适应大田环境，D 正确。
6．下图是某个生物技术的基本流程，下列相关叙述中，错误的是（ ）
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A．该生物技术是植物细胞工程的基本技术手段，⑥中的试管苗不容易感染病毒
B．该生物技术需要在无菌条件下操作，整个过程中使用的所有培养基应保证营养物质种类齐全、比
例合适，同时在整个培养过程中都需要提供适宜的温度、光照和氧气等外界条件
C．在培养过程中，②中的细胞失去了其特有的结构和功能
D．④和⑤的培养基完全相同
【答案】ABD
【详解】A、植物组织培养的基本流程为：离体 的植物器官、组织或细胞(外植体)→脱分化形成愈伤组织
→再分化形成根、芽等器官→长成植物体，据图可知，该生物技术是植物组织培养技术，是植物细胞工程
的基本技术手段，⑥中的试管苗是脱毒苗，病毒含量较少，但不是抗病毒植株，A 错误；
B、植物组织培养过程的愈伤组织形成阶段不需要光照，如果在光照条件下容易分化产生维管等组织，不
利于产生大量的愈伤组织，B 错误；
C、在培养过程中，②愈伤组织是指在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞可以经过再分
化，即失去其特有的结构和功能，转变成未分化的细胞，进而形成不定形的薄壁组织团块，C 正确；
D、生长素/细胞分裂素比例升高，利于根的分化；生长素/细胞分裂素比例降低，利于芽的分化，因此诱
导生根和生芽的培养基不完全相同，④和⑤分别表示诱导形成芽和根，即培养基不完全相同，D 错误。
7．下图为植物体细胞杂交过程示意图，请分析回答：
(1)植物原生质体融合的理论基础是 。
(2)①过程中，目前最常用的方法是 ，即在0.5～0.6mol/L 的甘露醇溶液提供的较 渗透压条件下用
水解植物的细胞壁。
(3)②过程可以用 等物理方法或用 作诱导剂的化学方法，获得的C 称为 。
(4)④和⑤过程可称为 和 。
(5)在得到融合的原生质体后，利用植物组织培养技术获得新植株。通过植物体细胞杂交和植物组织培养技
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术能使 同时在新的植物体上有所表现。
(6)若远缘杂交亲本A 和B 都是二倍体，则理论上杂种植株为 倍体。从理论上讲，这类杂种植株是
（填“可育”或“不育”）的。
(7)若运用传统的有性杂交方法则 （填“能”或“不能”）实现上述结果，其原因是 。因此这项研究
对于培育作物新品种方面的重大意义在于 。
(8)利用植物体细胞杂交的方法培育新品种的过程中，基因的传递 （填“遵循”或“不遵循”）孟德尔
的遗传定律，其原因是 。
【答案】(1)细胞膜具有一定的流动性
(2) 酶解法 高 纤维素酶和果胶酶
(3) 离心、振动、电激 PEG（聚乙二醇） 融合的原生质体
(4) 脱分化 再分化
(5)（亲缘关系较远的）亲本的遗传特征
(6) （异源）四 可育
(7) 不能 不同种生物之间存在生殖隔离 克服远缘杂交不亲和的障碍，大大扩展了可用于杂
交的亲本组合范围
(8) 不遵循 只有在生物进行有性生殖的过程中，才遵循孟德尔的遗传规律，而植物体细胞杂交
育种的过程不属于有性生殖
【详解】（1）植物原生质体融合的理论基础是细胞膜具有一定的流动性。
（2）植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，根据酶的专一性原理，采用酶解法去除植物细胞壁，常用
的酶是纤维素酶和果胶酶。在0.5～0.6mol/L 的甘露醇溶液提供的较高渗透压条件下，用纤维素酶和果胶
酶水解植物的细胞壁。
（3）②过程为人工诱导原生质体融合，物理方法有离心、振动、电激等，化学方法是用聚乙二醇（PEG）
等试剂作为诱导剂诱导融合。获得的C 称为融合的原生质体。
（4）④和⑤过程可称为脱分化和再分化。
（5）在得到融合的原生质体后，利用植物组织培养技术获得新植株。通过植物体细胞杂交和植物组织培
养技术能使（亲缘关系较远的）亲本的遗传特征同时在新的植物体上有所表现。
（6）若远缘杂交亲本A 和B 都是二倍体，则理论上杂种植株为异源四倍体。杂种植株含有植株A 和植株B
的全部遗传物质，从理论上讲是可育的。
（7）因为不同种生物之间存在生殖隔离，传统的有性杂交方法不能实现上述结果。这项研究对于培养作
物新品种方面的重大意义在于克服远缘杂交不亲和的障碍，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围。
（8）利用植物体细胞杂交的方法培育新品种的过程中，基因的传递不遵循孟德尔的遗传定律，其原因是
只有在生物进行有性生殖的过程中，才遵循孟德尔的遗传规律，而植物体细胞杂交育种的过程不属于有性
生殖。
实验五 DNA 的粗提取与鉴定
核心知识回顾
一、实验原理
1．提取DNA 的原理
利用DNA 与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
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如：(1)DNA 在酒精溶液中的溶解性：DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
(2)DNA 在NaCl 溶液中的溶解性：DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中的溶解度不同，它能溶于2 mol/L
的NaCl
溶液。
2．鉴定DNA 的原理
在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
二、方法步骤
1．称取约30 g 洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL 研磨液，充分研磨。
2．去除滤液中的杂质
方案一
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4 ℃冰箱中放置几分
钟后，再取上清液
方案二
直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1 500 r/min 的转速下离心5 min，
再取上清液
3．DNA 的析出
方案一
