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押题10 生物技术综合应用
猜押 4 大题型
题型01 DNA 粗提取与鉴定
题型02 细胞工程
题型03 发酵工程优化
题型04 基因工程与发酵工程综合
猜押考点
3 年真题
考情分析
押题依据
细胞分子组
成及结构
2024 年安徽
卷·第14 题
2024 年安徽
卷·第15 题
2024 年安徽
卷·第20 题
2025 年安徽卷或结合前沿科
研、生产生活实例，考查基因工
程、细胞工程、发酵工程等知识。
注重对关键技术原理、流程及应用
的理解，考查学生从题干获取信
息、运用知识解决实际问题的能
力，也可能涉及实验设计与分析。
题目更加注重综合性、应用
性、创新性，对知识点的背景和应
用有更多的掌握。
生物技术综合应用紧扣学科前沿与
实践，契合高考 “素养导向、情境创
新” 趋势。预计延续以往风格，考查核
心技术的操作要点、原理机制及在农
业、医疗等领域的应用，以体现学科价
值与育人功能。
题型1 DNA 粗提取与鉴定
1．关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验操作中，叙述正确的是（ ）
A．根据待分离DNA 片段的大小，需用无菌水配制琼脂糖溶液
B．向琼脂糖溶液中加入适量的核酸染料后，需在沸水浴内加热至琼脂糖熔化
C．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳取出凝胶置于紫外灯下观察
D．PCR 实验中所使用的离心管、微量移液器、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行湿热灭菌
2．关于菜花、洋葱DNA 的粗提取与琼脂糖凝胶电泳的鉴定实验，下列叙述正确的是（ ）
A．研磨液在4℃冰箱中静置可防止DNA 被酶降解
B．加入体积分数为95%的冷酒精是因为DNA 能溶于酒精
C．向微量离心管中添加PCR 反应体系时，移液器上的枪头可重复多次使用
D．PCR 的产物进行电泳一段时间后，离加样孔越近的DNA 分子越小
3．某实验小组设计了快速检测餐饮食品中金黄色葡萄球菌的方法，主要包括无菌采样、培养基预增菌、
1
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煮沸法提取DNA 和实时荧光 PCR 技术特异性检测四个步骤。下列叙述错误的是（ ）
A．培养基预增菌可以通过保持营养的稳定供给使所提取的菌株均能正常生长
B．提取 DNA 时需将金黄色葡萄球菌的培养液放入离心机中离心后采集上清液
C．可根据金黄色葡萄球菌基因组的保守序列设计两种引物，两引物的序列不互补
D．为满足PCR 反应的需求，需控制退火温度及添加 Mg2+以保证DNA 的稳定增长
4．下列有关“DNA 的提取与鉴定”“利用PCR 扩增DNA 片段及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（
）
A．洋葱切碎加研磨液研磨过滤后，滤液放置4℃冰箱中静置，DNA 存在于上清液中
B．将丝状物溶于体积分数95%的酒精，再加入二苯胺试剂在沸水浴中进行DNA 鉴定
C．PCR 扩增反应体系中dNTP 既可以为扩增提供原料，也可以为子链的合成提供能量
D．PCR 扩增后，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果不止一条条带，可能是引物特异性不强导致
5．关于“DNA 粗提取与鉴定”、“琼脂糖凝胶电泳”、“PCR 扩增”实验，下列说法正确的是（
）
A．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA 存在于沉淀物中
B．鉴定过程中DNA 双螺旋结构不发生改变
C．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA 分子结合，便于在紫外灯下观察
D．对2 个双链DNA 分子进行PCR 扩增，第n 次循环共需引物2n+1个
