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押题10 生物技术综合应用
猜押 4 大题型
题型01 DNA 粗提取与鉴定
题型02 细胞工程
题型03 发酵工程优化
题型04 基因工程与发酵工程综合
猜押考点
3 年真题
考情分析
押题依据
细胞分子组
成及结构
2024 年安徽
卷·第14 题
2024 年安徽
卷·第15 题
2024 年安徽
卷·第20 题
2025 年安徽卷或结合前沿科
研、生产生活实例，考查基因工
程、细胞工程、发酵工程等知识。
注重对关键技术原理、流程及应用
的理解，考查学生从题干获取信
息、运用知识解决实际问题的能
力，也可能涉及实验设计与分析。
题目更加注重综合性、应用
性、创新性，对知识点的背景和应
用有更多的掌握。
生物技术综合应用紧扣学科前沿与
实践，契合高考 “素养导向、情境创
新” 趋势。预计延续以往风格，考查核
心技术的操作要点、原理机制及在农
业、医疗等领域的应用，以体现学科价
值与育人功能。
题型1 DNA 粗提取与鉴定
1．关于“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”实验操作中，叙述正确的是（ ）
A．根据待分离DNA 片段的大小，需用无菌水配制琼脂糖溶液
B．向琼脂糖溶液中加入适量的核酸染料后，需在沸水浴内加热至琼脂糖熔化
C．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳取出凝胶置于紫外灯下观察
D．PCR 实验中所使用的离心管、微量移液器、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行湿热灭菌
【答案】C
【分析】PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、
DNA 分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA 分子通过染色，可以在波长为300 nm 的紫外灯下被检
测出来。
【详解】A、根据待分离DNA 片段的大小，需用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，A 错误；
1
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B、在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化，稍冷却后，再加入适量的核酸染料混匀，B 错误；
C、待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳取出凝胶置于紫外灯下观察，这样可以清晰地观察到
DNA 条带的位置和情况，C 正确；
D、微量移液器属于精密仪器，不能进行湿热灭菌，D 错误。
故选C。
2．关于菜花、洋葱DNA 的粗提取与琼脂糖凝胶电泳的鉴定实验，下列叙述正确的是（ ）
A．研磨液在4℃冰箱中静置可防止DNA 被酶降解
B．加入体积分数为95%的冷酒精是因为DNA 能溶于酒精
C．向微量离心管中添加PCR 反应体系时，移液器上的枪头可重复多次使用
D．PCR 的产物进行电泳一段时间后，离加样孔越近的DNA 分子越小
【答案】A
【分析】RCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成技术，相对分子质
量较大的扩增产物迁移速率较慢，与点样处的距离较近。原理：DNA 复制。
【详解】A、酶的活性受温度影响，DNA 酶在适宜温度下有活性可降解DNA。 将研磨液在4℃冰箱
中静置，因为低温能抑制DNA 酶的活性，所以可防止DNA 被酶降解，A 正确；
B、DNA 不溶于酒精，而细胞中的某些蛋白质等杂质能溶于酒精。 加入体积分数为95%的冷酒精是为
了析出DNA，B 错误；
C、向微量离心管中添加PCR 反应体系时，为防止杂菌污染和确保反应体系的纯净度，移液器上的枪
头使用后若重复多次使用，会可能带来污染，影响反应结果。 所以枪头不可重复多次使用，C 错误；
D、在凝胶电泳中，DNA 分子在电场作用下向正极移动，DNA 分子越大，在凝胶中的阻力越大，移动
越慢。 所以PCR 的产物进行电泳一段时间后，离加样孔越近的DNA 分子越大，D 错误。
故选A。
3．某实验小组设计了快速检测餐饮食品中金黄色葡萄球菌的方法，主要包括无菌采样、培养基预增菌、
煮沸法提取DNA 和实时荧光 PCR 技术特异性检测四个步骤。下列叙述错误的是（ ）
A．培养基预增菌可以通过保持营养的稳定供给使所提取的菌株均能正常生长
B．提取 DNA 时需将金黄色葡萄球菌的培养液放入离心机中离心后采集上清液
C．可根据金黄色葡萄球菌基因组的保守序列设计两种引物，两引物的序列不互补
D．为满足PCR 反应的需求，需控制退火温度及添加 Mg2+以保证DNA 的稳定增长
【答案】B
【分析】PCR 技术是多聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的DNA 片段的分子生物学技术，它
可看作是生物体外的特殊DNA 复制。用PCR 技术扩增目的基因，要先制备目的基因作为模板。
2
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【详解】A、培养基预增菌，目的是增加待测菌的数量，可以通过保持营养的稳定供给使所提取的菌株
均能正常生长，A 正确；
B、提取DNA 时需将金黄色葡萄球菌的培养液放入离心机中进行离心，将上清液去除后对菌体进行采
集，B 错误；
C、两种引物分别和目的基因的两端的序列互补，两引物的序列不互补，C 正确；
D、Mg2+可以提高已发生错配区域的稳定性，为满足PCR 反应的需求，需控制退火温度及添加
Mg2+以保证DNA 的稳定增长，D 正确。
故选B。
4．下列有关“DNA 的提取与鉴定”“利用PCR 扩增DNA 片段及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（
）
A．洋葱切碎加研磨液研磨过滤后，滤液放置4℃冰箱中静置，DNA 存在于上清液中
B．将丝状物溶于体积分数95%的酒精，再加入二苯胺试剂在沸水浴中进行DNA 鉴定
C．PCR 扩增反应体系中dNTP 既可以为扩增提供原料，也可以为子链的合成提供能量
D．PCR 扩增后，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果不止一条条带，可能是引物特异性不强导致
【答案】B
【分析】DNA 不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精；鉴定DNA 时，需要先将DNA 溶解在NaCl 溶液
中，再与二苯胺溶液混合，并在水浴加热条件下呈现蓝色。
【详解】A、洋葱切碎加研磨液研磨过滤后，滤液放置4 C
∘
冰箱中静置，DNA 存在于上清液中。因为
在该实验中，破碎细胞释放出 DNA 等物质，经过离心或静置分层后DNA 会溶解在上清液中，A 正确；
B、应该将丝状物溶于2mol/L 的NaCl 溶液，再加入二苯胺试剂在沸水浴中进行DNA 鉴定，而不是溶
于体积分数95%的酒精，B 错误；
C、PCR 扩增反应体系中dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）既可以为扩增提供原料，在形成磷酸二酯键时，
dNTP 脱去两个磷酸基团，释放的能量为子链的合成提供能量，C 正确；
D、PCR 扩增后，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果不止一条条带，可能是引物特异性不强，导致引物与模板结
合位点不唯一，扩增出多种不同的DNA 片段，从而在电泳结果上出现多条条带，D 正确。
故选B。
5．关于“DNA 粗提取与鉴定”、“琼脂糖凝胶电泳”、“PCR 扩增”实验，下列说法正确的是（
）
A．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA 存在于沉淀物中
B．鉴定过程中DNA 双螺旋结构不发生改变
C．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA 分子结合，便于在紫外灯下观察
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D．对2 个双链DNA 分子进行PCR 扩增，第n 次循环共需引物2n+1个
【答案】D
【分析】DNA 粗提取和鉴定的原理：（1）DNA 的溶解性：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度
NaCl 溶液中溶解度不同；DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。
（2）DNA 的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、将洋葱切碎加研磨液研磨、过滤后，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA 存在于上清
液中，A 错误；
B、在DNA 鉴定过程中，常用二苯胺在沸水浴条件下与DNA 反应呈现蓝色来鉴定DNA。在这个过程
中，鉴定过程中DNA 双螺旋结构会解旋，B 错误；
C、DNA 分子在凝胶载样缓冲液中带正电荷或负电荷，可用于电泳；电泳缓冲液中加入的核酸染料能
与DNA 分子结合，在波长为300nm 的紫外灯下可以被检测出来，凝胶载样缓冲液中加入的是指示剂，
C 错误；
D、PCR 技术中，DNA 复制遵循半保留复制原则。一个双链DNA 分子经过n 次循环后得到2ⁿ 个DNA
分子，需要的引物数量为（2ⁿ⁺¹ - 2）×2 个（因为最初的2 个DNA 分子各有2 条模板链，不需要引物）。
n-1 次循环共需引物（2ⁿ - 2）×2，第n 次循环共需引物2n+1 个，D 正确。
故选D。