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～
3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA；用玻璃棒沿一个方向
搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分
方案二
将溶液倒入塑料离心管中，在10 000 r/min 的转速下离心5 min，弃上清
液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干
4.DNA 的鉴定
取两支20 mL 的试管，各加入2 mol/L 的NaCl 溶液5 mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl 溶
液中，再向两支试管中各加入4 mL 的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min，待试管冷
却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
三、操作提示
1．以血液为实验材料时，每100 mL 血液中需要加入3 g 柠檬酸钠，防止血液凝固。
2．加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA
分子的断裂
，导致DNA 分子不能形成絮状沉淀。
四、关键点拨
1．利用动物细胞提取DNA 时，破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接使其吸水涨破。
2．不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。
3．提纯DNA 时，选用体积分数为95%的冷酒精的原因：体积分数为95%的冷酒精提纯效果更佳。
核心知识辨析
1．在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂会呈现紫色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA 的试剂。（选择性
必修3 P74）( )
【答案】错误
【详解】在一定温度下，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA 的试剂。
故题中描述错误。
2．DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。( )
【答案】正确
【解析】DNA 在酒精中会析出，因而可以通过酒精去除溶于酒精的蛋白质。
3．在溶有DNA 的NaCl 溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色。( )
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【答案】错误
【解析】二苯胺试剂需要沸水浴才呈蓝色。
高考真题剖析
1．（2023·广东·统考高考真题）“DNA 粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。
下列叙述错误的是（ ）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA 等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA 的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
【答案】D
【详解】A、裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA 等物质，A 正确；
B、DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L 的NaCl 溶液， 将溶液过滤，即可将混合物
中的多糖、蛋白质等与DNA 分离，B 正确；
C、DNA 不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA 纯度，C 正确；
D、将DNA 溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D 错误。
限时训练
A 组(选择题为单选)
1．血浆中含有大量蛋白质和少量脂质等，血浆cfDNA 与蛋白质紧密粘附结合，提取血浆cfDNA 的步骤主
要有：配制洗涤液→样本裂解→DNA 析出→DNA 吸附→杂质洗涤→DNA 洗脱与收集。下列说法错误的是
（ ）
A．样本裂解的目的是裂解血细胞，使其含有的DNA 释放
B．可以通过加入体积分数95%的预冷乙醇，轻轻颠倒混匀的方式析出DNA
C．洗涤液的作用是高效去除血浆中的蛋白质和脂质等
D．洗脱DNA 的洗脱液中含有一定浓度的NaCI
【答案】A
【详解】A、血浆不含有血细胞，裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，A 错误；
B、DNA 不溶于乙醇，细胞中某些蛋白质溶于乙醇，可以通过加入体积分数95%的预冷乙醇，轻轻颠倒混匀
的方式析出DNA，B 正确；
C、血浆中含有大量蛋白质和少量脂质等，洗涤液的作用是高效去除血浆中的蛋白质和脂质等，C 正确；
D、DNA 洗脱液的原理：在高盐状态下，硅胶膜专一性地吸附DNA；在低盐或水溶液状态下，DNA 被洗脱下
来，洗脱DNA 的洗脱液中含有一定浓度的NaCI，D 正确。
2．下图表示“DNA 粗提取与鉴定”实验的基本流程，下列叙述错误的是（ ）
①取材→②破碎细胞→③获得滤液→④去除杂质→⑤进一步提纯→⑥DNA 鉴定
A．本实验使用的酒精的浓度与“低温诱导植物细胞染色体数目的变化”实验中的相同
B．步骤①中可以使用猪的肝细胞作为实验材料
C．步骤①中可以使用纱布对研磨液进行过滤，并获取上清液
D．步骤⑥向试管中加入二苯胺试剂后静置5min 后即可呈现蓝色
【答案】D
40
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【详解】A、本实验和“低温诱导植物细胞染色体数目的变化”实验所用的酒精浓度相同，都是体积分数
为95%的酒精，A 正确；
