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专题18 基因工程
(2024 年1 月浙江省)1. 关于生物技术的安全与伦理问题在我国相关法规明令禁止的是（ ）
A. 试管动物的培育
B. 转基因食品的生产
C. 治疗性克隆的研究
D. 生物武器的发展和生产
【答案】D
【解析】
【分析】1、我国政府一再重申 四不原则:不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。
2、2010 年，在第65 届联合国大会上，我国政府重申支持《禁止生物武器公约》的宗旨和目标，全面、严
格履行公约义务，支持不断加强公约的约束力，并主张全面禁止和彻底销毁生物武器等各类大规模杀伤性
武器。
【详解】A、试管动物的培育属于胚胎工程，没有禁止，A 正确；
B、我过目前不反对转基因的食品的生产，B 正确；
C、中国政府禁止生殖性克隆，支持治疗性克隆，C 正确；
D、生物武器致病能力强、攻击范围广，世界范围内应全面禁止生物武器，D 错误
故选D。
(2024 年山东省）13. 关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（ ）
A. 整个提取过程中可以不使用离心机
B. 研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C. 鉴定过程中DNA 双螺旋结构不发生改变
D. 仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
【答案】A
【解析】
【分析】DNA 的粗提取与鉴定的实验原理是： ①DNA 的溶解性，DNA 和蛋白质等其他成分在不同 浓度的
氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可 以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA 溶解或析出， 从而达
到分离的目的; ②DNA 不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白
质和DNA 进一步分离; ③在沸水浴的条件下DNA 遇二苯胺会呈现蓝色。
【详解】A、在DNA 的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分
钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A 正确；
B、研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA 在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B 错误；
C、鉴定过程中用沸水浴加热，DNA 双螺旋结构会发生改变，C 错误；
D、加入二苯胺试剂后沸水浴处理
时间要在5 分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察
到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D 错误。
1
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故选A。
(2024 年山东省）25. 研究发现基因L 能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术
编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI 切点处插入大豆基因L 的向导DNA 序列，
将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、
目标基因L 部分序列及相关结果等如图所示。
（1）用PCR 技术从大豆基因组DNA 中扩增目标基因L 时，所用的引物越短，引物特异性越______（填
“高”或“低”）。限制酶在切开DNA 双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI 酶切大豆基
因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有______种。载体信息如图甲所示，经BsaI 酶切后，载体上保
留的黏性末端序列应为5'-______-3'和5'-______-3'。
（2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素______筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为
了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA 为模板，通过PCR 扩增目标基因L，部分序列信息及
可选用的酶切位点如图乙所示，PCR 产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是
______，其中纯合的突变植株是______（填序号）。
（3）实验中获得1 株基因L 成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1 条
染色体有T-DNA 插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占
比例为______，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
【答案】（1） ①. 低 ②. 256 ③. GTTT ④. CAAT
（2） ①. 卡那霉素 ②. Sac
③. ④
Ⅰ
（3）1/4
【解析】
【分析】1、基因工程的基本操作程序包括目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导
2
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入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
2、PCR 是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的基
因的核苷酸序列进行大量复制的技术，利用PCR 可以快速的获取和扩增目的基因。
【小问1 详解】
引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR 的引物长度通常为20~30 个
核苷酸。由此可知，在利用PCR 技术从大豆基因组DNA 中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特
异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA 双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI 酶切
大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaI 切
割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256 种排列顺序，故答案应为 256。根据图甲所示的载
体信息，经BsaI 酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-GTTT-3'和5'-CAAT-3'。
【小问2 详解】
根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通
过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L 的目标序列跟突变序列之间
的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意
可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA 为模板，通过PCR 扩增目标基因L，并对PCR 产
物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制
酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现
两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。
【小问3 详解】
根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l 成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检
测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA 插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA 片段上，因
此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对
抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，
纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种
选育。
（2024 年高考全国甲卷）12. 某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
（1）该同学利用PCR 扩增目的基因。PCR 的每次循环包括变性、复性、延伸3 个阶段，其中DNA 双链打
开成为单链的阶段是________________，引物与模板DNA 链碱基之间的化学键是________。
（2）质粒载体上有限制酶a、b、c 的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a
单酶切相比，用酶a 和酶b 双酶切的优点体现在________（答出两点即可）；使用酶c 单酶切构建重组质
粒时宜选用的连接酶是________。
（3）将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是________；若
3
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要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是________________。
（4）蛋白E 基因中的一段DNA 编码序列（与模板链互补）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG
开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G 缺失，则突变后相应肽链的序列是________________________。
氨基酸
密码子
赖氨酸
AAG
精氨酸
AGA
丝氨酸
AGC
脯氨酸
CCA
CCC
亮氨酸
CUG
甘氨酸
GGC
GGG
终止
UGA
【答案】（1） ①. 变性 ②. 氢键
（2） ①. 避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化 ②. T4DNA 连接酶
（3） ①. 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态 ②. 利用DNA 分子杂交技术，将
大肠杆菌的基因组DNA 提取出来，在含有目的基因的DNA 片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探
针，使探针与基因组DNA 杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
（4）甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸
【解析】
【分析】1、基因工程基本工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA 连接酶、运载体。
2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因
导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。
【小问1 详解】
PCR 的每次循环包括变性、复性、延伸3 个阶段，其中DNA 双链打开成为单链的阶段是变性，引物与模板
DNA 链碱基之间的化学键是氢键。
【小问2 详解】
构建重组质粒时，与单一酶酶切相比，采用的双酶切方法，可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目
的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化。酶c 单酶切后形成平末端，需用T4DNA 连接酶连
接。
【小问3 详解】
4
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大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子
的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，可利用DNA 分子杂交
技术，将大肠杆菌的基因组DNA 提取出来，在含有目的基因的DNA 片段上用放射性同位素等作标记，以
此作为探针，使探针与基因组DNA 杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
【小问4 详解】
蛋白E 基因中的一段DNA 编码序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码链与模板链互补，模板链与mRNA 互
补，因此mRNA 上的序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA，若第一个核苷酸G 缺失，则mRNA 上的序列变为
GGCCCAAGCUGAGAUGA，肽链序列是甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸。
（2024 年安徽省）14. 下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A. 实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA 提取的效率会降低
B. 利用DNA 和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C. DNA 在不同浓度NaC1 溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA 粗提物
D. 将溶解的DNA 粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
【答案】D
【解析】
【分析】DNA 粗提取和鉴定的原理：
（1）DNA 的溶解性：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同；DNA 不溶于酒精溶液，
但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性。
（2）DNA 的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、研磨液有利于DNA 的溶解，换为蒸馏水，DNA 提取的效率会降低，A 正确；
B、DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B 正确；
C、DNA 在NaCl 溶液中的溶解度随着NaCl 浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl 溶液对DNA 进行
粗提取，C 正确；
D、在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D 错误。
故选D。
（2024 年广东省）21. 驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能
优异的生物材料，BC 膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，
将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC 膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造
及印染工艺升级提供了新思路（图一）。
5
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回答下列问题：
（1）研究者优化了培养基
_______（答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可
在气液界面处获得BC 菌膜（菌体和 BC 膜的复合物）。
（2）研究者利用T7 噬菌体来源的RNA 聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光
调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子
PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP 识别）。为实现蓝光控制染色，
启动子①②及③依次为________，理由是___________。
（3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用
为________________________（答两点）。
（4）根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC 菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现
只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_____。
（5）有企业希望生产其他颜色图案的BC 膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路______。
【答案】（1）碳源、氮源
（2） ①. PT7、PBAD 和PBAD ②. 基因2 和3 正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1
表达
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（3）抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株
（4）该处细胞中T7RNAP 激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素
（5）将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核
心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：
根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和
花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法
是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。
【小问1 详解】
培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等
营养条件，并控制环境条件。
【小问2 详解】
题图二a 分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N 端-nMag 与T7RNAP C 端结合，导致无活性的T7RNAP 变成有活
性的T7RNAP，结合图一，蓝光处理后，RNA 聚合酶（T7RNAP）识别启动子①使基因1 转录获得相应的
mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见
基因2 和3 正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1 表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制
染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD 和PBAD。
