AI 驱动的抗体设计工作流

导语

我整理了 10 篇有关抗体设计的文章，1 篇综述 9 篇单独的设计，整理出了抗体设计流程，补充了我抗体设计领域的一些不足。文章 4 个部分，1：设计流程 2：一些经验 3：遇到的坑 4：一些指标，最后把涉及的论文标题及网址罗列下。

设计流程

1. 输入阶段 (Input Phase)：靶点定义与初始数据采集

该阶段的核心是获取靶点（抗原）信息并对抗体序列进行初步处理。

• • 靶点结构获取：利用 PDB 数据库或 ESMFold 预测抗原 3D 结构。
• • 序列注释：使用 ANARCI 对抗体可变区进行编号，区分框架区 (FR) 和互补决定区 (CDR)。
• • 候选来源：从 OAS、SAbDab 数据库或免疫库中提取已知序列。
• • 论文独特方法：
• ◦ Galindo et al. (SNV 研究)：强调在输入端评估靶点表位中的单核苷酸变异 (SNV)，利用 AlphaMissense 识别可能导致抗体药物产生抗药性的潜在位点。
• ◦ Chungyoun et al. (FLAb2 基准)：提出在输入端必须考虑生殖系编辑距离 (Germline distance)，以修正 AI 模型因学习进化信号而产生的预测偏差。

2. 核心设计策略 (Core Design Strategy)：多样性生成

这一阶段通过各种 AI 算法生成抗体候选分子或优化现有骨架。

• • 从头生成 (De novo)：利用扩散模型（如 RFdiffusion）生成新的 CDR 循环或骨架结构。
• • 序列再设计：使用 ProteinMPNN 进行固定骨架的氨基酸序列优化，以提高稳定性和溶解度。
• • 语言模型辅助：利用 IgLM 或 ProGen2 等抗体/蛋白质专用语言模型预测高概率序列。
• • 论文独特方法：
• ◦ Evers et al. (“Germinal”)：将 AlphaFold-Multimer 与 IgLM 结合，在生成过程中引入自定义损失函数，实现结构与序列的同步优化。
• ◦ Galindo et al. (胞内抗体)：在 ProteinMPNN 设计中采用局部固定策略，仅优化框架区，而固定 CDR 及其周围 3 Å 范围内的残基，以在改善胞内折叠的同时保留结合力。

3. 筛选与优化 (Screening & Optimization)：性能预测

利用计算指标在进入实验前压缩搜索空间。

• • 置信度筛选：依据 AlphaFold2/3 的 pLDDT 或 pTM 评分剔除物理上不可行的设计。
• • 可开发性评估 (Developability)：通过计算等电点 (pI)、表面电荷和疏水性评估聚集风险。
• • 物理驱动评分：利用 Rosetta (ddG) 或 FoldX 预测突变对亲和力的影响。
• • 论文独特方法：
• ◦ Siegmund et al. (pI 对齐策略)：提出针对多特异性抗体，将 Fab 和 VHH 域的 pI 值调整至 7.5–9.0 范围内，以显著提高胶体稳定性和降低粘度。
• ◦ Ausserwöger et al. (TAP 指标)：引入“治疗性抗体分析器 (TAP)”准则，特别关注 3-4 个大体积疏水残基构成的表面补丁，这是预测非特异性结合的关键经验法则。
• ◦ Abanades et al. (ImmuneBuilder)：在预测结构的同时提供残基级误差估计 (pRMSD)，作为筛选高可信度构象的滤网。

4. 验证环节 (Validation)：实验确认与闭环

通过物理化学和生物学实验确认设计分子的功能。

• • 结合亲和力测定：通过 SPR 或 BLI 测定 KDK_DKD 值。
• • 热稳定性评估：使用 nanoDSF 或 DSC 测量熔解温度 (TmT_mTm)。
• • 显示技术：利用酵母表面展示 (YSD) 进行快速筛选。
• • 论文独特方法：
• ◦ Sun et al. (DSA 域特异性分析)：针对 TAK-186 等多结构域药物，开发了域特异性竞争 assay，通过监测抗药物抗体 (ADA) 对不同域的抑制率，精确定位免疫原性位点。
• ◦ Grevys et al. (HERA 细胞分析)：引入人类内皮细胞回收检测 (HERA)，直接模拟 FcRn 介导的循环回收，用于评估变异序列对体内半衰期的影响。
• ◦ Galindo et al. (活细胞共定位 + FRAP)：直接在活细胞内观察 intrabody 的共定位情况，并结合光漂白恢复 (FRAP) 技术在真实生理环境下测量结合动力学。