B、猪的肝细胞中含有DNA，所以，步骤①中可以使用猪的肝细胞作为实验材料，B 正确；
C、步骤①中可以使用纱布对研磨液进行过滤，并获取上清液，C 正确；
D、步骤⑥中 DNA 鉴定时向试管中加入二苯胺试剂后，应将试管置于沸水中加热 5min，待试管冷却后可
观察到蓝色，D 错误。
3．如图为鸡血细胞中DNA 的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，下列相关叙述中，
正确的是（ ）
A．该实验的正确操作顺序是③→①→②→④→⑤
B．用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA 量相近
C．⑤表示要鉴定步骤①中所得到的白色丝状物主要成分为DNA，可使用二苯胺试剂来鉴定，沸水浴
冷却后，出现蓝色的试管组别是对照组
D．步骤①的目的是初步分离DNA 与蛋白质，析出并获得DNA；步骤④中在2mol/L 的NaCl 溶液中，
DNA 的溶解度较大
【答案】D
【详解】A、DNA 的粗提取和鉴定步骤是：加入蒸馏水，破碎细胞→过滤，获取含DNA 的滤液→去除滤液中
杂质→DNA 的析出→鉴定，因此图中表示正确的实验操作顺序是③→②→①→④→⑤，A 错误；
B、猪血红细胞中没有细胞核，提取不到DNA，用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA 量不相同，B
错误；
C、⑤表示要鉴定步骤①中所得到的白色丝状物主要成分为DNA，可使用二苯胺试剂来鉴定，沸水浴冷却后，
出现蓝色的试管组别是实验组，C 错误；
D、步骤①的目的是析出并获得DNA，步骤④中在2mol/L 的NaCl 溶液中，DNA 的溶解度较大，D 正确。
4．不同生物的DNA 的提取方法有所不同，DNA 提取的原理和实验流程大致相同（如图所示）。下列说法
错误的是（ ）
A．破碎细胞在冷冻下进行，可将组织材料冻裂和降低DNA 酶的活性
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B．溶于酒精中的可能有某些盐类、蛋白质、糖类或其他大分子物质
C．DNA 粗提取时离心需使用塑料离心管，用二苯胺试剂对离心结果进行鉴定
D．鉴定絮状物中DNA 时，需用2mol·L-¹NaCl 溶液溶解DNA 后加入二苯胺试剂直接观察
【答案】D
【详解】A、破碎细胞在冷冻下进行，可将组织材料冻裂，方便研磨，低温可以降低DNA 酶的活性，防止
DNA 被降解，A 正确；
B、DNA 不溶于酒精，但细胞中的某些物质却可以溶于酒精，据此推测，溶于酒精中的可能有某些盐类、蛋
白质、糖类或其他大分子物质，B 正确；
C、DNA 容易吸附在玻璃表面，使用塑料离心管可减少提取过程中DNA 的损失，用二苯胺试剂对离心结果进
行鉴定，C 正确；
D、鉴定絮状物中DNA 时，需用2mol·L-¹ NaCl 溶液溶解DNA，向溶液中加入二苯胺试剂后，需要置于沸水
中加热，D 错误。
B 组(选择题为不定项)
1．下列关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A．羊的成熟红细胞可作为提取DNA 的材料
B．提取植物细胞的DNA 时，需要加入一定量的研磨液
C．预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA 水解
D．在沸水浴条件下，DNA 与二苯胺试剂反应呈现蓝色
【答案】BCD
【详解】A、羊的成熟红细胞没有细胞核，因此不可作为提取 DNA 的材料，A 错误；
B、提取植物细胞的 DNA 时，需要加入一定量的研磨液（洗涤剂和食盐），洗涤剂的作用是瓦解细胞膜，
而食盐的作用是提高 DNA 的溶解度，B 正确；
C、预冷的酒精溶液具有两个功能：第一，能抑制核酸水解酶活性，防止 DNA 水解；第二， DNA 不溶于
酒精溶液，而细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液，因此利用酒精溶液可以将 DNA 析出，C 正确；
D、二苯胺是鉴定DNA 的试剂，在沸水浴条件下， DNA 与二苯胺反应呈现蓝色，D 正确。
2．图1、2 分别为“DNA 的粗提取与鉴定”实验中部分操作示意图，下列叙述正确的是（ ）
A．提取材料不能用猪血替换鸡血
B．图1、2 中完成过滤后均要保留滤液
C．图1、2 中搅拌的操作要求不同
D．图1、2 中加入蒸馏水的目的相同
【答案】AB
【详解】A、做DNA 的粗提取与鉴定实验时，所选的实验材料应该DNA 含量丰富，且易提取，由于哺乳动物
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成熟的红细胞无细胞核和细胞器，提取不到DNA，因此不能用猪血代替鸡血，A 正确；
B、图1 中在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液，图2 中DNA 易溶于
浓盐中，杂质不能溶解，因此过滤后获得滤液中含有DNA，B 正确；
C、图1、2 中搅拌的操作要求相同，都需要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅动，C 错误；
D、图1 中加入蒸馏水是为了让细胞吸水涨破，图1 中加入蒸馏水是为了析出DNA，两者的目的并不相同，
D 错误。
3．棉叶总DNA 的提取较为困难，若采集的鲜叶样品保存不当，将严重影响其DNA 的提取率及纯度。科
研人员以棉花新鲜嫩叶为对照，比较了不同贮藏条件（4℃冷鲜保存3d、-20℃冷冻保存3d 和7d）对棉叶
DNA 提取率及纯度的影响，结果如下图。相关叙述正确的是（ ）
A．利用不同浓度的NaCl 溶液可初步去除部分杂质
B．鲜叶提取的DNA 与二苯胺试剂反应呈现的蓝色最深
C．冷冻保存7d 后提取的DNA 中有些蛋白质或氨基酸未除尽
D．冷冻保存3d 组的DNA 提取效果优于冷鲜保存3d 组
【答案】ACD
【详解】A、DNA 在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同，利用不同浓度的NaCl 溶液可初步去除部分杂质，A
正确；
B、新鲜棉叶提取的DNA 纯度最高，但提取率不高，因此新鲜棉叶提取DNA 的量不是最多的，与二苯胺试剂
反应呈现的蓝色也不是最深，B 错误；