6．双脱氧测序法（Sangtr 法）是第一代DNA 测序方法。在4 支试管中分别加入4 种dNTP 和少量的1 种
ddNTP 进行PCR，再把PCR 产物变性，利用电泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方
法测定并比较某疾病患者与对照个体DNA 模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述错误的是
（ ）
注：dNTP 是PCR 的四种原料；双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP 四种；
在DNA 聚合酶作用下，ddNTP 与dNTP 竞争核苷酸链延长位点，以加入ddATP 的体系为例：若配对的为
ddATP，延伸终止；若配对的为dATP，继续延伸
A．5'-TAGTGCCCATC-3'为对照个体的一段序列
B．PCR 过程中需要DNA 聚合酶，不需要DNA 解旋酶和DNA 连接酶
C．上述PCR 反应体系中模板链需要足够多
2
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D．患者该段序列中某位点的碱基C 突变为T
7．第一代基因测序技术又叫双脱氧链终止法，它以DNA 合成反应为基础，反应体系中需加入ddNTP（有
ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP4 种）。下图是该技术的测序原理和某待测DNA 序列的电泳图谱。下
列说法正确的是（ ）
A．双脱氧核苷酸无法与模板链发生碱基互补配对，导致子链延伸终止
B．待分离DNA 片段有可解离的基团，在电场中会带上正电荷或负电荷
C．人工合成DNA 体系中必须要加入ATP 以供能
D．待测DNA 的碱基序列是3'-GACTGCCA-5'
8．进行DNA 的粗提取时，某研究小组欲探究提纯时不同的去杂质方式对实验结果的影响，相关数据如下
表所示。下列有关叙述正确的是（ ）
去杂质方式
沉淀质量/g
OD260/OD280
二苯胺鉴定
离心
0.168
1.51
蓝色
4℃冰箱静
置
0.1028
1.41
注：OD260/OD280可反映DNA 纯度，纯DNA 的OD260/OD280为1.8，当存在蛋白质等物质时，这一比值会明
显降低。
A．实验流程为取材→破碎细胞→获得沉淀物→去除杂质→提纯→DNA 鉴定
B．酵母菌、菠菜、菜花和猪血等均适宜作为实验材料进行DNA 的粗提取
C．与4℃冰箱静置相比，离心法可获得DNA 的纯度的较低
D．为排除二苯胺加热后可能变蓝，可设置一组对照实验
9.相分离是蛋白质具有的一种物理特性，是驱动细胞内各类无膜凝聚体形成的重要机制。研究人员将未知
蛋白与不具有相分离特性的Cry2 蛋白相连，如果未知蛋白具有相分离特性，则在蓝光照射下会发生凝
聚，从而开发出检测蛋白是否有相分离特性的工具。FUS 蛋白作为经典的相分离蛋白，经常用作实验
对照。为了探究X 蛋白是否具备相分离特性，科学家需要构建能同时表达Cry2 蛋白和X 蛋白的重组质
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粒，质粒中LacZ 基因编码产生的β——半乳糖苷酶可以分解X——gal 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，
否则菌落为白色。图1 表示质粒的结构，图2 表示含有目的基因的DNA 片段，其中P1、P2、P3 表示
引物，其余箭头处表示相关限制酶的识别位点。回答下列问题：
（1）构建重组质粒的过程中需要用到E.coliDNA 连接酶，该酶的作用是将具有 27
的DNA 片段连接起
来。据图1 分析，应选用四种限制酶中的 28
和 29
切割质粒，以保证目的基因插入后能够正常表达
出 Cry2 蛋白和X 蛋白。
（2）已知X 蛋白基因转录得到的mRNA 前三个碱基为起始密码子AUG。研究发现在紧邻起始密码子
AUG 之前加入序列，会显著提高基因的表达效率。利用PCR 技术获取X 蛋白基因时，为保证X 蛋白基因
