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必刷12 基因工程
高频考点1 重组DNA 技术
高频考点2 基因工程的操作
高频考点3 基因工程的应用
高考真题必刷
1．（2023·辽宁·统考高考真题）CD163 蛋白是PRRSV 病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163 蛋白的表
达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP 基因与CD163 基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。
该拼接过程的关键步骤是除去（ ）
A．CD163 基因中编码起始密码子的序列
B．CD163 基因中编码终止密码子的序列
C．RFP 基因中编码起始密码子的序列
D．RFP 基因中编码终止密码子的序列
【答案】B
【解析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子终止子和标记
基因等。
为实时监控CD163 蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP 基因与CD163 基因都得转
录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163 基因转录形成的mRNA 中不能出现终止密码
子，否则红色荧光蛋白RFP 基因转录形成的mRNA 不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接
过程的关键步骤是除去CD163 基因中编码终止密码子的序列，B 符合题意，ACD 不符合题意。
故选B。
2．（2023·江苏·统考高考真题）某生物社团利用洋葱进行实验。下列相关叙述正确的是（ ）
1
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A．洋葱鳞片叶内表皮可代替半透膜探究质膜的透性
B．洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂，溶液即呈砖红色
C．制作根尖有丝分裂装片时，解离、漂洗、按压盖玻片都能更好地将细胞分散开
D．粗提取的DNA 溶于2mol/L NaCl 溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色
【答案】A
【解析】观察细胞有丝分裂实验的步骤：解离（解离液由盐酸和酒精组成，目的是使细胞分散开来）、漂
洗（洗去解离液，便于染色）、染色（用龙胆紫、醋酸洋红等碱性染料）、制片（该过程中压片是为了将
根尖细胞压成薄层，使之不相互重叠影响观察）和观察（先低倍镜观察，后高倍镜观察）。
A.洋葱鳞片叶内表皮的原生质层具有选择透过性，可代替半透膜探究质膜的透性，A 正确；
B.洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂，需要水浴加热才可能出现砖红色沉淀，若出现砖红色，则可说明洋
葱匀浆中含有还原糖，B 错误；
C.制作根尖有丝分裂装片时，解离、按压盖玻片得目的都是为了获得单层细胞，即这些操作均能更好地将
细胞分散开，C 错误；
D.粗提取的DNA 溶于2mol/L NaCl 溶液中，加入二苯胺试剂后经过水浴加热可显蓝色，D 错误。
故选A。
3．（2023·浙江·统考高考真题）紫外线引发的DNA 损伤，可通过“核苷酸切除修复（NER）”方式修复，
机制如图所示。着色性干皮症（XP）患者的NER 酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤出现炎症等症状。
患者幼年发病，20 岁后开始发展成皮肤癌。下列叙述错误的是（ ）
A．修复过程需要限制酶和DNA 聚合酶
B．填补缺口时，新链合成以5 到3 的方向进行
C．DNA 有害损伤发生后，在细胞增殖后进行修复，对细胞最有利
D．随年龄增长，XP 患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释
【答案】C
2
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【解析】1、DNA 分子复制的过程：
①解旋：在解旋酶的作用下，把两条螺旋的双链解开。
②合成子链：以解开的每一条母链为模板，以游离的四种脱氧核苷酸为原料，遵循碱基互补配对原则，在
有关酶的作用下，各自合成与母链互补的子链。
③形成子代DNA：每条子链与其对应的母链盘旋成双螺旋结构。从而形成2 个与亲代DNA 完全相同的子
代DNA 分子。
2、限制酶和DNA 聚合酶作用的对象都是磷酸二酯键。
A.由图可知，修复过程中需要将损伤部位的序列切断，因此需要限制酶的参与；同时修复过程中，单个的
脱氧核苷酸需要依次连接，要借助DNA 聚合酶，A 正确；
B.填补缺口时，新链即子链的延伸方向为5 到3 的方向进行，B 正确；
C.DNA 有害损伤发生后，在细胞增殖中进行修复，保证DNA 复制的正确进行，对细胞最有利，C 错误；
D.癌症的发生是多个基因累积突变的结果，随年龄增长，XP 患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变
累积解释，D 正确。
故选C。
4．（2023·天津·统考高考真题）根据下图，正确的是（ ）
A．子代动物遗传性状和受体动物完全一致
B．过程1 需要MII 期去核卵母细胞
C．过程2 可以大幅改良动物性状
D．过程2 为过程3 提供了量产方式，过程3 为过程1、2 提供了改良性状的方式
【答案】D
【解析】动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发
育成一个新的胚胎，这个胚胎最终发育为动物。
A.子代动物的遗传性状与供体基本一致，但与受体无关，A 错误；
B.核移植过程中需要处于MII 中期的去核卵母细胞，而过程1 是培育试管动物，需要培育到适宜时期（桑
葚胚或囊胚等时期）进行胚胎移植，B 错误；
3
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C.过程2 得到的是克隆动物，是无性生殖的一种，不能大幅改良动物性状，C 错误；
D.过程2 克隆技术可得到大量同种个体，为过程3 提供了量产方式；过程3 是转基因技术，转基因可导入
外源优良基因，为过程1、2 提供了改良性状的方式，D 正确。
故选D。
5．（2023·湖南·统考高考真题）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物
AT1 蛋白通过调节细胞膜上PIP2s 蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是
（ ）
A．细胞膜上PIP2s 蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s 蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1 基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
【答案】B
【解析】分析题图：AT1 蛋白通过抑制PIP2s 蛋白的磷酸化而抑制细胞内的H2O2 排到细胞外，从而导致
植物抗氧化胁迫能力减弱，进而引起细胞死亡。AT1 蛋白缺陷，可以提高PIP2s 蛋白的磷酸化水平，促进
细胞内的H2O2 排到细胞外，从而提高植物抗氧化的胁迫能力，进而提高细胞的成活率。
A.由题图右侧的信息可知，AT1 蛋白缺陷，可以促进PIP2s 蛋白的磷酸化，进而促进H2O2 排出膜外，A 正
确；
B.据题图左侧的信息可知，AT1 蛋白能够抑制PIP2s 蛋白的磷酸化，减少了H2O2 从细胞内输出到细胞外的
量，导致抗氧化胁迫能力弱，不能减轻其对细胞的毒害，B 错误；
C.结合对A 选项的分析可推测，敲除AT1 基因或降低其表达，可提高禾本科农作物抗氧化胁迫的能力，进
而提高其成活率，C 正确；
D.从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因，可通过基因工程技术改良农作物抗逆性，D 正确。
故选B。
4
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6．（2023·湖北·统考高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因
构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体
（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet 的培养基中能形成菌落
【答案】D
【解析】图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有AcaI 和PvuI 的酶切位点，四环素抗性基因
（TetR）内含有HindIII、SphI 和SalI 的酶切位点。
A.若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A 正确。
B.若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的
菌落，不一定含有目的基因，B 正确；
C.DNA 凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA 片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构
建成功与否，C 正确；
D.SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因
（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet 的培
养基中不能形成菌落，D 错误。
故选D。
7．（2023·浙江·统考高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型
小鼠Gata3 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以期
获得Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2 用
于PCR 扩增，PCR 产物电泳结果如图乙所示。
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下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子无法控制GFP 基因的表达
B．翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C．2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
【答案】B
【解析】PCR 技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA
复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
A.分析图中可知，启动子在左侧，GFP 基因整合Gata3 基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP 基因
转录，Gata3 基因的启动子能控制GFP 基因的表达，A 错误；
B.因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA 从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时
先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白，B 正确；
C.整合GFP 基因后，核酸片段变长，2 号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP 基因纯合子，4 号个体只有
小片段，是野生型，C 错误；
D.用引物1 和引物3 进行PCR 扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好的区分片段，D 错误。
故选B。
8．（2023·广东·统考高考真题）“DNA 粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。
下列叙述错误的是（ ）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA 等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA 的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
【答案】D
【解析】DNA 粗提取和鉴定的原理：
1、DNA 的溶解性：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同（DNA 在0.14mol/L 的
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氯化钠中溶解度最低）；DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。
2、DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。
3、DNA 的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色。
A.裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA 等物质，A 正确；
B.DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L 的NaCl 溶液， 将溶液过滤，即可将混合物
中的多糖、蛋白质等与DNA 分离，B 正确；
C.DNA 不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA 纯度，C 正确；
D.将DNA 溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D 错误。
故选D。
9．（2023·广东·统考高考真题）中外科学家经多年合作研究，发现circDNMT1（一种RNA 分子）通过与
抑癌基因p53 表达的蛋白结合诱发乳腺癌，为解决乳腺癌这一威胁全球女性健康的重大问题提供了新思路。
下列叙述错误的是（ ）
A．p53 基因突变可能引起细胞癌变
B．p53 蛋白能够调控细胞的生长和增殖
C．circDNMT1 高表达会使乳腺癌细胞增殖变慢
D．circDNMT1 的基因编辑可用于乳腺癌的基础研究
【答案】C
【解析】人和动物细胞中的DNA 上本来就存在与癌变相关的基因：原癌基因和抑癌基因。一般来说，原
癌基因表达的蛋白质是细胞正常的生长和增殖所必需的，这类基因一旦突变或过量表达而导致相应蛋白质
活性过强，就可能引起细胞癌变。相反，抑癌基因表达的蛋白质能抑制细胞的生长和增殖，或者促进细胞
凋亡，这类基因一旦突变而导致相应蛋白质活性减弱或失去活性，也可能引起细胞癌变。
A.p53 基因是抑癌基因，这类基因突变可能引起细胞癌变，A 正确；
B.p53 基因是抑癌基因，抑癌基因表达的蛋白质能抑制细胞的生长和增殖，或促进细胞凋亡，B 正确；
C.依据题意，circDNMT1 通过与抑癌基因p53 表达的蛋白结合诱发乳腺癌，则circDNMT1 高表达会使乳腺
癌细胞增殖变快，C 错误；
D.circDNMT1 的基因编辑可用于乳腺癌的基础研究，D 正确。
故选C。
10．（2023·山西·统考高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3 和酶4）、DNA 连接酶为工具，将
目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限
制酶的切割位点如图所示。
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下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
B．质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割，用T4 DNA 连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割，用T4 DNA 连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
【答案】C
【解析】DNA 连接酶：
（1）根据酶的来源不同分为两类：E.coliDNA 连接酶、T4DNA 连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外
T4DNA 连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
（2）DNA 连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
A.酶3 切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA 连接酶连接，A 错误；
B.质粒用酶3 切割后得到平末端，目的基因用酶1 切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B 错误；
C.质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割后得到黏性末端，用T4 DNA 连接酶连接后，还能保证目的基因在
质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C 正确；
D.若用酶2 和酶4 切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少
标记基因，无法进行后续的筛选，D 错误。
故选C。
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11．（2023·广西北海·统考一模）研究发现，夜班工作引起的昼夜节律紊乱可以改变肿瘤相关基因的表达，
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引起细胞癌变，对人体自身DNA 修复也会产生负面影响。下列叙述正确的是（ ）
A．原癌基因在表达时，转录和翻译过程中碱基互补配对原则完全相同
B．熬夜可能会使细胞分裂过程中出现突变进而导致患癌症的风险增加
C．与正常细胞相比，癌变细胞细胞膜上的糖蛋白增多，细胞之间的黏着性显著增强
D．在DNA 修复过程中，需限制酶剪切错误片段中的氢键，需DNA 聚合酶催化DNA 片段的修复
【答案】B
【解析】1、克里克提出的中心法则：（1）遗传信息可以从DNA 流向DNA，即DNA 的复制；（2）遗传
信息可以从DNA 流向RNA，进而流向蛋白质，即遗传信息的转录和翻译；后来中心法则又补充了遗传信
息从RNA 流向RNA 以及从RNA 流向DNA 两条途径。
2、基因表达包括遗传信息的转录和翻译过程，其中转录是DNA 的一条链为模板合成RNA 的过程，需要
条件是：模板（DNA 的一条链）、原料（核糖核苷酸）、酶（解旋酶和RNA 聚合酶）和能量；翻译是以
mRNA 为模板合成蛋白质的过程，需要条件是：模板（mRNA）、原料（氨基酸）、酶、能量和tRNA。
A.原癌基因的表达包括转录和翻译，转录是以DNA 为模板合成RNA，翻译过程中mRNA 上的密码子和
tRNA 上的反密码子互补配对，故二者的碱基互补配对方式不完全相同，A 错误；
B.根据题干信息，熬夜可能会使细胞分裂过程中出现突变，进而使患癌症的风险增加，B 正确；
C.与正常细胞相比，癌变细胞细胞膜上的糖蛋白减少，细胞之间的黏着性显著降低，C 错误；
D.在DNA 修复过程中，限制酶剪切的是磷酸二酯键，DNA 聚合酶催化磷酸二酯键的形成，D 错误。
故选B。
12．（2023·浙江宁波·镇海中学校联考一模）科研人员将目的基因J 与质粒构建重组表达载体，该质粒的
部分结构如图所示，下列叙述错误的是（ ）
A．除图中标出的结构外，质粒还需具备的结构有复制原点、标记基因、限制酶切位点等
B．与图中启动子结合的酶是RNA 聚合酶
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C．用PCR 检测J 基因连接到质粒中且方向正确可选用的一对引物是F1和R2
D．若J 基因转录的链位于b 链，可知引物F1与基因J 的b 链相应部分序列相同
【答案】D
【解析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和
终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA 分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是
荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