6．双脱氧测序法（Sangtr 法）是第一代DNA 测序方法。在4 支试管中分别加入4 种dNTP 和少量的1 种
ddNTP 进行PCR，再把PCR 产物变性，利用电泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方
法测定并比较某疾病患者与对照个体DNA 模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述错误的是
（ ）
注：dNTP 是PCR 的四种原料；双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP 四种；
在DNA 聚合酶作用下，ddNTP 与dNTP 竞争核苷酸链延长位点，以加入ddATP 的体系为例：若配对的为
ddATP，延伸终止；若配对的为dATP，继续延伸
A．5'-TAGTGCCCATC-3'为对照个体的一段序列
B．PCR 过程中需要DNA 聚合酶，不需要DNA 解旋酶和DNA 连接酶
C．上述PCR 反应体系中模板链需要足够多
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D．患者该段序列中某位点的碱基C 突变为T
【答案】A
【分析】PCR 技术：（1）概念：PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核
酸合成技术。（2）原理：DNA 复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一
对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、耐高温的DNA 聚合酶（Taq 酶）。
（5）过程：①高温变性：DNA 解旋过程（PCR 扩增中双链DNA 解开不需要解旋酶，高温条件下氢键
可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA 上；③中温延伸：合成子链。
【详解】A、依据双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA 片段）的3'终端的碱基，
如+ddATP 的泳道中出现的条带（DNA 片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，
但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA 序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为
从上→下，即对应的DNA 片段为长→短，则对应的DNA 测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最
短的条带为+ddCTP 泳道组的条带，则说明该DNA 片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结
果为5'-CTACCCGTGAT-3'，A 错误；
B、PCR 过程中需要DNA 聚合酶，不需要解旋酶，高温变性解旋，不需要DNA 连接酶，两条链都是连
续合成，B 正确；
C、在进行序列时，模板量的数量需要足够多，以确保测序的准确性和可测性。如果模板DNA 量不足，
可能会导致测序结果不准确或无法进行，C 正确；
D、患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，对比患者
和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C 突变为T，D 正确。
故选A。
7．第一代基因测序技术又叫双脱氧链终止法，它以DNA 合成反应为基础，反应体系中需加入ddNTP（有
ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP4 种）。下图是该技术的测序原理和某待测DNA 序列的电泳图谱。下
列说法正确的是（ ）
A．双脱氧核苷酸无法与模板链发生碱基互补配对，导致子链延伸终止
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B．待分离DNA 片段有可解离的基团，在电场中会带上正电荷或负电荷
C．人工合成DNA 体系中必须要加入ATP 以供能
D．待测DNA 的碱基序列是3'-GACTGCCA-5'
【答案】D
【分析】基因检测是指通过检测生物体中的DNA 序列，以了解生物体基因状况的技术手段。Sanger 双
脱氧链终止法是DNA 测序的基本方法，其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、带有3′-OH 末端的单链核
苷酸引物、四种dNTP 存在的条件下复制或转录时，如果在反应系统中分别引入单一种类的ddNTP（即
2、3 双脱氧核苷三磷酸，在脱氧核糖的3′位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP 形成磷酸二酯
键），只要ddNTP 掺入链端，该链就停止延长，末端掺入dNTP 的片段可继续延长。
【详解】A、双脱氧核苷酸仍然可以按照碱基互补配对原则与模板链上的碱基互补配对，但是子链结合
上双脱氧核苷酸后无法再继续延伸，A 错误；
B、待分离DNA 片段带有负电荷，在电场中会向正极移动，B 错误；
C、双脱氧三磷酸核苷酸在人工合成DNA 体系中，可脱去两个磷酸基团形成焦磷酸和双脱氧核苷酸并
释放能量，故人工合成DNA 体系中无需加入ATP 提供能量，C 错误；
D、由于存在某一种双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）时则复制终止，其余情况能正常进行，则分子量越小，
证明终止的越早，根据碱基互补配对原则可知由左到右读出待测DNA 的碱基序列是3'-
GACTGCCA-5'，D 正确。
故选D。
8．进行DNA 的粗提取时，某研究小组欲探究提纯时不同的去杂质方式对实验结果的影响，相关数据如下
表所示。下列有关叙述正确的是（ ）
去杂质方式
沉淀质量/g
OD260/OD280
二苯胺鉴定
离心
0.168
1.51
蓝色
4℃冰箱静
置
0.1028
1.41
注：OD260/OD280可反映DNA 纯度，纯DNA 的OD260/OD280为1.8，当存在蛋白质等物质时，这一比值会明
显降低。
A．实验流程为取材→破碎细胞→获得沉淀物→去除杂质→提纯→DNA 鉴定
B．酵母菌、菠菜、菜花和猪血等均适宜作为实验材料进行DNA 的粗提取
C．与4℃冰箱静置相比，离心法可获得DNA 的纯度的较低
D．为排除二苯胺加热后可能变蓝，可设置一组对照实验
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【答案】D
【分析】DNA 的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA 的溶解性，DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓
度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA 溶解或析出，
从而达到分离的目的；②DNA 不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理
可以将蛋白质和DNA 进一步分离；③在沸水浴的条件下DNA 遇二苯胺会呈现蓝色。
【详解】A、该实验流程为取材→破碎细胞→获得滤液（DNA 溶解在滤液中）→去除杂质→提纯
→DNA 鉴定，A 错误；
B、酵母菌、菠菜、菜花细胞中均含有DNA，均适宜作为实验材料进行DNA 的粗提取，但猪血中的成
熟红细胞没有细胞核，不含DNA，不适合作为DNA 粗提取的材料，B 错误；
C、OD260/OD280 可反映DNA 纯度，离心时OD260/OD280 为1.51，而4℃冰箱静置时OD260/OD280
为1.41，说明离心法可以获得更高纯度的DNA，C 错误；
D、可设置一组对照实验，将未加入DNA 的二苯胺加热，以排除二苯胺加热后可能变蓝的情况，D 正
确。
故选D。
9.相分离是蛋白质具有的一种物理特性，是驱动细胞内各类无膜凝聚体形成的重要机制。研究人员将未知
蛋白与不具有相分离特性的Cry2 蛋白相连，如果未知蛋白具有相分离特性，则在蓝光照射下会发生凝
聚，从而开发出检测蛋白是否有相分离特性的工具。FUS 蛋白作为经典的相分离蛋白，经常用作实验
对照。为了探究X 蛋白是否具备相分离特性，科学家需要构建能同时表达Cry2 蛋白和X 蛋白的重组质
粒，质粒中LacZ 基因编码产生的β——半乳糖苷酶可以分解X——gal 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，
否则菌落为白色。图1 表示质粒的结构，图2 表示含有目的基因的DNA 片段，其中P1、P2、P3 表示
引物，其余箭头处表示相关限制酶的识别位点。回答下列问题：
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（1）构建重组质粒的过程中需要用到E.coliDNA 连接酶，该酶的作用是将具有 27
的DNA 片段连接起
来。据图1 分析，应选用四种限制酶中的 28
和 29
切割质粒，以保证目的基因插入后能够正常表达
出 Cry2 蛋白和X 蛋白。
（2）已知X 蛋白基因转录得到的mRNA 前三个碱基为起始密码子AUG。研究发现在紧邻起始密码子
AUG 之前加入序列，会显著提高基因的表达效率。利用PCR 技术获取X 蛋白基因时，为保证X 蛋白基因
能正确插入载体并高效表达，除选择引物P1 外，还需要选择引物 30
（填“P2”或“P3”），并在该引
物5 端增加碱基序列5＇- 31 -3＇。
（3）通过琼脂糖凝胶电泳可将不同的DNA 片段区分开来，该技术所依据的原理是 32
，对PCR 产物进
行电泳检测，结果显示除X 蛋白基因条带外，还有多条非特异性条带（引物和模板不完全配对导致）。为