【小问3 详解】
光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，抗生素具有抑
制杂菌；去除丢失质粒的菌株的作用。
【小问4 详解】
由小问2 分析可知，细胞中T7RNAP 激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC 菌膜并
继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。
【小问5 详解】
由小问2 分析可知，题干信息的设计思路最终BC 膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC 膜，则需要
将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)。
（2024 年吉林省）7. 关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA 片段的大小
B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA 分子的具体位置
C. 在同一电场作用下，DNA 片段越长，向负极迁移速率越快
D. 琼脂糖凝胶中的DNA 分子可在紫光灯下被检测出来
【答案】A
【解析】
【分析】琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物的原理主要基于DNA 分子在电场作用下的迁移行为以及琼脂糖凝胶
的特性。
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【详解】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA 分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根
据所需分离的DNA 片段大小来选择的。对于较大的DNA 片段，比如基因组DNA 或质粒DNA，通常选择较
低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA 片段，比如PCR 产物或酶
切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A 正确；
B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝
胶2/3 处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B 错误；
C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA 片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，
DNA 片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA 片段越长，迁移速率越慢，C 错误；
D、琼脂糖凝胶中的DNA 分子需染色后，才可在波长为300nm 的紫外灯下被检测出来，D 错误。
故选A。
（2024 年吉林省）25. 将天然Ti 质粒改造成含有Vir 基因的辅助质粒（辅助T-DNA 转移）和不含有Vir
基因、含有T-DNA 的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提
高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1-F3，R1-R3 表示引物；T-DNA-LB 表示左边界；T-DNA-RB 表示右边界；Ori 表示复制原点；KanR
表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B 抗性基因。
（1）从苏云金杆菌提取DNA 时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预
冷酒精，其目的是______。
（2）本操作中获取目的基因的方法是______和______。
（3）穿梭质粒中p35s 为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s 启动子，其目的可
能是______。
（4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转
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化的棉花愈伤组织。
（5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA 作模板，进行PCR，应选用的引物是
______和______。
（6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B. 将苏云金杆菌Bt 基因导入棉花细胞中表达
C. 将1-1362 基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D. 用1-1362 合成基因序列和1363-1848 天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
【答案】（1） ①. 水解DNA 酶，防止DNA 被分解 ②. 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的
DNA
（2） ①. PCR 技术扩增 ②. 人工合成
（3） ①. RNA 聚合酶识别并结合的部位 ②. 调控目的基因的表达
（4）HygBR （5） ①. F3 ②. R2 （6）D
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【小问1 详解】
从苏云金杆菌提取DNA 时，需加入蛋白酶，其作用是水解DNA 酶，防止DNA 被分解。提取过程中加入体
积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。
【小问2 详解】
本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR 技术扩增。
【小问3 详解】
穿梭质粒中p35s 为启动子，其作用是RNA 聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s
启动子，其目的可能是调控目的基因的表达。
【小问4 详解】
结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR 和HygBR 两个标记基因的位置，用HygBR 基因
对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
【小问5 详解】
为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA 作模板，进行PCR，应选用的引物是F3 和
R2。
【小问6 详解】
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造
现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，本研究采用的部分生物技术属于蛋
白质工程，理由是用1-1362 合成基因序列和1363-1848 天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，将1-1362 基因
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序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列，未产生新的蛋白质，不属于蛋白质工程。
ABC 不符合题意，D 符合题意。
故选D。
（2024 年安徽省）20. 丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合
成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。
（1）扩增X 基因时，PCR 反应中需要使用Taq DNA 聚合酶，原因是_________________。
（2）使用BamH I 和 SalI 限制酶处理质粒和X 基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如
图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是___________________________。
、
（3）研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳
源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的____________________，引起发酵液pH 值下降。兴趣小
组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同
浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮源浓
度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置______（填数字）组实验（重复组不计算在内）。
（4）大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是__________________。
（5）发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经_____________________，最终获得发酵产品。
【答案】（1）在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失
活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温,在高温条件下依然具有活性
（2）在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养
基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成
（3） ①. 乳酸或有机酸 ②. 9
（4）大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量
（5）提取、分离、纯化
【解析】
【分析】PCR 反应过程:变性→复性→延伸。变性:当温度上升到90℃以上时，双链DNA 解聚为单链，复性:
温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合，延伸:72℃左右时，Taq 酶有最大
活性，可使DNA 新链由5'端向3'端延伸。
【小问1 详解】
10
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在 PCR 反应中，变性的温度需要90℃以上，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA 聚合酶在高温
下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X 基因时，PCR 反
应中需要使用Taq DNA 聚合酶。
【小问2 详解】
据图可知，使用BamH I 和 Sal I 限制酶处理质粒和X 基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，
因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因菌株，因此实验思
路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养
基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成。
【小问3 详解】
碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基
本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相对较慢。
这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发酵液的pH
值下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3 种，酵母粉浓度也有3 种，因此理论
上应设置3×3=9 组实验。
【小问4 详解】
大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密
度发酵时，温度会升高。
【小问5 详解】
发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等方面，
因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离、纯化，最终获得发酵产品。
(2024 年1 月浙江省)22. 锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转
运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2 种锌转运蛋白M 和N 与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N
基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题：
（1）锌转运蛋白基因M、N 克隆。以该植物______为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序
列信息设计引物进行PCR 扩增，PCR 每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内
______的作用效果。PCR 产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA 分子因为含______而带负电荷，凝胶点样孔端应靠
近电泳槽负极接口；当2 个PCR 产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2 个条带之间的距离会
______。回收DNA 片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。
（2）重组表达载体构建。分别将含M、N 基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利
用______连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR 快速验证重组转化是否成功。此反应可以用
大肠杆菌悬液当模板的原因是______。
（3）酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行______培养，活化后接种至
液体培养基，采用______以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N 基因在受体细胞中的
表达水平，无显著差异。
（4）转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N 基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将
菌液用______法逐级稀释至OD600为0.06、0.006 和0.0006，然后各取10μL 菌液用涂布器均匀涂布在固体
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培养基上，培养2 天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为______。由实验结果可初步推测：转运蛋白M
和N 中，转运Zn2+能力更强的是______，依据是______。
注：OD600 为波长600nm 下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M 或N 基因的表达载
体。
【答案】（1） ①. 根 ②. 解旋酶 ③. 磷酸基团 ④. 变长
（2） ①. DNA 连接酶 ②. 热变性使大肠杆菌内的DNA 外溢
（3） ①. 划线分离 ②. 振荡培养
（4） ①. 梯度稀释 ②. 锌吸收缺陷型酵母+空载体 ③. N ④. 转入N 基因的这组酵母菌
数量数量多
【解析】
【分析】由图中光谱吸收值可知，锌吸收缺陷型酵母+N 基因表达载体组吸收值与野生型酵母+空载体组相
近，转入N 基因的这组酵母菌数量数量多，说明N 转运Zn2+能力更强。
【小问1 详解】
由题意可知，锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提
取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。热变性处理的目的是使DNA 解螺旋，相当于生物体内解旋酶的效果。
DNA 分子因为含有磷酸基团而带负电荷，所以其点样孔端应靠近电泳槽负极接口。随着时间的推移，不同
分子量的DNA 分子速度不同，时间越长，距离差越大。
【小问2 详解】
内切酶处理后的质粒和目的基因，用DNA 连接酶进行连接。由于RCR 过程中热变性使大肠杆菌内的DNA
外溢，所以可用大肠杆菌悬液当模板，利用PCR 快速验证重组转化是否成功。
【小问3 详解】
冻存酵母菌可直接在固体培养基上涂布或平板划线接种后进行培养，进行活化，然后转至液体培养基增殖，
培养过程中进行震荡，有利于增加培养液的溶氧量和使酵母菌和培养液充分接触，从而快速增殖。
【小问4 详解】
由题意可知，菌液稀释后OD600 为0.06、0.006 和0.0006，说明其进行10 指数的梯度稀释。由图可知，锌
吸收缺陷型酵母+空载体组不会吸收锌，为阴性对照。由图中光谱吸收值可知，转入N 基因的这组酵母菌
数量数量多，说明N 转运Zn2+能力更强。
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(2024 年1 月浙江省)23. 小鼠毛囊中表达F 蛋白。为研究F 蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技
术获得了F 基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f 小鼠，突变基因用f 表示。f 小鼠皮毛比野生型小鼠长
50%，表现出毛绒绒的样子，其它表型正常。（注：野生型基因用++表示；f 杂合子基因型用+f 表示）
回答下列问题：
（1）F 基因敲除方案如图甲。在F 基因的编码区插入了一个DNA 片段P，引起F 基因产生______，导致
mRNA 提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了______而丧失活性。要达到此目的，还可以对
该基因的特定碱基进行______和______。
（2）从野生型、f 杂合子和f 小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用
DNA 探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f 小鼠和f 杂合子对应的DNA 片段分别位于
第______泳道和第______泳道。
（3）g 小鼠是长毛隐性突变体（gg），表型与f 小鼠相同。f 基因和g 基因位于同一条常染色体上。f 杂合
子小鼠与g 小鼠杂交，若杂交结果是______，则g 和f 是非等位基因；若杂交结果是______，则g 和f 是等
位基因。（注：不考虑交叉互换；野生型基因用++表示；g 杂合子基因型用+g 表示）
（4）确定g 和f 为等位基因后，为进一步鉴定g 基因，分别提取野生型（++）、g 杂合子（+g）和g 小鼠
（gg）的mRNA，反转录为cDNA 后用（2）小题同样的DNA 探针和方法检测，结果如图丙。g 小鼠泳道
没有条带的原因是______。组织学检查发现野生型和g 杂合子表达F 蛋白，g 小鼠不表达F 蛋白，因此推
测F 蛋白具有的作用______。
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【答案】（1） ①. 编码序列错位 ②. 氨基酸序列 ③. 替换 ④. 缺失
（2） ①. 3 ②. 2
（3） ①. 子代全为野生型 ②. 野生型：突变型=1：1
（4） ①. 基因突变丢失了启动子，导致无法转录出 mRNA；反转录没有产物，检测不出结果 ②.