C、由图示可知，冷冻保存7d 后提取的DNA 纯度OD260/OD280 小于1.8，说明有些蛋白质或氨基酸未除尽，
C 正确；
D、由图示结果可知，冷冻保存3d 组的DNA 提取率大于冷鲜保存3d 组，D 正确。
4．下列有关“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．植物材料需先用洗涤剂破坏细胞壁再吸水涨破，释放DNA
B．在新鲜猪血中加入适量的柠檬酸钠，混合均匀后离心取血细胞液
C．在含有DNA 的2 mol/L 的氯化钠溶液中加入蒸馏水，搅拌出现丝状物后停止加水
D．鉴定DNA 时，将丝状物溶解于2mol/L 的氯化钠溶液中，再加入二苯胺试剂进行沸水浴
【答案】ABC
【详解】A、洗涤剂能够瓦解细胞膜，植物材料需先用洗涤剂溶解细胞膜，释放DNA，A 错误；
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B、在新鲜鸡血中加入适量的柠檬酸钠，混合均匀后离心取沉淀物，B 错误；
C、在含有DNA 的2mol/L 的氯化钠溶液中加入蒸馏水，NaCl 的浓度逐渐降低，DNA 析出，待丝状物不再增
加后停止加水，C 错误；
D、鉴定DNA 时，将丝状物溶解于2mol/L 的氯化钠溶液中，再加入二苯胺试剂进行沸水浴，出现蓝色，D
对。
5．“CTAB 法”和“SDS 法”是提取DNA 的常用方法，CTAB 提取液含有CTAB、EDTA 等成分，SDS 提
取液含SDS、EDTA 等成分。CTAB、SDS 能破坏膜结构，使蛋白质变性，提高DNA 在提取液中的溶解
度;EDTA 能螯合Mg2+、Mn2+，抑制DNA 酶的活性。某科研小组为了寻找提取腊梅DNA 的优良方法，比较
了两种提取DNA 的方法，主要操作如下:
实验测定结果如表(表中OD260 的值反映溶液中核酸的浓度，OD280 的值反映溶液中蛋白质的浓度。理论
上，纯DNA 溶液的OD260/OD280 的值为1.8，纯RNA 溶液的OD260/OD280 的值为2.0)。
CTAB
SDS
OD260
OD280
OD260/OD280
OD260
OD280
OD260/OD280
0.033
0.018
1.833
0.006
0.005
1.200
请回答下列问题:
(1)与常温下研磨相比，在液氮中研磨的优点是 ;CTAB 提取液和SDS 提取液中都加入EDTA 的
目的是 。
(2)氯仿-异戊醇密度大于水且不溶于水，DNA 不溶于氯仿-异戊醇，蛋白质等杂质可溶于氯仿-异戊醇，实
验过程中加入氯仿-异戊醇离心后，应取① (填“上清液”或“沉淀物”)加异丙醇(异丙醇与水互溶)并
离心进行纯化，利用异丙醇溶液纯化DNA 的原理是 。
(3)两种方法中， 法提取的DNA 的纯度更高，判断的依据是 。
【答案】(1) 研磨充分，且低温能抑制DNA 酶活性 抑制DNA 酶的活性，减少DNA 分解，提高DNA
的完整性和总量
(2) 上清液 DNA 不溶于异丙醇，而杂质能溶于异丙醇
(3) CTAB CTAB 法提取的DNA 溶液的OD260/OD280 的值为1.833，更接近纯DNA 溶液
【详解】（1）液氮温度低，在液氮中研磨会研磨得更充分，且低温能抑制DNA 酶的活性，减少DNA 的分解；
EDTA 能螯合Mg2+、Mn2+，抑制DNA 酶的活性，减少DNA 分解，提高DNA 的完整性和总量。
（2）氯仿-异戊醇密度大于水且不溶于水，DNA 不溶于氯仿-异戊醇，离心后，氯仿-异戊醇位于试管的底
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部，DNA 位于试管上层的水中，所以离心后应该取上清液进行后续操作;含DNA 的上清液中加异丙醇离心后
取的是沉淀物，说明DNA 不溶于异丙醇，而杂质能溶于异丙醇。
（3）从表中数据可知，CTAB 法提取的DNA 溶液中OD260/OD280 的值是1.833，而SDS 法提取的DNA 溶液中
OD260/OD280 的值是1.200，所以CTAB 法提取的DNA 的纯度更高。
实验六 DNA 片段的扩增及电泳鉴定
核心知识回顾
一、实验原理
1．DNA 片段的扩增
PCR 利用了DNA
的热变性
原理，通过调节温度来控制DNA 双链的解聚与结合。
2．琼脂糖凝胶电泳
(1)带电粒子：DNA 分子具有可解离的基团，在一定的pH 下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。
(2)迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电
泳。
(3)迁移速率：在凝胶中DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象有关。
(4)检测：凝胶中的DNA 分子通过染色，可以在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来。
二、方法步骤
1．移液：用微量移液器按照配方或PCR 试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
2．混合：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。
3．离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，使反应液集中在管的底部。
4．反应：将装有反应液的微量离心管放入PCR
仪
中，设置程序进行反应。
5．根据待分离的DNA 片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%
～
1.2%
的琼
脂糖溶液，并加入适量的核酸染料混匀。
6．将扩增得到的PCR 产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的
加样孔内。
7．接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1 ～
5 V/cm
。待指示剂前沿迁移接近
凝胶边缘时，停止电泳。
8．电泳结束后，取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
三、操作提示