A.图中有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等，A
正确；
B.启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，B 正确；
C.引物F2 与R1 或F1 与R2 结合部位包含J 基因的碱基序列，因此推测为了确定J 基因连接到质粒中且插
入方向正确，进行PCR 检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2 和R1 或F1 与R2，C 正确；
D.b 是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该
是3-5'，非模板链（也就是a 链）是5'-3'；考虑到DNA 复制的方向是子链的5-3'，引物基础上延伸的方向
肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1 是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3-5'的
b 链，故其序列应该与a 链相应部分的序列相同，D 错误。
故选D。
13．（2023·全国·校联考模拟预测）生物兴趣小组开展人类遗传病发病率和遗传方式的调查活动，发现某
家系同时有甲遗传病（基因为A、a）和乙遗传病（基因为B、b）患者，系谱如图1；对部分家庭成员是否
携带甲病基因进行核酸分子检测，结果如图2，已知乙病为常染色体遗传病，且在人群中的发病率为
1/10000。上述基因均不位于Y 染色体上，下列叙述错误的是（ ）
A．甲病属于常染色体隐性遗传病
B．Ⅲ9是患病男孩的概率是11/27
C．Ⅱ7同时携带两种致病基因的概率是4/9
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D．Ⅱ7与另一健康男子再婚，生一个患乙病孩子的概率约为1/303
【答案】B
【解析】1、分析甲病：根据限制酶切点的位置看出正常基因通过限制酶切成两段基因片段，突变基因通
过限制酶切下为一个基因片段。I3、Ⅰ4 有3 个不同的基因片段，故I3、I4 同时含有正常基因和突变基因，
为杂合子；Ⅱ8 也不患甲病，但有两个基因片段，故Ⅱ8 为只有正常基因的纯合子；Ⅰ2 只有一段基因片
段，即只有突变的基因，且据图1 可知I2 患甲病，故突变基因为甲病致病基因，甲病为隐性遗传病，若甲
病为伴X 染色体隐性遗传病，则图1 中Ⅰ3、Ⅰ4 基因型不同，酶切结果也不同，与图示结果不符，故可
判断甲病是常染色体隐性遗传病，致病基因为a；只考虑甲病，则I2 基因型为aa，I3 和I4 基因型均为
Aa，Ⅱ8 基因型为AA。
2、分析乙病：I1 和I2、I3 和I4 都不患乙病，但I1 和I2 的子代Ⅱ5、I3 和I4 的子代Ⅱ8 患乙病，可确定乙
病为隐性遗传病，结合题干信息，确定乙病为常染色体隐性遗传病，假设致病基因为b。
A.若只考虑甲病，由图2 可知，根据限制酶切点的位置看出正常基因通过限制酶切成两段基因片段，突变
基因通过限制酶切下为一整个基因片段。Ⅰ2 只有一种突变基因片段，Ⅰ2 是纯合子，Ⅰ3、Ⅰ4 有3 种不
同的基因片段，分别是正常基因和突变基因，说明Ⅰ3、Ⅰ4 均为杂合子，Ⅱ8 有两个正常基因片段，Ⅱ8
为纯合子；由图1 可知，Ⅰ2 患甲病，Ⅰ3、Ⅰ4 均为正常个体，Ⅱ8 不患甲病；故突变基因为甲病致病基
因，甲病为隐性遗传病。若甲病为伴X 染色体隐性遗传病，则图1 中Ⅰ3、Ⅰ4 基因型不同，酶切结果也
不同，与图示结果不符，故可判断甲病是常染色体隐性遗传病，A 正确；
B.由A 项分析可知，只考虑甲病：I2 基因型为aa，I3 和I4 基因型均为Aa，Ⅱ8 基因型为AA；由图1 可知
Ⅱ6 基因型为aa，Ⅱ7 基因型为1/3AA、2/3Aa；则Ⅲ9 患甲病（aa）的概率为2/3×1/2=1/3；分析乙病（只
考虑乙病）：正常个体I3 和I4 的子代Ⅱ8 患乙病，则乙病属于隐性遗传病，根据题干信息可知，乙病属于
常染色体隐性遗传病，则Ⅱ8 基因型为bb，故I3 和I4 基因型均为Bb，Ⅱ7 基因型为1/3BB、2/3Bb；Ⅱ5
患乙病基因型为bb，则I1 和I2 基因型均为Bb，故Ⅱ6 基因型为1/3BB、2/3Bb；由Ⅱ6 和Ⅱ7 乙病基因型
可以得出Ⅲ9 患乙病（bb）的概率为2/3×2/3×1/4=1/9，故Ⅲ9 患病的概率是患甲病的概率+患乙病的概率
+同时患甲病和乙病的概率=1/3+1/9+1/3×1/9=11/27，Ⅲ9 患病男孩的概率是11/27×1/2=11/54，B 错误；
C.根据B 项分析结果，只考虑甲病，Ⅱ7 基因型为1/3AA、2/3Aa；只考虑乙病，Ⅱ7 基因型为1/3BB、
2/3Bb；则Ⅱ7 同时携带两种致病基因的概率是2/3×2/3=4/9，C 正确；
D.只考虑乙病，Ⅱ7 基因型为1/3BB、2/3Bb；由题干信息乙病在人群中的发病率为1/10000，则b 基因频
率为1/100，B 基因频率为99/100，BB=（99/100）2，Bb 的基因型频率=2×1/100×99/100，该健康男子为
Bb 的概率=Bb/（BB+Bb）=Bb/（1-bb）=2/101；Ⅱ7 与另一健康男子再婚，要生一个患乙病的孩子，则
Ⅱ7 的基因型为Bb，健康男子的基因型为Bb，故Ⅱ7 与另一健康男子再婚，生一个患乙病孩子（bb）的
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概率为=2/3×2/101×1/4=1/303，D 正确。
故选B。
14．（2023·海南·统考二模）载体是基因工程中携带外源DNA 片段（目的基因）进入受体细胞的重要运载
工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。下图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示
意图，下列相关叙述正确的是（ ）
A．重组载体A、重组载体B 分别是基因表达载体和基因克隆载体
B．载体A 和载体B 都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因
C．必须把目的基因插入重组载体A 的启动子和终止子之间
D．培养细菌A 和细菌B 的培养基在营养成分和功能上没有明显差异
【答案】B
【解析】分析题图：图中重组载体A 导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，而重
组载体B 导入受体菌后，表达产生胰岛素，因此是基因表达载体。
A.重组载体A 导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，而重组载体B 导入受体菌后，
表达产生胰岛素，因此是基因表达载体，A 错误；
B.作为运载体必须要具备的条件：含有限制酶的切割位点（便于目的基因的插入）、复制原点（便于目的
基因的扩增）及标记基因（便于筛选含有目的基因的受体细胞）等，因此载体A 和载体B 都必须含有限制
酶切割位点、复制原点和标记基因，B 正确；
C.培养细菌A 的目的是扩增目的基因，不需要获得表达产物，因此目的基因不一定要插入重组载体A 的启
动子和终止子之间，C 错误；
D.培养细菌A 的目的是扩增目的基因，培养细菌B 的目的是获得胰岛素，因此培养两者的培养基在营养成
分和功能上有明显差异，D 错误。
故选B。
15．（2023·全国·校联考模拟预测）“嵌合体”是指同一个体或器官，其不同成熟体细胞的核基因组成不
同。下列情况一般不会出现“嵌合体”的是（ ）
A．经外源基因转入受精卵后正常发育的幼鼠
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B．经造血干细胞移植的血友病患者
C．经X 射线处理种子后发育成的小麦幼苗
D．经秋水仙素处理的单倍体幼苗
【答案】A
【解析】受精作用：卵细胞和精子相互识别、融合成为受精卵的过程。 单倍体育种：采用花药离体培养
的方法获得单倍体植株，然后经过人工诱导使染色体数目加倍，重新恢复到正常植株的染色体数目。 基
因突变：DNA 分子中发生碱基对的增添、缺失和替换，引起基因结构改变。基因突变不改变基因的数量和
排列顺序。
A.精、卵结合得到的受精卵为一个细胞，经有丝分裂增殖分化发育成的胎儿，其体细胞遗传物质组成均相
同，不会出现“嵌合体”，符合题意，A 正确；
B.血友病患者其体内细胞凝血因子基因缺陷，移植造血干细胞到血友病患者体内，会存在凝血因子基因不
缺陷的细胞，根据题意，会出现“嵌合体”，不符合题意，B 错误；
C.对小麦种子或幼苗进行诱变处理，部分细胞发生基因突变，会出现同一植株不同细胞基因组成不同的现
象，会出现“嵌合体”，不符合题意，C 错误；
D.单倍体育种过程中需要用秋水仙素处理使染色体加倍，但细胞分裂不同步，故植株中有的细胞可能含l
个染色体组（未加倍），有的细胞可能含2 个染色体组（加倍），会出现“嵌合体”，不符合题意，D 错
误。
故选A。
16．（2023·全国·校联考模拟预测）M 细胞由小鼠胚胎干细胞定向诱导分化而来，将其移植到糖尿病模型
小鼠（胰岛细胞被特定药物破坏的小鼠）体内，测定小鼠的血糖浓度如图所示。用胰岛素基因片段制成探
针，对小鼠胚胎干细胞和M 细胞进行检测，并将结果记录在表中。下列叙述正确的是（ ）
用探针检测细胞的DNA
用探针检测细胞的RNA
胚胎干细胞
M 细胞
胚胎干细胞
M 细胞
+
①
②
③
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注：“+”表示能检测到，“－”表示不能检测到
A．可用胃蛋白酶处理小鼠的早期囊胚以获得胚胎干细胞
B．图中结果表明M 细胞已具备胰岛β 细胞的功能
C．表中①②③处的结果分别为“+、-、-”
D．实验需用到动物细胞培养、胚胎移植、核酸分子杂交等技术
【答案】B
【解析】1、分析题图可知：未移植组血糖浓度不能恢复到正常水平；移植组的血糖浓度能够恢复到正常
小鼠的血糖浓度，说明此时小鼠体内存在了降低血糖的机制，而根据动物体内唯一降低血糖浓度的激素为
胰岛素，可知M 细胞内已经具有了胰岛B 细胞。
2、分析题表可知：细胞在分化的过程中，遗传物质（DNA）并不发生改变，只是基因选择性表达，所以
两细胞内均能用探针检测到胰岛素基因，但胰岛素基因只在M 细胞内转录和翻译，故只能在M 细胞内检
测到RNA。故表中①②③处的结果分别为“+、-、+”。
A.可用胰蛋白酶处理小鼠的早期囊胚以获得胚胎干细胞，A 错误；
B.分析题图可知：移植组的血糖浓度能够恢复到正常小鼠的血糖浓度，说明此时小鼠体内存在了降低血糖
的机制，而根据动物体内唯一降低血糖浓度的激素为胰岛素，可知M 细胞内已经具有了胰岛B 细胞，故图
中结果表明M 细胞已具备胰岛β 细胞的功能，B 正确；
C.细胞分化过程中遗传物质不变，细胞分化的实质是基因的选择性表达，由B 项可知M 细胞具备胰岛β 细
胞的功能，故表中①②③处的结果分别为“+、-、+”，C 错误；
D.实验需用到动物细胞培养、细胞移植、核酸分子杂交等技术，D 错误。
故选B。
17．（2023·云南大理·统考模拟预测）微生物是难以用肉眼观察到的微小生物的统称，在农业生产和科学
研究等方面都有重要用途。下列叙述正确的是（ ）
①硝化细菌和蓝细菌均不含叶绿体，但二者均是能进行光合作用的自养生物②有荚膜的S 型肺炎链球菌可
抵抗吞噬细胞的吞噬，有利于其在宿主体内生活并繁殖③T2 噬菌体专门寄生在大肠杆菌体内与其遗传物
质的特异性有关④腌制泡菜的过程中，泡菜坛只能装八成满是为了防止乳酸菌产生CO2使发酵液溢出⑤通
过发酵工程可以从微生物细胞中提取单细胞蛋白用于制成微生物饲料⑥农杆菌可以在自然条件下侵染双子
叶植物，将目的基因转移到受体细胞中
A．①②④
B．①④⑤
C．②③⑥
D．③⑤⑥
【答案】C
【解析】1.由原核细胞构成的生物叫原核生物，由真核细胞构成的生物叫真核生物；原核细胞与真核细胞
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相比，最大的区别是原核细胞没有被核膜包被的成形的细胞核，没有核膜、核仁和染色体，原核细胞只有
核糖体一种细胞器，但原核生物含有细胞膜、细胞质等结构，也含有核酸和蛋白质等物质。
2.常考的真核生物有绿藻、衣藻、真菌（如酵母菌、霉菌、蘑菇）、原生动物（如草履虫、变形虫）及动、
植物等；常考的原核生物有蓝藻（如颤藻、发菜、念珠藻、蓝球藻）、细菌（如乳酸菌、硝化细菌、大肠
杆菌等）、支原体、放线菌等；此外，病毒没有细胞结构，既不是真核生物也不是原核生物。
3.原核细胞和真核细胞均含有DNA 和RNA 两种核酸，其遗传物质都是DNA。
4.原核细胞的分裂方式是二分裂；真核细胞的分裂方式有三种：有丝分裂、无丝分裂和减数分裂。
①硝化细菌和蓝细菌均不含叶绿体，均是自养生物，但硝化细菌不能进行光合作用，进行的是化能合成作
用，蓝细菌可通过叶绿素和藻蓝素进行光合作用，①错误；
S
②型肺炎链球菌因为含有荚膜，可抵抗吞噬细胞的吞噬，导致小鼠患病，有利于其在宿主体内生活并繁
殖，②正确；
T2
③
噬菌体为病毒，专性寄生物，其能专门寄生在大肠杆菌体内与其DNA 的特异性有关，③正确；
④乳酸菌进行细胞呼吸不会产生CO2，④错误；
⑤单细胞蛋白是微生物菌体本身，并非从微生物细胞中提取，⑤错误；
⑥农杆菌可以在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，从而将目的基因转移到受体细胞中，⑥正确。
故选C。
18．（2023·辽宁·统考高考真题）天然β 淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR 改
造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23 质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答
下列问题：
（1）上述过程属于 工程。
(2)PCR 中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA 为模板的RNA 聚合酶 ②以RNA 为模板的RNA 聚合酶
③以DNA 为模板的DNA 聚合酶 ④以RNA 为模板的DNA 聚合酶
（3）某天然β-淀粉酶由484 个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476 位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性
明显提升。在图1 所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
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（4）为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2 所示的pLN23 质粒构建得到基因表达载
体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
（5）目的基因（不含EcoRI 酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I 位点。用EcoR I 酶切来自于不
同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段长度，这一操作的目的是 。正确连接
的基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
（6）采用PCR 还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR 的
模板。
【答案】(1）蛋白质
(2)③
(3)②③
（4）标记基因
（5）筛选导入目的基因的大肠杆菌 5.7
（6）逆转录
【解析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的
基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的
方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：
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（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因－-DNA 分子杂交技术；②
检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原－抗体杂交技
术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。
（2）PCR 的原理是DNA 双链复制，利用的酶是耐热的DNA 聚合酶，合成子链时是以DNA 为模板。
（3）根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，
则所用的引物是②③。
（4）作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，
根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。
（5）目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片
段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoR Ⅰ酶
切位点，则切割后的长度为4.2+1.5=5.7kb。
（6）转录是以DNA 为模板合成RNA 的过程，通过PCR 在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以
RNA 为模板逆转录出DNA 作为PCR 反应的模板。
19．（2023·江苏·统考高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建
质粒，如图1 所示。请回答下列问题：
（1）分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主
要的不同是 。
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（2）有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R 应在下列选项中选用______。
A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC
（3）将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这
一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
（4）转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300 个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
（5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
（6）对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
【答案】（1）模板（片段F1、片段F2）、引物 延伸时间
(2)CD
（3）限制性内切核酸酶（限制酶）、DNA 连接酶
(4)ABC
(5)P3、P4
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的碱基序列
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【解析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因
——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质——抗原－抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）PCR 反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR 扩增片
段F1 与片段F2 时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR 过程需要两
种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。片段F1 与片段F2 大小不同，因此扩增
程序中最主要的不同是延伸时间的不同。
（2）由图1 可知，引物F2-F 用于扩增F2 片段，引物F1-R 用于扩增F1 片段，C 选项中5'-GACGAG-3'能
与AnBI 中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F 选用C。D 选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP 中
的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R 选用D。
（3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性