抑制毛发生长
【解析】
【分析】基因分离定律实质：在杂合子细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性；
当细胞进行减数分裂，等位基因会随着同源染色体的分开而分离，分别进入两个配子当中，独立地随配子
遗传给后代。
【小问1 详解】
依据题意，在F 基因的编码区插入了一个DNA 片段P，引起F 基因产生编码序列错位，从而导致mRNA 提
前出现终止密码子，使得合成的蛋白质中氨基酸序列变短，蛋白质结构发生改变，结构决定功能，导致合
成的蛋白质丧失活性。该基因突变是插入一个DNA 片段引起的，除此之外，还可以缺失或者替换基因中的
碱基，从而导致基因突变。
【小问2 详解】
从图中看出，野生型基因和f 基因都含有2 个限制酶HindⅢ的识别序列，但f 基因中含有P 片段，因此限
制酶HindⅢ切割野生型基因和f 基因后，野生型基因切出来能与探针结合的片段较短，f 基因切出来能与
探针结合的片段较长，DNA 分子越长，分子质量越大，在电泳时迁移速度越慢，因此推测第1 泳道中只有
野生型基因，第2 泳道中既有野生型基因，又有f 基因，第3 泳道中只有f 基因，因此f 小鼠和f 杂合子对
应的DNA 片段分别位于第3 泳道和第2 泳道。
【小问3 详解】
据题意可知，野生型基因用++表示，g 小鼠是长毛隐性突变体，基因型用gg 表示，f 杂合子小鼠基因型用+f
表示，f 基因和g 基因位于同一条常染色体上，如果g 和f 是非等位基因，f 杂合子小鼠（+f/++）与g 小鼠
（++/gg）杂交，后代为++/+g 和+f/+g，全是野生型；如果g 和f 是等位基因，f 杂合子小鼠（+f）与g 小鼠
（gg）杂交，后代为+g：fg=1：1，即野生型与突变型比例为1：1。
【小问4 详解】
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据图可知，野生型基因突变成g 基因以后，启动子随着一部分DNA 片段丢失，无法转录出 mRNA，也无法
形成cDNA，PCR 时缺少模板，反转录没有产物，导致最终无结果，因此g 小鼠泳道没有条带。g 小鼠表型
与f 小鼠相同，表现出毛绒绒的样子，野生型和g 杂合子表达F 蛋白，g 小鼠不表达F 蛋白，即没有F 蛋白，
表现出长毛，说明F 蛋白在毛发生长中起抑制作用。
(河南省2024)11. 某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维
素的菌株（B2）。该小组在含有N 基因的质粒中插入B1基因组的M1 与M2 片段；再经限制酶切割获得含
N 基因的片段甲，片段甲两端分别为M1 与M2；利用CRISPR/Cas9 基因组编辑技术将片段甲插入B1的基
因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示
引物5'→3'方向。回答下列问题。
（1）限制酶切割的化学键是________。为保证N 基因能在菌株B2 中表达，在构建片段甲时，应将M1 与
M2 片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________。
（2）CRISPR/Cas9 技术可以切割细菌B1 基因组中与向导RNA 结合的DNA。向导RNA 与B1基因组DNA
互补配对可以形成的碱基对有G－C 和________。
（3）用引物P1 和P2 进行PCR 可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________；若用该模板
与引物P3 和P4 进行PCR，实验结果是________。
（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是________（答出2 点即可）。
【答案】（1） ①. 磷酸二酯键 ②. 不破坏N 基因，且能保证N 基因正常表达
（2）C-G、A-T、U-A
（3） ①. N 基因的两条链 ②. 不能扩增出目的基因
（4）不污染环境、增加土壤养分
【解析】
【分析】PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷酸为
原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子链的
5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要原因是
DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。
PCR 反应过程是：变性→复性→延伸。
【小问1 详解】
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限制酶切割
化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时，应将M1 与M2 片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和
Ⅳ酶切位点之间，不破坏N 基因，且能保证N 基因正常发表达。
【小问2 详解】
RNA 的碱基组成有A、U、G、C，DNA 的碱基组成为A、T、G、C，向导RNA 与B1 基因组DNA 互补配对可
以形成的碱基对有G-C 和C-G、A-T、U-A。
【小问3 详解】
用引物P1 和P2 进行PCR 可扩增N 基因，验证片段甲插入了细菌B1 基因组，所用的模板是N 基因的两条链；
用该模板与引物P3 和P4 进行PCR，因为P3 不能与N 基因模板链结合，实验结果是不能扩增出DNA 片段。
【小问4 详解】
与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是不污染环境、增加土壤养分。
(甘肃省2024)21. 源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，
某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协
同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
（1）过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是______。
高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了______。
（2）过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是______。
（3）过程⑤在基因工程中称为______，该过程需要的主要酶有______。
（4）过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有______。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种______的生理
状态。
（5）课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异
的原因是______（答出两点）。
生
物
质
原
料
降解率（%）
协同系数
酶
A
酶
B
酶
C
混1
混2
混1
混2
小
7.08
6 03
8.19
8 61
26.98
74.33
114.64
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麦
秸
秆
玉
米
秸
秆
2.62
1.48
3.76
3.92
9.88
24.98
77.02
玉
米
芯
0.62
0.48
0.86
0.98
6.79
1.82
11.34
注：混1 和混2 表示三种酶的混合物
【答案】（1） ①. 只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖 ②. 菌落产生的纤维素酶的
活性和量有关
（2）耐高温的DNA 聚合酶
（3） ①. 基因表达载体的构建 ②. 限制酶、DNA 连接酶
（4） ①. 繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等 ②. 能
吸收周围环境中DNA 分子
（5）降解时的温度不同、降解时的pH 不同
【解析】
【分析】据图可知，①②是利用选择培养基筛选出高产纤维素酶菌株X，③是提取菌株X 基因组，④为基
因工程操作程序中“目的基因的筛选和获取”，⑤为“基因表达载体的构建”，⑥为“将目的基因导入受
体细胞”，⑦为从培养体系中分离得到重组酶。
【小问1 详解】
选择培养基是指一类根据特定微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理而设计的培养基。具有
只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的
选择培养基中，只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖。
刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶
分解时，刚果红与纤维素的复合物无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透
明圈的大小直接反映了纤维素分解菌分解纤维素的能力。透明圈越大，说明纤维素分解菌分解纤维素的能
力越强，即菌落产生的纤维素酶的活性强、量多。
【小问2 详解】
扩增目的基因片段在PCR 仪中进行，因此需要耐高温的DNA 聚合酶。
【小问3 详解】
根据图示中酶基因与质粒载体经过过程⑤构成重组质粒，推导出过程⑤为基因表达载体的构建，该过程需
要限制酶和DNA 连接酶。
【小问4 详解】
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大肠杆菌作为受体细胞的优点繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操
作等。
先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态。将重
组质粒加于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA 分子，完成转化过程。
【小问5 详解】
不同酶的最适温度、最适pH 不同，当温度和pH 改变时，酶促反应速率也会受到影响。
2024 年黑龙江省普通高等学校招生选择性考试临考预测押题密卷-生物学 A 卷1. 吲哚胺-2，3-
二氧酶（IDO）是一种含铁血红素单体蛋白，可催化色氨酸分解代谢，可能与免疫排斥反应、病原体感染、
中枢神经系统疾病（如抑郁）等有关。为研究IDO 表达的相关特性，研究者构建了一个能融合表达IDO 和
绿色荧光蛋白（EGFP）的质粒IDO-EGFP-C1。回答下列问题：
（1）利用PCR 技术获取IDOcDNA，过程如图1 所示，图中①~③表示步骤，其中影响扩增特异性的步骤
是________。由图可知，扩增温度设置存在差异，其中与酶无关的步骤是______。
（2）构建融合IDO 和EGFP 的重组质粒IDO-EGFP-C1（图2 中KpnI、NheI、AgeI、BglⅡ均为限制酶且指
向其识别序列，KanR为卡那霉素抗性基因，ori 为复制原点，233bp 的片段为IDO 基因的特有序列）。已知
IDOcDNA 的长度为1200bp，而质粒EGFP-C1 的长度为4700bp，其上EGFP 的长度为780bp。图2 为设计
的实验流程（箭头表示正确的插入方向），研究者甲认为用引物a 和引物b 进行PCR 扩增，再将产物用电
泳鉴定，若产生______bp 的DNA 片段即可证明实验成功；但研究者乙认为该实验流程需修正，其最简单
的方法是____________。
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（3）重组质粒IDO-EGFP-C1 的测序。研究者乙根据其想法实施了实验并获得预期的产物，通常还需进一
步通过基因测序对结果进行确认，原因是_____________。
（4）转染结果鉴定。转染IDO-EGFP-C1 质粒的TC-1 细胞中可见荧光蛋白表达，该过程需在培养基中添
加______以便筛选转染成功的细胞，然后提取被转染的TC-1 细胞的基因组DNA，用引物a 和引物c 对其
进行扩增，结果如图3，则图中1 为含______的TC-1 细胞，2、3 为______。
【答案】（1） ①. ② ②. ①②
（2） ①. 1013 ②. 在IDOcDNA 左端插入KpnI 识别序列，右端插入NheI（或AgeI、BglⅡ）的识别
序列，以防止IDOcDNA 反向插入质粒
（3）电泳仅能检测DNA 片段的大小，无法确定DNA 分子的碱基序列是否正确
（4） ①. 卡那霉素 ②. 重组质粒IDO-EGFP-C1 ③. 含EGFP-C1 质粒（或空白质粒）的TC-1 细
胞
【解析】
【分析】1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将
目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
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2、PCR 技术扩增目的基因：
（1）原理：DNA 双链复制。
（2）过程：第一步：变性，加热至90~95℃使DNA 解旋；第二步：复性，降温到55~60℃，使引物结合到
互补DNA 模板链上；第三步：延伸，加热至70~75℃，热稳定的DNA 聚合酶从引物3'端起始互补链的合成。
【小问1 详解】
分析图1 可知，图中①~③表示步骤分别为变性、复性和延伸，其中影响扩增特异性的步骤是步骤②复性，