能正确插入载体并高效表达，除选择引物P1 外，还需要选择引物 30
（填“P2”或“P3”），并在该引
物5 端增加碱基序列5＇- 31 -3＇。
（3）通过琼脂糖凝胶电泳可将不同的DNA 片段区分开来，该技术所依据的原理是 32
，对PCR 产物进
行电泳检测，结果显示除X 蛋白基因条带外，还有多条非特异性条带（引物和模板不完全配对导致）。为
减少非特异性条带的产生，可适当 33
（填“提高”或“降低”）PCR 中复性过程的温度。
（4）为筛选出成功导入重组质粒的目标菌，需要将重组质粒与经处理的大肠杆菌混匀，再将大肠杆菌接
种到含有四环素和X-gal 的培养基上。培养一段时间后，培养基中颜色为 34
的菌落为目标菌落，原因
是 35
。
（5）为了确认X 蛋白的相分离特性，还可以构建两种重组质粒作为对照，对照组质粒与实验组质粒相比，
所含基因的差异分别是 36
、 37
。
题型2 细胞工程
1．下图是以铁皮石斛为材料，培养拟原球茎（简称PLBs，类似愈伤组织）生产生物碱的实验流程。下列
4
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说法正确的是（ ）
A．生物碱属于次生代谢产物，是铁皮石斛生长所必需的物质
B．图中过程①为脱分化形成PLBs，过程②为再分化生产生物碱
C．培养高产细胞系应选择细胞数量/生物碱产量比值小的PLBs
D．过程①②常用葡萄糖做碳源，原因是蔗糖不易被植物细胞吸收
2．花椰菜（2n=18）种植时容易遭受病菌侵害形成病斑，紫罗兰（2n=14）具有一定的抗病性。科研人员
利用植物体细胞杂交技术培育具有抗病性状的花椰菜新品种如图1 所示。通过蛋白质电泳技术分析了
亲本及待测植株中某些特异性蛋白，结果如图2 所示。下列有关叙述正确的是（ ）
A．图1 培育杂种植株所用的技术体现了细胞膜具有一定流动性原理和基因突变原理
B．②过程可用电融合法或灭活病毒诱导细胞融合，杂种细胞再生出细胞壁是成功的标志
C．只考虑细胞两两融合，图1 培育出的植株体细胞中最多含有72 条染色体，减数分裂时最多可形成
18 个四分体
D．可将病菌悬浮液均匀喷施于图2 中的3 和5 植株叶片上，一段时间后，测定病斑面积占叶片总面积
的百分比，筛选出抗病性强的杂种植株
3．次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产
物X 是植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中产生的防御物质。其研发流程为：筛选高产细
胞→确定细胞生长和产物X 合成的关系（如图）→发酵生产X。下列叙述错误的是（ ）
A．为了大量获取X，应先培养大量细胞，后改变条件使细胞停止生长
5
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B．可利用基因工程的方法改造酵母菌，利用发酵工程生产X
C．为提高目标细胞的X 含量，可将微生物菌体或其产物作为诱导因子加入到培养基中
D．图示测定数据应该是来自细胞周期不同步、来源多样的细胞群
4．我国科学家成功地用iPS 细胞克隆出了活体小鼠，部分流程如下图所示。其中Kdm4d 为组蛋白去甲基
化酶，TSA 为组蛋白脱乙酰酶抑制剂。下列说法错误的是（ ）
A．除过程①所示方法外，还可以通过直接将特定蛋白导入细胞来制备iPS 细胞
B．过程②应选用MⅠ期的卵母细胞，通过显微操作法将卵母细胞的细胞核去除
C．过程③通过电融合法使两细胞融合，这体现细胞膜具有一定的流动性
D．组蛋白的乙酰化或去甲基化有利于重构胚的发育
5．抗体结构分为可变区（V 区）和恒定区（C 区），与抗原特异性结合的区域被称为CDR 区，位于V 区
中。由杂交瘤技术制备的鼠源单抗可诱导人体产生抗单抗抗体（ADAs），从而降低其治疗效果。单克
隆抗体经过了四代的发展：小鼠单克隆抗体→嵌合单克隆抗体（将小鼠V 区代替人类V 区）→人源化
单克隆抗体（只有小鼠来源的CDR 区，其余由人类免疫球蛋白G 框架组成）→全人源单克隆抗体。下
