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必刷12 基因工程
高频考点1 重组DNA 技术
高频考点2 基因工程的操作
高频考点3 基因工程的应用
高考真题必刷
1．（2023·辽宁·统考高考真题）CD163 蛋白是PRRSV 病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163 蛋白的表
达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP 基因与CD163 基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。
该拼接过程的关键步骤是除去（ ）
A．CD163 基因中编码起始密码子的序列
B．CD163 基因中编码终止密码子的序列
C．RFP 基因中编码起始密码子的序列
D．RFP 基因中编码终止密码子的序列
2．（2023·江苏·统考高考真题）某生物社团利用洋葱进行实验。下列相关叙述正确的是（ ）
A．洋葱鳞片叶内表皮可代替半透膜探究质膜的透性
B．洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂，溶液即呈砖红色
C．制作根尖有丝分裂装片时，解离、漂洗、按压盖玻片都能更好地将细胞分散开
D．粗提取的DNA 溶于2mol/L NaCl 溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色
3．（2023·浙江·统考高考真题）紫外线引发的DNA 损伤，可通过“核苷酸切除修复（NER）”方式修复，
机制如图所示。着色性干皮症（XP）患者的NER 酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤出现炎症等症状。
患者幼年发病，20 岁后开始发展成皮肤癌。下列叙述错误的是（ ）
1
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A．修复过程需要限制酶和DNA 聚合酶
B．填补缺口时，新链合成以5 到3 的方向进行
C．DNA 有害损伤发生后，在细胞增殖后进行修复，对细胞最有利
D．随年龄增长，XP 患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释
4．（2023·天津·统考高考真题）根据下图，正确的是（ ）
A．子代动物遗传性状和受体动物完全一致
B．过程1 需要MII 期去核卵母细胞
C．过程2 可以大幅改良动物性状
D．过程2 为过程3 提供了量产方式，过程3 为过程1、2 提供了改良性状的方式
5．（2023·湖南·统考高考真题）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物
AT1 蛋白通过调节细胞膜上PIP2s 蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是
（ ）
2
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A．细胞膜上PIP2s 蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s 蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1 基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
6．（2023·湖北·统考高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因
构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体
（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet 的培养基中能形成菌落
7．（2023·浙江·统考高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型
小鼠Gata3 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以期
获得Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2 用
于PCR 扩增，PCR 产物电泳结果如图乙所示。
3
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下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子无法控制GFP 基因的表达
B．翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C．2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
8．（2023·广东·统考高考真题）“DNA 粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。
下列叙述错误的是（ ）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA 等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA 的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
9．（2023·广东·统考高考真题）中外科学家经多年合作研究，发现circDNMT1（一种RNA 分子）通过与
抑癌基因p53 表达的蛋白结合诱发乳腺癌，为解决乳腺癌这一威胁全球女性健康的重大问题提供了新思路。
下列叙述错误的是（ ）
A．p53 基因突变可能引起细胞癌变
B．p53 蛋白能够调控细胞的生长和增殖
C．circDNMT1 高表达会使乳腺癌细胞增殖变慢
D．circDNMT1 的基因编辑可用于乳腺癌的基础研究
10．（2023·山西·统考高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3 和酶4）、DNA 连接酶为工具，将
目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限
制酶的切割位点如图所示。
4
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下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
B．质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割，用T4 DNA 连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割，用T4 DNA 连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
高考模拟题必刷
11．（2023·广西北海·统考一模）研究发现，夜班工作引起的昼夜节律紊乱可以改变肿瘤相关基因的表达，
引起细胞癌变，对人体自身DNA 修复也会产生负面影响。下列叙述正确的是（ ）
A．原癌基因在表达时，转录和翻译过程中碱基互补配对原则完全相同
B．熬夜可能会使细胞分裂过程中出现突变进而导致患癌症的风险增加
C．与正常细胞相比，癌变细胞细胞膜上的糖蛋白增多，细胞之间的黏着性显著增强
D．在DNA 修复过程中，需限制酶剪切错误片段中的氢键，需DNA 聚合酶催化DNA 片段的修复
12．（2023·浙江宁波·镇海中学校联考一模）科研人员将目的基因J 与质粒构建重组表达载体，该质粒的