1．为避免外源DNA 等因素的污染，PCR 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压
灭菌处理。
2．缓冲液和酶应分装成小份，并在－
20
℃
储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4．在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
四、关键点拨
1．未出现扩增条带的主要原因
(1)TaqDNA 聚合酶失活。
(2)引物出现质量问题。
(3)Mg2＋浓度过低。
(4)变性时的温度低，变性时间短。
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2．出现非特异性扩增条带的主要原因
(1)模板DNA 出现污染。
(2)引物特异性不强或形成引物二聚体。
(3)Mg2＋浓度过高。
(4)复性时的温度过低等。
核心知识辨析
1．PCR 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前没必要进行高压灭菌处理。 ( )
【答案】错误
【详解】为避免外源DNA 等的污染，PCR 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高
压蒸灭菌处理。故该说法错误。
2．PCR 反应需提供DNA 模板，2 种引物，4 种核糖核苷酸和耐高温的DNA 聚合酶。( )
【答案】错误
【详解】PCR 反应需在一定的缓冲液中才能进行，需要提供DNA 模板，2 种引物，4 种脱氧核糖核苷酸和耐
高温的DNA 聚合酶，所以该说法是错误的。
31．（2023·全国·高二专题练习）PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA 分子的迁移
速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象等有关。（选择性必修3 P84）( )
【答案】正确
【详解】PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分
子的大小和构象等有关。 凝胶中的dna 分子通过染色，可以在波长为300nm 的紫外灯下被检测出来。
3．电泳是指在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相同的电极移动。（选择性必修3 P84）(
)
【答案】错误
【详解】DNA 分子具有可解离的基团，在一定的pH 下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用
下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
4．用PCR 方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。( )
【答案】正确
【详解】用PCR 方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列，只需要知道一段已知目的基因的核苷酸序
列，从而根据这段序列合成引物。该说法正确。
5．用PCR 方法扩增目的基因时需要设计两种引物。( )
【答案】正确
【详解】由于DNA 的两条链反向平行，碱基序列不相同，故PCR 过程中需要两种引物分子才能保证两条链
能同时扩增。本说法正确。
高考真题剖析
1．（2021·湖北·统考高考真题）某实验利用PCR 技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引
物与模板完全配对）外，还有2 条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产
生，以下措施中有效的是（ ）
A．增加模板DNA 的量
B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间
D．提高复性的温度
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【答案】D
【详解】A、增加模板DNA 的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A 错误；
BC、延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有
效减少反应非特异性条带，BC 错误；
D、非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性
的温度来减少反应非特异性条带的产生，D 正确。
限时训练
A 组(选择题为单选)
1．利用Sanger 法对未知序列DNA 进行测序的原理如下：将含有适量待测单链DNA 模板、引物、四种脱
氧核苷三磷酸（dNTP）和DNA 聚合酶等混合物分别加到4 支试管中，每支试管中再分别加入1 种足量的
放射性同位素标记双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），在子链合成过程中，ddNTP 可以与dNTP 竞争核苷酸链
延长位点，并终止DNA 片段的延伸。最终分离4 支试管中的所有子链片段，分泳道进行电泳，用放射自
显影法显示后结果如下图。下列说法正确的是（ ）
A．图中X 含有11 个碱基，在所有单链中相对分子质量最大，电泳速度最慢
B．图中所测单链DNA 片段中胸腺嘧啶数与鸟嘌呤数相等
C．在含ddTTP 的试管中含有2 种子链DNA 片段
D．图中所测单链DNA 模板的序列为5'-CTTGACGACGA-3'
【答案】B
【详解】A、图中X 含有11 个脱氧核苷酸，在所有单链中相对分子质量最大，电泳速度最慢，A 错误；
B、图中显示的子链中含有A 和C 的数目均为3 个，根据碱基互补配对原则可推测，所测单链DNA 片段中胸
腺嘧啶数与鸟嘌呤数相等，均为3 个，B 正确；
C、在含ddTTP 的试管中可能含有3 种子链DNA 片段，包括完整的子链长度，C 错误；
D、图中所测单链DNA 模板的序列为5'-GAACTGCTGCT-3'，D 错误。
2．将两对PCR 引物作特殊的设计，外侧两个引物大小为25bp，复性温度较高（68℃）；内侧两个引物大