一些经验

1. 序列设计与结构约束法则

• • CDR 长度控制：互补决定区（CDR）的长度是构象柔性的关键决定因素。较长的 CDR 循环通常与更高的构象柔性相关，这可能导致抗体具有更高的结合多特异性（Promiscuity）和脱靶结合风险。
• • 表面补丁 (Surface Patches) 大小：仅需 3 到 4 个连续的大体积疏水或芳香族残基（如 W, Y, F, L, I）组成的表面补丁，就足以诱导抗体的非特异性结合。
• • VHH 特有的非规范二硫键：超过 25% 的 VHH 序列含有非规范二硫键，这些键通常将 CDR3 连接到框架区。在设计或人源化时，必须保留参与这些二硫键的半胱氨酸，以维持 CDR3 的结构稳定性。

2. 改造与回补突变 (Back-mutation) 策略

• • VHH 人源化“低风险”策略：在将 CDR 移植到人类支架时，为了保持亲和力，建议采取以下回补突变准则：
• ◦ 回补突变关键的 Vernier 区和 Hallmark 位置（IMGT 编号的第 42, 49, 50, 52 位）。
• ◦ 保留所有与 CDR3 形成非规范二硫键的半胱氨酸。
• • 电荷中和法：在可变区引入负电荷突变以中和或降低整体 pI 值，已被证明是增加抗体体内半衰期的有效手段。

3. 生物物理与可开发性阈值

• • 等电点 (pI) 对齐法则：对于多特异性抗体（如 IgG1-VHH 格式），建议将所有可变域（Fab 和 VHH）的 pI 值调整在 7.5 至 9.0 之间。这种弱碱性范围可以减少酸性配方中的电荷吸引，从而提高胶体稳定性并降低粘度。
• • 热稳定性基准线：在可开发性筛选中，通常设定 onset>50∘C  和 m1>55∘C 作为合格候选分子的基准线。
• • 结合能变化阈值：使用 FoldX 等工具评估突变影响时，通常采用 ΔΔG>1 kcal/mol 作为判断突变是否显著降低结合能的切断值。

4. AI 模型微调与运行经验

• • ProteinMPNN 关键残基固定范围：在重新设计胞内抗体支架时，经验法则指出必须固定 CDR 及其周围 3 Å 范围内的框架残基。若固定范围设为 0 Å，则实验成功率为零；若设为 5 Å，则保留了过多原始残基，优化空间不足。
• • ProteinMPNN 运行参数设置：针对抗体优化，推荐的通用设置为：采样温度 (Sampling Temperature) = 0.1，骨架噪声 (Backbone Noise) = 0.02，序列生成数量通常设为 15 条。
• • 微调数据量规则：大规模基准测试（FLAb2）显示：
• ◦ 当实验数据 < 300 条时，建议使用大型预训练模型（如 billion-parameter models）的嵌入向量进行下游预测。
• ◦ 当实验数据 > 1000 条时，简单的 One-hot 编码模型性能即可与复杂的预训练大模型持平。
• • 结构预测误差过滤：在 ABodyBuilder2 等模型中，可以利用多个预测构象的根均方预测误差 (RMSPE) 作为滤网。设定约 1 Å 的截断值可以有效剔除结构建模不准确的候选者。
• • 扩散模型 (Diffusion) 损失函数经验：在 de novo 设计中，通过引入自定义损失函数，激励模型生成非结构化的 CDR 循环，而非扩散模型容易产生的 alpha 螺旋，这对抗体功能至关重要。

遇到的坑

1. 结构预测的“坑”：CDR-H3 的不确定性与物理畸变

• • 设计难点与失败案例：
• ◦ CDR-H3 预测精度极低：几乎所有模型在预测 CDR-H3 环时的均方根偏差（RMSD）显著高于其他区域。即使是先进的模型也难以准确捕捉其高柔性和极端多样性。
• ◦ 物理不可能性（Physical Implausibility）：深度学习模型生成的结构常出现原子严重碰撞（Clashes）、非物理键长或顺式肽键（Cis-peptide bonds）。例如，IgFold 在精修后仍可能产生大量顺式肽键。
• • 人工经验修正：
• ◦ 强制物理约束精修：引入 OpenMM 或 Rosetta 进行能量最小化和限制性精修，以纠正模型输出的立体化学错误。
• ◦ 集成预测与误差过滤：通过生成结构系综（Ensemble），利用预测误差估计（如 pRMSD）作为滤网。作者建议设定约 1 Å 的截断值，剔除结构不稳定的设计。