部分结构如图所示，下列叙述错误的是（ ）
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A．除图中标出的结构外，质粒还需具备的结构有复制原点、标记基因、限制酶切位点等
B．与图中启动子结合的酶是RNA 聚合酶
C．用PCR 检测J 基因连接到质粒中且方向正确可选用的一对引物是F1和R2
D．若J 基因转录的链位于b 链，可知引物F1与基因J 的b 链相应部分序列相同
13．（2023·全国·校联考模拟预测）生物兴趣小组开展人类遗传病发病率和遗传方式的调查活动，发现某
家系同时有甲遗传病（基因为A、a）和乙遗传病（基因为B、b）患者，系谱如图1；对部分家庭成员是否
携带甲病基因进行核酸分子检测，结果如图2，已知乙病为常染色体遗传病，且在人群中的发病率为
1/10000。上述基因均不位于Y 染色体上，下列叙述错误的是（ ）
A．甲病属于常染色体隐性遗传病
B．Ⅲ9是患病男孩的概率是11/27
C．Ⅱ7同时携带两种致病基因的概率是4/9
D．Ⅱ7与另一健康男子再婚，生一个患乙病孩子的概率约为1/303
14．（2023·海南·统考二模）载体是基因工程中携带外源DNA 片段（目的基因）进入受体细胞的重要运载
工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。下图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示
意图，下列相关叙述正确的是（ ）
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A．重组载体A、重组载体B 分别是基因表达载体和基因克隆载体
B．载体A 和载体B 都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因
C．必须把目的基因插入重组载体A 的启动子和终止子之间
D．培养细菌A 和细菌B 的培养基在营养成分和功能上没有明显差异
15．（2023·全国·校联考模拟预测）“嵌合体”是指同一个体或器官，其不同成熟体细胞的核基因组成不
同。下列情况一般不会出现“嵌合体”的是（ ）
A．经外源基因转入受精卵后正常发育的幼鼠
B．经造血干细胞移植的血友病患者
C．经X 射线处理种子后发育成的小麦幼苗
D．经秋水仙素处理的单倍体幼苗
16．（2023·全国·校联考模拟预测）M 细胞由小鼠胚胎干细胞定向诱导分化而来，将其移植到糖尿病模型
小鼠（胰岛细胞被特定药物破坏的小鼠）体内，测定小鼠的血糖浓度如图所示。用胰岛素基因片段制成探
针，对小鼠胚胎干细胞和M 细胞进行检测，并将结果记录在表中。下列叙述正确的是（ ）
用探针检测细胞的DNA
用探针检测细胞的RNA
胚胎干细胞
M 细胞
胚胎干细胞
M 细胞
+
①
②
③
注：“+”表示能检测到，“－”表示不能检测到
A．可用胃蛋白酶处理小鼠的早期囊胚以获得胚胎干细胞
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B．图中结果表明M 细胞已具备胰岛β 细胞的功能
C．表中①②③处的结果分别为“+、-、-”
D．实验需用到动物细胞培养、胚胎移植、核酸分子杂交等技术
17．（2023·云南大理·统考模拟预测）微生物是难以用肉眼观察到的微小生物的统称，在农业生产和科学
研究等方面都有重要用途。下列叙述正确的是（ ）
①硝化细菌和蓝细菌均不含叶绿体，但二者均是能进行光合作用的自养生物②有荚膜的S 型肺炎链球菌可
抵抗吞噬细胞的吞噬，有利于其在宿主体内生活并繁殖③T2 噬菌体专门寄生在大肠杆菌体内与其遗传物
质的特异性有关④腌制泡菜的过程中，泡菜坛只能装八成满是为了防止乳酸菌产生CO2使发酵液溢出⑤通
过发酵工程可以从微生物细胞中提取单细胞蛋白用于制成微生物饲料⑥农杆菌可以在自然条件下侵染双子
叶植物，将目的基因转移到受体细胞中
A．①②④
B．①④⑤
C．②③⑥
D．③⑤⑥
18．（2023·辽宁·统考高考真题）天然β 淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR 改
造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23 质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答
下列问题：
（1）上述过程属于 工程。
(2)PCR 中使用的聚合酶属于 （填写编号）。
①以DNA 为模板的RNA 聚合酶 ②以RNA 为模板的RNA 聚合酶
③以DNA 为模板的DNA 聚合酶 ④以RNA 为模板的DNA 聚合酶
（3）某天然β-淀粉酶由484 个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476 位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性
明显提升。在图1 所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是 （填写编号）。
（4）为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2 所示的pLN23 质粒构建得到基因表达载
体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和 。
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（5）目的基因（不含EcoRI 酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I 位点。用EcoR I 酶切来自于不
同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA 片段长度，这一操作的目的是 。正确连接
的基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为 kb。
（6）采用PCR 还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过 反应获得PCR 的
模板。
19．（2023·江苏·统考高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建
质粒，如图1 所示。请回答下列问题：
（1）分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主
要的不同是 。
（2）有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R 应在下列选项中选用______。
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A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC
（3）将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这
一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
（4）转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300 个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
（5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
（6）对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
20．（2023·北京·统考高考真题）变胖过程中，胰岛B 细胞会增加。增加的B 细胞可能源于自身分裂（途