减少非特异性条带的产生，可适当 33
（填“提高”或“降低”）PCR 中复性过程的温度。
（4）为筛选出成功导入重组质粒的目标菌，需要将重组质粒与经处理的大肠杆菌混匀，再将大肠杆菌接
种到含有四环素和X-gal 的培养基上。培养一段时间后，培养基中颜色为 34
的菌落为目标菌落，原因
是 35
。
（5）为了确认X 蛋白的相分离特性，还可以构建两种重组质粒作为对照，对照组质粒与实验组质粒相比，
所含基因的差异分别是 36
、 37
。
【答案】(1) 互补黏性末端 MunI XhoI
(2) P2 GAATTCGCCACC
(3) 不同DNA 分子的大小和构象不同，在凝胶中的迁移速率不同 提高
(4) 白色 重组质粒中不含LacZ 基因，不能编码产生的β-半乳糖苷酶，不能分解X-gal 产生蓝
色物质
(5) 不含X 蛋白基因 用FUS 蛋白基因替换X 蛋白基因
【分析】PCR 是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板(克隆或基因组DNA)
的扩增反应，是模拟体内DNA 复制过程，在体外特异性扩增DNA 片段的一种技术。
【详解】（1） E．coli DNA 连接酶只能连接黏性末端，则其作用是将具有互补黏性末端的DNA 片段
连接起来；据图可知，EcoRI 能将CadR 切掉，不能选用，SalI 位于终止子外，也不能选用，故只能选
用MunI 和XhoⅠ切割质粒，产生不同的黏性末端，以保证目的基因插入后能够正常表达出Cry2 蛋白和
X 蛋白。
（2）根据图中X 蛋白基因的编码链的方向及质粒中启动子方向可知，需要将编码链的5′端靠近启动子，
由于X 蛋白基因中含有Munl 的酶切位点，所以不能用Munl 进行切割，但是EcoRI 与Mun l 切割产生
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的黏性末端相同，所以可以在设计引物的时候添加EcoRI 的识别序列（-GAATTC-），同时也不能选用
含有SalI 识别序列的引物，所以还需要选择引物P2，并在其5'端增加碱基序列5'-
GAATTCGCCACC-3'。
（3）不同DNA 分子的大小和构象不同，在凝胶中的迁移速率不同，所以可以通过琼脂糖凝胶电泳可
将不同的DNA 片段区分开来；可适当提高PCR 中复性过程的温度，可减少引物和模板不完全配对现象，
从而减少非特异性条带的产生。
（4） 分析题意可知，LacZ 基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal 产生蓝色物质，使菌落呈现
蓝色，重组质粒中导入了目的基因，则重组质粒中不含LacZ 基因，不能编码产生的β-半乳糖苷酶，不
能分解X-gal 产生蓝色物质，培养一段时间后，培养基中颜色为白色的菌落为目标菌落。
（5） 由题意可知，对照组质粒与实验组质粒相比，不含有X 蛋白基因，此外FUS 蛋白作为经典的相
分离蛋白，经常用作实验对照，故为了确认X 蛋白的相分离特性，还可以构建两种重组质粒作为对照，
对照组质粒与实验组质粒相比，所含基因的差异分别是不含X 蛋白基因、用FUS 蛋白基因替换X 蛋白
基因。
题型2 细胞工程
1．下图是以铁皮石斛为材料，培养拟原球茎（简称PLBs，类似愈伤组织）生产生物碱的实验流程。下列
说法正确的是（ ）
A．生物碱属于次生代谢产物，是铁皮石斛生长所必需的物质
B．图中过程①为脱分化形成PLBs，过程②为再分化生产生物碱
C．培养高产细胞系应选择细胞数量/生物碱产量比值小的PLBs
D．过程①②常用葡萄糖做碳源，原因是蔗糖不易被植物细胞吸收
【答案】C
【分析】在一定的激素和营养等条件的诱导下，外植体可脱分化形成愈伤组织。在脱分化过程中，植
物细胞的分化程度逐渐降低，全能性逐渐升高。脱分化形成的愈伤组织由一些排列疏松而无规则，高
度液泡化、呈无定形状态的薄壁细胞组成。
【详解】A、生物碱是铁皮石斛的次生代谢物，不是细胞进行正常生命活动必需的物质，A 错误；
B、题意显示PLBs 类似愈伤组织，因此，图中过程①为脱分化形成PLBs，过程②为植物细胞培养过程，
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不属于再分化，B 错误；
C、该实验目的是要生产生物碱，故需要选择生物碱产量/细胞数量的值大的PLBs 作为高产细胞系，或
者说细胞数量/生物碱产量比值小的PLBs，C 正确；
D、过程①②常用蔗糖做碳源，因为蔗糖更有利于渗透压调节，D 错误。
故选C。
2．花椰菜（2n=18）种植时容易遭受病菌侵害形成病斑，紫罗兰（2n=14）具有一定的抗病性。科研人员
利用植物体细胞杂交技术培育具有抗病性状的花椰菜新品种如图1 所示。通过蛋白质电泳技术分析了
亲本及待测植株中某些特异性蛋白，结果如图2 所示。下列有关叙述正确的是（ ）
A．图1 培育杂种植株所用的技术体现了细胞膜具有一定流动性原理和基因突变原理
B．②过程可用电融合法或灭活病毒诱导细胞融合，杂种细胞再生出细胞壁是成功的标志
C．只考虑细胞两两融合，图1 培育出的植株体细胞中最多含有72 条染色体，减数分裂时最多可形成
18 个四分体
D．可将病菌悬浮液均匀喷施于图2 中的3 和5 植株叶片上，一段时间后，测定病斑面积占叶片总面积
的百分比，筛选出抗病性强的杂种植株
【答案】C
【分析】1、植物体细胞杂交技术：就是将不同种的植物体细胞原生质体在一定条件下融合成杂种细胞，
并把杂种细胞培育成完整植物体的技术。植物体细胞杂交的终点是培育成杂种植株，而不是形成杂种
细胞就结束；杂种植株的特征：具备两种植物的遗传特征，原因是杂种植株中含有两种植物的遗传物
质；植物体细胞杂交克服了远缘杂交不亲和的障碍。
2、根据图谱分析，4 号和5 号个体含有紫罗兰和花椰菜两种类型的蛋白质，说明是杂种细胞，而1、
2、3 号个体只有紫罗兰中的蛋白质，说明不是杂种细胞。
【详解】A、植物体细胞杂交技术将杂种细胞培养成完整植株，体现了植物细胞全能性；两个物种细胞
的融合体现了细胞膜流动性原理和染色体变异原理，A 错误；
B、植物细胞不能用灭活病毒诱导细胞融合，杂交细胞再生出新的细胞壁是植物细胞融合成功的标志之
一，发育成完整植株是植物体细胞杂交技术成功的标志，B 错误；
C、只考虑细胞两两融合，若两个花椰菜细胞融合则最多有36 条染色体，在有丝分裂后期最多有72 条
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染色体，C 正确；
D、根据图谱分析4 号和5 号个体含有紫罗兰和花椰菜两种类型的蛋白质，是杂种植株，可将病菌悬浮
液均匀喷施于4、5 号杂种植株叶片上，一段时间后，测定病斑面积占叶片总面积的百分比，筛选出抗
病性强的杂种植株，D 错误。
故选C。
3．次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产
物X 是植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中产生的防御物质。其研发流程为：筛选高产细
胞→确定细胞生长和产物X 合成的关系（如图）→发酵生产X。下列叙述错误的是（ ）
A．为了大量获取X，应先培养大量细胞，后改变条件使细胞停止生长
B．可利用基因工程的方法改造酵母菌，利用发酵工程生产X
C．为提高目标细胞的X 含量，可将微生物菌体或其产物作为诱导因子加入到培养基中
D．图示测定数据应该是来自细胞周期不同步、来源多样的细胞群
【答案】D
【分析】分析图示可知：在培养过程中细胞生物量不断增加，一段时间后才开始形成次生代谢产物
X；当细胞生物量达到最大值、细胞停止生长后，次生代谢产物X 才大量增加。
【详解】A、据实验结果可知，细胞停止生长后才开始大量合成X，为了大量获取X，应先培养大量细
胞，后改变条件使细胞停止生长，A 正确；
B、可以把植物中合成X 的相关基因导入酵母菌构建工程菌，利用发酵工程生产X，B 正确；
C、次生代谢产物X 是植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中产生的防御物质，为提高目标细
胞的X 含量，可将微生物菌体或其产物作为诱导因子加入到培养基中，C 正确；
D、图示测定数据应该是来自细胞周期同步、来源一致的细胞群，D 错误。
故选D。
4．我国科学家成功地用iPS 细胞克隆出了活体小鼠，部分流程如下图所示。其中Kdm4d 为组蛋白去甲基
化酶，TSA 为组蛋白脱乙酰酶抑制剂。下列说法错误的是（ ）
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A．除过程①所示方法外，还可以通过直接将特定蛋白导入细胞来制备iPS 细胞
B．过程②应选用MⅠ期的卵母细胞，通过显微操作法将卵母细胞的细胞核去除
C．过程③通过电融合法使两细胞融合，这体现细胞膜具有一定的流动性
D．组蛋白的乙酰化或去甲基化有利于重构胚的发育
【答案】B
【分析】生物体基因的碱基序列保持不变，但基因表达和表型发生可遗传变化的现象，叫作表观遗传。
除了DNA 甲基化，构成染色体的组蛋白发生甲基化、乙酰化等修饰也会影响基因的表达。
【详解】A、制备iPS 细胞，除了图中①所示的用小分子化合物诱导小鼠成纤维细胞的方法外，还可以
借助载体将特定基因导入细胞中，或直接将特定蛋白导入细胞中来诱导形成iPS 细胞 ，A 正确；
B、过程②是去除卵母细胞的细胞核，应选用处于MⅡ期的卵母细胞，因为MⅡ期卵母细胞的细胞质中
含有促进细胞核全能性表达的物质，且通过显微操作技术可以将卵母细胞的细胞核去除，B 错误；
C、过程③是将iPS 细胞与去核卵母细胞融合形成重构胚，通过电融合法使两细胞融合，这体现了细胞
膜具有一定的流动性，因为细胞膜的流动性是细胞融合的基础，C 正确；
D、Kdm4d 为组蛋白去甲基化酶，TSA 为组蛋白脱乙酰酶抑制剂，它们的作用是促进重构胚的发育，
说明组蛋白的乙酰化和去甲基化有利于重构胚的发育，D 正确。
故选B。
5．抗体结构分为可变区（V 区）和恒定区（C 区），与抗原特异性结合的区域被称为CDR 区，位于V 区
中。由杂交瘤技术制备的鼠源单抗可诱导人体产生抗单抗抗体（ADAs），从而降低其治疗效果。单克