步骤②是引物与特异性扩增的DNA 模板链结合的过程，由图可知，扩增温度设置存在差异，其中步骤①变
性，加热至90~95℃使DNA 解旋，与酶无关，步骤②复性是引物与特异性扩增的DNA 模板链结合的过程，
与酶无关。
【小问2 详解】
根据题意和图2 可知，已知IDOcDNA 的长度为1200bp，而质粒EGFP-C1 的长度为4700bp，其上EGPP 的长
度为780bp。研究者甲认为用引物a 和引物b 进行PCR 扩增，再将产物用电泳鉴定，那么引物a 和引物b 进
行PCR 扩增后得到的片段有IDOcDNA 中长度为233bp 片段和EGFP 的长度为780bp 的片段，因此产物用电
泳鉴定后，若产生233+780=1013bp 的DNA 片段即可证明实验成功；但是该实验流程中插入的IDOcDNA 两
端均为限制酶KpnI 切割的序列，容易导致IDOcDNA 反向插入，因此实验流程修正的方法为：在IDOcDNA
左端插入KpnI 识别序列，根据质粒EGFP-C1 上限制酶的识别序列，在IDOcDNA 右端插入NheI（或AgeI、
BglⅡ）的识别序列，这样IDOcDNA 序列左右两端限制酶识别序列不同，可防止IDOcDNA 反向插入质粒。
【小问3 详解】
根据题意，重组质粒IDO-EGFP-C1 的测序。根据题意，用电泳鉴定的结果仅能检测DNA 片段的大小，无法
确定DNA 分子的碱基序列是否正确，因此通常还需进一步通过基因测序对结果进行确认。
【小问4 详解】
根据图2 可知，IDO-EGFP-C1 质粒上存在KanR 为卡那霉素抗性基因，将IDO-EGFP-C1 质粒导入TC-1 细胞中，
可以利用标记基因筛选转染成功的细胞，即在培养基中添加卡那霉素以便筛选转染成功的细胞。然后提取
被转染的TC-1 细胞的基因组DNA，用引物a 和引物c 对其进行扩增，结果如图3，引物a 和引物c 扩增的产
物为IDOcDNA 中长度为233bp 片段，则图3 中1 具有233bp 的片段，233bp 的片段为IDO 基因的特有序列，
说明1 为导入重组质粒IDO-EGFP-C1 的TC-1 细胞，图3 中2、3 不含有IDOcDNA 中长度为233bp 片段，说明
导入TC-1 细胞的为含EGFP-C1 质粒或空白质粒。
2024 届黑龙江省齐齐哈尔市三模生物试题2. 大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA 就会缠
绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限
制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述，正确的是（ ）
A. DNA 溶于酒精，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA
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B. 电泳鉴定DNA 利用了DNA 在电场中会向着它所带电荷相同的电极移动的原理
C. 根据电泳结果，质粒上没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点
D. 用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果
【答案】D
【解析】
【分析】DNA 粗提取和鉴定的原理：1、DNA 的溶解性：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl 溶液中
溶解度不同；DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性。
2、DNA 的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色。DNA 分子在琼脂糖凝胶电泳中的迁移
速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小、和构象等有关。电泳技术可以根据相对分子质量大小把不同的DNA
分开，双链DNA 分子片段长度越大，在琼脂糖凝胶电泳中移动速率越慢。
【详解】A、DNA 不溶于酒精，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA，A 错误；
B、DNA 带负电，DNA 在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理，B 错误；
C、因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个切割
位点，也可能没有切割位点，C 错误；
D、用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒时，电泳结果中的这些条带通常需要在紫外线下观察和照射才能显示出来，
因此需要紫外灯照射，D 正确。
故选D。
2024 届黑龙江省齐齐哈尔市三模生物试题3. 科研人员从某热泉的细菌中发现一种α-淀粉酶
（AmyS1）,利用蛋白质工程对其进行改造，获得了具有更高热稳定性和催化效率的重组耐高温α-淀粉酶
（AmyS2）。获取AmyS2 基因后，构建基因表达载体的过程如图所示。该过程中，将目的基因与原始质
粒A 构建成质粒B,将质粒B 与信号肽（一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链）基因构建成质粒
C。下列分析正确的是（ ）
A. 对淀粉酶结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成
B. 生产AmyS2 是从预期AmyS2 功能出发设计其氨基酸序列
C. 可以从导入质粒C 的工程菌的培养液中提取获得AmyS2
D. 构建质粒B 和C,选择的限制酶分别是NdeI 和EcoRI、BamHI 和Eco52 I
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【答案】ABC
【解析】
【分析】1、蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的
氨基酸列→找到相对应的核糖核苷酸序列（RNA)→找到相对应的脱氧核糖核苷酸序列（DNA)。
2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受
体细胞→目的基因的检测与表达。
【详解】A、对蛋白质结构进行改造最终要通过改造或合成基因来完成，A 正确；
B、α—淀粉酶（AmyS1）的化学本质是蛋白质，蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设
计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核糖核苷酸序列（基因）或合成
新的基因→获得所需要的蛋白质，正确；
C、将质粒B 与信号肽（一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链）基因构建成质粒C，可以从导入质
粒C 的工程菌的培养液中提取获得AmyS2，C 正确；
D、若用BamH I 酶进行切割，会导致目的基因结构破坏，因此选择Nde I 和EcoR I，既不会破坏目的基因，
也能防止目的基因片段反向连接与质粒自身环化等问题；根据质粒C 的结构以及信号肽基因上的酶切位点
可知，将质粒B 与信号肽基因构建成质粒C，应选择的限制酶是Mlu I 和Eco 52Ⅰ，D 错误。
故选ABC。
2024 届黑龙江省齐齐哈尔市三模生物试题4. 人乳铁蛋白广泛分布于乳汁等外分泌液中，在初乳中含
量较高，对细菌、真菌和病毒等有抑制作用。下图表示利用基因工程技术构建人乳铁蛋白基因重组质粒的
过程（图中Tetr表示四环素抗性基因， Ampr表示氨苄青霉素抗性基因），五种限制酶的识别序列及切割
位点如下表所示。回答下列问题：
限制酶
BamHⅠ
HaeⅢ
BclⅠ
Sau3AⅠ
NotⅠ
识别序列及切割
位点
（1）要将人乳蛋白图插入载体中，若只允许使用一种限制酶，应选择的限制酶是__________。基因工程
技术中通常选择__________种限制酶进行酶切。
（2）人乳铁蛋白基因可利用PCR 技术进行扩增，扩增需要引物__________（在“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ”中选
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择），连续扩增5 次后至少需要引物_________个。
（3）据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒需要再含有____________（填“四环素”或
“氨苄青霉素”）的培养基上进行筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用_________工程
技术获得转基因小牛。
（4）检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用___________技术，若___________，则表明目的基因已翻
译形成蛋白质。
（5）对比大肠杆菌，转基因动物作为生物反应器生产人乳铁蛋白更具有优势，其理由是
________________。
【答案】（1） ①. BamH
②. 2##
Ⅰ
两
（2） ①. Ⅱ、Ⅲ ②. 62
（3） ①. 氨苄青霉素 ②. 胚胎
（4） ①. 抗原-抗体杂交 ②. 检测结果呈阳性
（5）转基因动物细胞具有内质网和高尔基体等细胞器，能够对人乳铁蛋白进行加工，使人乳铁蛋白具有
生物活性
【解析】
【分析】基因表达载体的构建使基因工程的核心步骤，表达载体元件包括启动子、终止子、目的基因、标
记基因和复制原点。
【小问1 详解】
要将人乳蛋白图插入载体中，若只允许使用一种限制酶，根据人乳铁蛋白两端的识别序列可知，BclⅠ和
Sau3AⅠ可以切除相同的黏性末端
，结合质粒上的识别序列可知，只用一种酶且切除相同的黏性末
端，则应选择的限制酶是BamHⅠ。为了避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，基因工程技术中通常
选择2 种限制酶进行酶切，以形成不同的黏性末端。
【小问2 详解】
引物的作用是使耐高温DNA 聚合酶从引物的3'端连接游离的脱氧核苷酸，所以引物5'端应该于模板链的
3'端配对，故引物应选择Ⅱ、Ⅲ，连续扩增5 次后至少需要引物为（25-1）×2=62 个。
【小问3 详解】
据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，需要在含有氨苄青霉素的
培养基上筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用胚胎工程技术获得转基因小牛。
【小问4 详解】
检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用抗原-抗体杂交技术，若检测结果呈阳性，则表明目的基因已翻译
形成蛋白质。
【小问5 详解】
对比大肠杆菌，转基因动物作为生物反应器生产人乳铁蛋白更具有优势，其理由是转基因动物细胞具有内
质网和高尔基体等细胞器，能够对人乳铁蛋白进行加工，使人乳铁蛋白具有生物活性。
2024 届东北三省四市教研联合体高三模拟（二）生物试题5. 中国科学家领衔的国际团队发现，驯
鹿能适应极昼和极夜的环境而不会出现睡眠紊乱的原因是节律调控有关基因PER2 发生突变，利用PCR 技
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术可获取和扩增PER2 基因，下列有关说法错误的是（ ）
A. 研究该基因的表达及功能可为治疗失眠提供方案
B. PCR 反应每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步
C. DNA 聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸
D. 一般采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定 PCR 的产物
【答案】C
【解析】
【分析】PCR 是利用DNA 在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C 左右）时引物与单链
按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA 聚合酶最适反应温度（72°C 左右），DNA 聚合酶沿着磷酸到
五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR 仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温
度，延伸温度之间很好地进行控制。
【详解】A、题意显示，驯鹿能适应极昼和极夜的环境而不会出现睡眠紊乱的原因是节律调控有关基因
PER2 发生突变，因此研究该基因的表达及功能可为治疗失眠提供方案，A 正确；
B、PCR 反应过程中的每一轮循环依次包括变性（高温解旋）、复性（引物结合）、延伸（子链延伸）三
步，B 正确；
C、DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，C 错误；
D、一般采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR 的产物，按相对分子质量大小分离DNA 的凝胶电泳技术，D 正确。
故选C。
2024 届东北三省四市教研联合体高三模拟（二）生物试题6. 我国科研人员通过基因治疗，成功治
愈了全球首例β-地中海贫血症患者。研究人员运用高精准变形式碱基编辑器(tBE)，对患者自体造血干细胞