末端，之后再用DNA 连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，
由于PCR 产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内切核
酸酶（限制酶）和DNA 连接酶。
（4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于
30，A 错误；
B.培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B 错误；
C.转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故
不会出现大量杂菌形成的菌落，C 错误；
D.稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无
需进一步划线纯化，D 正确。
故选ABC。
（5）EGFP 为720bp，AnBI 为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1-F 和F2-R 进行了
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PCR 扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的碱基序列，
因此对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
20．（2023·北京·统考高考真题）变胖过程中，胰岛B 细胞会增加。增加的B 细胞可能源于自身分裂（途
径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研
究了L 基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK 中新增B 细胞的来源。
(1)EdU 和BrdU 都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA 中，掺入DNA 的EdU 和
BrdU 均能与 互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU 和BrdU 短时间内即被降解。
（2）将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间
向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU 标记细胞的
百分比（如图）。图中反映DNA 复制所需时长的是从 点到 点。
（3）为研究变胖过程中B 细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除
小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L 基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L 基因两侧已插入特异DNA 序列（x），但L 的功能正常；②Ce 酶基因：源自噬菌
体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x 间的DNA 片段丢失；③Er 基因：编码的Er 蛋白位于
细胞质，与Er 蛋白相连的物质的定位由Er 蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er 蛋白进入细
胞核。请完善制备小鼠IK 的技术路线： →连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选
目标小鼠→ →获得小鼠IK。
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（4）各种细胞DNA 复制所需时间基本相同，但途径I 的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）
的三倍以上。据此，科学家先用EdU 饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU 饲喂，再过t2时间后检测B 细胞被
标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B 细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是
。
【答案】(1)A/腺嘌呤
(2)Q R
（3）将Ce 酶基因和Er 基因连接 饲喂口服药T
（4）大多数B 细胞没有被BrdU 标记
【解析】DNA 分子的复制时间：有丝分裂和减数分裂间期；条件：模板（DNA 的双链）、能量（ATP 水
解提供）、酶（解旋酶和DNA 聚合酶等）、原料（游离的脱氧核苷酸）；过程：边解旋边复制；结果：
一条DNA 复制出两条DNA；特点：半保留复制。
（1）分析题意可知，EdU 和BrdU 都是胸腺嘧啶（T）类似物，根据碱基互补配对的原则可知，掺入DNA
的EdU 和BrdU 均能与A（腺嘌呤）互补配对，并可以被分别检测。
（2）DNA 分子复制时会发生模板链与子链的碱基互补配对，据题可知，将处于细胞周期不同阶段的细胞
混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，则EdU 会与A 结合，导致子链出现放射性，随后每隔一定
时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU 也会与A 结合，使放射性增强，最终实现双标记，随复制完成达到
峰值，故结合题图可知，图中反映DNA 复制所需时长的是从Q 点到R 点。
（3）分析题意，要制备IK 小鼠，需要用诱导型基因敲除小鼠，而饲喂诱导物后小鼠的L 基因才会被敲除，
结合所给实验材料及药物可知，制备小鼠IK 的技术路线为：将Ce 酶基因和Er 基因连接（Ce 酶可作用于
x，导致两个x 间的DNA 片段丢失）→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→饲喂口服药T（诱
导Er 蛋白进入细胞核）→获得小鼠IK。
（4）据题可知，变胖过程中增加的B 细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、
分化（途径Ⅱ），由于但途径I 的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，若先用
EdU 饲喂小鼠IK，各种细胞DNA 复制所需时间基本相同，t2 时间已经经过一个细胞周期，所有的细胞应
都含有EdU 标记，实验假设是变胖过程中增加的B 细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，该过程
已经复制的B 细胞直接分裂，不会再有DNA 复制过程，故t2 时间后用BrdU 饲喂则不起作用，即大多数B
细胞没有被BrdU 标记。
21．（2023·北京·统考高考真题）二十大报告提出“种业振兴行动”。油菜是重要的油料作物，筛选具有
优良性状的育种材料并探究相应遗传机制，对创制高产优质新品种意义重大。
（1）我国科学家用诱变剂处理野生型油菜（绿叶），获得了新生叶黄化突变体（黄化叶）。突变体与野
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生型杂交，结果如图甲，其中隐性性状是 。
（2）科学家克隆出导致新生叶黄化的基因，与野生型相比，它在DNA 序列上有一个碱基对改变，导致突
变基因上出现了一个限制酶B 的酶切位点（如图乙）。据此，检测F2基因型的实验步骤为：提取基因组
DNA→PCR→回收扩增产物→ →电泳。F2中杂合子电泳条带数目应为 条。
（3）油菜雄性不育品系A 作为母本与可育品系R 杂交，获得杂交油菜种子S（杂合子），使杂交油菜的大
规模种植成为可能。品系A1 育性正常，其他性状与A 相同，A 与A1 杂交，子一代仍为品系A，由此可大
量繁殖A。在大量繁殖A 的过程中，会因其他品系花粉的污染而导致A 不纯，进而影响种子S 的纯度，导
致油菜籽减产。油菜新生叶黄化表型易辨识，且对产量没有显著影响。科学家设想利用新生叶黄化性状来
提高种子S 的纯度。育种过程中首先通过一系列操作，获得了新生叶黄化的A1，利用黄化A1 生产种子S
的育种流程见图丙。
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①图丙中，A 植株的绿叶雄性不育子代与黄化A1 杂交，筛选出的黄化A 植株占子一代总数的比例约为
。
②为减少因花粉污染导致的种子S 纯度下降，简单易行的田间操作用 。
【答案】(1）黄化叶
（2）用限制酶B 处理 3
（3）50% 在开花前把田间出现的绿叶植株除去
【解析】基因突变是DNA 分子中碱基对的增添、缺失或替换而引起的基因结构的改变。碱基对的增添、
缺失或替换如果发生在基因的非编码区，则控制合成的蛋白质的氨基酸序列不会发生改变；如果发生在编
码区，则可能因此基因控制合成的蛋白质的氨基酸序列改变。
（1）野生型油菜进行自交，后代中既有野生型又有叶黄化，由此可以推测黄化叶是隐性性状。
（2）检测F2 基因型的实验步骤为：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→用限制酶B 处理→电泳。野
生型基因电泳结果有一条带，叶黄化的基因电泳结果有两条带，则F2 中杂合子电泳条带数目应为3 条。
（3）①油菜雄性不育品系A 作为母本与可育品系R 杂交，获得杂交油菜种子S（杂合子），设育性基因为
A、a，叶色基因为B、b，可判断雄性不育品系A 为显性纯合子（AA），R 为隐性纯合子（aa），A 植株
的绿叶雄性不育子代（AaBb）与黄化A1（aabb）杂交，后代中一半黄化，一半绿叶，筛选出的黄化A 植
株占子一代总数的比例约为50%。
A
②
不纯会影响种子S 的纯度，为减少因花粉污染导致的种子S 纯度下降，应在开花前把田间出现的绿叶
植株除去。
22．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种
新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB 法）。图1 与图2 分别是利用常规转化法
和CDB 法在某植物中递送基因的示意图。
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回答下列问题。
（1）图1 中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生
长素和 ，该过程还需要光照，其作用是 。
（2）图1 中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A 的 。图1
中，含有外源基因的转化植株A 若用于生产种子，其包装需标注 。
（3）图1 与图2 中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。
（4）已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS 基因的CRISPR/Cas9 基因编辑
载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2 中的CDB 法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功
获得转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ，图2 中，鉴定导入幼苗中的基
因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ，依据是 。
（5）与常规转化法相比，采用CDB 法进行基因递送的优点是 （答出2 点即可）。
【答案】（1）脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要
（2）遗传特性 转基因标识
(3)Ti 质粒中的T-DNA 能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA 整合到一起
（4）荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根 观察幼苗是否表现出白化特征 PDS 缺失会导致
植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS 基因的敲除
（5）操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
【解析】植物组织培养过程是：离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织，然后再分化生成根、
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芽，最终形成植物体。植物组织培养依据的原理是植物细胞的全能性。
（1）图1 中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于脱分化过程，该过程的本质是使细胞失去原来特定的结
构和功能；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和细胞分裂素，这两种激素的比值能调控愈
伤组织的分化方向，该过程还需要光照，因为叶绿素的形成需要光；且叶绿体利用光能制造有机物，供试
管苗生长发育。
（2）图1 中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A 的遗传特性。
图1 中，含有外源基因的转化植株A 若用于生产种子，其包装需标注转基因种子，即进行转基因标识。
（3）图1 与图2 中，农杆菌侵染植物细胞时，利用了农杆菌含有的Ti 质粒的作用，Ti 质粒中的T-DNA 能
将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA 整合到一起。
（4）已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS 基因的CRISPR/Cas9 基因编辑
载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2 中的CDB 法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功
获得转化植株B，该过程中通过荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根即为阳性毛状根段，图2 中，鉴
定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是观察幼苗是否表现出白化特征，因为PDS 缺失会
导致植株白化，而白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS 基因的敲除。
（5）与常规转化法相比，采用CDB 法进行基因递送的优点主要表现在操作方法简单，不需要借助植物组
织培养技术进行操作，且培养周期较短。
23．（2023·浙江·统考高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量
很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
（1）植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维
持在一定浓度水平，这种调节方式属于 。根据这种调节方式，在培养基中添加 ，用于筛选经
人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
（2）随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011 年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功
培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过
检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相
应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF 膜发生
，表达载体最终进入细胞核，发生转化。
③核移植。将转基因的BEF 作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为 。
将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了 重组细胞发育的作用。
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④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至 ，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤检测。DNA 水平检测：利用PCR 技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以 为阳性对照，
检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA 水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛
乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA 进行 处理，以去除DNA 污染，
再经逆转录形成cDNA，并以此为 ，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因
牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？ 。
【答案】（1）负反馈调节 过量赖氨酸类似物
（2）基因数据库 融合 核受体细胞 激活 早期囊胚 转基因BEF
DNA 酶
PCR 的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳
细胞中不能表达。
【解析】负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使
系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获
取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程
的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细
胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法
和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方
法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA
是否插入目的基因-DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的
基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系
统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合
成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。如果
想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体可在培养基中添加过量赖氨酸类似物。
（2）①从基因数据库获取获取目的基因编码序列，用化学合成法制备可得到目的基因。
②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与BEF 膜发生融合。
③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数第二次分裂中期，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能
性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。
④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑椹胚或囊胚阶段；植入代孕母牛子宫角，
直至小牛出生。
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⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影
响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面
预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对