隆抗体经过了四代的发展：小鼠单克隆抗体→嵌合单克隆抗体（将小鼠V 区代替人类V 区）→人源化
单克隆抗体（只有小鼠来源的CDR 区，其余由人类免疫球蛋白G 框架组成）→全人源单克隆抗体。下
列关于单克隆抗体的叙述，正确的是（ ）
A．杂交瘤细胞一般是由小鼠的骨髓瘤细胞和浆细胞融合形成的
B．嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体诱发产生ADAs 的强度依次升高
C．人鼠嵌合单抗的制备过程涉及蛋白质工程和细胞工程等生物技术
D．人编码抗体的基因转移至小鼠中，小鼠表达出的均为完全人源化单抗
【答案】C
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【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已
经免疫的B 淋巴细胞；诱导B 细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体
检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培
养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
【详解】A、杂交瘤细胞可由骨髓瘤细胞和小鼠的B 细胞融合而成，A 错误；
B、结合题意可知，该技术鼠表达出完全人源化单抗，故嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体诱发产生
ADAs 的强度依次降低，B 错误；
C、人鼠嵌合单抗的制备过程涉及将小鼠 V 区基因与人类抗体基因拼接等蛋白质工程技术，以及细胞
融合等细胞工程技术，C 正确；
D、人编码抗体的基因转移至小鼠中，小鼠表达出的不一定是完全人源化单抗，可能还会受到小鼠自身
细胞内一些因素的影响，导致表达产物并非完全符合人源化单抗的预期，D 错误。
故选C。
6．单克隆抗体的发展经历了多个阶段，如最初的鼠源性单克隆抗体，其制备路线如图1 所示。由其发展
形成的嵌合性单克隆抗体，用人的恒定区取代小鼠的恒定区，保留鼠单抗的可变区序列，形成了人—
鼠杂合的抗体，如图2 所示。下列有关分析错误的是（ ）
A．蛋白A 刺激小鼠和刺激人体产生的抗体结构不完全相同
B．小鼠体内抗体的种类与抗体基因的种类通常不是一一对应的
C．制备的人鼠嵌合单抗常用于制备病毒抗原检测的试纸
D．第二次筛选时将杂交瘤细胞接种到多孔培养板上进行克隆化培养和抗体检测
【答案】C
【分析】单克隆抗体的制备：
1、细胞来源：经免疫的B 淋巴细胞：能产生特异性抗体，在体外不能无限繁殖；骨髓瘤细胞：不产生
专一性抗体，体外能无限繁殖。
2、杂交瘤细胞的特点：既能大量增殖，又能产生特异性抗体。
3、两次筛选：①筛选得到杂交瘤细胞（去掉未杂交细胞以及自身融合的细胞）；②筛选出能够产生所
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需抗体的细胞群。
4、提取单克隆抗体：从培养液或小鼠腹水中提取。
5、单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高，并可能大量制备。
【详解】A、由于小鼠和人体的免疫系统存在差异，对同一抗原（蛋白A）的免疫应答也不完全相同。
因此，蛋白A 刺激小鼠和刺激人体产生的抗体结构不完全相同，A 正确；
B、小鼠体内的一个抗体基因可以通过基因重排等机制产生多种不同的抗体。 所以，小鼠体内抗体的
种类与抗体基因的种类通常不是一一对应的，B 正确；
C、人 - 鼠嵌合单抗虽然保留了鼠单抗的可变区序列，能与相应抗原结合，但由于其存在一定的人源
化部分，在免疫原性等方面与天然的鼠源单抗有所不同。 目前常用于制备病毒抗原检测试纸的主要是
单克隆抗体，尤其是鼠源单克隆抗体，人 - 鼠嵌合单抗一般不常用于制备病毒抗原检测的试纸，C 错
误；
D、单克隆抗体制备过程中，第二次筛选时将杂交瘤细胞接种到多孔培养板上，进行克隆化培养和抗体
检测，目的是筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞，D 正确。
故选C。
7．2017 年，某国批准了首例使用细胞核移植技术培育“三亲婴儿”的申请。其培育过程可选用如下技术
路线。据图分析，下列叙述正确的是（ ）
A．图中的核心技术是核移植，但涉及基因编辑，会带来伦理问题
B．该技术可有效治疗镰状细胞贫血症等因遗传物质改变而引起的疾病
C．图中细胞在体外培养时，需置于含95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中
D．“三亲婴儿”的外貌特征只与提供细胞核的父母相似，与提供细胞质的女性无关
【答案】C
【分析】动物细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的
细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。原理是动物细胞核具有全能性，克隆动物的遗传物
质来自双亲，其核遗传物质来自供核生物，而细胞质基因来自提供细胞质的生物。
【详解】A、图中的核心技术是核移植，该过程并没有涉及基因编辑。“三亲婴儿”技术主要是通过核
移植等技术，将不同个体的细胞核和细胞质进行组合，从而实现生殖目的，此过程未对基因进行编辑
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操作，所以不会因基因编辑带来伦理问题，A 错误；
B、三亲婴儿”技术主要是为了避免母亲线粒体中的致病基因传递给后代，主要解决的是线粒体遗传病
问题，而镰状细胞贫血症是核基因控制的遗传病，该技术不能有效治疗镰状细胞贫血症等因核基因改
变而引起的疾病，B 错误；
C、图中细胞在体外培养时，需置于含95%空气和5%CO2 的混合气体的CO2 培养箱中。其中，O2
是细胞代谢所必需的，CO2 的主要作用是维持培养液的pH，C 正确；
D、“三亲婴儿”的细胞核基因来自母亲B 和父亲C，细胞质基因来自捐献者A，因此其外貌特征与
提供细胞核的父母和提供细胞质的女性都有关，D 错误。
故选C。
8．体外动物细胞培养制造出的细胞培养肉是一种人造肉，具有营养可控、结构仿真、口感真实的特点。
其主要生产流程如下图，图中的微载体是一种固体的细胞生长基质，其表面能使细胞贴附。下列叙述
错误的是（ ）
A．①过程可用机械方法或用胰蛋白酶、胃蛋白酶处理获得细胞悬液
B．③④过程需使用经灭菌处理的培养液，富含细胞生长所需的营养物质
C．③过程加入微载体为细胞提供更大附着面积，延迟接触抑制出现，可增加产量
D．动物细胞培养技术的原理是细胞增殖，培养过程中细胞通过有丝分裂增加细胞数目
【答案】A
【分析】动物细胞培养需要满足以下条件：①无菌、无毒的环境。②营养：合成培养基成分：糖、氨
基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。③温度：适宜温度。
④气体环境：95%空气+5%CO2，O2 是细胞代谢所必需的，CO2 的主要作用是维持培养液的pH。
【详解】A、①过程为制备细胞悬液的过程，可用机械的方法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理的方法获
得细胞悬液，胃蛋白酶最适pH 为2，在7.2~7.4 的环境中会失活，A 错误；
B、③④过程需使用经灭菌处理的培养液，培养细胞时提供95%空气+5%CO2，B 正确；
C、③过程中加入微载体为细胞提供了更大的附着面积，为生物提供了更多的空间，延迟接触抑制出现，
可增加产量，C 正确；
D、动物细胞培养技术的原理是细胞增殖，培养过程中细胞通过有丝分裂增加细胞数目，D 正确。
故选A。
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题型3 发酵工程优化
1．蓝莓中含有丰富的矿质元素和维生素，有机酸种类丰富。某同学按照“蓝莓果实→清洗破碎→酶解→
过滤→硫处理→成分调整→接种→主发酵→倒灌过滤→后发酵→陈酿→澄清→配兑→灌装→杀菌→成
品”的流程研究蓝莓果酒酿造工艺。下列叙述错误的是（ ）
A．发酵前需要对基因工程获得的高产菌株进行扩大培养
B．主发酵和后发酵时都需要密闭，且保持温度在28℃左右
C．在成分调整环节按比例添加蔗糖可以提高果酒的酒精含量
D．发酵过程中要适时排气，后发酵时期可以适当延长排气时间间隔
【答案】B
【分析】发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，
或直接把微生物应用于工业生产过程的一种技术。发酵工程的内容包括菌种选育、培养基的配置、灭
菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯（生物分离工程）等方面。
【详解】A、基因工程获得的高产菌株在发酵前需扩大培养，以增加菌种数量，确保发酵效率，A 正确；
B、酵母菌的增殖和酒精产生均在主发酵阶段完成，主发酵时先进行通气后密闭，后发酵应在低温、密
闭环境下进行，B 错误；
C、调整成分时主要添加的是蔗糖，目的是提供营养物质，增加酒精产量，C 正确；
D、主发酵阶段产气量大，需及时排气；后发酵产气减少，可延长排气间隔，D 正确。
故选B。
2．玉米秸秆中含有丰富的粗纤维和粗蛋白等营养成分，将玉米秸秆资源化，利用绿色木霉生产单细胞蛋
白饲料的工艺流程如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．绿色木霉应具有能分泌大量淀粉酶、不产生有毒物质等优点
B．玉米秸秆可为绿色木霉生长提供所需的碳源和氮源等
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C．以玉米秸秆为原料获得单细胞蛋白，有利于提高能量的利用率
D．通风培养过程中，应定时检测绿色木霉的数量及原料中粗纤维、粗蛋白的含量
【答案】A
【分析】玉米秸秆中含有丰富的粗纤维和粗蛋白等营养成分，要将玉米秸秆中的这些大分子物质分解