中的单个碱基进行编辑，以重新激活γ-珠蛋白的表达，最终使患者血红蛋白水平恢复正常，过程如图1 所
示。相较于图2 中基于 CRISPR 技术的β-地贫基因编辑疗法，该方法见效更快、疗效更好，且不引发患者
基因组突变或片段缺失。请回答下列问题。
（1）基因治疗中通常用到AAV(腺病毒)等，AAV 的作用为____________。
（2）据图2 分析CRISPR 技术中gRNA 起____________(填“导向”或“切割”)的作用。相比 CRISPR
技术(切断双链)，tBE 不需要破坏DNA 双链就能对致病的碱基突变进行校正，由此可知tBE 具有
________优点(写出1 点即可)。
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（3）为了检测目的基因是否翻译成γ-珠蛋白，可采用的技术为____________。采用自体造血干细胞编辑
移植的优点为________________________________(写出1 点即可)。
（4）欲验证图1 中基因治疗方法对β-地中海贫血症患者的疗效，请写出大致实验思路。(注：使用的测量
工具无需说明，β-地中海贫血症志愿者、健康志愿者多人)__________________
【答案】（1）作为载体将目的基因导入（受体）细胞
（2） ①. 导向 ②. 高安全性、高特异性；针对单碱基进行编辑，正常不发生错编或误编的情况；
见效更快、疗效更好，且不引发患者基因组突变和片段缺失
（3） ①. 抗原-抗体杂交 ②. 不发生免疫排斥反应，
（4）将生理状态、性别、年龄等相同的β-地中海贫血症志愿者随机均分为甲、乙两组，分别测量二者的
血红蛋白水平后，对甲组采用碱基编码疗法进行治疗，乙组不采用，适宜条件下生活一段时间后，分别再
次测量二者的血红蛋白水平，并与健康志愿者的血红蛋白水平进行比较。
【解析】
【分析】CRISPR/Cas9 基因编辑技术是由一条单链向导RNA 引导核酸内切酶Cas9 到一个特定的基因位点进
行准确切割的技术，通过设计向导RNA 中的识别序列，可人为选择DNA 上的目标位点进行切割。
【小问1 详解】
基因治疗中通常用到AAV(腺病毒)等，该技术中用到转基因技术，腺病毒AAV 作为载体将目的基因导入
（受体）细胞。
【小问2 详解】
图2 中CRISPR 技术中gRNA 起导向的作用，即能通过碱基互补配对原则实现基因中碱基的定点改变。相比
CRISPR 技术(切断双链)，tBE 不需要破坏DNA 双链就能对致病的碱基突变进行校正，由此可知tBE 具有高
安全性、高特异性；针对单碱基进行编辑，正常不发生错编或误编的情况；见效更快、疗效更好，且不引
发患者基因组突变和片段缺失。
【小问3 详解】
为了检测目的基因是否翻译成γ-珠蛋白，由于要检测蛋白质的存在，因而可采用的技术为抗原-抗体杂交技
术。
采用自体造血干细胞编辑移植的优点表现为由于造血干细胞取自患者本身，因而在改造后的造血干细胞移
植后不会发生免疫排斥，因而更安全，治疗成功率高，且不需要在手术后服用免疫抑制剂。
【小问4 详解】
本实验的目的是验证基因治疗方法对β-地中海贫血症患者的疗效，自变量应为是否进行基因治疗，因变量
为血红蛋白的含量，因此实验设计思路为：将生理状态、性别、年龄等相同的β-地中海贫血症志愿者随机
均分为甲乙组，分别测量二者的血红蛋白水平后，对甲组采用碱基编码疗法进行治疗，乙组不采用，适宜
条件下生活一段时间后，分别再次测量二者的血红蛋白水平，并与健康志愿者的血红蛋白水平进行比较。
若甲组体内血红蛋白低含量高于对照组，则表明基因治疗方法对β-地中海贫血症患者的疗效。
（2024 届贵州省黔东南苗族侗族自治州凯里市第一中学黄金二卷三模）7. 胰岛素是治疗人类糖
尿病的特效药，传统生产胰岛素的方法是从动物胰腺中提取。1978 年，我国科学家将人胰岛素基因（S）
导入大肠杆菌细胞中，构建基因工程菌并进行筛选，使大肠杆菌表达重组人胰岛素，这是我国拥有自主知
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识产权的基因工程药物，流程如图所示。为防止目的基因与载体质粒反向连接，选用图中MunI 和NheI 两
种限制酶来切割目的基因和质粒，但INS 基因的两侧无MunI 和NheI 两种限制酶的识别序列及切割位点，
可在PCR 扩增INS 基因时增加MunI 和NheI 两种限制酶的识别序列，以便构建基因表达载体。回答下列问
题：
注：LacZ 基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。
图中限制酶识别序列及切割位点：EcoRI：G↓AATTC、MunI：C↓AATTG、NheI：G↓CTAGC、XhoI：C↓TCGAG
（1）设计引物时需要在引物的________（填“3'”或“5'”）端增加相应限制酶的识别序列。
（2）已知INS 基因编码区首端和末端（其中一条链）的序列为5'-AGCCCTCC…（中间核苷酸序列）…
GAACCAGC-3'，下列可选用的一对引物是________（选填字母序号）。
A. 5'-GAATTCAGCCCTCC-3'
B. 5'-CAATTGAGCCCTCC-3'
C. 5'-GCTAGCGCTGGTTC-3'
D. 5'-CTCGAGGAACCAGC-3'
（3）流程中步骤③将目的基因导入大肠杆菌前，常用_________处理大肠杆菌细胞，以提高转化率。转化
后的大肠杆菌，需要配制培养基进行培养，配制的培养基采用___________法进行灭菌。
（4）在经步骤③处理后的大肠杆菌中进一步分离筛选出导入重组质粒（含目的基因的质粒）的大肠杆菌，
从菌落特征的角度设计一个实验方案进行筛选，要求写出实验思路及预期结果______。
【答案】（1）5′ （2）BC
（3） ①. Ca2+ ②. 湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）
（4）实验思路：将步骤③处理后的大肠杆菌培养在含有氨苄青霉素和X−gal 的牛肉膏蛋白胨培养基中，在
适宜条件下培养一段时间，观察平板上菌落的颜色。预期结果：若菌落呈白色，说明大肠杆菌导入了重组
质粒；若菌落呈蓝色，说明大肠杆菌导入的是未含有目的基因的空质粒。
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选与获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR
技术扩增；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因、复制原点等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不
一样；（4）目的基因的检测与鉴定。
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【小问1 详解】
用PCR 扩增目的基因时，需要加入引物，引物与目的基因模板链的3′端结合，使DNA 聚合酶能够从引物的
3′端开始连接脱氧核苷酸，因此限制酶的识别序列只能添加在引物的5′端。
【小问2 详解】
已知INS 基因的编码区的首段和末端（其中一条链）的序列为5′—AGCCCTCC…（中间核苷酸序列）…
GAACCAGC—3′，则其互补链碱基序列为3′—TCGGGAGG…（中间核苷酸序列）…CTTGGTCG—5′。因为两种
引物结合在模板链的3′端，根据碱基互补配对原则在没有添加识别序列时引物的序列为：5′—AGCCCTCC 和
5′—GCTGGTTC，且两种限制酶识别序列添加在引物的5′端，所以将限制酶MunⅠ的识别序列CAATTG 和限
制酶NheⅠ的识别序列GCTAGC 分别加在原引物的5′端，故可选用的一对引物是B：5′—CAATTGAGCCCTCC
—3′和C：5′—GCTAGCGCTGGTTC—3′。
【小问3 详解】
大肠杆菌等原核细胞一般用Ca2+处理，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，然后再
将重组质粒导入其中。配置好的培养基采用湿热灭菌法灭菌。
【小问4 详解】
要设计实验用菌落的特征从步骤③处理后的大肠杆菌中分离筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，分离纯化微
生物的方法可采用稀释涂布平板法或平板划线法进行接种操作。将步骤③处理后的大肠杆菌培养在含有氨
苄青霉素和X−gal 的牛肉膏蛋白胨培养基中，在适宜条件下培养一段时间，观察平板上菌落的颜色。由于
氨苄青霉素具有杀菌作用，因此未含有目的基因的空质粒和含有重组质粒的大肠杆菌均能在此培养基生存。
但由于目的基因的插入质粒，破坏了LacZ 基因，导致LacZ 基因不能编码产生β−半乳糖苷酶，培养基中的
X−gal 物质由于缺少β−半乳糖苷酶不能分解产生蓝色物质，故导入重组质粒（含目的基因的质粒）的大肠
杆菌菌落呈白色。
（2024 届广西桂柳高三下学期名校联考）8. 科研人员利用不同算法，可依据蛋白质结构预测其功能。
下列有关说法错误的是（ ）
A. 将未知蛋白质与已知蛋白质的氨基酸序列进行对比分析可以预测蛋白质的功能
B. 通过三维结构对比可以判断两个蛋白质是否有相似的功能
C. 核苷酸序列发生突变，其编码的蛋白质功能就会发生改变
D. 可根据蛋白质结构相似程度判断物种间亲缘关系的远近
【答案】C
【解析】
【分析】1．蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成
基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
2．蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序
列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质
【详解】A、蛋白质的功能主要由其三维结构决定，而其三维结构与氨基酸序列有关。所以将未知蛋白质
与已知蛋白质的氨基酸序列进行对比分析可以预测蛋白质的功能，A 正确；
B、蛋白质的功能主要由其三维结构决定，所以通过三维结构对比可以判断两个蛋白质是否有相似的功能，
B 正确；
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C、核苷酸序列发生突变，由于密码子具有简并性，其编码的蛋白质功能不一定发生改变，C 错误；
D、蛋白质结构相似程度越高，生物之间的相似性越大，亲缘关系越近，因此可根据蛋白质结构相似程度
判断物种间亲缘关系的远近，D 正确。
故选C。
（2024 届广西桂柳高三下学期名校联考）9. 基因工程中常采用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植
物细胞。某科研小组欲将某抗虫基因导入某植物，下列分析错误的是（ ）
A. 应该将抗虫基因插入农杆菌Ti 质粒的T-DNA 片段内
B. 可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物
C. 目的基因与Ti 质粒的结合未涉及碱基互补配对原则
D. 转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状
【答案】C
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的筛选和获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体
细胞和目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、农杆菌中的Ti 质粒上的T-DNA 可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 上，因
此应该将抗虫基因插入农杆菌Ti 质粒的T-DNA 片段内，A 正确；
B、若在单子叶植物的伤口处涂抹酚类化合物，则可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物，B 正确；
C、目的基因的黏性末端与质粒的黏性末端依赖碱基互补配对原则连接在一起，C 错误；
D、转基因是否成功，最简便的方法是从个体水平上观察该植物有没有抗虫性状，D 正确。
故选C。
（2024 届贵州省贵阳一中联考模拟预测）10. 某科研团队利用农杆菌转化法将抗除草剂基因导入甘
蓝，过程如图所示，①～④为操作步骤，限制酶BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ酶切位点唯一。其中BamHⅠ与
EcoRⅠ之间的距离为20kb，BamHⅠ与BglⅡ之间的距离为25kb，BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ识别序列和切
割位点如图。请回答：
BamHⅠ：—G↓GATCC— BglⅡ：—A↓GATCT— EcoRⅠ：—G↓AATTC—
（1）常用特异性地扩增抗除草剂基因的方法是PCR，每次循环一般分为“变性→__________”三步。
（2）启动子的功能是__________。
（3）步骤①应选择限制酶__________切割农杆菌质粒。步骤④的培养基中应添加__________，以便筛选
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出含目的基因的甘蓝植株，原因是__________。
（4）经检测，部分转基因甘蓝植株细胞中的目的基因不能表达，科研团队对此现象的观点是：目的基因
存在正向与反向两种连接方式。用__________酶对步骤①获得的重组质粒进行切割，通过凝胶电泳分析产
物大小，若出现__________条电泳条带，则说明科研团队的观点正确。
【答案】（1）复性→延伸
（2）RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
（3） ①. BamH
②.