列关于单克隆抗体的叙述，正确的是（ ）
A．杂交瘤细胞一般是由小鼠的骨髓瘤细胞和浆细胞融合形成的
B．嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体诱发产生ADAs 的强度依次升高
C．人鼠嵌合单抗的制备过程涉及蛋白质工程和细胞工程等生物技术
D．人编码抗体的基因转移至小鼠中，小鼠表达出的均为完全人源化单抗
6．单克隆抗体的发展经历了多个阶段，如最初的鼠源性单克隆抗体，其制备路线如图1 所示。由其发展
形成的嵌合性单克隆抗体，用人的恒定区取代小鼠的恒定区，保留鼠单抗的可变区序列，形成了人—
鼠杂合的抗体，如图2 所示。下列有关分析错误的是（ ）
6
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A．蛋白A 刺激小鼠和刺激人体产生的抗体结构不完全相同
B．小鼠体内抗体的种类与抗体基因的种类通常不是一一对应的
C．制备的人鼠嵌合单抗常用于制备病毒抗原检测的试纸
D．第二次筛选时将杂交瘤细胞接种到多孔培养板上进行克隆化培养和抗体检测
7．2017 年，某国批准了首例使用细胞核移植技术培育“三亲婴儿”的申请。其培育过程可选用如下技术
路线。据图分析，下列叙述正确的是（ ）
A．图中的核心技术是核移植，但涉及基因编辑，会带来伦理问题
B．该技术可有效治疗镰状细胞贫血症等因遗传物质改变而引起的疾病
C．图中细胞在体外培养时，需置于含95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中
D．“三亲婴儿”的外貌特征只与提供细胞核的父母相似，与提供细胞质的女性无关
8．体外动物细胞培养制造出的细胞培养肉是一种人造肉，具有营养可控、结构仿真、口感真实的特点。
其主要生产流程如下图，图中的微载体是一种固体的细胞生长基质，其表面能使细胞贴附。下列叙述
错误的是（ ）
A．①过程可用机械方法或用胰蛋白酶、胃蛋白酶处理获得细胞悬液
B．③④过程需使用经灭菌处理的培养液，富含细胞生长所需的营养物质
C．③过程加入微载体为细胞提供更大附着面积，延迟接触抑制出现，可增加产量
D．动物细胞培养技术的原理是细胞增殖，培养过程中细胞通过有丝分裂增加细胞数目
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题型3 发酵工程优化
1．蓝莓中含有丰富的矿质元素和维生素，有机酸种类丰富。某同学按照“蓝莓果实→清洗破碎→酶解→
过滤→硫处理→成分调整→接种→主发酵→倒灌过滤→后发酵→陈酿→澄清→配兑→灌装→杀菌→成
品”的流程研究蓝莓果酒酿造工艺。下列叙述错误的是（ ）
A．发酵前需要对基因工程获得的高产菌株进行扩大培养
B．主发酵和后发酵时都需要密闭，且保持温度在28℃左右
C．在成分调整环节按比例添加蔗糖可以提高果酒的酒精含量
D．发酵过程中要适时排气，后发酵时期可以适当延长排气时间间隔
2．玉米秸秆中含有丰富的粗纤维和粗蛋白等营养成分，将玉米秸秆资源化，利用绿色木霉生产单细胞蛋
白饲料的工艺流程如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．绿色木霉应具有能分泌大量淀粉酶、不产生有毒物质等优点
B．玉米秸秆可为绿色木霉生长提供所需的碳源和氮源等
C．以玉米秸秆为原料获得单细胞蛋白，有利于提高能量的利用率
D．通风培养过程中，应定时检测绿色木霉的数量及原料中粗纤维、粗蛋白的含量
3．生产L-谷氨酸主要依赖有氧发酵，常用菌种谷氨酸棒状杆菌大多为生物素合成缺陷型。在各组发酵罐
中分别添加不同浓度的生物素，检测结果如下图。下列叙述错误的是（ ）
A．发酵前用平板划线法进行谷氨酸棒状杆菌的纯培养
B．发酵过程将空气直接通入发酵罐以保证有氧条件
8
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C．甲～丁组谷氨酸棒状杆菌数量均呈现“S”形增长
D．乙～丁组L-谷氨酸产量不与菌体细胞密度呈正比
4．如图为发酵工程规模化生产产品的流程图，下列叙述错误的是（ ）