照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。
为了除去DNA 污染，可以使用DNA 酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR 的模板进行扩增。
目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含
有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。
24．（2023·天津·统考高考真题）基因工程：制备新型酵母菌
（1）已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需
的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是 （填“细胞内”和“细胞外”）
（2）同源切割是一种代替限制酶、DNA 连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的
小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用
同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A．B，已知酵母菌体内DNA 有许多A-B 序列位点可
以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物 对目的基因进行PCR。
（3）已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-
氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。
（i）导入目的基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，
因此在导入一种目的基因后，要切除UGA 基因，再重新导入。研究人员在UGA 基因序列两端加上酵母菌
DNA 中不存在的同源C．C 序列，以便对UGA 基因进行切除。C．C 的序列方向将影响切割时同源序列的
配对方式，进而决定DNA 片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式 进行连接。
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（ii）切去UGA 基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。
（4）综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图 。
【答案】(1）细胞外
(2)P1 和P6
（3）缺乏尿嘧啶 方式二 含有5-氟乳清酸
（4）图3
【解析】 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA 重组和转基因技术，赋予生物
以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品．基因工程是在DNA 分子水平上进
行设计和施工的，又叫做DNA 重组技术。
（1）由于酵母菌不能吸收淀粉，所以导入分解淀粉的酶发挥作用的场所在细胞外。
（2）根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，
将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P1 和
P6 这对引物进行PCR。
（3）（i）选择了尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，则应该将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上
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培养，如果导入成功，则形成菌落；如果没有导入，则缺乏尿嘧啶，不能生存；
方式一，C 和C'方向相反，如果切割，则末端在一条链上，不能连接，所以选择方式二，连接方向相同，
切割后形成末端，便于连接。
（ii）由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上，
如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。
（4）根据前面分析，C 和C'的中间插入UGA，A 和B 之间插入的目的基因，所以图3 正确。
25．（2023·天津·统考高考真题）某植物四号染色体上面的A 基因可以指导植酸合成，不能合成植酸的该
种植物会死亡。现有A3-和A25-两种分别由A 基因缺失3 个和25 个碱基对产生的基因，已知前者不影响植
酸合成，后者效果未知。
（1）现有基因型为AA25-的植物，这两个基因是 基因。该植物自交后代进行PCR，正向引物与A25-缺
失的碱基配对，反向引物在其下游0．5kb 处，PCR 后进行电泳，发现植物全部后代PCR 产物电泳结果均
具有明亮条带，原因是 ，其中明亮条带分为较明亮和较暗两种，其中较明亮条带代表基因型为
的植物，比例为 。
（2）将一个A 基因导入基因型为A3-A25-的植物的6 号染色体，构成基因型为A3-A25- A 的植物、该植物自
交子代中含有A25-A25-的比例是 。
（3）在某逆境中，基因型为A3-A3-的植物生存具有优势，现有某基因型为A3-A 的植物，若该种植物严格自
交，且基因型为A3-A3-的植物每代数量增加10%，补齐下面的表格中，子一代基因频率数据（保留一位小
数）：
代
亲代
子一代
子二代
A 基因频率
50%
%
46．9%
A3-基因频率
50%
%
53．1%
基因频率改变，是 的结果。
【答案】（1）等位 自交后代中基因型为A25-A25-的个体死亡，基因型为A25-A 和AA 的个体由于都
至少含有一个A 基因，因此可以与正向引物和反向引物结合进而完成PCR，获得明亮条带。 AA
1/3
(2)1/5
(3)48.8% 51.2% 自然选择
【解析】基因突变是指DNA 分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构的改变。基因分
离定律的实质：在杂合子的细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性；生物体在进
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行减数分裂形成配子时，等位基因会随着同源染色体的分开而分离，分别进入到两个配子中，独立地随配
子遗传给后代。基因自由组合定律实质：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或组合是互不干扰的，
在减数分裂形成配子的过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离，非同源染色体上的非等位基因自由组
合。
生物进化的实质在于种群基因频率的改变。突变和基因重组、自然选择及隔离是物种形成过程的三个基本
环节，通过它们的综合作用，种群产生分化，最终导致新物种的形成。其中突变和基因重组产生生物进化
的原材料，自然选择使种群的基因频率发生定向的改变并决定生物进化的方向。
（1）由题干可知，A25-基因是由A 基因缺失25 个碱基对产生的基因，即A 基因通过基因突变产生A25－
基因，因此二者属于等位基因。基因型为AA25-的植物自交后代的基因型及其比例为AA：AA25-：A25-
A25-=1:2:1。当对这些后代进行PCR 时，正向引物与A25-缺失的碱基配对，反向引物在其下游0.5kb 处，
可推知缺失这25 个碱基对的A25-基因无法与正向引物配对从而不能扩增，因此只含有A25－基因的个体
（即A25-A25-）不具有条带；含有这25 个碱基对的A 基因才能与正向引物和反向引物都进行碱基互补配
对从而扩增出条带，因此基因型为AA、AA25－的个体均具有条带，且A 基因个数越多，扩增产物越多，
条带越明亮，因此基因型为AA 的个体具有较明亮的条带，基因型为AA25-的个体具有较暗的条带。由题
干可知，该植物的全部后代都具有明亮条带，说明基因型为A25-A25-的个体无法存活，只有基因型为AA
和AA25－的个体能够存活下来，并进行了PCR 扩增产生了条带，因此较明亮条带代表基因型为AA，占
比为1/3。
（2）已知基因A3-和A25-都在4 号染色体上，再导入一个A 基因至6 号染色体上，由于它们位于不同对染
色体上，故该植物在减数分裂产生配子时，遵循基因自由组合定律，产生配子的基因型为A3-A、A25-A、
A3-、A25-，比例各自占1/4；该植物自交后代中基因型为A25-A25-=1/4×1/4=1/16 的个体死亡，存活个体
占1-1/16=15/16，含有A25-A25-的后代个体基因型有2 种，分别是AAA25-A25-=1/4×1/4=1/16，AA25-
A25-=1/4×1/4×2=2/16，二者共占3/16，因此该植物自交子代中含有A25-A25-的比例是3/16÷15/16=1/5。
（3）基因型为A3-A 的植物自交产生子一代的基因型及比例为AA=1/4，A3-A=1/2，A3-A3-=1/4，由题干
可知，基因型为A3-A3-的植物每代数量增加10%，则子一代中A3-A3-=1/4+1/4×10%=11/40，因此子一代
中AA：A3-A：A3-A3-=1/4：1/2：11/40=10:20:11，可计算出三者的基因型频率分别是AA=10÷
（10+20+11）=10/41，A3-A=20÷（10+20+11）=20/41，A3-A3-=11÷（10+20+11）=11/41，可进一步计算出
子一代中A 基因频率=10/41+1/2×20/41=48.8%，A3-基因频率=11/41+1/2×20/41=51.2%。自然选择导致具有
有利变异的个体存活并由更大概率产生更多后代，导致后代中决定有利变异的基因频率增大，而具有不利
变异的个体则会被自然选择淘汰，因此决定不利变异的基因频率减小，因此基因频率的改变是自然选择的
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结果。
26．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部
分结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5。
（1）与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结
构有 （答出2 个结构即可）。
（2）构建重组质粒后，为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR 检测，若仅用一对引
物，应选择图甲中的引物 。已知J 基因转录的模板链位于b 链，由此可知引物F1 与图甲中J 基
因的 （填“a 链”或“b 链”）相应部分的序列相同。
（3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表
达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1 证明细胞内表达了 ，条带2 所检出的蛋白
（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J 基因表达的。
【答案】（1）RNA 聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
（2）F2 和R1 或F1 与R2
a 链
（3）J-V5 融合蛋白 不是
【解析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和
终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA 分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是
荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA 聚合酶
识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标
记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，
对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构
有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
（2）据图甲可知，引物F2 与R1 或F1 与R2 结合部位包含J 基因的碱基序列，因此推测为了确定J 基因连
接到质粒中且插入方向正确，进行PCR 检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2 和R1 或F1 与
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R2。b 是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应
该是3-5'，非模板链（也就是a 链）是5'-3'；考虑到DNA 复制的方向是子链的5-3'，引物基础上延伸的方
向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1 是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3-
5'的b 链，故其序列应该与a 链相应部分的序列相同。
（3）据图乙可知，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1 是J-V5 融合蛋白。
抗J 蛋白抗体检测出现条带2，抗V5 抗体检测不出现条带2，说明条带2 所检出的蛋白不是由重组质粒上
的J 基因表达的。
27．（2023·湖南·统考高考真题）基因检测是诊断和预防遗传病的有效手段。研究人员采集到一遗传病家
系样本，测序后发现此家系甲和乙两个基因存在突变：甲突变可致先天性耳聋；乙基因位于常染色体上，
编码产物可将叶酸转化为N5-甲基四氢叶酸，乙突变与胎儿神经管缺陷（NTDs）相关；甲和乙位于非同源
染色体上。家系患病情况及基因检测结果如图所示。不考虑染色体互换，回答下列问题：
（1）此家系先天性耳聋的遗传方式是 。1-1 和1-2 生育一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率
是 。
（2）此家系中甲基因突变如下图所示：
正常基因单链片段5'-ATTCCAGATC……（293 个碱基）……CCATGCCCAG-3'
突变基因单链片段5'-ATTCCATATC……（293 个碱基）……CCATGCCCAG-3'
研究人员拟用PCR 扩增目的基因片段，再用某限制酶（识别序列及切割位点为
）酶切检测甲
基因突变情况，设计了一条引物为5′-GGCATG-3'，另一条引物为 （写出6 个碱基即可）。用上
述引物扩增出家系成员Ⅱ-1 的目的基因片段后，其酶切产物长度应为 bp（注：该酶切位点在目的
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基因片段中唯一）。
（3）女性的乙基因纯合突变会增加胎儿NTDs 风险。叶酸在人体内不能合成，孕妇服用叶酸补充剂可降低
NTDs 的发生风险。建议从可能妊娠或孕前至少1 个月开始补充叶酸，一般人群补充有效且安全剂量为0.4
～1.0mg.d-1，NTDs 生育史女性补充4mg.d-1。经基因检测胎儿（Ⅲ-2）的乙基因型为-/-，据此推荐该孕妇
（Ⅱ-1）叶酸补充剂量为 mg.d-1。
【答案】（1）常染色体隐性遗传病 1/32
(2)5'-ATTCCA-3' 8、302 和310
(3)0.4~1.0
【解析】基因分离定律和自由组合定律的实质：进行有性生殖的生物在进行减数分裂产生配子的过程中，
位于同源染色体上的等位基因随同源染色体分离而分离，分别进入不同的配子中。随配子独立遗传给后代，
同时位于非同源染色体上的非等位基因进行自由组合
（1）由遗传系谱图可知，由于I-1 与I-2 均表现正常，他们关于甲病的基因型均为+/-，而他们的女儿Ⅱ-4
患病，因此可判断甲基因突变导致的先天性耳聋是常染色体隐性遗传病，由I-1、I-2 和Ⅱ-3 关于乙病的基
因可以推出乙基因突变导致的遗传病也是常染色体隐性遗传病，所以I-1 和I-2 生出一个甲和乙突变基因双
纯合体女儿的概率为1/4×1/4×1/2=1/32 。
（2）本题研究甲基因突变情况，二代1 为杂合子，兼有正常甲基因和突变甲基因。目的基因为甲基因，扩
增引物应与两基因共有的TAAGGT 片段结合，应为ATTCCA。可扩增出大量正常甲基因和突变甲基因供
后续鉴定。此时酶切，正常甲基因酶切后片段为8 和2+293+7=302bp，突变甲基因无法被酶切，大小为
310bp。后续可通过电泳等手段区分开，达到检测甲基因突变情况的目的。
（3）女性的乙基因纯合突变会增加胎儿NTDs 风险，Ⅲ-1 和Ⅲ-2 关于乙的基因型为－/-，但不表现
NTDs，即该孕妇（Ⅱ-1）无NTDs 生育史，推荐叶酸补充剂量为0.4～1.0mg·d-1。
28．（2023·湖北·统考高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A 为
抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：
（1）与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过
原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG 可促进细胞融合，该过程中PEG 对细胞膜的作用是 。
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（2）在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT 培养基），该培养基对 和
生长具有抑制作用。
（3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
（4）构建重组质粒需要使用DNA 连接酶。下列属于DNA 连接酶底物的是 。
【答案】（1）不需要
使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
（2）未融合的亲本细胞 融合的具有同种核的细胞
（3）通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(4)④
【解析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免
疫的B 淋巴细胞；诱导B 细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛
选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培
养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
（1）浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG 可
使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
（2）在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融
合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
（3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原－抗体杂交技术，抗体检测
呈阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。
（4）DNA 连接酶能连接DNA 片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，-OH 位于3'端，①②③脱氧核苷酸
链的两端基团有误；DNA 连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸5'端的磷酸基团与另一条脱
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氧核苷酸链的3'端的-OH 相连，④符合题意。
故选④。
29．（2023·全国·统考高考真题）GFP 是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP 基因
为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
（1）构建突变基因文库，科研人员将GFP 基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出
GFP 基因的突变基因文库。通常，基因文库是指 。