Ⅰ
潮霉素 ③. Ti 质粒
T－DNA 中含有潮霉素抗性基因
（4） ①. BamHⅠ和EcoR
②.
Ⅰ
四
【解析】
【分析】分析题图：①为基因表达载体
构建，②为将重组质粒导入农杆菌，③为农杆菌侵染愈伤组织，
④为植物组织培养。
【小问1 详解】
利用PCR 扩增目的基因，每次循环一般分为“变性→复性→延伸” 三步。
【小问2 详解】
启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
【小问3 详解】
由图可知：目的基因的一侧和质粒中都含有BamHⅠ的酶切位点，因此步骤①应选择限制酶BamHⅠ切割
农杆菌质粒。Ti 质粒的T－DNA 中含有潮霉素抗性基因，因此在步骤④的培养基中需要添加潮霉素，以便
筛选出含目的基因的甘蓝植株。
【小问4 详解】
由图可知：用BamHⅠ酶和BglⅡ酶切割得到的黏性末端相同，均为-GATC，因此剪切后的目的基因能与质
粒连接在一起。在构建的重组质粒中，不再有BglⅡ酶的识别位点，但含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，
酶切位点与目的基因正向和反向连接方式有关（见图）。
若只选一种酶切割基因表达载体，无论目的基因正向连接还是反向连接，均只得到长度180＋25＋20＝
225kb 的DNA，无法区分目的基因正向连接还是反向连接。若选用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切割，目的基因正
向连接的重组质粒被切成180kb、45kb 的两种DNA 片段，目的基因反向连接的重组质粒被切成205kb、
20kb 两种DNA 片段，所以电泳应出现四条条带。
(广东省汕头市某校2023-2024 学年高三下学期三模)11. 基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的
基因和质粒，以便于重组和筛选。已知限制酶I 的识别序列和切点是—G↓CATCC—；限制酶Ⅱ的识别序列和
切点是—↓GATC—。据图判断，下列操作正确的是（ ）
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A. 质粒用限制酶I 切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B. 质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶I 切割
C. 目的基因和质粒均用限制酶I 切割
D. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
【答案】A
【解析】
【分析】分析题图：限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-，
因此限制酶Ⅱ也能作用于限制酶Ⅰ的识别序列。
【详解】限制酶I 的识别序列和切点是-G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-，可知限制酶Ⅱ
能够识别和切割限制酶Ⅰ的识别序列，目的基因的右端限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-，目的基因
左端是限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-G↓GATCC-，只有用限制酶Ⅱ才能同时将目的基因切割下来；质粒有
GeneI 和GeneⅡ表示两种标记基因，分别有限制酶I 的识别序列和限制酶Ⅱ的识别序列，如果用限制酶Ⅱ
切割，则GeneI 和GeneⅡ都被破坏，造成重组质粒无标记基因，用限制酶Ⅰ切割，则破坏GeneⅡ，保留
GeneI，其黏性末端和切割目的基因所在DNA 的黏性末端相同，可以连接形成重组DNA，A 正确，BCD 错误。
故选A。
(广东省汕头市某校2023-2024 学年高三下学期三模)12. 下图为DNA 分子的某一片段，其中①②③
分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次为（ ）
A. DNA 连接酶、限制酶、解旋酶
B. 限制酶、解旋酶、DNA 连接酶
C. 限制酶、DNA 连接酶、解旋酶
D. 解旋酶、限制酶、DNA 连接酶
【答案】D
【解析】
【分析】解旋酶：能使DNA 分子两条链之间的氢键断裂，使DNA 双链打开。
限制酶：能够识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的
磷酸二酯键断裂。
DNA 连接酶：连接的是两个DNA 片段之间的磷酸二酯键。
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【详解】①处为氢键，是解旋酶的作用部位；②处为磷酸二酯键，是限制酶的作用部位；③处为两个DNA
片段的缺口，是DNA 连接酶的作用部位，催化磷酸二酯键的形成，即D 正确。
故选D。
(广东省汕头市某校2023-2024 学年高三下学期三模)13. 目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，
连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计
引物进行PCR 后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3 条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目
的基因为长度300bp 的片段。下列有关说法错误的是（ ）
A. PCR 复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链
B. 电泳条带迁移的位置和速度与DNA 分子的大小、带电量和构象有关
C. 选取引物甲、丙，扩增出450bp 长度片段时，可以说明目的基因正接
D. 选取引物甲、乙，扩增出400bp 长度片段时，可以说明目的基因反接
【答案】C
【解析】
【分析】PCR 是利用DNA 在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C 左右）时引物与单链
按
碱基互补配对的原则结合，再调
温度至DNA 聚合酶最适反应温
度（72°C 左右），DNA 聚合酶
沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶
制造的PCR 仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
【详解】A、退火是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合，退火温度不宜太低，避免引物错配和模
板链形成双链，A 正确；
B、电泳条带迁移的位置和速度与DNA 分子的大小、带电量和构象有关，如电泳一段时间后，较大的DNA
分子迁移距离小，离加样孔近，而较小的DNA 分子迁移距离大，离加样孔远，B 正确；
C、由于使用的引物是甲和丙，没有与基因相应位置配对，因此不管基因正接还是反接，均为450bp，C 错
误；
D、选取引物甲乙，扩增出400bp 长度片断时，可以说明目的基因反接，若正接，不能扩增出100bp 的片
段，D 正确。
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故选C。
(广东省汕头市某校2023-2024 学年高三下学期三模)14. 巢式PCR 是指先后用外内引物扩增目的基因
的方法。其原理为：先以比目的基因大的DNA 片段为模板，用外引物（F1，R1）进行扩增，获得大量含目
的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物（F2，R2）扩增目的基因，如图所示。下列
说法错误的是（ ）
A. 两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA 片段
B. 第二轮PCR 反应能否进行，是对第一轮PCR 反应正确性的鉴定
C. 由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性
D. 如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物
【答案】D
【解析】
【分析】PCR 技术的原理是细胞内DNA 复制，需要模板、原料、能量、酶、引物等条件。PCR 一般要经历
三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性、延伸三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为
模板参与反应。引物是一小段DNA 或RNA，它能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对。
【详解】A、两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA 片段，以便与模板互补配对，A 正确；
B、第二轮PCR 使内侧引物以第一轮PCR 产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR 反应能否进行，是对第一
轮PCR 反应正确性的鉴定，B 正确；
C、由于和两套引物同时都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性 ，将需要的目的基因扩增
出来，C 正确；
D、如果两套引物一起加入反应体系中，外引物复性温度要明显高于内引物，使外引物先进行反应，D 错误。
故选D。
(广东省汕头市2024 年高三二模考试)15. 转基因技术的研发是加快农业现代化的重要途径，但转基因
食品的安全性备受关注。研究者将水稻抗虫基因（crylC）和双T-DNA 载体连接（图示连接后双T-DNA 部分
结构），利用其中的“Cre/LoxP”系统培育了安全可食用的转基因水稻。在“Cre/LoxP”系统中，Cre 基因
编码的Cre 酶可特异性识别同一DNA 两个同向的loxP 序列并将两个loxP 间的序列删除。
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图：P—启动子（P1 为胚乳特异表达启动子；P2 为绿色组织特异性表达启动子）
回答下列问题：
（1）Cre 酶与基因工程中的______（工具酶）作用类似。
（2）载体中，T-DNA 的作用是转移到被侵染的细胞后__________________，hpt 基因（潮霉素抗性基因）
和gus 基因（表达产物使无色底物显蓝色）有助于双T-DNA 共转化植株的筛选，起到基因表达载体中
____________（填结构）的作用。
（3）筛选得到双T-DNA 共转化成功的植株T0中，hpt 基因对植物和环境具有潜在的危害，需设法将其删除。
先从T0植株中筛选T-DNA1和T-DNA2都是单拷贝（单个）插入的植株GH-1、GH-2 和GH-3，自交后得到T1代
植株进行潮霉素抗性检测，选择抗性检测为阴性植株的叶片的gus 基因进行PCR 检测，产物的电泳结果如
下图a。（不考虑减数分裂时发生互换）
①T0代中______（填编号）是T-DNA1和T-DNA2以连锁形式在单一位点插入植株。
②在答题卡对应
图b 中画出植株GH-2 的T-DNA1和T-DNA2在染色体上的位置_____（注：用圆点·表示T-
DNA1和T-DNA2在染色体上的位置）
③GH-1 的T0代自交的后代T1植株中，具有抗虫特性但不含hpt 基因的植株的比例为______。这些植株自交
后筛选即可获得稳定遗传的种子Tx。
（4）水稻种子主要包括胚和胚乳，其中胚乳被加工成精米食用。该“Cre/LoxP”系统，实现了______，培
育了安全可食用的转基因水稻。Tx种子播种后获得的叶片______（填“具有”或“不具有”）抗虫的性状。
【答案】（1）限制酶 （2） ①. 整合到染色体（细胞核）DNA ②. 标记基因
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（3） ①. GH-3 ②.