A．图中①②③是发酵工程的中心环节
B．若生产人生长激素的工程菌是通过①培育而来，则①需用到转基因技术
C．扩大培养的条件和发酵罐内发酵的条件可能不同
D．如果⑥是微生物菌体，分离、提纯的方法是过滤、沉淀等
5．ε-聚赖氨酸是一种由白色链霉菌发酵产生并分泌的具有抑菌功效的多肽，可被人体消化分解，最终转化
为人体必需的赖氨酸，安全性高。如图为ε-聚赖氨酸生产的简要流程，下列叙述正确的是（ ）
A．白色链霉菌的细胞结构和代谢类型都类似于酵母菌
B．在ε-聚赖氨酸的生产过程中需密切监控发酵液的pH
C．生产的ε-聚赖氨酸具有抑菌作用，通入的空气无须灭菌
9
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D．发酵产物ε-聚赖氨酸需从白色链霉菌体内分离提纯
6．发酵制作酱油在我国具有悠久的历史。某企业通过发酵制作酱油的流程示意图如下。下列叙述错误的
是（ ）
A．大豆中的蛋白质可为菌种生长提供碳源、氮源
B．该过程利用乳酸菌、酵母菌等微生物的有氧呼吸
C．发酵罐和原料需要灭菌，加盐可调味并防止杂菌滋生
D．米曲霉分泌蛋白酶、淀粉酶等利于原料中有机物的分解
7．科研人员通过改良发酵工艺“把玉米变成衣服”，即利用大肠杆菌将玉米转化为戊二胺，再将戊二胺
转化为尼龙布，流程如图所示。其中，戊二胺不能从大肠杆菌体内排出，且对细胞有毒害作用。下列
相关分析错误的是（ ）
A．该工业生产中要使用淀粉酶、果胶酶、纤维素酶等酶制剂
B．发酵过程中，应将培养液置于有氧、pH 中性或接近中性的条件下培养
C．发酵时定期更换培养液，能降低戊二胺对大肠杆菌的毒害
D．发酵结束后，可采用提取、分离和纯化措施来获得戊二胺
题型4 基因工程与发酵工程综合
1．蛋白质工程中可以利用引物引导的方法对DNA 进行定点突变，进而改变蛋白质的特定氨基酸。图示为
这种定点诱变方法的实验流程。已知在细菌体内合成的DNA 分子有甲基化修饰，通过PCR 扩增的
DNA 链无甲基化修饰。据图分析，下列叙述错误的是（ ）
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A．待突变质粒的甲基化修饰不会影响PCR 扩增
B．用于突变的两条引物之间不能发生碱基互补配对
C．图中所示限制酶能够识别质粒中发生甲基化的位点
D．突变质粒缺口补齐依赖于大肠杆菌DNA 连接酶的作用
2．大肠杆菌有AR 菌和AS 菌两种类型，只有AR 菌对氨卞青霉素（Amp）有抗性。某兴趣小组用CaCl2
处理两种菌后，进行了以下实验。
实验1：将AS 菌与煮沸灭活的AR 菌混合后，接种于含Amp 的固体培养基上，获得了少量培养物
实验2：将具有氨卞青霉素抗性基因的质粒加入AS 菌液，一段时间后接种于含Amp 的固体培养基上，获
得了少量培养物
下列对实验方法或现象的分析，正确的是（ ）
A．实验1 和实验2 都发生了细菌转化现象，其转化因子就是质粒DNA
B．实验2 的AS 获得了可稳定遗传的表型变化，推测质粒具有遗传效应
C．两个实验都需增设仅接种AS 菌的对照组，旨在排除杂菌污染的影响
D．将实验中灭活的AR 菌破碎并加入限制酶，则无法再现实验1 的结果
3．大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA 就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在
上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．可利用DNA 在酒精中溶解度较大的特点来提取质粒DNA
B．将提取的DNA 溶于2mol/LNaCl 溶液后，不能用二苯胺试剂进行鉴定
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C．凝胶中的DNA 分子通过染色，可在紫外灯下被检测出来
D．根据电泳结果，质粒上没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，有限制酶Ⅲ的切割位点