利用，绿色木霉应具有能分泌大量纤维素酶和蛋白酶等优点，而不是淀粉酶。因为淀粉酶主要作用于
淀粉，将淀粉分解为小分子糖类，而玉米秸秆中的主要成分是粗纤维（主要成分是纤维素）和粗蛋白
【详解】A、玉米秸秆中含有丰富的粗纤维和粗蛋白等营养成分，要将玉米秸秆中的这些大分子物质分
解利用，绿色木霉应具有能分泌大量纤维素酶和蛋白酶等优点，而不是淀粉酶。因为淀粉酶主要作用
于淀粉，将淀粉分解为小分子糖类，而玉米秸秆中的主要成分是粗纤维（主要成分是纤维素）和粗蛋
白，A 错误；
B、玉米秸秆中含有碳元素和氮元素等，可为绿色木霉生长提供所需的碳源和氮源等营养物质，B 正
确；
C、以玉米秸秆为原料获得单细胞蛋白，实现了对玉米秸秆中营养物质的利用，使能量更多地流向对
人类有益的部分，有利于提高能量的利用率，C 正确；
D、通风培养过程中，定时检测绿色木霉的数量可以了解其生长状况，以便及时调整培养条件；检测
原料中粗纤维、粗蛋白的含量，能够判断绿色木霉对原料的分解利用情况，D 正确。
故选A。
3．生产L-谷氨酸主要依赖有氧发酵，常用菌种谷氨酸棒状杆菌大多为生物素合成缺陷型。在各组发酵罐
中分别添加不同浓度的生物素，检测结果如下图。下列叙述错误的是（ ）
A．发酵前用平板划线法进行谷氨酸棒状杆菌的纯培养
B．发酵过程将空气直接通入发酵罐以保证有氧条件
C．甲～丁组谷氨酸棒状杆菌数量均呈现“S”形增长
D．乙～丁组L-谷氨酸产量不与菌体细胞密度呈正比
【答案】B
【分析】 微生物常见的接种的方法：
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（1）平板划线法：把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基，通
过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当
作待分离微生物的纯种。
（2）稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体
培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从
而能在培养基表面形成单个的菌落。
【详解】A、平板划线法是微生物纯培养的常用方法之一，发酵前可以用平板划线法进行谷氨酸棒状杆
菌的纯培养，A 正确；
B、发酵过程不能将空气直接通入发酵罐，因为空气中可能含有杂菌等，会污染发酵液，应该对通入的
空气进行过滤等处理后再通入发酵罐，B 错误；
C、从左图中可以看出，甲 - 丁组谷氨酸棒状杆菌的数量都是先增加，然后趋于稳定，均呈现 “S”
形增长，C 正确；
D、观察右图和左图，对比乙 - 丁组菌体细胞密度和 L - 谷氨酸产量的变化趋势，发现 L - 谷氨酸产
量并不随着菌体细胞密度的增加而一直增加，即乙 - 丁组 L - 谷氨酸产量不与菌体细胞密度呈正比，
D 正确。
故选B。
4．如图为发酵工程规模化生产产品的流程图，下列叙述错误的是（ ）
A．图中①②③是发酵工程的中心环节
B．若生产人生长激素的工程菌是通过①培育而来，则①需用到转基因技术
C．扩大培养的条件和发酵罐内发酵的条件可能不同
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D．如果⑥是微生物菌体，分离、提纯的方法是过滤、沉淀等
【答案】A
【分析】1、发酵工程生产的产品有两类：一类是代谢产物，另一类是菌体本身。产品不同，分离提纯
的方法一般不同。①如果产品是菌体，可采用过滤，沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来；②如果
产品是代谢产物，可用萃取、蒸馏、离子交换等方法进行提取。
2、发酵过程中要严格控制温度、pH、溶氧、通气量与转速等发酵条件。
3、发酵过程一般来说都是在常温常压下进行，条件温和、反应安全，原料简单、污染小，反应专一性
强，因而可以得到较为专一的产物。
【详解】A、由图可知，①②③表示筛选或培育优良菌种，而发酵工程的中心环节是发酵罐内发酵，A
错误；
B、生产人生长激素的工程菌需用转基因技术获得，B 正确；
C、扩大培养的目的是获得更多的菌种，发酵罐内发酵的目的是获得更多的发酵产物，目的不同，因此
条件可能不同，C 正确；
D、如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥，
即可得到产品，D 正确。
故选A。
5．ε-聚赖氨酸是一种由白色链霉菌发酵产生并分泌的具有抑菌功效的多肽，可被人体消化分解，最终转化
为人体必需的赖氨酸，安全性高。如图为ε-聚赖氨酸生产的简要流程，下列叙述正确的是（ ）
A．白色链霉菌的细胞结构和代谢类型都类似于酵母菌
B．在ε-聚赖氨酸的生产过程中需密切监控发酵液的pH
C．生产的ε-聚赖氨酸具有抑菌作用，通入的空气无须灭菌
D．发酵产物ε-聚赖氨酸需从白色链霉菌体内分离提纯
【答案】B
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【分析】白色链霉菌是细菌，是原核生物，而酵母菌是真核生物，因此两者的细胞结构不同；白色链
霉菌的代谢类型是好氧型，而酵母菌是兼性厌氧型，因此两者的代谢类型也不同
【详解】A、白色链霉菌是细菌，是原核生物，而酵母菌是真核生物，因此两者的细胞结构不同；白色
链霉菌的代谢类型是好氧型，而酵母菌是兼性厌氧型，因此两者的代谢类型也不同，A 错误。
B、在ε-聚赖氨酸的生产过程中，随着ε-聚赖氨酸的生成，发酵液的pH 会发生变化，为了维持发酵的
适宜条件，需密切监控发酵液的pH 并及时添加pH 调节液，B 正确；
C、通入的空气必须灭菌，以防杂菌污染，C 错误；
D、发酵产物ε-聚赖氨酸是白色链霉菌的分泌物，不需要从白色链霉菌体内分离提纯，D 错误。
故选B。
6．发酵制作酱油在我国具有悠久的历史。某企业通过发酵制作酱油的流程示意图如下。下列叙述错误的
是（ ）
A．大豆中的蛋白质可为菌种生长提供碳源、氮源
B．该过程利用乳酸菌、酵母菌等微生物的有氧呼吸
C．发酵罐和原料需要灭菌，加盐可调味并防止杂菌滋生
D．米曲霉分泌蛋白酶、淀粉酶等利于原料中有机物的分解
【答案】B
【分析】1、酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，把糖分解成
二氧化碳和水；在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。
2、由题图信息分析可知，酿造酱油主要利用的是米曲霉，能够产生蛋白酶和脂肪酶，将蛋白质和脂肪
分别水解成小分子的肽和氨基酸、甘油和脂肪酸。
【详解】A、大豆中含有丰富的蛋白质，蛋白质由C、H、O、N 等元素组成。 在微生物的生长过程中，
蛋白质可以被分解利用，其中的碳元素可作为碳源，氮元素可作为氮源，为菌种生长提供所需的物质
和能量，A 正确；
B、乳酸菌是厌氧菌，主要进行无氧呼吸产生乳酸。 而酵母菌在有氧条件下进行有氧呼吸大量繁殖，
在无氧条件下进行无氧呼吸产生酒精等。在酱油发酵过程中，乳酸菌进行无氧呼吸参与发酵，不是利
用其有氧呼吸，B 错误；
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C、发酵罐和原料灭菌是为了防止杂菌污染，避免杂菌与发酵菌种竞争营养物质等，影响发酵过程。
加盐一方面可以增加酱油的风味，进行调味；另一方面高浓度的盐可以抑制杂菌的生长繁殖，防止杂
菌滋生，C 正确；
D、米曲霉能够分泌蛋白酶、淀粉酶等多种酶。 蛋白酶可以分解原料中的蛋白质为小分子肽和氨基酸，
淀粉酶可以分解淀粉为葡萄糖等，有利于原料中有机物的分解，为后续发酵提供更易被利用的营养物
质，D 正确。
故选B。
7．科研人员通过改良发酵工艺“把玉米变成衣服”，即利用大肠杆菌将玉米转化为戊二胺，再将戊二胺
转化为尼龙布，流程如图所示。其中，戊二胺不能从大肠杆菌体内排出，且对细胞有毒害作用。下列
相关分析错误的是（ ）
A．该工业生产中要使用淀粉酶、果胶酶、纤维素酶等酶制剂
B．发酵过程中，应将培养液置于有氧、pH 中性或接近中性的条件下培养
C．发酵时定期更换培养液，能降低戊二胺对大肠杆菌的毒害
D．发酵结束后，可采用提取、分离和纯化措施来获得戊二胺
【答案】C
【分析】发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，
或直接把微生物应用于工业生产过程的一种技术。发酵工程的内容包括菌种选育、培养基的配制、灭
菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯（生物分离工程）等方面。
【详解】A、玉米籽粒主要含淀粉，非粮原料(秸秆、玉米芯)主要含纤维素和果胶，淀粉酶、果胶酶和
纤维素酶等酶制剂可以帮助分解玉米原料为葡萄糖，以利于后续发酵过程的进行，A 正确；
B、发酵过程利用的菌种是大肠杆菌(一种细菌)，大肠杆菌适宜在有氧、pH 中性或接近中性的条件下培
养，B 正确；
C、根据题意，戊二胺因不能排出大肠杆菌而对其有毒害作用，所以可能需要通过基因工程改造大肠杆
菌，使其能够耐受或排出戊二胺，仅定期更换培养液不能解决戊二胺对大肠杆菌的毒害作用，C 错误；
D、 根据题意，发酵产品是大肠杆菌的代谢产物，不是大肠杆菌细胞本身，所以需根据戊二胺的性质
采取适当的提取、分离和纯化措施来获得戊二胺，D 正确。
故选C。
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题型4 基因工程与发酵工程综合
1．蛋白质工程中可以利用引物引导的方法对DNA 进行定点突变，进而改变蛋白质的特定氨基酸。图示为
这种定点诱变方法的实验流程。已知在细菌体内合成的DNA 分子有甲基化修饰，通过PCR 扩增的
DNA 链无甲基化修饰。据图分析，下列叙述错误的是（ ）
A．待突变质粒的甲基化修饰不会影响PCR 扩增
B．用于突变的两条引物之间不能发生碱基互补配对
C．图中所示限制酶能够识别质粒中发生甲基化的位点
D．突变质粒缺口补齐依赖于大肠杆菌DNA 连接酶的作用
【答案】B