③. 3/16
（4） ①. 在胚乳中特异性删除抗虫基因（外源基因/两个loxP 间的序列） ②. 具有
【解析】
【分析】基因工程又称基因拼接技术和DNA 重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生
物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA 分子，然后导入活细
胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①
目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，
基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【小问1 详解】
由题干信息可知，在“Cre/LoxP”系统中，Cre 基因编码的Cre 酶可特异性识别同一DNA 两个同向的loxP 序
列并将两个loxP 间的序列删除，所以Cre 酶与基因工程中的限制酶作用类似。
【小问2 详解】
载体中，T-DNA 的作用是转移到被侵染的细胞后整合到染色体（细胞核）DNA，hpt 基因（潮霉素抗性基
因）和gus 基因（表达产物使无色底物显蓝色）有助于双T-DNA 共转化植株的筛选，起到基因表达载体中
标记基因的作用。
【小问3 详解】
①由题图信息可知，对自交后得到T1 代植株进行潮霉素抗性检测，而潮霉素抗性检测为阴性植株，如果T-
DNA1 和T-DNA2 以连锁形式在单一位点插入植株，则对叶片的gus 基因进行PCR 检测时，电泳结果不会出
现相应的条带，符合GH-3 植株的电泳结果。
②由题图信息可知，先从T0 植株中筛选T-DNA1 和T-DNA2 都是单拷贝（单个）插入的植株GH-2，再结合
植株GH-2 的T1 代叶片gus 基因电泳结果可知，抗性检测为阴性，但植株的叶片中都含有gus 基因，说明T-
DNA1 和T-DNA2 插入到了一对同源染色体的不同位点，如果插入到了两对同源染色体的不同位置，符合自
由组合定律，经过自交后会出现有的叶片含有gus 基因，有的叶片不含gus 基因，符合GH-1 的电泳结果，
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所以植株GH-2 的T-DNA1 和T-DNA2 在染色体上的位置如图：
③根据GH-1 的T0 代自交的后代T1 植株的gus 基因电泳结果可知，T-DNA1 和T-DNA2 插入到了两对同源染
色体的不同位置，符合自由组合定律，亲本为杂合子，所以在T1 植株中具有抗虫特性但不含hpt 基因的植
株的比例为3/4×1/4=3/16。
【小问4 详解】
由题干信息可以，在“Cre/LoxP”系统中，Cre 基因编码的Cre 酶可特异性识别同一DNA 两个同向的loxP 序
列并将两个loxP 间的序列删除，可以实现了在胚乳中特异性删除抗虫基因（或外源基因或两个loxP 间的序
列），培育了安全可食用的转基因水稻。GH-1 的T0 代自交的后代T1 植株中，具有抗虫特性但不含hpt 基
因的植株，这些植株自交后筛选即可获得稳定遗传的种子Tx，所以Tx 种子播种后获得的叶片具有抗虫的性
状。
(2024 年广东省茂名市高三模拟测试)16. 不对称PCR 是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA
（ssDNA）的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。
PCR 的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产
生大量的ssDNA。不对称PCR 的简单过程如图所示。假设模板DNA 分子初始数量为a 个，6 次循环后开始
扩增产生ssDNA。下列叙述错误的是（ ）
A. 限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA 的碱基序列来设计
B. 据图可知，最后大量获得的ssDNA 与图中甲链的碱基序列相同
C. 上述过程中子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3'端延伸
D. 该不对称PCR 过程中需要（26-1）a 个限制性引物
【答案】C
【解析】
【分析】PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷酸为
原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子链的
5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要原因是
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DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。
【详解】A、PCR 扩增时需要已知目的基因两侧的碱基序列来设计引物，因此限制性引物和非限制性引物均
需要依据模板DNA 的碱基序列来设计，A 正确；
B、当限制性引物的浓度降低，甚至基本耗尽，双链 DNA 的合成速率显著下降，此时非限制性引物将继续
引导单链 DNA 的合成，非限制性引物是与乙链结合，故反应的最后阶段只产生初始 DNA 中一条链的拷
贝（非限制性引物引导合成的单链），最后大量获得的ssDNA 与图中甲链的碱基序列一致，B 正确；
C、扩增时耐高温DNA 聚合酶将4 种脱氧核苷酸连接至引物的3'端，C 错误；
D、PCR 扩增时引物是新子链的一部分，假设模板DNA 分子初始数量为a 个，6 次循环后产生26 个DNA 分
子，因此该不对称PCR 过程中需要（26-1）a 个限制性引物，D 正确。
故选C。
(2024 年广东省茂名市高三模拟测试)17. 在DNA 体外重组实验中，目的基因与载体连接形成基因表达
载体时，基因表达载体是否构建成功需要进行筛选与鉴定。抗药性筛选法是一种常见的筛选方法，该方法
实施的前提条件是载体DNA 上携带特定的抗性基因。利用某外源DNA 和pBR322 质粒构建基因表达载体，
然后导入大肠杆菌中，并进行筛选和鉴定，部分过程如图1、2 所示，其中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，
TetR表示四环素抗性基因。回答下列问题：
（1）已知限制酶PstI 和BamHI 识别序列和切点分别是—CTGCA↓C—和—G↓CATCC—，为构建重组质粒，
图1 中，若使用限制酶PstI 切割外源DNA 片段，则切割pBR322 应该选择限制酶___（填“PstI 或”
“BamHI”），不选择另外一种限制酶的理由是___。
（2）在某次实际操作中，实验人员将外源DNA 片段插入pBR322 的BamHI 切割位点处，构建了重组质粒，
然后导入大肠杆菌中。为检测重组质粒是否构建成功，实验人员进行了图2 所示的实验。
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①结合图2 阶段一实验分析，将大肠杆菌接种到固体培养基上的方法是___。该培养基中添加了氨苄青霉素
（Amp），但是能在该培养基中生长的大肠杆菌并不是一定导入了含外源DNA 的重组质粒，这是由于___。
②实验人员利用影印培养技术，将一块无菌丝绒布接触含有大肠杆菌菌落的平板表面，使之定位沾上菌落
印迹，然后平移并压在含四环素（Tet）的培养基上，经过培养至菌落显现，如图2 阶段二实验所示。导入
了成功构建的重组质粒的大肠杆菌菌落应该从含___（填“Amp”或“Tet”）的培养基上获取，理由是___。
【答案】（1） ①. PstI ②. PstI 和BamHI 切割DNA 分子产生的末端不能互补，若选择BamHI 切割
pBR322，则无法与PstI 切割的外源DNA 片段相互连接
（2） ①. 稀释涂布平板法 ②. pBR322 和外源DNA 的重组质粒上均含有AmpR，导入了pBR322 或
外源DNA 的重组质粒的大肠杆菌对Amp 均有抗性 ③. Amp ④. 限制酶BamHI 破坏了质粒上的TetR
（四环素抗性基因），因此含外源DNA 的重组质粒不能在添加了四环素的培养基中生长
【解析】
【分析】基因工程的操作步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的
基因的检测与鉴定。
【小问1 详解】
若使用限制酶PstI 切割外源DNA 片段，则切割pBR322 应该选择限制酶PstI，不选择另外一种限制酶的理由
是PstI 和BamHI 切割DNA 分子产生的末端不能互补，若选择BamHI 切割pBR322，则无法与PstI 切割的外
源DNA 片段相互连接。
【小问2 详解】
①图示中培养基上菌落分布均匀，因此将大肠杆菌接种到固体培养基上的方法是稀释涂布平板法。由于
pBR322（空载质粒）和含外源DNA 的重组质粒上均含有AmpR，导入了pBR322（空载质粒）或含外源DNA
的重组质粒的大肠杆菌对Amp 均有抗性，因此在该培养基中生长的大肠杆菌并不是一定导入了含外源DNA
的重组质粒。
②由于限制酶BamHⅠ破坏了质粒上的TetR（四环素抗性基因），因此含外源DNA 的重组质粒不能在添加
了四环素的培养基中生长，所以导入了成功构建的重组质粒的大肠杆菌菌落应该从含Amp 的培养基上获取。
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(甘肃省西北师范大学附属中学2023-2024 学年高三第五次诊断（三模）)18. 猪流行性腹泻是由
猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种急性肠道传染病。PEDV 是一种正链单股RNA 病毒，PEDV 基因组共
编码蛋白21 种，这些蛋白共同协调着病毒的复制与增殖。其中Nsp10 蛋白对基因组RNA 合成以及病毒多
聚蛋白的加工有着极其重要的作用。研究人员构建了PEDV Nsp10 基因真核表达载体，为进一步探究PEDV
Nsp10 蛋白的生物学功能以及特性奠定一定的基础。请回答下列相关问题：
（1）对于PEDV 而言，基因指的是______。PEDV 在细胞中的增殖过程如图1 所示。PEDV 感染细胞后，其
基因组既可作为______翻译出病毒特异的蛋白质，又能够作为模板经过______次复制得到子代病毒的基因
组。
