Trim Galore软件详解

软件基本信息：

Trim Galore是对Cutadapt和FastQC进行了包装的工具，用于可自动地对FastQ文件进行一致的、统一的（测序）质量和接头（Adapter）修剪（trimming），以及质量控制（Quality Control, QC）。

该软件也携带一些额外的功能，例如：可应用于通过MspI消化的RRBS（Reduced Representation Bisufite-Seq）类（DNA甲基化测序）文库，以删除单端或双端测序中具有偏向性的甲基化位置（biased methylation positions）。

Trim Galore的作者是菲利克斯•克鲁格 (Felix Krueger)。

生物信息学家Felix Krueger

供职于英国伯拉罕研究所(The Babraham Institute)生物信息小组，他于2009年在完成分子信号的博士后职位后加入生物信息学团队，在德国埃尔兰根肿瘤学系(Department of Oncology in Erlangen/Germany)接受生物学培训，并获得分子细胞生物学博士学位。

Phone: +44 (0)1223 496104

Google Scholar Github：https://scholar.google.com/citations?user=e7C36YkAAAAJ&hl=en

作者的工作单位：英国巴布拉汉研究所生物信息小组（Babraham Bioinformatics）

该小组为研究所的30个研究小组提供生物信息学服务，并提供外部商业咨询服务。

该团队在生物信息学的各个领域都有丰富的经验，包括基因组学、蛋白质组学、统计学和微阵列，以及定制软件开发的丰富经验。

Babraham研究所

Trim Galore有哪些具体的功能？除了对碱基的修剪，是否可以"扔掉整个Reads"？是可以的，具体看参数的设定。主要功能介绍如下：

1. 针对单/双端测序FastQ文件，默认去除Illumina的标准接头序列（13bp, 'AGATCGGAAGAGC'），也可以自定义接头序列。

• Uses the first 13 bp of Illumina standard adapters ('AGATCGGAAGAGC') by default (suitable for both ends of paired-end libraries), but accepts other adapter sequence, too.

其它接头：Small RNA, TGGAATTCTCGG；Nextera, CTGTCTCTTATA

2. 针对MspI消化的RRBS文库，进行根据碱基质量和接头的裁剪，其中也可去除2个额外的含有胞嘧啶的碱基，该碱基是在文库制备过程中人为引入的。

• For MspI-digested RRBS libraries, performs quality and adapter trimming in two subsequent steps. This allows it to remove 2 additional bases that contain a cytosine which was artificially introduced in the end-repair step during the library preparation.

3. 除了MspI消化的RRBS文库，对于任何类型的FastQ文件进行Single-pass接头和质量修剪。

• For any kind of FastQ file other than MspI-digested RRBS, Trim Galore! can perform single-pass adapter- and quality trimming.

4. 这里提到了可以对Phred碱基质量和接头序列的"单独指定的"清除。

• The Phred quality of basecalls and the stringency for adapter removal can be specified individually.

5. 如果序列在修剪过程中变得太短，可以删除序列；对双端测序文件，如果（trim之后）两个Reads中的一个(或两个)比设置的长度cutoff值更短，则删除整个序列对；如果Reads对的读长超过给定阈值，但配对Reads变得太短，则可以选择性地将其写入单端文件（这确保了如果只有一个Read是高质量的，Reads对的信息不会完全丢失）。

• Can remove sequences if they become too short during the trimming process. For paired-end files, removes entire sequence pairs if one (or both) of the two reads became shorter than the set length cutoff. Reads of a read-pair that are longer than a given threshold but for which the partner read has become too short can optionally be written out to single-end files. This ensures that the information of a read pair is not lost entirely if only one read is of good quality.

聊生信：自定义地、严谨地删除不符合某些条件的Reads，对于ctDNA等肿瘤相关的、旨在分析稀有体细胞变异的测序数据的质控可能非常重要。

• Can trim paired-end files by 1 additional bp from the 3' end of all reads to avoid problems with invalid alignments with Bowtie 1.

7. 接收且可以输出标准的、或gzip压缩的FastQ文件

• Accepts and produces standard or gzip compressed FastQ files.

8. 一旦裁剪完成，FastQC可（自动）在输出文件上运行(可选)

• FastQC can be run on the resulting output files once trimming has completed (optional).

conda install -y -q trim-galore

注意：软件名称的大小写和横杠

trim_galore --help

这个“伪”碱基质量ASCII字符需要首先取出其对应的十进制数值（可自行查询ASCII表），减去33或64后，才是对应Reads第二行碱基的真正质量值Qphred/Q。若测序错误率用 P_error表示，则：Q = ASCII - 33(或64) = -10log10(P_error) 。所以Q的值为10时表示该碱基有10%的错误率（即90%的概率是正确的）, 20时有1%错误率, 30时有0.1%的错误率，以此类推。

Trim Galore的参数--phred33或--phred64就是用来选择上述公式使用33还是64。如果选错后果是比较严重的，但一般从最终Clean Data的FastQC质控结果可以很容易辨别出来是否选错。因为Qphred一般在40~0之间，选错后在FastQC质控结果中可以看出来最终的质量值明显脱离了这个区间，甚至Reads全部被删掉。

(1) --phred64：用于指导Trim Galore内置的Cutadapt软件使用ASCII-64质量分数作为Phred分数 (适用于Illumina 1.5 encoding，即Illumina的早期版本质量值，包括v1.3和v1.4等）来对碱基质量修剪。

有了上面的介绍，会发现我们其实只需要一个对照表就好了。即Q值、P_error和ASCII码的对照表（如下图），并仔细理解一下红框的位置即可。

延伸阅读

以上是Sanger中心采用记录Read测序质量的方法，Illumina起初没有完全依照Sanger中心的方法来定义测序质量，而是把P换成了p/(1-p)。其他完全按照Sanger的定义来做。但是这种形式在某些情况下是不准确的，可以看出当测序质量很高的情况下两种形式几乎没区别，但低质量的碱基则有区别了。

质量得分Qphred和错误率p的关系符合下图（红色的为phred，黑色的为Illumina的早期版本质量值：

虚线表明p=0.05，对应的质量得分为Qphred≈13