小为17bp，复性温度较低（46℃）。通过控制复性温度（68℃）使外侧引物先行扩增，经过20～30 次循
环后（第一轮PCR 结束），再降低复性温度（46℃）使内侧引物以第一轮PCR 产物为模板进行再次扩增，
整个过程被称为巢式PCR，该技术更适用于DNA 含量低的待扩增的样品。两轮PCR 反应均在一个PCR 管
中进行。下列说法错误的是（ ）
A．与常规PCR 技术相比，两套引物的使用提高了扩增的特异性和敏感性
B．第二轮PCR 反应能否进行，是对第一轮PCR 反应正确性的鉴定
C．复性温度与引物长度成正相关
D．在一个PCR 管中进行两轮PCR 反应均使用了相同的模板
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【答案】D
【详解】A、巢式PCR 中，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增
的概率极低，提高了扩增的特异性和敏感性，A 正确；
B、第二轮PCR 使内侧引物以第一轮PCR 产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR 反应能否进行，是对第一轮
PCR 反应正确性的鉴定，B 正确；
C、外侧两个引物大小为25bp，复性温度较高（68℃）；内侧两个引物大小为17bp，复性温度较低
（46℃），复性温度与引物长度成正相关，C 正确；
D、第一轮PCR 使用一开始投放的模板DNA，第二轮以第一轮PCR 产物为模板进行再次扩增，D 错误。
3．关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是（ ）
A．PCR 中DNA 双链的解聚与结合利用了DNA 的热变性原理，通过调节温度来控制DNA 复制
B．PCR 反应体系中需要加入大肠杆菌中的DNA 聚合酶
C．在凝胶中DNA 分子的迁移速率只与DNA 分子的大小有关
D．DNA 分子在一定的pH 下带电，在电场的作用下会向着与它所带电荷相同的电极移动
【答案】A
【详解】A、在PCR 技术的过程中包括：高温变性（解链）→低温复性→中温延伸三个步骤，因此DNA 两条
链的解旋过程不需要解旋酶的催化，而是利用了DNA 在高温下变性的原理，通过控制温度来控制双链的解
聚与结合，A 正确；
B、PCR 反应体系中需要加入耐高温的DNA 聚合酶，B 错误；
C、DNA 分子在凝胶中的迁移速率除了与DNA 分子大小有关外、还与DNA 分子构象、凝胶的浓度等有关，C
错误；
D、根据电荷同性相斥、异性相吸引可知，DNA 分子进行电泳时，会向着与其所带电荷相反的电极移动，D
错误。
4．不对称PCR 的基本原理是采用不等量的引物，产生大量的单链目标DNA。这两种引物分别称为限制性
引物与非限制性引物；其最佳比例一般为1：50~1：100。在PCR 反应的早期循环（约20 次）中，扩增产
物主要是双链DNA，当后期数量较少的限制性引物耗尽后，数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标
DNA，过程如图所示。下列相关叙述错误的是（ ）
A．PCR 反应缓冲液中一般需添加Mg2+，以激活DNA 聚合酶
B．复性时引物与模板链3'端的碱基序列通过互补配对结合
C．PCR 进行最初20 次循环的目的是增加模板DNA 的量
D．不对称PCR 产生的大量单链DNA 是由限制性引物延伸而来
【答案】D
【详解】A、PCR 反应缓冲液中一般要添加Mg2+，以激活耐高温的DNA 聚合酶，A 正确；
B、复性时引物会与模板链3'端的碱基序列互补配对，B 正确；
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C、PCR 进行最初20 次循环的目的是增加模板DNA 的量，C 正确；
D、不对称PCR 产生大量的单链DNA 是由非限制性引物延伸而来，D 错误。
5．下列关于PCR 技术相关叙述正确的是（ ）
A．DNA 聚合酶可从引物的5 端开始连接脱氧核苷酸
B．退火温度过低导致得不到任何产物，过高导致产生非特异性片段
C．PCR 反应体系中需加入TaqDNA 聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用
D．扩增DNA 片段的过程中，第n 次循环共需要引物2n+1-2 个
【答案】C
【详解】A、DNA 聚合酶可从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，A 错误；
B、退火温度过低会导致引物与模板链不能形成互补的碱基对，从而不能进行延伸，过高会导致引物与非
特异性片段结合，进而产生非特异性片段，B 错误；
C、PCR 反应体系中需加入TaqDNA 聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用，C 正确；
D、扩增DNA 片段的过程中，第n 次循环共需要引物[（2n+1-2）-（2n-2）]=2n 个，D 错误。
6．光定量PCR 技术是在常规PCR 的基础上，加入与模板DNA 某条链互补的荧光探针（一类两端经过特
殊基团修饰的单链DNA 片段），当子链延伸至探针处时DNA 聚合酶会水解掉探针一端并生成荧光分子，
使荧光监测系统接收到荧光信号，即DNA 每扩增一次，就有一个荧光分子生成，原理如图所示。下列有
关叙述正确的是（ ）
A．该项技术可用来直接检测样本中新冠病毒核酸的含量
B．1 个双链DNA 分子经过3 轮循环一共会生成8 个荧光分子
C．1 个双链DNA 分子经过5 轮循环一共需要消耗15 对引物
D．该PCR 技术中DNA 聚合酶既催化形成磷酸二酯键，又催化断裂磷酸二酯键
【答案】D
【详解】A、利用荧光定量PCR 技术可以进行DNA 的含量测定，模板DNA 越多，荧光信号越强，而新冠病毒
的核酸为 RNA，无法直接用该技术检测，A 错误；
B、荧光探针只能跟模板DNA 的某条链互补配对，DNA 分子每扩增一次，就有一个荧光分子生成，3 轮循环
后得到8 个DNA 分子，即扩增形成了7 个新DNA 分子，一共会生成1+2+4=7 个荧光分子，B 错误；
C、1 个双链DNA 分子经过5 轮循环一共会形成 32 个 DNA 分子，即形成64 条链，其中62 条链都是新合成
