核磁共振ERETICⅡ定量工具的介绍

背景介绍

核磁共振（NMR）定量分析在成分含量测定、纯度评估及代谢物定量等领域具有重要应用价值。传统的NMR定量方法通常依赖于添加化学内标物，然而这不仅增加了样品制备的复杂性，还可能因内标物与样品之间的相互作用而影响定量的准确性和重复性。为解决这些问题，PULCON方法（JACS 2006, 128: 8, 2571-2576）通过两个不同样品（参考样品与待测样品）信号强度的绝对值比较，结合脉冲长度测定，直接推算未知样品浓度，无需加入内标物，且不依赖特殊硬件。

原理

ERETICⅡ是一款定量工具，该工具是基于PULCON方法，PULCON定量测量基于互易原理，即如果线圈在某点产生较强的射频场（使得脉冲时间短），它就能更灵敏地接收该点产生的信号。

根据互易原理，线圈的灵敏度 A 与 射频场强B₉₀ 或B₃₆₀成正比，因此：

 在温度近似条件下，样品中核磁化强度 M 与核浓度 c 成正比，且温度 T 对磁化强度有影响（服从居里定律）：

将上述关系结合，信号强度 S 与浓度 c、射频场强 B₉₀ 及温度 T 关系为：

假设有两个样品：

参考样品 R，已知浓度c_R ，信号强度S_R ，360°脉冲时间θ_360,R，测量温度T_R ，扫描次数 n_R；

待测样品 U，未知浓度c_U ，信号强度S_U ，360°脉冲时间θ_360,U ，测量温度T_U ，扫描次数 n_U。

考虑信号强度与扫描次数的累积效应，且可能存在实验参数差异引入的修正因子 ，则根据上述比例关系：

整理得到待测样品浓度的计算公式：

该原理指出90°或360°脉冲的脉冲长度与NMR信号强度成反比。因此，前提是已知其中一个样品的浓度且所有样品的90°脉冲均已准确校准。

操作流程

1. 定义ERETIC参考

打开参考样品的NMR谱图，进入TopSpin软件菜单“Analyse” → “Integrate”，选择目标峰进行积分。右键点击积分峰，选择“Eretic” → “Define as Eretic Reference”。在弹出的窗口中填写参考样品的已知浓度、积分峰对应的核数。可选填写溶液体积和分子量，以便后续计算中直接显示待测物的质量。

图1 定义参考信号，填写参考样品的相关参数，红色为必填项，黄色为可选项。

2. 计算样品浓度

打开待测样品的谱图，重复积分步骤，右键点击积分峰选择“Eretic” → “Calculate concentration”。输入积分峰对应的核数，若同时填写了溶液体积和分子量，软件将自动计算并显示待测样品的浓度和质量。

图2 填写待测样品的相关参数，红色为必填项，黄色为可选项。

应用案例

称取木犀草素4.43 mg和槲皮素6.04 mg，分别溶解于200 μL DMSO-d₆中制备浓缩溶液。随后，将50 μL槲皮素溶液和50 μL木犀草素溶液分别转移至两支核磁管中。为制备混合样品，将50 μL木犀草素溶液加入含槲皮素的核磁管。最终，向两支核磁管中分别补加DMSO-d₆至总体积0.5 mL，计算得木犀草素浓度为7.76 mM，槲皮素浓度为9.99 mM。

核磁共振数据采集采用一维NOESY脉冲序列（noesy1d），采集参数设置为：采集间隔时间（D1）15秒，确保充分弛豫；精确时域采样点数（TD）32,768；傅里叶变换点数（SI）65,536；接收增益（rg）101。数据处理时，采用指数乘窗函数（EM），线宽展宽参数（LB）设置为0.3 Hz，以优化信噪比和峰形质量。

对校正后的谱图进行相位和基线校正，选择未重叠的峰，采用ERETICⅡ工具计算木犀草素含量，结果为7.38 mM，含量1.06 mg，相对误差4.5%。采用内标法计算含量为7.31 mM，相对误差5.7%，误差较大的原因可能为卫星峰重叠影响。结果表明，ERETICⅡ工具的定量精度与传统内标法相当。

图3 采用ERETICⅡ工具计算木犀草素的实验结果。

注意事项

该方法要求在“定量”条件下采集一维谱，即弛豫延迟时间至少达到5T₁（90°脉冲）或3T₁（30°脉冲）所需时间，采集时间足够长（3T₂）且信噪比不低于10:1。参考谱图和待测谱图使用的脉冲序列要一致，90/360度脉冲需要经过校准，两张谱图具有同样的增益。

结论

ERETICⅡ因其无需添加化学内标的优势，广泛应用于药物分析、代谢组学、食品安全及生命科学等领域。尤其适用于标准品难以获得或内标添加受限的情况。ERETIC Ⅱ提高了核磁共振定量分析的便捷性和可靠性，是日常样品浓度测定的有效工具。