【分析】甲基化修饰属于表观遗传的一种，只会影响基因的表达过程，不会影响基因的复制；DNA 连
接酶可以进行DNA 片段之间的连接，合成磷酸二酯键。
【详解】A、甲基化修饰属于表观遗传的一种，只会影响基因的表达过程，不会影响基因的复制，而
PCR 扩增的实质就是DNA 在体外进行的复制，所以待突变质粒的甲基化修饰不会影响PCR 扩增，A 正
确；
B、由图可以看出，用于突变的两条引物之间在第三、四幅图（从左往右）中都进行了碱基互补配对
（成环、且挨得很近），B 错误；
C、由图可以看出，经限制酶切割后，被甲基化修饰的待突变质粒模板被切割（第四幅图虚线的环），
所以图中所示限制酶能够识别质粒中发生甲基化的位点，C 正确；
D、由图可以看出，转入大肠杆菌后突变质粒的缺口被补齐，而大肠杆菌中有DNA 连接酶，且DNA 连
接酶可以进行DNA 片段之间的连接，所以突变质粒缺口补齐依赖于大肠杆菌DNA 连接酶的作用，D
正确。
故选B。
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2．大肠杆菌有AR 菌和AS 菌两种类型，只有AR 菌对氨卞青霉素（Amp）有抗性。某兴趣小组用CaCl2
处理两种菌后，进行了以下实验。
实验1：将AS 菌与煮沸灭活的AR 菌混合后，接种于含Amp 的固体培养基上，获得了少量培养物
实验2：将具有氨卞青霉素抗性基因的质粒加入AS 菌液，一段时间后接种于含Amp 的固体培养基上，获
得了少量培养物
下列对实验方法或现象的分析，正确的是（ ）
A．实验1 和实验2 都发生了细菌转化现象，其转化因子就是质粒DNA
B．实验2 的AS 获得了可稳定遗传的表型变化，推测质粒具有遗传效应
C．两个实验都需增设仅接种AS 菌的对照组，旨在排除杂菌污染的影响
D．将实验中灭活的AR 菌破碎并加入限制酶，则无法再现实验1 的结果
【答案】B
【分析】1、质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细胞核和拟核的DNA 之外，并具有自我复制能力
的很小的双链环状DNA 分子。携带外源DNA 片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，
或整合到受体细胞的DNA 上，随受体细胞的DNA 同步复制。
2、用CaCl2 处理两种菌后，两种菌的细胞膜通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA 的载体分子
通过的感受态细胞。
【详解】A、实验1 中，“煮沸灭活的AR 菌”中的DNA 作为转化因子被AS 菌吸收，让部分AS 菌变
成了能抵抗Amp 的AR 菌；实验2 中，具有氨卞青霉素抗性基因的质粒作为转化因子被AS 菌吸收，让
部分AS 菌发挥了氨卞青霉素抗性基因的作用，在含Amp 的固体培养基上，获得了少量培养物，A 错
误；
B、实验2 中，具有氨卞青霉素抗性基因的质粒被部分AS 菌吸收，使少量AS 菌发挥了氨卞青霉素抗
性基因的作用，获得了可稳定遗传的表型变化，推测质粒具有遗传效应，B 正确；
C、两个实验都需增设仅接种AS 菌的对照组，以验证Amp 对AS 菌生长的真实影响，排除干扰因素，
确保结论的科学性和可靠性，C 错误；
D、将实验中灭活的AR 菌破碎并加入限制酶，若该种限制酶不破坏AR 菌的氨卞青霉素抗性基因，可
能会再现实验1 的结果，D 错误。
故选B。
3．大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA 就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在
上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。
下列叙述正确的是（ ）
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A．可利用DNA 在酒精中溶解度较大的特点来提取质粒DNA
B．将提取的DNA 溶于2mol/LNaCl 溶液后，不能用二苯胺试剂进行鉴定
C．凝胶中的DNA 分子通过染色，可在紫外灯下被检测出来
D．根据电泳结果，质粒上没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，有限制酶Ⅲ的切割位点
【答案】C
【分析】DNA 粗提取和鉴定的原理：
（1）DNA 的溶解性：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同（DNA 在
0.14mol/L 的氯化钠中溶解度最低）；DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。
（2）DNA 的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、蛋白质可溶于酒精，而DNA 在冷酒精中溶解度很低，所以在提取DNA 时加入酒精，使溶
于酒精的蛋白质等物质溶解，而让DNA 析出，A 错误；
B、由于DNA 在2mol/LNaCl 溶液中溶解度较大，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色，所以将提取的DNA
溶于2mol/LNaCl 溶液后，可用二苯胺试剂在沸水条件进行鉴定，B 错误；
C、凝胶中的DNA 分子通过染色，可在紫外灯下出现一定的颜色特征，从而被检测出来，C 正确；
D、因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个
切割位点，也可能没有切割位点，D 错误。
故选C。
4．肌醇在生物医药、食品和饲料领域具有广泛用途。科研人员运用基因工程技术改造大肠杆菌以生产肌
醇。过程是从酿酒酵母获取关键基因I，与质粒p 连接构建重组质粒p-I，再导入大肠杆菌BL21 获得重
组菌BL21/p-I。回答下列问题：
(1)构建重组质粒p-I 时，先用限制酶BamHI 和HindⅢ切质粒p，若目的基因内部含有这两种限制酶识别位
点，则需在基因I 进行PCR 扩增时在引物的 端添加能产生 末端的限制酶的识别序列。相对于单
酶切，采用双酶切法理论上最多可减少 种环状DNA 分子的产生（不考虑2 个及以上同种分子之间的
连接）。
(2)构建基因表达载体时连在基因I 上游的启动子应来自 （填“大肠杆菌”或“酿酒酵母”）。重组
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质粒p-I 在导入大肠杆菌BL21 时，需用 处理，使其处于 的状态。
(3)为检测大肠杆菌中基因I 是否导入成功，提取其质粒进行酶切，酶切产物做电泳分析，结果如右图（酶
切后产生的极短DNA 片段不可见）。由图分析可知，样品 含有重组质粒。
(4)科研人员对重组菌产肌醇的发酵条件进行了探究，结果见下图。由图可知， 因素的变化对肌醇产
量影响最小。若进一步探究葡萄糖量对肌醇产量的影响，新增实验组的葡萄糖量应设在 g/L 范围内。
(5)工业化生产肌醇时，从降低成本考虑，可采取 措施（答1 点）。发酵过程中，要随时检测 、
，以了解发酵进程。
【答案】(1) 5' 相同 3
(2) 大肠杆菌 Ca2+ 能吸收周围环境中 DNA 分子
(3)2
(4) 接种量 10–14
(5) 将发酵条件设置为最优；优化培养基配方；利用廉价原料替代昂贵原料；重复利用发酵设备等
大肠杆菌数量或微生物数量 肌醇浓度（产量）或产物浓度
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR
技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基
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因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受
体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法
和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞
的方法是Ca2+转化法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的
DNA 是否插入目的基因一DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA 一分子杂交技术；
③检测目的基因是否翻译成蛋白质一抗原一抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、
活性鉴定等。
2、基因对性状的控制：基因通过控制蛋白质的结构直接控制生物体的性状。基因还可以通过控制酶的
合成控制细胞代谢，从而控制生物体的性状。
【详解】（1）若目的基因内部含有这两种限制酶识别位点，为防止限制酶切割部位在目的基因内部，
破坏目的基因，则需在目的基因I 进行PCR 扩增时在引物的5'端添加能产生相同末端的限制酶的识别
序列。对于单酶切，采用双酶切可避免自身环化，从理论上最多可减少3 种（质粒自身环化、目的基
因自身环化、反向连接的两种情况）DNA 产生。
（2）基因表达载体在基因上的启动子启动方向应与“大肠杆菌”一致，因为要在大肠杆菌中表达。
重组质粒p - L 导入大肠杆菌BL21 时，需用Ca²⁺处理，使其处于感受态，便于吸收周围环境中的DNA
分子。
（3）提取质粒进行酶切，酶切产物电泳分析，重组质粒会被切为两个片段。根据图中条带，样品2 产
生两个条带，所以样品2 含有重组质粒。
（4）观察所给的三个柱状图，分别是初始葡萄糖添加量、接种量、诱导温度对肌醇产量的影响。对比
三个图中不同条件下肌醇产量的波动情况。在初始葡萄糖添加量变化时，肌醇产量有较明显变化；诱
导温度变化时，肌醇产量也有较大差异；而接种量从1% - 5%变化时，肌醇产量的波动相对较小。所以
可以判断出接种量因素的变化对肌醇产量影响最小。观察初始葡萄糖添加量对肌醇产量影响的柱状图，