（2）构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP 突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构
建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP 突变基因的转录方向）。图中①为 ；②为 ，
其作用是 ；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 。
（3）目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿
色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是
（答出1 点即可）。
（4）新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP 突变
基因进行测序，发现其碱基序列与GFP 基因的不同，将该GFP 突变基因命名为YFP 基因（黄色荧光蛋白
基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP 基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
【答案】(1）将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有
这种生物的不同的基因
（2）终止子 启动子 RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 鉴别受体细胞中是否含
有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
（3）密码子具有简并性
（4）将构建好的表达载体（含有目的基因YFP 基因）导入酵母菌中进行表达
【解析】有关密码子，考生可从以下几方面把握：
①概念：密码子是mRNA 上相邻的3 个碱基。
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②种类：64 种，其中有3 种是终止密码子，不编码氨基酸。
③特点：一种密码子只能编码一种氨基酸，但一种氨基酸可能由一种或多种密码子编码；密码子具有通用
性，即自然界所有的生物共用一套遗传密码。
（1）将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生
物的不同的基因，称为基因文库。
（2）一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子，终止子以及标记基因等，且基因的
转录方向为从启动子到终止子，故图中①为终止子，②为启动子，启动子是一段有特殊结构的DNA 片段，
位于基因的首端，它是RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所
需要的蛋白质。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛
选出来，如抗生素基因就可以作为这种基因。
（3）正常情况下，GFP 突变基因应该不发绿色荧光，而大肠杆菌有的发绿色荧光，从密码子特点的角度
分析，原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由一种或多种密码子决定。
（4）基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
要通过基因工程的方法探究YFP 基因能否在真核细胞中表达，可将构建好的表达载体（含有目的基因YFP
基因）导入酵母菌中进行表达，如果酵母菌发出黄色荧光，说明YFP 基因能在真核细胞中表达，反之则不
能在真核细胞中表达。
30．（2023·全国·统考高考真题）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙
肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA 病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因
工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
（1）接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是 。
（2）制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞
中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启
动子并驱动目的基因转录的酶是 。
（3）目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取 进行
DNA 分子杂交，DNA 分子杂交时应使用的探针是 。
（4）若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
【答案】(1）重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖
（2）筛选 RNA 聚合酶
（3）核染色体DNA 被标记的目的基因的单链DNA 片段
（4）通过使用相应抗体，利用抗原－抗体杂交技术，检测mRNA 是否翻译形成蛋白质
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【解析】基因工程的操作步骤：（1）目的基因的获取；方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和
人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目
的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效
的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因-DNA 分子杂交技术②检测目的基
因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原－抗体杂交技术；个体水
平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）重组乙肝疫苗的成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体后，无法完成病毒遗传物质
的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。
（2）抗生素抗性基因作为标记基因，用于转化细胞的筛选。
RNA 聚合酶结合目的基因启动子并驱动转录。
（3）检测的对象是目的基因是否插入染色体中，故提取酵母细胞染色体进行目的基因鉴定。
基因探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列。
（4）要检测出目的基因是否表达，除了需要检测目的基因是否插入染色体外，还需要检查目的基因是否
转录与表达。检测是否转录，用核酸分子杂交技术，检测是否翻译用抗原－抗体杂交技术。
31．（2023·浙江·统考高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。
某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体
融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：
（1）根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备
的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼
苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的 为外植体。
（2）植物细胞壁的主要成分为 和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。
在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的 失活。对处理
后的原生质体在显微镜下用 计数，确定原生质体密度。两种原生质体1 1∶混合后，通过添加适
宜浓度的PEG 进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是 。
（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板
中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于 。下列各项中能说明这些
愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？
A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂
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B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂
C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂
D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂
（4）愈伤组织经 可形成胚状体或芽。胚状体能长出 ，直接发育形成再生植株。
（5）用PCR 技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA 序列a，乙植物细胞质具有特异性
DNA 序列b；M1、M2为序列a 的特异性引物，N1、N2为序列b 的特异性引物。完善实验思路：
Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR 扩增的 。
Ⅱ．将DNA 提取物加入PCR 反应体系， 为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列
b。
Ⅲ．得到的2 个PCR 扩增产物经 后，若每个PCR 扩增产物在凝胶中均出现了预期的
个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
【答案】（1）再生 叶
（2）纤维素 细胞质和细胞核 血细胞计数板 降低PEG 浓度，使其失去融合作用
（3）同一个杂种融合原生质体 ABD
（4）再分化 根和芽
（5）模板 M1、M2 凝胶电泳 1
【解析】1、植物组织培养过程：离体的植物组织经过脱分化形成愈伤组织，经过再分化愈伤组织又能重
新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。
2、植物体细胞杂交可以克服植物有性杂交不亲和性、打破物种之间的生殖隔离，操作过程包括：原生质
体制备、原生质体融合、杂种细胞筛选、杂种细胞培养、杂种植株再生以及杂种植株鉴定等步骤。
（1）在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备再生的能力。为了
便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植
体，则乙植物可用幼苗的叶为外植体。
（2）植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。甲植
物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应，在原生质体融合前，需对原生质体进行
处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质和细胞核失活，融合后具有甲植物的细胞核基因和乙植物
的细胞质基因。对处理后的原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数，确定原生质体密度。两种原生质体
1 1∶混合后，通过添加适宜浓度的PEG 进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的
是降低PEG 浓度，使其失去融合作用。
（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板
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中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于同一个杂种融合的原生质体。未融合
的原生质体因为细胞质或细胞核的失活，无法正常生长、分裂；同种融合的原生质体也因为甲原生质体细
胞质或乙原生质体细胞核失活而不能生长、分裂；只有杂种细胞才具备有活性的细胞质和细胞核，可以生
长、分裂，因此这些愈伤组织只能来自于杂种细胞。故选ABD。
（4）愈伤组织经再分化可形成胚状体或芽。胚状体能长出根和芽，直接发育形成再生植株。
（5）Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR 扩增的模板。
Ⅱ．将DNA 提取物加入PCR 反应体系，M1、M2 为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。
Ⅲ．得到的2 个PCR 扩增产物经凝胶电泳后，若每个PCR 扩增产物在凝胶中均出现了预期的1 个条带，则
可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
32．（2023·湖南郴州·统考一模）我国有7000 年的种植水稻的历史，如今水稻已经成为我国重要作物。生
产实践中获得具有杂种优势的杂合种子是提高水稻产量的重要途径，同时寻找抗病、耐旱、耐盐、耐高温
基因并对其调控机制进行深入研究对水稻遗传改良具有重要意义。
（1）自然条件下，科研人员从水稻品种ZH11 中筛选出雄性不育突变体（hms1）。利用雄性不育突变体进
行杂交水稻育种的优势是 。
（2）科研人员获得纯合稻瘟病抗性突变体 M，并对野生型（WT）和抗性突变体 M 的 R 基因进行测序
分析，结果如图。
由图可知，突变体的第591 位发生了 ，可能导致第 位及之后的氨基酸发生改变，从而引起该蛋白
质空间结构发生变化。
（3）若需要对M 的R 基因进行PCR 扩增处理，已知引物1 为 5'-TCA-3'，则引物2 应为 。
（4）某研究所提取水稻品种 nonabokra 的两个耐盐基因 qgslc-1 和 Salto1 并导入普通水稻zhonghua11，
从而筛选出成功整合的耐盐水稻植株（两个耐盐基因都表达才表现为高耐盐性状，表达一个为中耐盐，不
表达即为不耐盐）。如下图表示两个基因随机整合的三种情况，让三株转基因水稻植株自交，若自交后代
性状分离及其比例为 ，则为甲整合情况；若自交后代性状分离及其比例为 ，则为乙整合情况；若
自交后代性状分离及其比例为 ，则为丙整合情况。
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【答案】(1）不需要将母本人工去雄
（2）G-C 碱基对缺失 198
(3)5—ATG
（4）高耐盐∶不耐盐=3 1
∶
高耐盐∶中耐盐∶不耐盐=9 6 1
∶∶
高耐盐∶中耐盐=1 1∶
【解析】1、基因的分离定律的实质是：在杂合体的细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一
定的独立性，在减数分裂形成配子的过程中，等位基因会随同源染色体的分开而分离，分别进入两个配子
中，独立地随配子遗传给后代。
2、基因的自由组合定律的实质是：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或组合是互不干扰的；在减
数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时非同源染色体上的非等位基因自由组合。
3、据第一个图可知，与WT 相比，突变体M 的591 位点碱基对G-C 发生了缺失，即发生了碱基对的缺失。
（1）水稻是两性花，杂交实验过程中，需要对母本进行人工去雄处理，而雄性不育的个体不需要去雄。
（2）据图可知，与WT 相比，突变体M 的碱基对G//C 发生了缺失，即发生了碱基对的缺失，且后一碱基
对仍是G//C，一个密码子由mRNA 上三个相邻的碱基组成，故导致第198 位及之后的氨基酸发生改变，从
而引起该蛋白质空间结构发生变化。
（3）对突变体M 的R 基因进行PCR 扩增时，引物是连接在基因的3'端，并与之发生碱基互补配对，已知
引物1 为 5'-TCA-3'，则引物2 应为5'-ATG-3'。
（4）假设qskc-1 基因用A 表示，Saltol 基因用B 表示，让甲、乙、丙三株转基因水稻植株分别自交，甲植
株所产生的配子为AB：OO=1：1，自交后代中高耐盐∶不耐盐=3 1∶；乙植株所产生的配子为AB： AO：
BO：OO=1：1：1：1，自交后代中高耐盐∶中耐盐∶不耐盐=9 6 1
∶∶；丙植株所产生的配子为AO：
BO=1：1，自交后代中高耐盐∶中耐盐=1 1∶。
33．（2023·湖南郴州·统考一模）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建
质粒，如图1 所示。请回答下列问题：
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（1）进行 PCR 扩增时需要耐高温的DNA 聚合酶，为使其活化应在 PCR 反应缓冲液中加入 （填
“Ca2+”或“Mg2+”）。
（2）有关基因序列如图2，引物 F2-F、F1-R 应在下列选项中分别选用 。
A．5'-ATGGTG------CAACCA-3'
B．5'-TGGTTG------CACCAT-3'
C．5-GACGAG------CTGCAG-3
D．5-CTGCAG------CTCGTC-3
（3）将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在酶的作用下可形成环形质粒，直接用于转化细菌。这一
过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要是 。
（4）构建好的重组质粒除了含有目的基因、标记基因，还要有 ，用以控制目的基因的表达。
（5）如何将重组质粒导入大肠杆菌？ 。
（6）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，符合要求的质粒为 。
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【答案】(1)Mg2+
(2)CD
（3）限制酶/限制性内切核酸酶
（4）启动子和终止子
（5）用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，可将重组质粒导入细胞
(6)P1 和P2
【解析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的
构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可
便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因
——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质——抗原－抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）进行 PCR 扩增时需要耐高温的DNA 聚合酶，为使其活化应在PCR 反应缓冲液中加入Mg2+。
（2）由图1 可知，引物F2−F 用于扩增F2 片段，引物F1−R 用于扩增F1 片段，C 选项中5′−GACGAG−3′
能与AnBI 中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物 F2−F 选用C；D 选项中 5′−CTGCAG−3′ 能与
EGFP 中的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1−R 选用D。故选CD。
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（3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性
末端，之后再用 DNA 连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将 PCR 产物片段与线性质粒载体混合
后，在 DNA 连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）。
（4）构建好的重组质粒除了含有目的基因、标记基因，还要有启动子和终止子，用以控制目的基因的表
达。
（5）将重组质粒导入大肠杆菌一般是用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于能吸收周围环境中 DNA 分子的
生理状态。
（6）EGFP 为720bp，AnBI 为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1−F 和F2−R 进行