4．肌醇在生物医药、食品和饲料领域具有广泛用途。科研人员运用基因工程技术改造大肠杆菌以生产肌
醇。过程是从酿酒酵母获取关键基因I，与质粒p 连接构建重组质粒p-I，再导入大肠杆菌BL21 获得重
组菌BL21/p-I。回答下列问题：
(1)构建重组质粒p-I 时，先用限制酶BamHI 和HindⅢ切质粒p，若目的基因内部含有这两种限制酶识别位
点，则需在基因I 进行PCR 扩增时在引物的 端添加能产生 末端的限制酶的识别序列。相对于单
酶切，采用双酶切法理论上最多可减少 种环状DNA 分子的产生（不考虑2 个及以上同种分子之间的
连接）。
(2)构建基因表达载体时连在基因I 上游的启动子应来自 （填“大肠杆菌”或“酿酒酵母”）。重组
质粒p-I 在导入大肠杆菌BL21 时，需用 处理，使其处于 的状态。
(3)为检测大肠杆菌中基因I 是否导入成功，提取其质粒进行酶切，酶切产物做电泳分析，结果如右图（酶
切后产生的极短DNA 片段不可见）。由图分析可知，样品 含有重组质粒。
(4)科研人员对重组菌产肌醇的发酵条件进行了探究，结果见下图。由图可知， 因素的变化对肌醇产
量影响最小。若进一步探究葡萄糖量对肌醇产量的影响，新增实验组的葡萄糖量应设在 g/L 范围内。
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(5)工业化生产肌醇时，从降低成本考虑，可采取 措施（答1 点）。发酵过程中，要随时检测 、
，以了解发酵进程。
5．同源重组基因敲除技术是将同源DNA 片段导入受体细胞，利用同源 DNA 片段的互换，用其他DNA
片段在原有位置替代靶基因，从而实现基因的敲除。米曲霉产生的曲酸具有抗菌性、抗氧化性等抗逆
能力，具有重要的应用价值。为提高米曲霉产曲酸能力，科研人员用同源重组基因敲除技术成功敲除
了米曲霉3.042 菌株中的msn2 基因，获得高产的g-5 菌株。其部分机理如图1 所示（bp 表示碱基对）。
(1)构建基因敲除框需要的工具酶有 ，将基因敲除框导入米曲霉细胞常用的方法是 。
(2)科研人员选取进行基因敲除操作后的3 个菌落，分别提取其DNA，选择图中引物 进行PCR 扩增，
电泳结果如图2 所示。根据1 号菌落电泳结果可得出的结论是 。为进一步验证3 号菌落为目的菌落，
需要选择图中引物 重复上述操作。
(3)米曲霉的曲酸产量与其对逆境的敏感性有关，tpsⅠ基因表达产物可以降低米曲霉对逆境的敏感性。推测
tpsⅠ基因表达产物与曲酸合成的关系是 。为验证该推测，可采用的实验方法是 ，预期实验结果
是 。
6．米曲霉的改造
曲酸具有抗菌性、抗氧化性等抗逆能力，具有重要的应用价值。为提高米曲霉产曲酸能力，科研人员用同
源重组基因敲除技术成功敲除了米曲霉g-3 菌株中的msn2 基因，获得高产的g-5 菌株，部分过程如图
1，其中kanr（卡那霉素抗性基因）、pyrG 基因（表达合成尿嘧啶）为标记基因。步骤Ⅲ米曲霉g-3 发
生的变化如图2 所示。
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(1)步骤 I 的接种方法一般为 。
(2)下列关于培养基甲和乙的相关叙述，正确的是_____。（多选）
A．培养基甲为固体培养基
B．培养基甲为鉴别培养基
C．培养基乙可获得大量质粒
D．培养基乙需加入卡那霉素
科研人员选取培养基丙的3 个菌落，分别提取其基因组DNA，选用图2 中相关引物进行PCR 扩增，结果
如图3 所示。
(3)根据图3 结果可知，科研人员选用的PCR 引物组合为_____。（单选）
A．引物A 和引物B
B．引物C 和引物E
C．引物A 和引物C
D．引物B 和引物E
(4)根据图3 结果， 号泳道对应菌株为目的菌株g-5．为进一步验证，科研人员重新选择图2 的相关引
物组合重复上述操作，请将获得的电泳结果在答题纸相应虚线方框内涂黑。
(5)尿嘧啶属于曲霉生长所需的 。（编号选填）由图1、2 和相关信息推断，与培养基丙相比，培养基
丁 尿嘧啶。（编号选填）
①碳源②氮源③无机盐④生长因子⑤含⑥不含
(6)图1 所示实验步骤中需要使用无菌技术的有 。（编号选填）