发现当葡萄糖添加量在10 - 14g/L 时，肌醇产量相对较高且产量变化情况可能还存在进一步探究的空间，
所以为了进一步探究葡萄糖量对肌醇产量的影响，新增实验组的葡萄糖量应设在10 - 14g/L 范围内。
（5）从降低成本考虑，可采取将发酵条件设置为最适；优化培养基配方；利用廉价原料替代昂贵原料；
重复利用发酵设备等措施。 发酵过程中，需随时检测大肠杆菌数量或生物量、肌醇酶浓度（产量）或
产物浓度，以了解发酵进程。
5．同源重组基因敲除技术是将同源DNA 片段导入受体细胞，利用同源 DNA 片段的互换，用其他DNA
片段在原有位置替代靶基因，从而实现基因的敲除。米曲霉产生的曲酸具有抗菌性、抗氧化性等抗逆
能力，具有重要的应用价值。为提高米曲霉产曲酸能力，科研人员用同源重组基因敲除技术成功敲除
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了米曲霉3.042 菌株中的msn2 基因，获得高产的g-5 菌株。其部分机理如图1 所示（bp 表示碱基对）。
(1)构建基因敲除框需要的工具酶有 ，将基因敲除框导入米曲霉细胞常用的方法是 。
(2)科研人员选取进行基因敲除操作后的3 个菌落，分别提取其DNA，选择图中引物 进行PCR 扩增，
电泳结果如图2 所示。根据1 号菌落电泳结果可得出的结论是 。为进一步验证3 号菌落为目的菌落，
需要选择图中引物 重复上述操作。
(3)米曲霉的曲酸产量与其对逆境的敏感性有关，tpsⅠ基因表达产物可以降低米曲霉对逆境的敏感性。推测
tpsⅠ基因表达产物与曲酸合成的关系是 。为验证该推测，可采用的实验方法是 ，预期实验结果
是 。
【答案】(1) 限制酶、DNA 连接酶 钙离子转化法
(2) A 和B 1 号菌落没有实现基因敲除，含有米曲霉3.042 基因组原始序列 C 和D
(3) msn2 基因表达产物的缺乏，抑制了tpsI 基因的表达，提高了米曲霉对逆境的敏感性，从而导
致米曲霉产生更多的曲酸 敲除米曲霉的msn2 基因，检测米曲霉的曲酸产量 曲酸产量增
多
【分析】基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用同源DNA 片段替代靶基因片段，从而达到基因
敲除的目的，由此可见，基因敲除可定向改变生物体的某一基因。基因敲除既可以是用突变基因或其
它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。
【详解】（1）从图中可以看出在msn2 两侧存在msn2L 和msn2R 基因，所以欲实现msn2 基因的敲除，
需要在pyrG 基因两侧分别插入msn2L 和msn2R 片段，在这个过程中，需要用限制酶将基因切割，再用
DNA 连接酶将三个基因片段连接；米曲霉是微生物，常用钙离子转化法将外源基因转入微生物细胞。
（2） 从图中可以看出，引物C 和引物D 都不能将g-5 基因组扩增完，所以为进行PCR 扩增，需要选
择引物A 和B；1 号菌落碱基对接近3000bp≈1024+1024+909，所以没有实现基因敲除，含有米曲霉
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3.042 基因组原始序列；3 号菌落大约含有3700bp 的碱基对，引物C 和D 可以扩增pyrG，所以可以选
择引物C 和D 重新扩增并电泳。
（3） tpsI 基因表达产物可以降低米曲霉对逆境的敏感性，g-5 菌落tpsI 基因表达量明显降低，所以可
以推测msn2 基因敲除能使米曲霉产曲酸增多的机理是msn2 基因表达产物的缺乏，抑制了tpsI 基因的
表达，提高了米曲霉对逆境的敏感性，从而导致米曲霉产生更多的曲酸；为验证该推测，可采用的实
验方法是将米曲霉的msn2 基因敲除，检测米曲霉的曲酸产量。预期msn2 基因敲除，米曲霉的曲酸产
量增多。
6．米曲霉的改造
曲酸具有抗菌性、抗氧化性等抗逆能力，具有重要的应用价值。为提高米曲霉产曲酸能力，科研人员用同
源重组基因敲除技术成功敲除了米曲霉g-3 菌株中的msn2 基因，获得高产的g-5 菌株，部分过程如图
1，其中kanr（卡那霉素抗性基因）、pyrG 基因（表达合成尿嘧啶）为标记基因。步骤Ⅲ米曲霉g-3 发
生的变化如图2 所示。
(1)步骤 I 的接种方法一般为 。
(2)下列关于培养基甲和乙的相关叙述，正确的是_____。（多选）
A．培养基甲为固体培养基
B．培养基甲为鉴别培养基
C．培养基乙可获得大量质粒
D．培养基乙需加入卡那霉素
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科研人员选取培养基丙的3 个菌落，分别提取其基因组DNA，选用图2 中相关引物进行PCR 扩增，结果
如图3 所示。
(3)根据图3 结果可知，科研人员选用的PCR 引物组合为_____。（单选）
A．引物A 和引物B
B．引物C 和引物E
C．引物A 和引物C
D．引物B 和引物E
(4)根据图3 结果， 号泳道对应菌株为目的菌株g-5．为进一步验证，科研人员重新选择图2 的相关引
物组合重复上述操作，请将获得的电泳结果在答题纸相应虚线方框内涂黑。
(5)尿嘧啶属于曲霉生长所需的 。（编号选填）由图1、2 和相关信息推断，与培养基丙相比，培养基
丁 尿嘧啶。（编号选填）
①碳源②氮源③无机盐④生长因子⑤含⑥不含
(6)图1 所示实验步骤中需要使用无菌技术的有 。（编号选填）
①步骤I②步骤③步骤Ⅲ④步骤IV
对摇瓶培养相同时间后的g-3 和g-5 在相同放大倍数下镜检结果如图4，在比较两者菌丝球（菌丝缠绕而
成）形态后科研人员认为g-5 对外界营养物质吸收速率快于g-3，是其曲酸产量高的原因之一、
(7)据此判断图4 中 （A/B）视野中菌株为g-5。
米曲霉的曲酸产量与其对逆境的敏感性有关，tps1 基因表达产物可以降低米曲霉对逆境的敏感性。研究发
现g-5 菌株tpsI 基因表达量明显降低。
(8)综合以上信息，阐述msn2 基因敲除能使米曲霉产曲酸增多的可能机制 。
【答案】(1)稀释涂布平板法
(2)ACD
(3)C
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(4) 3
(5)
④
⑥
(6)①②③④
(7)B
(8)米曲霉被敲除 msn2 基因后，一方面菌丝缠绕程度下降，菌丝对外界营养物质的吸收速率提高，有
更多营养物质用于产生曲酸；另一方面，msn2 基因表达产物的缺乏，抑制了tpsI 基因的表达，提高了
米曲霉对逆境的敏感性，从而使米曲霉产生更多的曲酸。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的筛选和获取从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便
于目的基因的鉴定和筛选，是基因工程的核心步骤。
（3）将目的基因导入受体细胞将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通
道法。将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感
受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因
——PCR 等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR 等技术；③检测目的基因是否翻译成
蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）从图中可以看出，步骤 I 是将含有重组质粒的大肠杆菌接种到培养基甲上，在固体培养
基上进行筛选等操作，其接种方法一般为稀释涂布平板法。
（2）A、从图中可以看到，步骤 I 是将含有重组质粒的大肠杆菌接种到培养基甲上，一般在固体培养
基上进行接种操作，方便筛选单菌落等，所以培养基甲为固体培养基，A 正确；
B、培养基甲为选择培养基，而不是鉴别培养基，B 错误；
C、培养基乙用于培养导入重组质粒的米曲霉，目的是培养米曲霉并使其生长繁殖，进而获得高产曲酸
等，故培养基乙可获得大量质粒，C 正确；
D、重组质粒中含有kanr（卡那霉素抗性基因），因此在培养基乙中加入卡那霉素可以筛选出含有重组
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质粒的米曲霉，D 正确。
故选ACD。
（3）从图3 中可以看出，3 号菌落相关DNA 的碱基对接近3706bp≈1032+1650+1024，由此可知，科研
人员选用的PCR 引物组合为引物A 和引物C，C 正确。
故选C。
（4）3 号菌落大约含有3700bp 的碱基对，3 道的条带情况与目的菌株 g - 5 预期条带特征相符，所以3
道对应菌株为目的菌株 g - 5。
（5）尿嘧啶是含氮的小分子有机物，在微生物培养中属于生长因子，所以选④。菌株 g - 5 能在培养
基丙上生长，不能在培养基丁上生长，结合图2 中基因缺失情况，推测是培养基丁不含尿嘧啶，所以
选⑥。
（6）为了防止杂菌污染，影响实验结果，整个过程都应该无菌处理，因此图1 所示实验步骤中需要使
用无菌技术的有步骤I、步骤、步骤Ⅲ、步骤IV，即①②③④正确。
（7）g-5 对外界营养物质吸收速率快于g-3，由于图4 中B 视野中的菌株缠绕程度上升，菌丝对外界营
养物质的吸收速率提高，有更多营养物质用于产生曲酸，因此B 视野中菌株为g-5。
（8）米曲霉被敲除 msn2 基因后，一方面菌丝缠绕程度下降，菌丝对外界营养物质的吸收速率提高，
有更多营养物质用于产生曲酸；另一方面，msn2 基因表达产物的缺乏，抑制了tpsI 基因的表达，提高
了米曲霉对逆境的敏感性，从而使米曲霉产生更多的曲酸，因此msn2 基因敲除能使米曲霉产曲酸增多。
7．乙偶姻是一种天然存在于多种食品中的化合物，常被用作食品添加剂和防腐剂。当前，生物法制备乙
偶姻主要以糖类为底物，从微生物发酵液中提取乙偶姻，其代谢途径如图1。
为了得到高产乙偶姻的菌株，科学家构建了budC 基因敲除的枯草芽孢杆菌，构建流程如图2。