了PCR 扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，符合要求的质粒有P1、P2。
34．（2023·浙江宁波·镇海中学校联考一模）某DNA 病毒对动物养殖业危害十分严重。研究人员拟以该病
毒抗原蛋白A 来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：
（1）获取基因A：用于制备蛋白A 的基因称为 ，获取该基因的常用方法是先建立 ，
用一定方法“钓取”相应基因克隆片段后通过 技术扩增，扩增的原料是 。下列对引
物的叙述错误的是 。
A．两个引物之间不应有互补性 B．引物自身不存在互补序列
C．引物与模板链复制起始端碱基互补 D．引物的碱基包含AGCU 四种
（2）工程菌转化：将工程菌放于低温、低浓度 溶液中，造成细胞膜通透性改变，成为
细胞，通过一定手段将外源DNA 导入细胞完成转化。
（3）筛选获得杂交瘤细胞：在杂交瘤细胞筛选中，常使用特殊选择培养基如 培养基，该培养
基对 和 两类细胞的存活和繁殖具有抑制作用。
（4）特定杂交瘤细胞的培养和单克隆抗体的筛选：特定杂交瘤细胞培养常用搅拌式发酵罐，培养时需注
意控制如 等条件（写出2 点）。发酵罐中营养物质通常需加入葡萄糖、氨基酸、激素、无机盐
和 ，以及诱导抗体分泌的化学物质，如丁酸钠。发酵罐内细胞增殖形成 （细胞株/细
胞系），其分泌的抗体可利用 技术筛选。罐内上清液中单克隆抗体含少量杂质，可采用
方法纯化。
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【答案】（1）目的基因/外源基因 基因文库 PCR dNTP（四种脱氧核苷三磷酸） D
（2）CaCl2/Ca2+ 感受态/能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态
（3）HAT 未融合细胞 同种核融合细胞
(4)PH、温度、溶解氧 动物血清 细胞系 抗原—抗体杂交 过滤/层析/离心/离子交换/萃
取
【解析】单克隆抗体的制备：（1）制备产生特异性抗体的B 淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的抗原，
然后从小鼠脾内获得相应的B 淋巴细胞。（2）获得杂交瘤细胞：①将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中形成的B
淋巴细胞融合；②用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体。（3）
克隆化培养和抗体检测。（4）将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。（5）提取单克隆抗体：
从细胞培养液或小鼠的腹水中提取。
（1）蛋白A 的基因为目的基因，可从基因文库中获取目的基因，因此获取该基因的常用方法是先建立基
因文库。常用PCR 技术对目的基因进行扩增，dNTP（四种脱氧核苷三磷酸）既能为DNA 复制提供能量，
又能为PCR 技术提供原料。
A.两种引物之间不能有互补性，否则引物之间会配对形成双链DNA，A 正确；
B.每种引物自身不应存在互补性，B 正确；
C.DNA 分子合成时子链从5'→3'端延伸，则扩增时，引物与模板链的3'端碱基互补配对，C 正确；
D.引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，引物的碱基包含AGCT 四种，D
错误。
故选D。
（2）将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法，将工程菌放在低温、低浓度的CaCl2 溶液中，
使细胞膜的通透性改变，成为感受态细胞，该状态为容易从周围环境中吸收外源DNA 的状态，进而可提
高转化效率。
（3）在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT 培养基），该培养基对未融合细胞和
同种核融合细胞两类细胞的存活和繁殖具有抑制作用，只有杂交瘤细胞可以正常增殖，因此该选择培养基
只允许杂交瘤细胞正常生长，从而筛选出杂交瘤细胞。
（4）在发酵过程中，要及时添加必需的营养组分，要严格控制温度、pH 和溶解氧等发酵条件。因此，特
定杂交瘤细胞培养常用搅拌式发酵罐，培养时需注意控制如pH、温度、溶解氧等条件。在动物细胞培养的
过程中，通常需加入动物血清、血浆等天然物质。抗原与抗体的结合具有特异性，发酵罐内细胞增殖形成
细胞系，其分泌的抗体可利用抗原—抗体杂交筛选。罐内上清液中单克隆抗体含少量杂质，可采用过滤/层
析/离心/离子交换/萃取方法纯化。
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35．（2023·江苏连云港·东海县石榴高级中学校考模拟预测）基因工程可以赋予生物新的性状，科研人员
利用基因工程技术以期待获得具备抗旱特性的小麦。请回答下列问题：
（1）研究发现，某些植物的种子脱水数十年后复水仍能够恢复活性，原因是细胞中积累了海藻糖。科研
人员拟将酵母菌的海藻糖合成酶基因（TPS）转入小麦中。下图标注了载体、TPS 基因的酶切位点和预期
的基因表达载体的结构，表格列举了限制酶的识别序列。
酶
识别序列
BamHI
5GGATCC
SacI
5GAGCTC
HindⅢ
5AAGCTT
XbaI
5TCTAGA
①科研人员利用PCR 技术获得大量的TPS 基因。
现将2 种引物的一侧添加限制酶识别序列，这样TPS 基因的PCR 产物和载体用相同的限制酶切割后，可利
用 酶将TPS 基因拼接到载体的切口处，形成基因表达载体。
②从图分析，在TPS 基因两侧引入的是 限制酶的酶切位点。设计的引物序列为
（2）图中Bar 基因是抗除草剂基因。基因表达载体转入细胞后，在获得的植株叶片上涂抹除草剂，筛选出
7 株抗除草剂个体。Bar 基因作为载体上的 基因辅助筛选TPS 转基因植株。
（3）现对筛选出的抗除草剂个体进行DNA 水平的检测。请填写表格，完成实验设计：
组别
植株编号1-7
对照组1
对照组2
模板
①
基因表达载体或TPS 基因片段
②
PCR 体系中其他物质
扩增缓冲液、水、引物、③、④
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电泳预期结果
⑤
有条带
没有条带
① ；② ；③ ；④ ；⑤ 。
（4）下图为用探针检验某一转海藻糖合成酶基因抗旱植物基因型的原理，相关基因用R 和r 表示。若被检
植株发生A 现象，不发生B、C 现象，则被检植物的基因型为 。
【答案】（1）DNA 连接 BamHI、SacI 5-GGATCCGAATCGAACGATTAGCAACT 5-
GAGCTCAGCCTAACGTACAAGTTCGT
（2）标记
（3）（提取的）1-7 号植株DNA 空质粒载体 4 种脱氧核苷酸/dNTP Taq 酶 有条带
(4)RR
【解析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因
——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
PCR 技术的条件：引物、dNTP、Taq 酶、模板DNA，其中dNTP 是合成DNA 的原料；设计引物时要注意
避免引物之间形成碱基互补配对而形成双链。
（1）①DNA 连接酶的作用是将DNA 片段连接起来，TPS 基因的PCR 产物和载体用相同的限制酶切后，
可利用DNA 连接酶将TPS 基因拼接到载体的切口处，形成基因表达载体。
②据题意可知，载体中的Bar 标记基因中含有HindⅢ识别位点，TPS 基因中存在XbaⅠ识别位点，因此构
建基因表达载体时不能用这两种酶，只能用BamHⅠ和SacⅠ进行酶切，因此在TPS 基因两侧引入的是
BamHⅠ、SacⅠ限制酶的酶切位点。设计的引物时两侧要分别加入BamHⅠ和SacⅠ的识别序列，因此设计的引
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物序列为5'-GGATCC（BamHⅠ识别序列）GAATCGAACGATTAGCAACT（TPS 基因中已知序列）、5'-
GAGCTC（SacⅠ识别序列）AGCCTAACGTACAAGTTCGT（TPS 基因中已知序列）。
（2）Bar 基因是抗除草剂基因，说明其作为标记基因，可辅助筛选TPS 转基因植株。
（3）表中的实验设计中的自变量是模板的不同，即分别是植株1～7 号各自的DNA（待测DNA）、基因
表达载体或TPS 基因（已知的DNA），空载体空白对照，加入模板DNA 后，分别进行PCR 扩增，扩增的
条件是，在反应体系中加入缓冲液、4 种脱氧核苷酸、热稳定的DNA 聚合酶（Taq 酶），水和引物等，多
次循环后，进行电泳检测，待测DNA 中有条带说明该植株是成功导入目的基因的植株，无条带说明待测
植株是导入空载体的植株，空载体上没有目的基因，因此检测的结果表现为无检测的目的基因条带，所以
植株编号1-7 的电泳预期结果为有条带。
（4）被检植物发生A 现象，不发生B、C 现象，即r 探针没有形成杂交环，所以被检植物的基因型为
RR。
36．（2023·河南·校联考模拟预测）从胡萝卜中提取的橘黄色β-胡萝卜素具有预防白内障等医用价值。图1
为提取β-胡萝卜素的装置图。胡萝卜素脱饱和酶参与β-胡萝卜素的合成。科学家将β-胡萝卜素脱饱和酶基
因（基因M）转入水稻愈伤组织细胞，经培育、筛选出含有β-胡萝卜素的“黄金大米”。图2 表示利用
PCR 技术扩增基因M 并且同时在一端添加限制酶EcoRI 酶切位点的过程示意图。回答下列问题：
（1）利用图1 装置提取胡萝卜素，该装置在加热瓶口安装冷凝管的目的是 。⑤⑥萃取过
程采用水浴加热是因为 。
（2）提取的胡萝卜粗品通过 法进行鉴定。如图表示鉴定结果示意图，其①－中属于其他
色素或杂质的是 （填序号）。
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（3）双链的解开是进行DNA 复制的前提，PCR 过程中在80~100℃的温度范围内，DNA 双链分开，这个
过程称为 。PCR 复制过程需要引物，原因是 。若引物2 与基因M 末端互补的部
分序列为5-GCAT……-3，则完整的引物2 的序列应为 ，经3 轮PCR 可以得到等长的成功添加
了限制酶EcoRI 酶切位点的基因M 有 个。
【答案】（1）防止加热时有机溶剂挥发 有机溶剂一般是易燃物，直接使用明火加热容易引起燃烧、
爆炸
（2）纸层析 ①②
（3）变性 DNA 聚合酶只能从DNA 子链3 端延伸 5-GAATTCGCAT……-3 2
【解析】PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 中游离脱氧核苷酸
为原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子
链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要
原因是DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。
（1）图1 装置在加热瓶口安装冷凝管的目的是防止加热时有机溶剂挥发。有机溶剂一般是易燃物，直接使
用明火加热容易引起燃烧、爆炸，因此萃取过程应采用水浴加热。
（2）色素不同在层析液中溶解度不同，在滤纸上扩散的速度不同，提取的胡萝卜粗品通过纸层析法进行
鉴定。鉴定结果示意图中，BC 处点样的是萃取样品，其中⑤⑥是胡萝卜素的层析结果；①②是其他色素
或者杂质的层析结果，③④（对应AD 点样处）是标准的胡萝卜素的层析结果。
（3）PCR 技术利用的是高温解旋，将DNA 的双链分开的过程是变性的过程。DNA 聚合酶在引物的引导
下，从DNA 子链3 端延伸，形成磷酸二酯键，进而形成新的DNA 分子。若引物2 与基因M 末端互补的部
分序为5-GCAT……-3，为了在基因的一端添加限制酶序列，应该将限制酶序列添加在引物的5 端，因此完
整的引物2 的序列应为5-GAATTCGCAT……-3，经3 轮PCR 可以得到扩增产物为23=8 个DNA 分子，其
中等长的且成功添加了限制酶EcoRⅠ酶切位点的基因M 有2 个。
37．（2023·江苏连云港·东海县石榴高级中学校考模拟预测）某科研人员从苏云金芽孢杆菌中获取Bt 毒蛋
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白基因，并将其导入大豆叶肉细胞，培育出抗虫的转基因大豆，主要过程如下图。请回答下列问题：
（1）为了正确扩增Bt 毒蛋白基因，并能与图中质粒正确连接，需根据 、 设计两种引物。PCR 时引
物的作用是 。
(2)PCR 扩增产物可根据 不同，可以用 技术鉴定。结果发现有目的基因以外的杂带存在，分析可能的
原因有 。解决方案一般是在目的基因的 （填“内部”或“上、下游”）重新设计引物进行PCR。
A．引物特异性不强 B．退火温度过低 C．模板DNA 污染 D．引物碱基序列过长
（3）图中①为
请写出HindIII 和BamHI 的识别序列分别是 、 。①②过程所需
要用到的酶有 。
（4）过程③筛选抗虫能力强的大豆，应从 水平上检测。
【答案】（1）Bt 毒蛋白基因两端的核苷酸序列 HindIII 和BamHI 识别核苷酸序列 使DNA 聚合
酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核糖核苷酸
（2）DNA 分子的大小和构象（电荷） 琼脂糖凝胶电泳 ABC 上、下游
（3）5´AAGCTT3´ 5´GGATCC3´ 限制酶和DNA 连接酶
（4）个体
【解析】PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA 片段的核酸合成技术，利用的
原理是DNA 复制，需要条件有模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物（使DNA 聚合酶能够从引物的3'端
开始连接脱氧核糖核苷酸）、热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶），过程包括：①高温变性：DNA 解旋过程
（PCR 扩增中双链DNA 解开，不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到
互补链DNA 上；③中温延伸：合成子链。
（1）由图可知，质粒上的限制酶有Hind III 和Bam H I，因此为了正确扩增Bt 毒蛋白基因并能与图中质粒
正确连接（为保证正确连接，需要用两种不同的限制酶切割），需根据Bt 毒蛋白基因两端的核苷酸序列，
Hind III 和Bam H I 识别核苷酸序列设计两种引物。PCR 时，需要一对引物，其作用是使DNA 聚合酶能够
从引物的3'端开始连接脱氧核糖核苷酸。
（2）PCR 扩增产物为DNA，可用琼脂糖凝胶电泳技术鉴定，其原理是不同DNA 分子由于大小和构象
（电荷）不同，在电场中的泳动速率液不同。引物特异性不强、退火温度过低（引物无法结合到模板链
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上）、模板DNA 污染等都有可能导致目的基因以外的杂带存在，故选ABC。引物一般设计在目的基因上、
下游，以便表达一段完整的基因。
（3）图中①为限制酶切割目的基因（Bt 毒蛋白基因）产生的黏性末端，使用的酶为限制酶。②过程表示
将目的基因与质粒重组在一起，为基因表达载体的构建，是基因工程的核心，此过程需要DNA 连接酶。
结合质粒上Hind III 和Bam H I 的切点可知，Bt 毒蛋白基因的左边为Hind III 的识别序列，右边为BamH I
的识别序列，因此Hind III 和 BamH I 的识别序列分别是5AAGCTT 3、5GGATCC 3。
（4）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定等，因此过程③筛选抗虫能力强的大豆，应从个体水平上
检测。
38．（2023·山西运城·校联考模拟预测）植物细胞壁中含大量不能被猪消化的多聚糖类物质，如半纤维素
多聚糖、果胶质（富含半乳糖醛酸的多聚糖）等。研究人员通过现代生物技术培育出转多聚糖酶基因
（manA）猪，主要流程如图所示，图中neo 为标记基因，回答下列问题：
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（1）图中获取目的基因采用的限制酶是BamHI 和BglⅡ，但是处理后的目的基因后并不能避免自身环化，
原因是 。处理质粒应采用的限制酶是 。
（2）图中通过PCR 技术扩增目的基因的前提是 ，以用于制备PCR 扩增需要的引物，引物的作
用是 。基因工程的核心环节是图中的 （填标号）。
（3）如果要一次性获得更多的转基因猪，可在囊胚期对早期胚胎进行胚胎分割，操作时要注意 。
获得的转基因猪中的manA 主要在 中进行表达。
【答案】（1）两种酶处理目的基因得到的黏性末端相同 BamHI
（2）已知目的基因两端的一小段碱基序列（或脱氧核苷酸序列） 使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开
始连接脱氧核苷酸 ①
（3）将囊胚的内细胞团均等分割 消化腺细胞
【解析】据图分析，①过程为构建基因表达载体，②是将目的基因导入受体细胞，③是细胞核移植，④是
早期胚胎培养，⑤是胚胎移植，据此分析。
（1）据图分析，限制酶BamHI 和BglⅡ处理目的基因后得到的黏性末端相同，均为—GATC，故不能避免
目的基因的自身环化。目的基因应插入质粒的启动子和终止子之间，故处理质粒应采用限制酶BamHI。
（2）通过PCR 技术扩增目的基因的前提是已知目的基因两端的一小段碱基序列（或脱氧核苷酸序列）。
引物的作用是使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。①构建基因表达载体是基因工程的核
心环节。
（3）进行胚胎分割时要注意将囊胚的内细胞团均等分割，转多聚糖酶在消化道内分解多聚糖类物质，故
获得转基因猪中的manA 主要在消化腺细胞中进行表达。
39．（2023·全国·校联考模拟预测）猕猴桃美味可口、营养丰富，市场需求高，现欲将来自拟南芥的抗病
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基因X 转入猕猴桃，培育抗病猕猴桃品系。
注：启动子35S：真核细胞启动子，启动下游基因在真核细胞内的表达；
绿色荧光蛋白基因：作为报告基因并与目的基因融合表达，通过荧光强度可反映目的基因表达量；卡那霉
素、潮霉素：2 种抗生素，通过抑制核糖体功能对细菌、动物、植物产生广谱杀伤作用。
限制性酶
NheI
XbaI
BglⅡ
BamHI
识别序列及酶切位点
回答下列问题：
（1）构建表达载体。根据上述信息，为使基因X 定向插入Ti 质粒，需分别在引物F 和R 的末端添加限制
性酶 的碱基序列。
（2）转化农杆菌。将构建好的表达载体与经 处理制备的农杆菌悬液混合、再经约42℃短暂的热刺
激转化。将其慢摇复苏后转移至添加有 的LB 培养液中振荡培养12h，该过程的培养目的是 ，
最终在选择培养基平板上挑选目标单菌落。
（3）下列方案中，哪几项不适用于鉴定单菌落是否转化成功的？_______
A．提取各个单菌落质粒并用（1）中所选限制性酶酶切消化，后通过电泳检测有无基因X
B．以F 和R 为引物对各个单菌落进行PCR 扩增，后通过电泳检测有无基因X
C．用抗X 蛋白的单克隆抗体作探针来鉴定各个单菌落的蛋白质成分
D．用特定波长光源作激发光观察鉴定各个单菌落是否发出绿色荧光
（4）转化植物愈伤组织。选取野生猕猴桃长势健康的幼嫩枝条一支，在超净台中消毒后用 冲洗，
再 后接种到若干培养基中，使其在适宜条件下诱导发生 过程；接着向其中倒入目标菌悬液，侵
染后部分愈伤组织细胞的染色体上已整合了T—DNA，但是由于 ，所以不能马上使用潮霉素来杀
除残留农杆菌。最终筛选出的愈伤组织继续诱导培养获得 ，包埋形成 ，便于远距离运输、
快速繁殖转基因猕猴桃品种。
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【答案】(1)BamHI、XbaI
(2)CaCl2、Ca2+低浓度低温的CaCl2 卡那霉素 富集含重组质粒的农杆菌/筛选并扩大培养含重组
质粒的农杆菌
(3)ACD
（4）无菌水 分割/切割/剪切/切/割 脱分化 潮霉素抗性基因在植物细胞中尚未表达/潮霉素抗
性基因在植物细胞中处于低表达水平，抗性不够/T—DNA 在愈伤组织细胞中稳定表达需要一定的时间
胚状体/体细胞胚/芽 人工种子
【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最
有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与
鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因——DNA 分子杂交技术或
PCR 技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术或PCR 技术；③检测目的基因是否翻
译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）根据题目信息，目的基因应插入T-DNA 中，T-DNA 中含有BglⅡ和NheI 两个酶切序列，在目的基因