（2）Nsp10 基因不能直接进行PCR 扩增，需要经______过程得到相应的产物再进行PCR 扩增。为了便于扩
增后的DNA 片段与表达载体连接，需在引物的______（填“3'端”或“5'端”）加上限制性酶切位点，且
常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是______。
（3）扩增Nsp10 基因的特异性引物分别为：
引物Ⅰ序列：5'-GCCATGGAGGCCCGAATTCGGATGGCTGGT-3'，
引物Ⅱ序列：5'-CGCGGCCGCGGTACCTCGAGATTGCATAAT-3'
下表为几种限制酶的识别序列及其切割位点，图2 质粒上的，Ampr代表青霉素抗性基因，其作用是______，
orl 为复制原点，其余为限制酶切割位点，由此推断切割质粒选择的限制酶是______。
限制酶名
称
识别序列和切割位
点
BamHⅠ
5'-G↓GATCC-3'
EcoRⅠ
5'-G↓AATTC-3'
XhoⅠ
5'-C↓TCGAG-3'
【答案】（1） ①. 有遗传效应的RNA 片段 ②. mRNA ③. 2
（2） ①. 逆转录 ②. 5'端 ③. 保证扩增后的DNA 片段与表达载体正向连接
（3） ①. 便于重组DNA 分子的筛选 ②. EcoRⅠ、XhoⅠ
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1） 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
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增和人工合成。（2） 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子终止子和标记基因等。（3） 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【小问1 详解】
基因是生物体遗传的基本单位，通常是有遗传效应的DNA 片段，PEDV 是一种正链单股RNA 病毒，因此它
的基因为有遗传效应的RNA 片段，分析图可知PEDV 感染细胞后，其基因组既可作为mRNA 翻译出病毒特
异的蛋白质，又能够作为模板经过复制得到子代病毒的基因组，因为PEDV 是一种正链单股RNA 病毒，因
此需要2 次复制才得到子代病毒的基因组。
【小问2 详解】
Nsp10 基因是RNA，不能直接进行PCR 扩增，需要经逆转录过程得到相应的产物再进行PCR 扩增。由于
DNA 子链是从引物的3’端延伸，而且引物的3’端序列必须与模板链配对，因此在设计引物时，只能在两条
引物的5’端加上限制性酶切位点，常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，保证扩增后的DNA 片
段与表达载体正向连接。
【小问3 详解】
Ampr 代表青霉素抗性基因，在基因表达载体中作为标记基因存在，便于重组DNA 分子的筛选。扩增
Nsp10 基因的特异性引物分别为： 引物Ⅰ序列：5'-GCCATGGAGGCCCGAATTCGGATGGCTGGT-3'， 引物Ⅱ序
列：5'-CGCGGCCGCGGTACCTCGAGATTGCATAAT-3'，两种引物上分别有EcoRⅠ、XhoⅠ的识别序列，由此推断
切割质粒选择的限制酶是EcoRⅠ、XhoⅠ。
2024 届黑龙江省部分学校高三冲刺卷（五）生物试题19. 尖孢镰刀菌容易引起番茄枯萎症，对农
业造成巨大损失。为研究F 基因（目
基因）的功能，科学家利用同源重组交换的原理对F 基因敲除，分
析其生物学功能及致病力。基因敲除过程是先构建基因敲除载体，将基因敲除载体导入受体细胞，经过筛
选找出基因敲除成功的受体细胞。基因敲除原理如下图所示：
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注：Hygr为潮霉素抗性基因；A、B 为实现同源重组交换的序列，C、D、E、G 为其他不同的基因片段；1
～6 为引物。
（1）选取限制酶____、____分别对F 基因左右两端A、B 片段进行酶切，并用____酶将A、B 片段与潮霉
素抗性基因连接，构建目的基因敲除载体。同时需要在潮霉素抗性基因前添加启动子，启动子的作用是
____。
（2）把构建好的目的基因敲除载体导入尖孢镰刀菌细胞内，导入成功后，将菌液放在含____的固体培养
基上培养，使用的接种方法是____。在这一过程中，F 基因与潮霉素抗性基因发生同源重组交换，与____
（填减数分裂时期）的某些行为类似。
（3）培养完毕，挑取单菌落提取其基因组DNA 作为模板，选择引物____进行PCR 扩增，其中引物会结合
在DNA 片段的____（3'或5'）端，扩增30 个循环进行电泳，如果没有F 基因条带，则确定目的基因敲除
成功。
（4）潮霉素抗性基因能够在尖孢镰刀菌中表达的原因是____。
【答案】（1） ①. KpnI/XhoI ②. SmaI/XbaI ③. DNA 连接 ④. RNA 聚合酶识别和结合的部位，
驱动基因转录，使潮霉素抗性基因能够在尖孢镰刀菌细胞内表达
（2） ①. 潮霉素 ②. 平板划线法或稀释涂布平板法 ③. 减数分裂Ⅰ前期
（3） ①. 引物1、2 ②. 3’
（4）生物界共用一套遗传密码子
【解析】
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：①目的基因的获取②基因表达载体的构建③将目的基因导入受体
细胞④目的基因的检测与鉴定。2、PCR 是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA 半保留复制的原理，
在体外提供参与DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术 。
【小问1 详解】
选取限制酶KpnI/XhoI 对A 片段进行酶切，选取限制酶SmaI/XbaI 对B 片段进行酶切。需要用DNA 连接酶将
A、B 片段与潮霉素抗性基因连接。启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录，能够使潮霉
素抗性基因在尖孢镰刀菌细胞内表达。
【小问2 详解】
导入完成后，潮霉素抗性基因与F 基因完成重组替换，受体细胞就具有抗潮霉素的特性，所以用潮霉素进
行筛选转化的受体细胞。得到单菌落的接种方法有平板划线法或稀释涂布平板法。减数分裂过程中，发生
类似于潮霉素抗性基因替换目的基因的过程，是减数分裂Ⅰ前期（或四分体时期）的互换。
【小问3 详解】
用基因敲除成功的基因组DNA 为模板，由于子链延伸方向是5’到3’，所以引物会结合在DNA 片段的3’端。
如果敲除成功，那么尖孢镰刀菌无F 基因，用引物1 和2 是无法扩增出F 基因的。
【小问4 详解】
由于生物界共用一套遗传密码子，所以潮霉素抗性基因能够在尖孢镰刀菌中表达。
2024 届黑龙江省部分学校高三冲刺卷（五）生物试题20. 在盐碱地种植的作物会受胁迫产生过量
的有害物质H2O2，PIP2s 为某种水通道蛋白，其磷酸化水平影响H2O2的跨膜运输。我国的科研团队首次发
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现了植物细胞中AT1 基因编码的AT1 蛋白可以调节作物的耐碱性表型，其机理如图一所示。图二表示通过
“PCR 替换个别核苷酸获得突变基因”的定点突变技术，且个别核苷酸差异不影响引物与模板链的结合。
回答下列问题：
（1）盐碱环境可引起大多数作物细胞内液渗透压_______，吸水能力_______。图一中植物细胞中AT1 基
因编码的AT1 蛋白可以调节作物的耐碱性表型，其机理为______。
（2）通过PCR 替换个别核苷酸诱导AT1 基因突变时，引物_______中含有特定的突变，为防止引物相互杂
交，需要设计两个反应体系，分别加入引物对_____、______用于合成PCR 产物1 和PCR 产物2；然后将
PCR 产物1 和2 加入无引物的PCR 反应体系得到含有点突变的目的基因。再用引物对________扩增目的基
因，得到大量的点突变目的基因。
（3）为了使扩增的目的基因两侧能被某种限制酶酶切形成黏性末端，对引物1 和引物4 的要求是_____。
（4）若将点突变目
基因导入棉花细胞，我国科学家自己独创的方法是______。要检测是否成功表达，
可以从转基因生物个体中提取蛋白质，用相应的抗体进行_______杂交。
【答案】（1） ①. 上升 ②. 增强 ③. PIP2s 是一种水通道蛋白，AT1 蛋白能够抑制PIP2s 蛋白的
磷酸化，抑制H2O2 外排
（2） ①. 2 和3 ②. 1 和2 ③. 3 和4 ④. 1 和4 物种多样性减少，群落优势度增大
（3）均带有该限制酶识别序列
（4） ①. 花粉管通道法 ②. 抗原—抗体
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：(1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成。(2) 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。(4) 目的
基因的检测与鉴定。
【小问1 详解】
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盐碱环境可引起大多数作物细胞内液渗透压上升，吸水能力增强，图一中植物细胞中PIP2s 是水通道蛋白
的一种，AT1 蛋白能够抑制PIP2s 蛋白的磷酸化，抑制H2O2 外排，导致细胞抗氧化胁迫减弱，最终死亡。
【小问2 详解】
据图二可知，引物2 和引物3 中含有特定的突变，由PCR 产物1 和PCR 产物2 的位置分析可知，为了防止
引物相互杂交，需要设计两个反应体系，分别加入引物对为1 和2、3 和4，要扩增发生突变的目的基因，
需要用能与目的基因两侧发生碱基互补配对的引物，即引物1 和4。
【小问3 详解】
因为目的基因两侧没有某种限制酶的酶切位点，所以为了使扩增的目的基因两侧能被某种限制酶酶切形成
黏性末端，应该在引物1 和4 均带上该限制酶识别序列。
【小问4 详解】
若将目的基因导入棉花细胞的方法很多，其中花粉管通道法是我国科学家自己独创的。要检测目的基因是
否成功表达，即检测相关蛋白质是否合成，需要从转基因生物个体中提取蛋白质，可通过抗原-抗体杂交方
法检测目的基因是否表达成功。
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