2. 性能评估的“坑”：高置信度 (pLDDT) 不等于功能成功

• • 设计难点与失败案例：
• ◦ “置信度陷阱”：在胞内抗体（Intrabodies）设计中，作者发现某些候选者尽管 AlphaFold2 的 pLDDT 评分极高（>90），但在活细胞实验中却表现为严重聚集或完全不结合。
• ◦ 环境敏感性失效：模型通常基于静态结构预测，忽略了胞内还原性环境对折叠和溶解度的影响。
• • 人工经验修正：
• ◦ 关键残基固定策略：在使用 ProteinMPNN 重新设计骨架时，经验法则指出必须固定 CDR 及其周围 3 Å 范围内的框架残基。若固定范围设为 0 Å，实验成功率为零。
• ◦ 算法偏见屏蔽：ProteinMPNN 存在明显的**“赖氨酸偏向（Lysine bias）”**，倾向于将 Q/R/S/T 突变为 Lys (K)。作者建议根据具体的结构上下文评估这些突变，而非盲目接受模型输出。

3. 可开发性的“粘性”陷阱：非特异性结合的误导

• • 设计难点与失败案例：
• ◦ 净电荷的误导性：抗体可能拥有理想的等电点（pI）或净电荷，但表面存在的**局部电荷/疏水补丁（Surface Patches）**会导致其非特异性结合（“粘性”问题）。
• ◦ 失败案例 MEDI1912：因 CDRH1 中存在由 Trp30、Phe31 和 Leu56 组成的疏水补丁，导致体内清除极快且粘度极高。
• • 人工经验修正：
• ◦ 补丁破坏策略（Patch Disruption）：不改变整体 pI，而是通过人工点突变将补丁中的疏水氨基酸改为极性氨基酸。
• ◦ 电荷/空间屏蔽：在补丁附近引入相反电荷的氨基酸或引入 N-糖苷化位点，利用糖链遮盖有害表面。

4. 数据偏见的“坑”：生殖系偏见 (Germline Bias)

• • 设计难点与模型失效：
• ◦ 进化信号优于物理信号：大规模基准测试（FLAb2）显示，当前的 AI 模型在预测药代动力学（PK）和免疫原性方面表现极差（80% 的数据集无相关性）。
• ◦ 失效原因：预训练模型学习到的是序列距离生殖系的远近（Germline distance），而非真实的生物物理规律。模型往往给“更像天然”的序列打高分，从而忽略了决定功能的关键突变。
• • 人工经验修正：
• ◦ 引入物理基准线：在评估时手动结合电荷计算（BioPython Charge）等物理参数，因为物理模型在预测聚集和 PK 方面往往比大型预训练模型更可靠。
• ◦ 纠正偏见评估：在验证模型性能时，必须使用偏相关分析（Partial correlation）扣除生殖系距离的影响，以看清模型是否真正学到了生物物理特性。

一些指标

文章列表

1. 1. Closing the loop: Experimentally validated methods in artificial intelligence–driven protein designhttps://doi.org/10.1016/j.sbi.2026.103272
2. 2. From discovery to the clinic: structural insights, engineering options, clinical, and ‘next wave’ applications of camelid-derived single-domain antibodieshttps://doi.org/10.1080/19420862.2025.2583210
3. 3. Heterogeneous and evolving epitope landscape of clinical anti-drug antibodies against multidomain biotherapeutic: a case study of TAK-186https://doi.org/10.1080/19420862.2025.2587584
4. 4. Optimizing colloidal stability and viscosity of multispecific antibodies at the drug discovery-development interface: a systematic predictive case studyhttps://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12407640/
5. 5. Non-specificity as the sticky problem in therapeutic antibody developmenthttps://doi.org/10.1038/s41570-022-00438-x](https://doi.org/10.1038/s41570-022-00438-x
6. 6. Antibody variable sequences have a pronounced effect on cellular transport and plasma half-lifehttps://doi.org/10.1016/j.isci.2022.103746
7. 7. Single-amino acid variants in target epitopes can confer resistance to antibody-based therapieshttps://doi.org/10.1126/scitranslmed.ady4877
8. 8. Fitness Landscape for Antibodies 2: Benchmarking Reveals That Protein AI Models Cannot Yet Consistently Predict Developability Propertieshttps://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12767642
9. 9. ImmuneBuilder: Deep-Learning models for predicting the structures of immune proteinshttps://doi.org/10.1038/s42003-023-04927-7
10. 10. AI-assisted protein design to rapidly convert antibody sequences to intrabodies targeting diverse peptides and histone modificationshttps://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12758555