中存在的这两个序列可破坏目的基因，根据表格的信息BglⅡ形成的黏性末端和BamHI 形成的黏性末端抑
制，NheI 形成的黏性末端与XbaI 形成的黏性末端一致，根据目的基因序列上面的链为编码链，下面的链
是模板链，为了保证定向连接，需要把目的基因的左边插入到接近启动子的一侧，故引物F 上应添加
BamHI 序列，而引物R 上应添加XbaI 序列。
（2）细菌经过Ca2+处理后，可处于易于吸收外源DNA 的状态，有利于表达载体进入农杆菌。因基因表达
载体中含有卡那霉素基因，可作为标记基因用于筛选目的基因，故需要加入卡那霉素。用含有卡那霉素的
LB 培养基振荡培养，可筛选的同时增大含有重组质粒的农杆菌的数量，即目的是筛选并扩大培养含重组
质粒的农杆菌。
（3）A、目的基因在T-DNA 上，T-DNA 可转移到染色体DNA 上，提取质粒进行检测未必检测到，A 错误；
B.F 和R 作为引物可扩增出目的基因，用二者作为引物进行PCR 扩增后，有X 基因的证明含有目的基因，
导入成功，B 正确；
C.35S 是真核细胞的启动子，目的基因在真核细胞中才能表达，菌落中不能表达，用抗X 蛋白抗体检测不
到基因表达产物，C 错误；
D.发出绿色荧光证明绿色荧光蛋白基因成功表达，不能说明目的基因导入，D 错误。
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故选ACD。
（4）消毒的试剂长时间存在可影响细胞活性，需要用无菌水进出冲洗；冲洗后需要对外植体即猕猴桃枝
条进行切割，因为植物细胞具有全能性，在适宜条件下课脱分化形成愈伤组织，愈伤组织再经过诱导可再
分化；当侵染后部分愈伤组织细胞的染色体上已整合了T—DNA 时，目的基因及标记基因的表达水平很低，
潮霉素抗性基因在植物细胞中处于低表达水平，抗性不够，不能马上使用潮霉素杀灭残留农杆菌。愈伤组
织再分化可形成一定的结构，如胚状体、体细胞胚或者芽等，加入一定的营养物质和种皮可形成人工种子，
方面储存和运输。
40．（2023·贵州·统考模拟预测）如图甲为基因工程中常用的某一质粒载体，将目的基因插入Ampr或Tetr
中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。图乙表示限制酶
BamHI 的识别序列和切割位点。
据图回答下列问题：
（1）图甲质粒中存在复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 。该质粒中还含有启动子，启动子是
指 。该质粒中的标记基因是指 。
（2）用限制酶BamHI 切割目的基因和质粒后，可用 （填“E·coliDNA 连接酶”“T4DNA 连接酶”或
“E·coliDNA 连接酶或T4DNA 连接酶”）进行连接。
（3）目的基因和图甲所示的质粒用限制酶BamHI 切割后，再用DNA 连接酶连接得到重组质粒，将其导入
受体细胞。若受体细胞在含有氨苄青霉素的培养基上能生长， （填“能”或“不能”）判断该受体
细胞中含有重组质粒，原因是 。
（4）为了检测目的基因是否转录出了mRNA，可用标记的目的基因片段作为探针与mRNA 杂交，该杂交
技术称为 。为了检测目的基因转录的mRNA 是否翻译成 ，常用抗原—抗体杂交技术。
【答案】（1）自我复制 位于基因首端的一段特殊DNA 序列，是RNA 聚合酶识别及结合的部位，能
驱动转录过程 氨苄青霉素抗性基因
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(2)E·coliDNA 连接酶或T4DNA 连接酶
（3）不能 导入普通质粒或重组质粒的受体细胞都能抗氨苄青霉素，都能在含有氨苄青霉素的培养基
上生长。
（4）DNA—RNA 分子杂交 蛋白质
【解析】基因工程又称基因拼接技术和DNA 重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微
生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA 分子，然后导入
活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
（1）质粒DNA 分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能自我复制、稳定存在；表达载体含有启
动子，启动子位于基因首端的一段特殊DNA 序列，是RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动转录过程；
使用BamHI 切割质粒，将四环素抗性基因破坏，所以标记基因型是氨苄青霉素抗性基因，抗性基因的作用
是便于对重组DNA 分子的筛选。
（2）E.coliDNA 连接酶和T4DNA 连接酶都能连接黏性末端，另外T4DNA 连接酶还可以连接平末端，但连
接平末端时的效率比较低。据乙图可知，BamHI 切割DNA 后产生的是黏性末端，因此图中BamHI 切割目
的基因和质粒后，可用E·coliDNA 连接酶或T4DNA 连接酶。
（3）由图可知，质粒上含有四环素抗性基因和氨苄青霉素的抗性基因。构建基因表达载体时，破坏了质
粒上的四环素抗性基因，但没有破坏氨苄青霉素的抗性基因，所以导入普通质粒或重组质粒的受体细胞都
能抗氨苄青霉素，都能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，所以不能判断该受体细胞中含有重组质粒。
（4）为了检测目的基因是否转录出了mRNA，可用采用分子杂交技术，即用标记的目的基因片段作探针
与mRNA 杂交；为了检测目的基因转录的mRNA 是否翻译成蛋白质，常用抗原—抗体杂交技术。
41．（2023·陕西商洛·校联考一模）草甘膦是一种非选择性内吸传导型茎叶处理除草剂，其机理是抑制与
植物多种代谢途径有关的EPSP 合酶的活性。科研人员试图培育抗草甘膦作物，主要过程如图所示。请回
答下列问题：
（1）科研人员从草甘膦严重污染的土壤中分离出一株高抗草甘膦菌株——假单胞杆菌G6，利用 技
术扩增其基因组，得到具有抗草甘膦特性的G6 基因，该基因的表达对EPSP 合酶的活性具有 （“促
进”或“抑制”）作用。
（2）通过①过程将G6 基因插入Ti 质粒的 ，并利用农杆菌将重组DNA 导入矮牵牛细胞，通过②过
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程可将目的基因插入矮牵牛染色体DNA 的原理是 。
(3)③过程可通过 技术将经过培养、筛选后的矮牵牛细胞培育得到转基因矮牵牛植株。抗草甘
膦基因来自假单胞杆菌G6，但经检测它可以在水稻细胞中表达，其原因是细菌和植物共用
。
（4）科研人员通过④过程对转基因矮牵牛进行个体生物学水平鉴定，最为合理有效的方法是 ，
为了使结果更具有说服力，进行该过程时可选择 作为对照。
【答案】（1）PCR 促进
（2）T-DNA 农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti 质粒上的T-DNA 转移到被侵染的细胞，并将其整合到
该细胞的染色体DNA 上
（3）植物组织培养 一套遗传密码
（4）利用一定浓度的草甘膦溶液喷洒转基因矮牵牛植株 非转基因矮牵牛植株
【解析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因
——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质——抗原－抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA 片段的核酸合成技术，利用的原理
是DNA 复制，获得的抗草甘膦特性的G6 基因可利用PCR 技术大量扩增。除草剂（草甘膦）能够抑制
EPSP 合酶的活性，从除草剂（草甘膦）严重污染的土壤中分离出一株高抗草甘膦菌株，该植株体内具有
抗草甘膦特性的G6 基因，由此推测，G6 基因对EPSP 合酶的活性具有促进作用。
（2）农杆菌中的Ti 质粒上的T-DNA 可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 上，通过①
过程将G6 基因插入Ti 质粒的T-DNA。农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti 质粒上的T-DNA 转移到被侵染的
细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA 上，故通过②过程可将目的基因插入矮牵牛染色体DNA。
（3）③过程可通过植物组织培养技术，将矮牵牛细胞培育得到转基因矮牵牛植株。抗草甘膦基因来自于
细菌，但经检测它可以在水稻细胞中表达，其原因是细菌和植物共用一套遗传密码。
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（4）要确定G6 基因导入矮牵牛后，是否赋予了矮牵牛抗草甘膦的特性，在个体水平上还需要做抗病鉴定，
即利用一定浓度的草甘膦溶液喷洒转基因矮牵牛植株。为了使结果更具有说服力，进行该过程时还需要进
行对照实验，即选择非转基因矮牵牛植株作为对照。
42．（2023·湖南永州·统考一模）在医药领域，单克隆抗体在疾病诊断和病原体鉴定中发挥重要作用，但
鼠源的单抗容易在人体内引发人抗鼠抗体反应（HAMA），从而消弱其治疗的有效性。科学家对鼠源杂交
瘤抗体进行改造，生产出效果更好的鼠一人嵌合抗体，主要流程如下图所示。回答下列有关问题：
（1）抗体由两条L 链和两条H 链组成，每条链都含V 区和C 区，其中决定抗体特异性的是 区。
（2）获取VL 基因和VH 基因时，通常先从生长状态良好的杂交瘤细胞中提取 ，再通过反转录法来
合成。图中的Sp2/0 细胞最可能是 细胞。
（3）为了便于嵌合基因与载体连接，需在扩增嵌合基因时在引物的 端加上特定的限制性酶切位点，
且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是 。
（4）上述基因表达载体中，除含有嵌合基因外，还应含有启动子和 （答出两个即可），其中启动子
的作用是 。
【答案】(1)V
（2）mRNA 骨髓瘤
（3）5′ 使DNA 片段能定向插入表达载体，减少自连
（4）标记基因、终止子、复制原点 RNA 聚合酶识别和结合的部位
【解析】单克隆抗体的制备：
1、细胞来源：B 淋巴细胞：能产生特异性抗体，在体外不能无限繁殖；骨髓瘤细胞：不产生专一性抗体，
体外能无限繁殖。
2、杂交瘤细胞的特点：既能大量增殖，又能产生特异性抗体。
3、两次次筛选：①筛选得到杂交瘤细胞（去掉未杂交细胞以及自身融合的细胞）；②筛选出能够产生特
异性抗体的细胞群。
4、两次抗体检测：专一抗体检验阳性。
5、提取单克隆抗体：从培养液或小鼠腹水中提取。
6、单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高，并可能大量制备。
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（1）抗体由两条L 链和两条H 链组成，每条链都含V 区和C 区，V 区有人源C 区，其中决定抗体特异性
的是V 区。
（2）获取VL 基因和VH 基因时，通常先从生长状态良好的杂交瘤细胞中提取mRNA，再通过反转录法来
合成。图中的Sp2/0 细胞最可能是骨髓瘤细胞。
（3）为了便于嵌合基因与载体连接，需在扩增嵌合基因时在引物的5′端加上特定的限制性酶切位点，为了
使DNA 片段能定向插入表达载体，减少自连常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点。
（4）基因表达载体中，除含有嵌合基因外，还应含有启动子和标记基因、终止子、复制原点，其中启动
子的作用是RNA 聚合酶识别和结合的部位。
43．（2023·福建龙岩·福建省龙岩第一中学校考模拟预测）心脏移植是挽救终末期心脏病患者生命唯一有
效的手段，然而心脏移植过程中会发生缺 血再灌注损伤（IRI），可能导致心脏坏死。研究发现，IRI 通过
促进Caspase8 蛋白等一系列凋亡蛋白的表达，导致细胞凋亡最终引起器官损伤。根据Caspase8 基因合成的
小干扰RNA（siRNA）可以使Gaspase8 基因沉默，有效抑制IRI 所致的器官损伤。图1 是利用猪的心肌细
胞开展siRNA 作用研究的示意图，图2 是此研究可能用到的4 种限制酶及其切割位点。回答下列问题：
（1）图1 中步骤②构建重组质粒需要使用多种工具酶。常用的DNA 连接酶有E.coli DNA 连接酶和T4
DNA 连接酶。图2 中 酶切割后的DNA 片段可以用T4 DNA 连接酶连接。DNA 连接酶催化目的基因
片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
（2）图1 中步骤③将重组质粒导入猪的心肌细胞最常用的方法是 。siRNA 对应DNA 序列是在心肌细
胞中表达产生siRNA，siRNA 与RISC 组装形成基因沉默复合物，通过 ，从而降低IRI 引起的细胞凋
亡。
（3）研究人员根据Caspase8 基因的碱基序列，设计了三种序列分别导入猪的心肌细胞，通过测定靶基因
Caspase8 的mRNA 含量来确定最优序列。测定mRNA 含量时，需提取心肌细胞的总RNA，经过 过程
得到cDNA，再进行PCR 扩增，测定PCR 产物量，结果如图3 所示。据此判断最优序列是 。
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（4）与直接将siRNA 导入猪的心肌细胞相比，通过重组质粒将siRNA 对应的DNA 序列导入心肌细胞，其
优点是 （答出1 点）。
（5）为了解决心脏移植供体短缺问题，许多科学家正在研究用猪心脏代替人的心脏。选用猪的心肌细胞
作受体细胞是因为猪的内脏构造、大小、血管分布与人的极为相似，而且与灵长类动物相比，可导致人类
疾病的病毒要少得多。将猪心脏移植到人体面临的最大挑战是免疫排斥，以下哪些技术，能有效解决免疫
排斥这一问题（ ）
A．细胞融合
B．基因敲除
C．选猿猴细胞为受体细胞
D．转入一些人类特有蛋白基因，将猪细胞伪装成人细胞
E．导入抑制抗原决定基因表达的调节因子
【答案】（1）EcoRI、SmaI、PstⅠ、EcoRV 磷酸二酯键
（2）显微注射法 抑制Gaspase8 基因的翻译过程（抑制Gaspase8 蛋白的合成）
（3）逆转录 序列2
（4）可持续产生siRNA，使靶基因长时间沉默
(5)BDE
【解析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法等；将目的基因导入动物细胞最有效的方
法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法（感受态细胞法）。（4）目的基因
的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因－-DNA 分子杂交
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技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原－抗
体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（1）限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRV 切割形成的是平末端，E．
coliDNA 连接酶和T4DNA 连接酶都能连接黏性末端，另外T4DNA 连接酶还可以连接平末端，因此图中
EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA 片段（具有黏性末端）可以用E．coliDNA 连接酶连接，EcoRI、PstⅠ、SmaⅠ和
EcoRV 切割后的DNA 片段可以用T4DNA 连接酶连接。DNA 连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之
间形成磷酸二酯键。
（2）将重组质粒导入动物细胞常采用显微注射法。mRNA 是翻译的模板，据图1 可知，基因沉默复合物
作用于Caspase8mRNA，抑制了基因表达的翻译过程，使Caspase8 基因沉默。
（3）研究人员根据Caspase 8 基因的碱基序列，设计了三种序列分别导入猪的心肌细胞，通过测定靶基因
Caspase 8 的mRNA 含量来确定最优序列。测定mRNA 含量时，需提取心肌细胞的总RNA，经过逆转录过
程得到cDNA，再进行PCR 扩增，通过测定PCR 产物量进而推测相关基因的表达量，图3 结果显示，序列
2 引起的PCR 产物量最少，说明相关基因被沉默，因而可判断抑制效果最好的是序列2。
（4）与直接将sRNA 导入猪的心肌细胞相比，通过重组质粒将siRNA 对应的DNA 序列导入心肌细胞，
siRNA 可随重组质粒增殖而持续产生，从而使靶基因长时间沉默。
（5）对于人体而言，猪的器官属于外来物质，免疫系统会把外来器官当作抗原成分进行攻击，故免疫排
斥反应是将猪心脏移植到人体面临的最大挑战。利用基因工程技术将猪与免疫排斥有关的抗原基因敲除，
转入一些人类特有蛋白的基因，将猪细胞伪装成人的细胞，导入抑制抗原决定基因表达的调节因子等方面
可能解决这一问题，故选BDE。
44．（2023·四川成都·校联考二模）为了能让绵羊作为人的抗胰蛋白酶的生物反应器，科学家将人的抗胰
蛋白酶基因与绵羊乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，培育出了能够合成人的抗胰蛋白酶的转
基因绵羊。回答下列问题：
（1）获取人的抗胰蛋白酶基因可以采用从人体细胞中获取基因片段，这种方法的缺点是 ，如
果基因 ，也可以用
合成仪直接合成，获取的目的基因可以通过 进行扩增。
（2）目的基因和启动子等组件的整合过程需要用到的工具酶是 ，启动子在基因表达过程中的
作用是 ，选择乳腺蛋白基因的启动子的原因是 。
（3）将重组
导入受精卵的方法通常选用 ，受精卵在体外培养到阶段 时再将其
移植到受体母羊的子宫中进行发育。
【答案】（1）具有一定的盲目性 比较小、核苷酸序列已知
技术
（2）限制酶和
连接酶
聚合酶的识别和结合位点，驱动目的基因转录出
让基
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因在乳腺细胞中选择性表达
（3）显微注射法 桑椹胚或囊胚
【解析】PCR 是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA 复
制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
（1）从人体细胞中获取基因片段需要大量处理材料，目的性不强，具有一定的盲目性；当基因比较小、
核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA 合成仪直接合成；PCR 技术可以根据DNA 复制的原理，在体外
大量扩增目的基因。
（2）利用限制酶可对目的基因和质粒进行切割，获得相同的黏性末端后可利用DNA 连接酶进行连接，形
成磷酸二酯键。启动子位于基因的上游，是RNA 聚合酶的识别和结合位点，驱动目的基因转录出
mRNA。
（3）将目的基因导入动物细胞一般利用纤维注射法；受精卵培养道桑椹胚或囊胚阶段可移植进子宫，利
于胚胎存活。
45．（2023·吉林长春·统考模拟预测）癌细胞表面蛋白“PDL-1”与T 细胞表面蛋白“PD-1”特异性结合后，
可抑制T 细胞活性并启动其凋亡程序，导致肿瘤细胞发生免疫“逃逸”。研究者对“PD-1”基因进行克隆、
表达及生物学活性鉴定，为制备抗体打基础。研究中所用引物a 和β 碱基序列见图1，几种常用限制酶名
称及识别序列与酶切位点见图2:
（1）首先提取细胞中的mRNA 逆转录生成eDNA 作为模板：设计含有不同的限制酶切位点的α 和β 序列
为引物，通过 技术扩增目的基因。
（2）为保证目的基因和载体正向连接，选用图中的名称为 的限制酶将质粒和目的基因进行切割，
再用DNA 连接酶构建表达载体。该表达载体的组成，除了目的基因、标记基因（抗卡那霉素基因）外，
还必须具有 等（写出2 点即可）。
（3）而后一定温度下，与经过Ca2+处理的感受态大肠杆菌混合培养在含 培养基中，可筛选出已经完
成转化的大肠杆菌，继续培养该种大肠杆菌以扩增重组DNA。
（4）将扩增后的“载体A/PD-1 重组DNA”转入可高度表达外源基因的原代293T 细胞。一段时间后，为确
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定PD-1 基因是否表达，检测细胞膜表面是否具有 研究中还会有一步骤是只将载体A 转入293T 细胞，
其目的是 。
【答案】(1)PCR
(2)Xho I、EcoR I 启动子、终止子、复制原点
（3）卡那霉素
（4）PD-1 蛋白 作为（阴性）对照，从而排除载体A 本身序列对实验结果的影响
【解析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：
①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因−−DNA 分子杂交技术；
②检测目的基因是否转录出了mRNA−−分子杂交技术；
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗原抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活
−−
−
性鉴定等。
（1）扩增目的基因可采用PCR 技术。