①步骤I②步骤③步骤Ⅲ④步骤IV
对摇瓶培养相同时间后的g-3 和g-5 在相同放大倍数下镜检结果如图4，在比较两者菌丝球（菌丝缠绕而
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成）形态后科研人员认为g-5 对外界营养物质吸收速率快于g-3，是其曲酸产量高的原因之一、
(7)据此判断图4 中 （A/B）视野中菌株为g-5。
米曲霉的曲酸产量与其对逆境的敏感性有关，tps1 基因表达产物可以降低米曲霉对逆境的敏感性。研究发
现g-5 菌株tpsI 基因表达量明显降低。
(8)综合以上信息，阐述msn2 基因敲除能使米曲霉产曲酸增多的可能机制 。
7．乙偶姻是一种天然存在于多种食品中的化合物，常被用作食品添加剂和防腐剂。当前，生物法制备乙
偶姻主要以糖类为底物，从微生物发酵液中提取乙偶姻，其代谢途径如图1。
为了得到高产乙偶姻的菌株，科学家构建了budC 基因敲除的枯草芽孢杆菌，构建流程如图2。
注：1）F1、F2、R1、R2表示引物，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，Kanr为卡那霉素抗性基因，Tetr为四环素
抗性基因。2）同源重组是指两个DNA 分子的相同区域之间发生的交换和重组。
(1)PCR 过程中，每次循环可分为 三步，扩增budC 基因下游片段时引物中需分别添加 的酶切
位点。
(2)为筛选出目的菌株（即含有完整重组质粒的枯草芽孢杆菌），请完善以下内容：
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序
步骤内容
结果及结论
1
将经图中③处理的枯草芽孢杆菌接种到含氨苄青霉素
的培养基上培养，一段时间后，培养基上出现单菌
落。
，说明该单菌落的
菌株即为目的菌株。
2
将 培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生
长。
(3)为检测枯草芽孢杆菌budC 基因敲除是否成功，研究人员提取（2）小题筛选出的枯草芽孢杆菌的5 个菌
株的基因组，然后用引物F1和R2进行扩增并电泳，结果如图3。根据电泳结果能判断budC 基因敲除成功，
原因是 。
(4)将budC 基因敲除成功的枯草芽孢杆菌经过优化后投入到工厂中进行乙偶姻的生产，请在图4 中补充发
酵产乙偶姻的基本步骤 、 。
8．细菌中的蛋白激酶Y 感受外界刺激后，利用ATP 将特异性底物A 蛋白磷酸化，改变A 蛋白的活性从而
应答外界刺激，调控细菌的生长。研究者将Y 基因（编码蛋白激酶Y）与GFP 基因（编码绿色荧光蛋
白）拼接成Y-GFP 融合基因（Y-GFP 基因），导入载体，并表达出融合蛋白（Y-GFP 蛋白），以分析
蛋白激酶Y 的功能，实验过程如图示。
限制酶名
EcoRI
BamHI
XhoI
MunI
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称
识别序列
5'G↓AATTC3'
5'G↓GATCC3'
5'C↓TCGAG3'
5'C↓AATTG3'
(1)据图分析，为获得Y-GFP 融合基因，在设计引物时，引物F2 和F3 序列应该分别选择（ ）
A．5’TCACTGCTAGCG3’
B．5’TTACGACTAGCG3’
C．5’CGCTAGTCGTAA3’
D．5’CGCTAGCAGTGA3’
(2)构建基因表达载体时，因融合基因两端不含酶切位点，根据题中所提供的限制酶，应当在引物F1 和F4
中分别添加 限制酶识别序列，若用EcoRI 和BamHI 切割（完全酶切）构建成功的表达载体，能够
得到 个片段。
(3)常用 法将基因表达载体导入大肠杆菌，在检测融合基因表达情况时发现，能够检测到融合基因
的mRNA，但表达的蛋白质只有蛋白激酶Y，原因是 。
(4)A 蛋白磷酸化水平一定程度上代表了细菌对外界刺激的反应程度，在导入基因表达载体的大肠杆菌中，
可通过直接观察 来反应这一情况。
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