的，一共需要消耗31 对引物，C 错误；
D、子链延伸时DNA 聚合酶可在子链的3′端不断添加脱氧核苷酸，从而形成磷酸二酯键，当子链延伸至探
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针处时 DNA 聚合酶可以利用 5′-3′外切酶活性水解DNA 单链探针的一端，使其有关基团出现荧光，D 对。
7．数字PCR 技术是一种核酸分子绝对定量技术，其原理如图所示。下列有关叙述不正确的是（ ）
A．应根据目的基因的两端已知序列设计两种引物
B．PCR 每一循环包括变性、复性和延伸三个过程
C．PCR 结束后有靶分子的反应单位能检测出荧光
D．每个反应单位中都需要加入解旋酶和耐高温DNA 聚合酶
【答案】D
【详解】A、由于 DNA 聚合酶只能从3'端延伸 DNA 链，因此要用两种引物才能确保 DNA 两条链同时被扩
增，A 正确；
B、PCR 技术中的每个循环由变性退火（复性）、延伸三个基本反应步骤构成，B 正确；
C、荧光的出现是荧光探针水解导致的，荧光探针将首先与模板 DNA 的相应区段结合（靶分子），随着
DNA 复制延伸至荧光探针部位，导致荧光探针的水解进而产生荧光，显然每个反应单位有无荧光取决于是
否含有靶分子，C 正确；
D、 PCR 技术通过高温解旋，不需要解旋酶，所以每个反应单位中都需要加入耐高温 DNA 聚合酶，D 错误。
B 组(选择题为不定项)
1．通过引物设计，运用PCR 技术可以实现目的基因的定点诱变，如图为基因工程中获取突变基因的过程，
其中引物1 序列中含有一个碱基T 不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体
系中引物1 和引物2 分别设计增加限制酶a 和限制酶b 的识别位点。有关叙述错误的是（ ）
A．限制酶a 和限制酶b 的识别位点分别加在引物1 和引物2 的5’端
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B．PCR 反应体系需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA 聚合酶、Ca2+等
C．第2 轮PCR 中，引物1 与图中②结合形成两条链等长的突变基因
D．在第3 轮PCR 结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA 占1/4
【答案】BC
【详解】A、DNA 的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的（从引物的3'端延伸），据此可知，图中限制
酶a 和限制酶b 的识别位点分别加在引物1 和引物2 的5’端，A 正确；
B、PCR 反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA 聚合酶和扩增缓冲液（含Mg2+）等物质，B 错误；
C、第2 轮PCR 中，引物1 与图中②结合形成两条链不等长的突变基因，因为图中②是由引物2 开始直到完
整的DNA 单链，而引物1 与该模板链的复性过程并没有从该模板DNA 单链的一端开始，C 错误；
D、在第3 轮PCR 结束后，会产生23=8 个DNA 分子，其中含突变碱基对且两条链等长的DNA 分子有两个，
其他的DNA 分子均是不等长的，故含突变碱基对且两条链等长的DNA 分子所占的比例为1/4，D 正确。
2．聚合酶链式反应（PCR）是一种体外扩增DNA 片段的技术。某DNA 片段的PCR 反应程序如图所示。
下列叙述错误的是（ ）
A．预变性可促进模板DNA 边解旋边复制
B．退火是让解旋状态模板DNA 恢复双螺旋
C．延伸结束后，新片段中的引物将被切除
D．终延伸可使目的基因的扩增更加充分
【答案】ABC
【详解】A、预变性的目的是破坏DNA 中可能存在的较难破坏的复杂二级结构，使DNA 充分变性，A 错误；
B、退火是让两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合，B 错误；
C、延伸结束后，新片段中不会切除引物，C 错误；
D、终延伸过程是为了让引物完全延伸并让单链产物完全复性形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充
分，D 正确。
3．交错PCR 能实现同源基因的重组（如图，仅示单链）。第一轮延伸15s，获得短产物①②。在第二轮开
始时（95℃）产物①②与原来模板分开，然后（55℃）随机地与不同模板交错结合，延伸15s，合成交错
产物③④。每一轮扩增仅延伸一小段，经过多轮“产物-模板”交替结合、延伸，最终扩增出交错重组基因
产物。相关叙述正确的是（ ）
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A．交错PCR 原理是DNA 半保留复制
B．交错PCR 延伸温度设定为55℃可增加交错次数
C．上一轮交错产物需与模板链严格配对才能继续下一轮扩增
D．若交错循环20 轮，一共产生220 个DNA 分子
【答案】AB
【详解】A、交错PCR 是PCR 技术的延伸，利用了DNA 半保留复制，A 正确；
B、在第二轮开始时（95℃）产物①②与原来模板分开，然后（55℃）随机地与不同模板交错结合，延伸
15s，合成交错产物③④，故延伸温度设定为55℃可增加交错次数，B 正确；
CD、交错延伸PCR 与普通PCR 技术的区别是每轮扩增仅延伸一小段，经过多轮“产物一模板”交替结合、
延伸，最终扩增出交错重组基因片段混合产物。故上一轮交错产物不需与模板链完全配对即可继续下一轮
扩增，交错循环20 轮，也只产生1 个DNA 分子，CD 错误。
4．引物在极大程度上决定了PCR 的成败，下列关于引物的说法正确的有（ ）
A．PCR 和生物体内的DNA 合成都需要引物，PCR 引物一般是单链DNA
B．若引物的CG 碱基含量相对较高，PCR 退火步骤的温度需要适当升高
C．在PCR 的退火步骤，两种引物分别结合在模板链的3’端和5’端
D．若初始有10 个胰岛素基因，PCR 中进行10 轮循环，至少需要20460 个引物分子
【答案】ABD
【详解】A、PCR 和生物体内的DNA 合成都需要引物，体内的DNA 复制引物通常是RNA，PCR 引物一般是单链
DNA，A 正确；