（2）分析图1 中碱基序列，α 链上有“—CTCGAC—”识别序列，β 链上有“—GAATTC—”碱基识别序列，
与图2 中XhoI 限制酶和EoRI 限制酶的识别序列相同。选用图1 中的两种名称分别为Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ的限制
酶将载体A 进行双切，再用DNA 连接酶将其与目的基因拼接，构建表达载体。基因表达载体的组成包括
目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等。
（3）根据第（2）题可知，标记基因是卡那霉素抗性基因，因此培养基中需要加入卡那霉素。
（4）将扩增后的“载体A/PD-1 重组DNA”转入可高度表达外源基因的原代293T 细胞。一段时间后，为确
定PD-1 基因是否表达，检测细胞膜表面是否具有PD-1 蛋白。为了增加实验的可信度，还需设置对照，从
而排除载体A 本身序列对实验结果的影响，只将“载体A”转入293T 细胞，因为不含PD-1 基因，所以
“PD-1 与PDL-1 信号通路”不会阻断。
46．（2023·广东东莞·校考模拟预测）幽门螺杆菌（Hp）是慢性胃炎、淋巴增生性胃淋巴瘤的主要致病菌，
该菌的Ipp20 基因能合成其特有的蛋白质，据此，研究者利用基因工程制备Hp 疫苗。已知lpp20 基因表达
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时，双链DNA 的一条链是编码链，另一条链是模板链，如图1；四种限制酶及其识别序列如图2；三种质
粒如图3，箭头表示限制酶的切割位点；操作步骤如图4。回答下列问题：
（1）转录产生的mRNA 前8 个碱基序列为 （方向为5'→3'）。若通过PCR 技术大量扩增Ipp20 基
因的编码区段，则需要设计一对引物，其中结合到编码链上的引物序列是 （方向为5'→3'，写出5'端
8 个碱基序列）。
（2）据图1、2、3 分析，构建基因表达载体时，应选用的限制酶是 ，最适合用作载体的质粒是 。
（3）图4 中为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，通常采用影印法（使用无菌的线毡布压在培养基A 的菌
落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B 上、结果如图所示）。培养基A、B 中应分别添加 ，
符合实验要求的菌落是 （填写数字），判断依据是 。
【答案】（1）5' CUCGAGAU 5' TCTAGAGG
(2)Xbal、XhoI 质粒Z
（3）潮霉素、氯霉素 3、5 菌落3、5 在含潮霉素培养基中能生长，但在含氯霉素培养基中不能
生长，说明含有因插入目的基因而丢失氯霉素抗性基因的重组质粒。
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【解析】基因工程的基本操作程序：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体
细胞、目的基因的检测与表达。
（1）模板链和图1 中的编码链碱基互补配对，而转录产生的mRNA 又与模板链的碱基互补配对，所以转
录产生的mRNA 前8 个碱基序列为5' CUCGAGAU；若通过PCR 技术大量扩增Ipp20 基因的编码区段，则
需要设计一对引物，其中结合到编码链上的引物序列是5' TCTAGAGG。
（2）质粒X 上有BamHI 的酶切位点位于启动子的上游，Xhol 的酶切位点会破坏终止子，Xbal 酶切后的黏
性末端和BamHI 的酶切黏性末端相同，可能使启动子丢失，因此质粒X 不适合做载体；质粒Y 上有2 个
PstI 的酶切位点位于启动子的上游和下游，可能使质粒中的启动子丢失，XhoI 和Xbal 酶切位点会破坏抗性
基因，BamHI 单一酶切后会导致质粒自身环化和任意连接，因此质粒Y 不适合做载体；质粒Z 上有2 个
BamHI 的酶切位点位于启动子的上游和下游，可能使质粒中的启动子丢失，但XhoI 和Xbal 限制酶切后的
黏性末端不同，可避免质粒自身环化和任意连接，故质粒Z 适合做载体，用XhoI 和Xbal 限制酶进行切割。
（3）为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，因该大肠杆菌含有潮霉素抗性基因，而氯霉素抗性基因丢失，
故培养基A、B 中应分别添加潮霉素、氯霉素，符合要求的菌落，应该能在含潮霉素的培养基上生长，但
不能在含有氯霉素的培养基上生长，故菌落3、5 符合。
47．（2023·广东东莞·校考模拟预测）新冠病毒（+RNA）的刺突蛋白S 通过与人体黏膜细胞表面的ACE2
受体结合而进入细胞，是宿主抗体的重要作用位点。下图1 是科研人员利用新冠病毒的+RNA 提取S 蛋白
基因和S 蛋白受体结合域RBD 基因作为抗原基因序列，研制新冠病毒双抗原疫苗的技术路线。已知PCR1
与PCR2 要分别进行，然后将产物混合，使用引物1 和引物4 进行PCR3，最终获得大量S-RBD 融合基因
（1300bp）。请分析回答：
（1）片段1 与片段2 连接形成S-RBD 融合基因。在PCR3 对其进行扩增的过程中，需要使用 酶，
该酶的作用是 。
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（2）为初步检测过程B 构建是否成功，对重组pX 系列质粒及其酶切产物进行凝胶电泳检测，结果如图
2。据图可知，酶切时用到的酶是 ，重组质粒pX2 和pX5 构建成
功的依据是 。
（3）在工程菌的筛选时，可先后用两种抗生素进行培养实验。鉴定pX 质粒是否导入工程菌还可以采用的
方法是 。
【答案】（1）耐高温DNA 聚合 （Taq 酶） 将单个的脱氧核苷酸连接到引物的3'端
(2)HindⅢ、Ndel、EcoRI 重组质粒pX2 和pX5 酶切后形成的750 和550 片段碱基对总和为S—RBD 融
合基因长度1300
（3）观察菌落是否具有荧光，有荧光的则含有pX 质粒
【解析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
（1）由于操作过程具有较高的温度，故PCR 过程中，需要的酶是耐高温的DNA 聚合酶（Taq 酶）；该酶
的作用是将单个的脱氧核苷酸连接到引物的3'端。
（2）据图可知，目的基因应插入到启动子和终止子之间，可选择的酶有HindⅢ、Ndel，此外结合图2 电
泳图可知，还需经融合基因的1300bp 切割，图1 中该融合基因中的限制酶是EcoRI；分析图2，图右边M
是对照基因，用于标记大小，1、2 号泳道是两个质粒全长，3、4 号泳道是酶切后目的基因和质粒的大小，
据图可知，重组质粒pX2 和pX5 构建成功的依据是：重组质粒pX2 和pX5 酶切后形成的750 和550 片段碱
基对总和为S—RBD 融合基因长度1300。
（3）在工程菌的筛选时，由于含目的基因的菌落对第二次培养时使用的抗生素无抗性，故在第二次培养
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时存活的菌落不含目的基因；鉴定pX 质粒是否导入工程菌还可以采用的方法是：观察菌落是否具有荧光，
有荧光的则含有pX 质粒。
48．（2023·广东·校考模拟预测）家禽的饲料中富含谷物，纤维素是谷物的重要成分，但家禽消化道中缺
少能降解纤维素的酶，将其添加到饲料中，以提高家禽养殖效率。枯草芽孢杆菌能分泌一种可降解纤维素
的酶，需使用图1 中质粒作为载体，图2 为含W 基因的DNA 片段。回答下列问题：
（1）常见的乳酸菌除乳酸杆菌外，还有 。家禽肠道内的乳酸杆菌可利用葡萄糖通过细胞呼吸
产生酸性物质，抑制有害细菌的生长和繁殖，维持肠道的正常功能，请写出相关的反应式
。
（2）利用PCR 技术扩增W 基因时，用到的DNA 聚合酶与普通的酶相比，具有的特点是 。扩增
完成后，常采用 法来鉴定PCR 的产物。为得到含W 基因的乳酸杆菌，可采用平板划线法纯
化乳酸杆菌，进行划线操作要注意： （写出2 点即可）。
(3)W 基因以乙链为转录模板链，转录时mRNA 自身延伸的方向为5'→3'。下表是几种限制酶的识别序列及
切割位点，图1、图2 标注了相关限制酶的酶切位点。为获得能正确表达W 基因的重组质粒，应分别使用
哪些限制酶对质粒和含W 基因的DNA 片段进行切割？ 。
限制酶
EcoRⅠ
BamHⅠ
KpnⅠ
MfeⅠ
HindⅢ
识别位
点
5'
G↓AATTC
﹣
﹣
3'
3'
CTTAA↑G
﹣
﹣
5'
5'
G↓GATCC
﹣
﹣
3'
3'
CCTAG↑G
﹣
﹣
5'
5'
G↓GTACC
﹣
﹣
3'
3'
CCATG↑G
﹣
﹣
5'
5'
C↓AATTG
﹣
﹣
3'
3'
GTTAA↑C
﹣
﹣
5'
5'
A↓AGCTT
﹣
﹣
3'
3'
TTCGA↑A
﹣
﹣
5'
【答案】（1）乳酸链球菌 C6H12O6
2C3H6O3+能量
（2）耐高温 琼脂糖凝胶电泳 从第一次划线的末端开始进行第二次划线；不要将最后一次的划
线与第一次的划线相连；每次划线前要灼烧接种环；在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环
（3）质粒：限制酶HindⅢ、MfeⅠ；含W 基因的DNA 片段：限制酶HindⅢ、EcoRⅠ
【解析】1、纯化微生物的常用方法：①平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，
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将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，在稀释
度足够高的菌液里，微生物将分散成单个细胞，将它们均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
2、PCR 是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA 复制的
各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR 反应需要在一定的缓冲溶液中
才能进行，需提供DNA 模板，分别与两条模板链结合的2 种引物，4 种脱氧核苷酸和耐高温的DNA 聚合
酶；同时通过控制温度使DNA 复制在体外反复进行。扩增的过程是：目的基因 DNA 受热变性后解为单链，
引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA 为模板，在DNA 聚合酶作用下进行延伸，即将4 种脱氧
核苷酸加到引物的3 端，如此重复循环多次。由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而
每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增。
（1）乳酸菌是厌氧细菌，在自然界中分布广泛，还有乳酸链球菌，其只能进行无氧呼吸，其反应式为：
C6H12O6 酶→2C3H6O3+能量。
（2）PCR 是一项体外扩增DNA 的技术，该过程中温度可能达到90℃以上，用到的DNA 聚合酶具有的特
点是耐高温；PCR 产物的鉴定方法是琼脂糖凝胶电泳技术。
（3）选择限制酶时应注意：不能破坏目的基因，质粒要确保至少含有一个完整的标记基因，目的基因要
以正确方向插入启动子与终止子之间的部位。结合图表，BamHⅠ会切割到启动子，用EcoRⅠ切割质粒后，
质粒也会“自身环化”，只能初步考虑MfeⅠ、KpnⅠ切割质粒，MfeⅠ会破坏目的基因；目的基因的两端需
要能产生不同末端的限制酶切割，所以要选用HindⅢ，据表可知、HindⅢ，需要选择HindⅢ切割质粒的
其中一个位点，转录时mRNA 自身延伸的方向为5'→3'，为了W 基因以正确方向拼接到质粒上、HindⅢ切
割，MfeⅠ与EcoRⅠ切割后产生的黏性末端相同。所以质粒用限制酶HindⅢ、MfeⅠ切割；含W 基因的DNA
片段用限制酶HindⅢ、EcoRⅠ切割。
49．（2023·广东东莞·校考一模）赤霉素与其受体 GID 结合后，可以促进植物茎秆伸长。蓝光能够激活蓝
光受体 CRY，抑制赤霉素的作用，为探究该机理，研究者分别构建了含有 His-CRY 和 GST-GID 融合基
因的表达载体，表达出相应的融合蛋白。His 和 GST 均为短肽，它们与其他蛋白形成的融合蛋白能与
His 或 GST 抗体结合，且不影响其他蛋白的结构和功能。
（1）构建含上述融合基因的表达载体。
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①结合图 1 分析，欲使 His 短肽连在 CRY 的氨基酸序列前端（氨基端），则应在 （填“F 引物”
或“R 引物”）的 （填“5'”或“3'”）端加上 His 短肽的编码序列。
②为使融合基因能与载体相连接，还需在 F 引物和 R 引物上添加相应的酶切位点序列，该序列应该位于
His 短肽编码序列的 （填“5'”或“3'”）端。
③用同样的方法扩增 GST-GID 融合基因，并构建相关表达载体。
（2）将两个表达载体同时导入拟南芥细胞，一段时间后裂解细胞，将含有 His 抗体的磁珠加入裂解液中，
充分孵育后收集磁珠，将磁珠上的蛋白（磁珠蛋白）分离下来，进行抗原-抗体杂交，结果如图 2。
①由图可知 His-CRY 和 GST-GID 融合基因的表达情况是 。对磁珠蛋白进行 His 抗体检测的目
的是 。
②图示结果说明，蓝光的作用机理是 。
【答案】（1）F 引物 5' 5'
（2）His-CRY 和 GST-GID 这两个融合基因在拟南芥细胞中已正常表达 确定磁珠上的 His 抗体可
以结合 His 短肽 蓝光激活 CRY 后，CRY 与赤霉素受体 GID 结合，使赤霉素无法发挥作用，从而
抑制赤霉素的作用
【解析】1、基因工程的基本操作步骤包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体
细胞、目的基因的检测与鉴定。
2、基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA 连接酶、载体。
（1）由图1 可知，欲使His 短肽连在CRY 的氨基酸序列前面（氨基端），即获得"3'-His 短肽-CRY 基
因-5'"的基因表达载体，由图可知CRY 基因的3'端对应的为F 引物，即要将His 短肽加在CRY 的氨基端，
应在CRY 基因模板链的3'端上加His 短肽编码序列，对应的是F 引物；而且加上的His 序别不与CRY 转录
模板配对，所以只能加在F 引物5'端，才能保证引物与模板配对后可以正常延伸。为使融合基因能与载体
相连接，酶切位点序列应该位于F 引物的3'端，His 短肽编码序列的5'端。
（2）分析题图可知，在黑暗和蓝光条件下得到的细胞裂解液，用 His 抗体和 GST 抗体进行检测，细胞
裂解液中均出现杂交带，说明His-CRY 和 GST-GID 这两个融合基因在拟南芥细胞中已正常表达；为了确
定磁珠上的His 抗体可以结合His 短肽，需对磁珠蛋白进行His 抗体检测。由题意可知，蓝光可以激活蓝光
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受体CRY，抑制赤霉素的作用，分析图2，对细胞裂解液蛋白进行抗原—抗体杂交，无论黑暗或蓝光条件
下，均具有条带，但含有His 抗体的磁珠蛋白组，黑暗条件下没有检测到GST 条带，但蓝光组出现了GST
条带，说明磁珠蛋白中有CRY 与赤霉素受体GID 的结合物，推测蓝光激活CRY 后，CRY 与赤霉素受体
GID 结合，使赤霉素无法发挥作用，所以从而抑制赤霉素的作用。
50．（2023·广东·统考高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行
诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI 基因发生一个碱基G 到A 的替
换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
（1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因
植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
（2）用PCR 反应扩增DAI 基因，用限制性核酸内切酶对PCR 产物和 进行切割，用DNA 连接酶
将两者连接。为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
（3）转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入
多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获
得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基
因组中插入了 。
T
②
1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养基
中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 （填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3
代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR 扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切
酶X 切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带
涂黑 。
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【答案】(1）野生型
（2）载体（基因表达载体） 启动子和终止子
（3 ）DAI 基因和卡那霉素抗性基因 75
自交 100
【解析】1、基因突变是基因结构的改变，包括碱基对的增添、缺失或替换；基因突变发生的时间主要是
细胞分裂的间期；基因突变的特点是低频性、普遍性、少利多害性、随机性、不定向性。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记
基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方
法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将
目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（1）根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI 基因为显性基因，因此采用农杆菌转
化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野
生型植株的种子大小相近。
（2）利用PCR 技术扩增DAI 基因后，应该用同种限制性核酸内切酶对DAI 基因和运载体进行切割，再用
DNA 连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾
端，因此为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。
（3）①根据题干信息和图形分析，将T0 代植株的花序浸没在农杆菌（T-DNA 上含有DAI 基因和卡那霉素
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抗性基因）液中转化，再将获得的T1 代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，若在选择培养基上
有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI 基因和卡那霉
素抗性基因。
T1
②
代阳性植株都含有DAI 基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一
位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相
当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3 1∶的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植
株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。
③将以上获得的T2 代阳性植株自交，再将得到的T3 代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养
基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目
标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X
的切割位点，而突变型的基因有限制酶X 的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有
150bp，突变型有50bp 和100bp，如图：
。
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