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注：1）F1、F2、R1、R2表示引物，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，Kanr为卡那霉素抗性基因，Tetr为四环素
抗性基因。2）同源重组是指两个DNA 分子的相同区域之间发生的交换和重组。
(1)PCR 过程中，每次循环可分为 三步，扩增budC 基因下游片段时引物中需分别添加 的酶切
位点。
(2)为筛选出目的菌株（即含有完整重组质粒的枯草芽孢杆菌），请完善以下内容：
序
步骤内容
结果及结论
1
将经图中③处理的枯草芽孢杆菌接种到含氨苄青霉素
的培养基上培养，一段时间后，培养基上出现单菌
落。
，说明该单菌落的
菌株即为目的菌株。
2
将 培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生
长。
(3)为检测枯草芽孢杆菌budC 基因敲除是否成功，研究人员提取（2）小题筛选出的枯草芽孢杆菌的5 个菌
株的基因组，然后用引物F1和R2进行扩增并电泳，结果如图3。根据电泳结果能判断budC 基因敲除成功，
原因是 。
(4)将budC 基因敲除成功的枯草芽孢杆菌经过优化后投入到工厂中进行乙偶姻的生产，请在图4 中补充发
酵产乙偶姻的基本步骤 、 。
【答案】(1) 变性、复性、延伸 XbaⅠ和SphⅠ
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(2) 两种（或分别含有卡那霉素和四环素的）培养基上都没有菌落生长 步骤1 得到的单菌落
影印接种到分别含有卡那霉素和四环素的培养基上
(3)引物F1 和R2 扩增出的DNA 片段为budC 基因或重组质粒中的重组片段，根据图3 的电泳结果可知
扩增出的DNA 片段长度为1500bp，而budC 基因的长度为4563bp，说明目的菌株的基因组中没有
budC 基因。
(4) 扩大培养 分离、提纯产物
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将
目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）PCR 技术，即聚合酶链式反应，其过程中每次循环都包含变性、复性和延伸这三个关键
步骤。在变性步骤中，DNA 双链被打开成单链；在复性步骤中，引物与DNA 单链的特定区域结合；
在延伸步骤中，DNA 聚合酶沿着引物延伸，合成新的DNA 链。由于扩增所得的budC 基因的下游要与
质粒的终止子端连接，据图2 分析可知，当需要扩增budC 基因的下游片段时，引物中需分别添加XbaⅠ
和SphⅠ的酶切位点。
（2）据题图2 分析可知，为了筛选出含有完整重组质粒的枯草芽孢杆菌（即目的菌株），可以进行以
下步骤：首先，将经过图中③（转化）处理的枯草芽孢杆菌接种到含有氨苄青霉素的培养基上培养，
一段时间后，培养基上出现单菌落。由于原始质粒和重组质粒上都含有氨苄青霉素抗性基因
（Ampr），因此培养基上都能出现的单菌落，无法确定是否为重组质粒。所以为了进一步验证这些菌
落的菌株是否真正含有重组质粒，可以将步骤1 得到的单菌落影印接种到分别含有卡那霉素和四环素
的培养基上培养一段时间，并观察培养基上是否有菌落生长。由于原始质粒上含有卡那霉素抗性基因
和四环素抗性基因，而重组质粒上并不包含这两个基因，所以若某个菌株能在含有四环素或卡那霉素
的培养基上生长，那么就说明它导入的并不是重组质粒，而是原始质粒或其他质粒。若某个菌株不能
在含有四环素或卡那霉素的培养基上生长，则说明该单菌落的菌株即为目的菌株。
（3）据题图2 分析可知，为了检测枯草芽孢杆菌budC 基因敲除是否成功，研究人员提取了筛选出的
枯草芽孢杆菌的基因组，并用引物F1 和R2 进行扩增和电泳。根据电泳结果，如果只能扩增出较小的
片段（即budC 基因被敲除后的剩余部分），那么说明budC 基因敲除成功。因为引物F1 和R2 分别位
于budC 基因的两侧，如果budC 基因存在，那么扩增出的片段应该较大；而如果budC 基因被敲除，那
么扩增出的片段就会较小。所以根据电泳结果能判断budC 基因敲除成功，原因是引物F1 和R2 扩增出
的DNA 片段为budC 基因或重组质粒中的重组片段，根据图3 的电泳结果可知扩增出的DNA 片段长度
为1500bp，而budC 基因的长度为4563bp，说明目的菌株的基因组中没有budC 基因。
（4）将budC 基因敲除成功的枯草芽孢杆菌经过优化后投入到工厂中进行乙偶姻的生产，属于发酵工
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程，发酵工程的基本环节是：菌种的选育、扩大培养、培养基的配制、灭菌、接种、发酵、产品的分
离、提纯。因此图4 中发酵产乙偶姻的基本步骤中缺少的步骤分别为扩大培养、分离、提纯产物。
8．细菌中的蛋白激酶Y 感受外界刺激后，利用ATP 将特异性底物A 蛋白磷酸化，改变A 蛋白的活性从而
应答外界刺激，调控细菌的生长。研究者将Y 基因（编码蛋白激酶Y）与GFP 基因（编码绿色荧光蛋
白）拼接成Y-GFP 融合基因（Y-GFP 基因），导入载体，并表达出融合蛋白（Y-GFP 蛋白），以分析
蛋白激酶Y 的功能，实验过程如图示。
限制酶名
称
EcoRI
BamHI
XhoI
MunI
识别序列
5'G↓AATTC3'
5'G↓GATCC3'
5'C↓TCGAG3'
5'C↓AATTG3'
(1)据图分析，为获得Y-GFP 融合基因，在设计引物时，引物F2 和F3 序列应该分别选择（ ）
A．5’TCACTGCTAGCG3’
B．5’TTACGACTAGCG3’
C．5’CGCTAGTCGTAA3’
D．5’CGCTAGCAGTGA3’
(2)构建基因表达载体时，因融合基因两端不含酶切位点，根据题中所提供的限制酶，应当在引物F1 和F4
中分别添加 限制酶识别序列，若用EcoRI 和BamHI 切割（完全酶切）构建成功的表达载体，能够
得到 个片段。
(3)常用 法将基因表达载体导入大肠杆菌，在检测融合基因表达情况时发现，能够检测到融合基因
的mRNA，但表达的蛋白质只有蛋白激酶Y，原因是 。
(4)A 蛋白磷酸化水平一定程度上代表了细菌对外界刺激的反应程度，在导入基因表达载体的大肠杆菌中，
可通过直接观察 来反应这一情况。
【答案】(1)BC
(2) Mun I 和Xho I 2/二/两
(3) Ca2+处理法 Y 基因中编码终止密码子的序列未去除，翻译到终止密码子处停止翻译
(4)绿色荧光强度
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【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将
目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）据题图分析可知，为获得Y-GFP 融合基因，需要设计特定的引物进行PCR 扩增。由于
PCR 扩增是依赖模板进行的，且需要保证扩增出的片段是Y 基因与GFP 基因的融合，因此引物的设计
至关重要。结合Y−GFP 融合基因的转录方向和Y 基因与GFP 基因的模板链特点，引物F2 应该与Y 基
因模板链的5'端一部分序列互补，而引物F3 则应该与GFP 基因的模板链的3'端一部分序列互补，并且
引物之间应该有一定的重叠区域，以便在PCR 扩增时能够形成融合基因。故引物F2 序列为
5’TTACGACTAGCG3’，引物F3 序列为5’CGCTAGTCGTAA3’，AD 错误，BC 正确。
故选BC。
（2）在构建基因表达载体时，由于融合基因两端不含酶切位点，我们需要在引物F1 和F4 中分别添加
限制酶识别序列，以便将融合基因插入到载体中。根据题中所提供的限制酶及识别序列可知，若在融
合基因两端添加EcoRI 限制酶的识别序列，因Y 基因中含有EcoRI 限制酶识别序列，在构建基因表达
载体时，用EcoRI 限制酶切割时会破坏融合基因，若在融合基因两端添加BamHI 限制酶的识别序列，
在构建基因表达载体时，使用的质粒中的标记基因含有BamHI 限制酶识别序列，用BamHI 限制酶切割
时会破坏标记基因，根据Y−GFP 融合基因的转录方向可知，在构建基因表达载体时，融合基因中Y 基
因端连接质粒启动子端，而GFP 基因端连接终止子端，再因为用EcoRI 限制酶酶切形成的黏性末端与
用MunI 限制酶酶切形成的黏性末端相同，故在PCR 扩增时，引物F1 应添加MunI 限制酶的识别序列，
引物F4 应添加XhoI 限制酶的识别序列。由于构建成功的表达载体含有Y−GFP 融合基因，且插入在
EcoRI 限制酶和XhoI 限制酶识别点之间，所以构建成功的表达载体中只含有一个EcoRI 限制酶和一个
BamHI 限制酶的识别位点，故用EcoRI 和BamHI 切割（完全酶切）构建成功的表达载体，能得到2 个
DNA 片段。
（3）将目的基因导入大肠杆菌时，一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境
中DNA 分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导人其中。在检测融合基因表达情况时发现，
能够检测到融合基因的mRNA，但表达的蛋白质只有蛋白激酶Y，这可能是Y 基因中编码终止密码子
的序列未去除，翻译到终止密码子处停止翻译，导致无法合成绿色荧光蛋白，仅表达Y 蛋白。
（4）A 蛋白磷酸化水平一定程度上代表了细菌对外界刺激的反应程度。在导入基因表达载体的大肠杆
菌中我们可以通过直接观察绿色荧光蛋白（GFP）的荧光强度来反映这一情况。因为融合蛋白中包含了
GFP 部分，所以当融合蛋白正常表达时就可以观察到绿色荧光。而由于融合蛋白中的蛋白激酶Y 部分
能够感受外界刺激并磷酸化特异性底物A 蛋白，因此，可以通过观察GFP 的荧光强度来间接反映A 蛋
白的磷酸化水平以及细菌对外界刺激的反应程度。
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