B、G 与C 之间有3 个氢键，稳定性高，若引物的CG 碱基含量相对较高，PCR 退火步骤的温度需要适当升高，
B 正确；
C、在PCR 的退火步骤，两种引物都结合在模板链的3’端，C 错误；
D、若初始有10 个胰岛素基因，PCR 中进行10 轮循环，得到10×210 个=10240 个DNA 分子，共
1024×2=20480 条链，由于初始的20 条链不需要引物，故至少需要20480-20=20460 个引物分子，D 正确。
5．微滴式数字PCR（ddPCR）是一种检测新冠病毒等病原体的手段，原理如图所示，分为样本分散、PCR
扩增、检测三个过程。下列有关叙述正确的是（ ）
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A．新冠病毒样本在进行ddPCR 检测时，需要先进行逆转录处理
B．多孔板中如果某个孔没有核酸分子，就不需要加入引物和Taq 酶
C．检测时只要有一个孔出现阳性结果，就可以说明原样本中有病毒核酸
D．相对于传统手段，ddPCR 更加灵敏，更容易检测出微量病毒，但成本相对较高
【答案】ACD
【详解】A、PCR 是一项体外扩增DNA 分子的技术，新冠病毒的遗传物质是RNA，故新冠病毒样本在进行
ddPCR 检测时，需要先进行逆转录处理得到DNA，A 正确；
B、由于核酸分子无法肉眼观察到，即使某个孔中不含核酸分子也无法得知，故为避免有遗漏，每个多孔
板中都需要加入引物和Taq 酶，最终通过阳性反应进行鉴定，B 错误；
C、阳性结果意味着有核酸分子能与试剂发生碱基互补配对，故检测时只要有一个孔出现阳性结果，就可
以说明原样本中有病毒核酸，C 正确；
D、相对于传统手段，ddPCR 在每个孔中含有少量核酸的条件下即可检测，故更加灵敏，更容易检测出微量
病毒，但成本相对较高，D 正确。
6．下列关于PCR 过程及结果的叙述正确的是（ ）
A．若在酶和引物都正常工作，但是不出现扩增带，其原因可能是核酸模板变性不彻底导致的
B．复性的温度设定与引物有关，延伸时间的设定与扩增片段的长度有关
C．PCR 与细胞内DNA 复制破坏氢键的原理相同
D．理论上推测，第n 轮循环产物中只含有一种引物的DNA 片段所占比例为1/2n-2
【答案】AB
【详解】A、PCR 扩增的过程包括变性-复性-延伸过程，其中变性是在高温条件下将DNA 双链解开，作为模
板，若在酶和引物都正常工作，但是不出现扩增带，其原因可能是核酸模板变性不彻底导致的，A 正确；
B、复性的温度设定与引物有关，当其中G-C 碱基对多时，温度较高，而延伸时间的设定与扩增片段的长度
有关，长度越大，则时间越长，B 正确；
C、PCR 与细胞内DNA 复制破坏氢键的原理不同，其中PCR 通过高温破坏氢键，而细胞内DNA 复制通过解旋
酶破坏氢键，C 错误；
D、DNA 进行半保留复制，每次复制都需要两种引物结合在DNA 的两端，第n 轮循环产物共2n 个DNA 分子，
仅含有其中一种引物的DNA 片段为2 个，故理论上推测，第n 轮循环产物中只含有一种引物的DNA 片段所
占比例为2/2n=1/2n-1，D 错误。
7．宫颈癌的发生与人乳头状瘤病毒（HPV）感染有关，其中HPV16、18、31、45 型是宫颈癌的高危型，
E7 蛋白是HPV16 型重要的抗原标志蛋白。我国研究人员以酿酒酵母菌为表达载体，成功构建表达HPV16
型E7 蛋白的转基因重组全酿酒酵母疫苗。图1 表示拟转入的质粒上某片段及其上的酶切位点分布，图2 表
示各限制酶识别序列和切割位点。
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(1)研究人员首先需要利用PCR 技术从HPV16 型的基因组中获取E7 蛋白基因的DNA 序列，以 为原料
合成子链，扩增6 次需要引物B 个。
(2)为了将获得的E7 蛋白基因准确连接至图1 中的质粒上，需要在引物A 和引物B 的 （填“5′”或
“3'”）端分别添加 限制酶的识别序列。若决定E7 蛋白的mRNA 的碱基序列为5'-AUGAGCTAC…（中
间序列）…CAACGTAGA—3',理论上应设计引物A 的前12 个碱基序列为5' -3'。
(3)控制表达载体大量扩增的组成元件是 ,该结构发挥作用时通常需要的酶是 。
(4)HPV16 型E7 蛋白疫苗注入人体后作为抗原，可以刺激机体的B 淋巴细胞增殖分化成为 。在预防接
种疫苗时通常需要多次注射，但是相邻的两次注射之间需要间隔一定的时期，原因是 。
【答案】(1) 四种游离的脱氧核苷酸（或dNTP） 63
(2) 5' MfeI 和KpnI CAATTGATGAGC
(3) 复制原点 解旋酶和DNA 聚合酶
(4) 记忆B 细胞和浆细胞 若间隔时间太短，上次免疫产生的抗体会与疫苗结合，导致刺激产生的
记忆细胞数量少，免疫效果下降
【详解】（1）DNA 是以4 种脱氧核苷酸为原料合成，利用PCR 技术（原理DNA 复制）从HPV16 型的基因组
中获取E7 蛋白基因的DNA 序列，以4 种脱氧核苷酸为原料合成子链。若一个该目的基因循环扩增6 次，
PCR 技术大量扩增目的基因时，缓冲液中需要加入的引物B 个数计算公式为2n-1，因此扩增6 次需要引物B
有2n-1=26-1=63 个。
（2）引物是从子链的5'端往3'方向延伸，为了能让扩增出的目的基因与表达载体正确连接，则需要在引
物的5'端分别添加相应限制酶的识别序列。由于限制酶EcoR Ⅰ会切割启动子，限制酶BamH Ⅰ会切割终止
子，因此选择的限制酶是MfeI 和KpnI。设计引物A 时其左边需要添加MfeI 识别序列5'-CAATTG-3'，且引
物需要与E7 蛋白的DNA 碱基序列5'-TACTCG-3'互补配对，故设计引物A 的前12 个碱基序列为5'-
CAATTGATGAGC-3'。
（3）复制原点可以保证表达载体（质粒）在受体细胞中能自我复制，因此，控制表达载体大量扩增的组
成元件是复制原点，复制原点的作用是进行目的基因的复制，DNA 复制时需要解旋酶和DNA 聚合酶。
（4）HPV16 型E7 蛋白疫苗作为抗原，可以刺激机体的B 淋巴细胞增殖分化成为记忆B 细胞和浆细胞。若间
隔时间太短，上次免疫产生的抗体会与疫苗结合，导致刺激产生的记忆细胞数量少，免疫效果下降，因此
相邻的两次注射之间需要间隔一定的时期。
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