径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研
究了L 基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK 中新增B 细胞的来源。
(1)EdU 和BrdU 都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA 中，掺入DNA 的EdU 和
BrdU 均能与 互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU 和BrdU 短时间内即被降解。
（2）将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间
向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU 标记细胞的
百分比（如图）。图中反映DNA 复制所需时长的是从 点到 点。
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（3）为研究变胖过程中B 细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除
小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L 基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L 基因两侧已插入特异DNA 序列（x），但L 的功能正常；②Ce 酶基因：源自噬菌
体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x 间的DNA 片段丢失；③Er 基因：编码的Er 蛋白位于
细胞质，与Er 蛋白相连的物质的定位由Er 蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er 蛋白进入细
胞核。请完善制备小鼠IK 的技术路线： →连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选
目标小鼠→ →获得小鼠IK。
（4）各种细胞DNA 复制所需时间基本相同，但途径I 的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）
的三倍以上。据此，科学家先用EdU 饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU 饲喂，再过t2时间后检测B 细胞被
标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B 细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是
。
21．（2023·北京·统考高考真题）二十大报告提出“种业振兴行动”。油菜是重要的油料作物，筛选具有
优良性状的育种材料并探究相应遗传机制，对创制高产优质新品种意义重大。
（1）我国科学家用诱变剂处理野生型油菜（绿叶），获得了新生叶黄化突变体（黄化叶）。突变体与野
生型杂交，结果如图甲，其中隐性性状是 。
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（2）科学家克隆出导致新生叶黄化的基因，与野生型相比，它在DNA 序列上有一个碱基对改变，导致突
变基因上出现了一个限制酶B 的酶切位点（如图乙）。据此，检测F2基因型的实验步骤为：提取基因组
DNA→PCR→回收扩增产物→ →电泳。F2中杂合子电泳条带数目应为 条。
（3）油菜雄性不育品系A 作为母本与可育品系R 杂交，获得杂交油菜种子S（杂合子），使杂交油菜的大
规模种植成为可能。品系A1 育性正常，其他性状与A 相同，A 与A1 杂交，子一代仍为品系A，由此可大
量繁殖A。在大量繁殖A 的过程中，会因其他品系花粉的污染而导致A 不纯，进而影响种子S 的纯度，导
致油菜籽减产。油菜新生叶黄化表型易辨识，且对产量没有显著影响。科学家设想利用新生叶黄化性状来
提高种子S 的纯度。育种过程中首先通过一系列操作，获得了新生叶黄化的A1，利用黄化A1 生产种子S
的育种流程见图丙。
①图丙中，A 植株的绿叶雄性不育子代与黄化A1 杂交，筛选出的黄化A 植株占子一代总数的比例约为
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。
②为减少因花粉污染导致的种子S 纯度下降，简单易行的田间操作用 。
22．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种
新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB 法）。图1 与图2 分别是利用常规转化法
和CDB 法在某植物中递送基因的示意图。
回答下列问题。
（1）图1 中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生
长素和 ，该过程还需要光照，其作用是 。
（2）图1 中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A 的 。图1
中，含有外源基因的转化植株A 若用于生产种子，其包装需标注 。
（3）图1 与图2 中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。
（4）已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS 基因的CRISPR/Cas9 基因编辑
载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2 中的CDB 法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功
获得转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ，图2 中，鉴定导入幼苗中的基
因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ，依据是 。
（5）与常规转化法相比，采用CDB 法进行基因递送的优点是 （答出2 点即可）。
23．（2023·浙江·统考高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量
很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
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（1）植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维
持在一定浓度水平，这种调节方式属于 。根据这种调节方式，在培养基中添加 ，用于筛选经
人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
（2）随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011 年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功
培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过
检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相
应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF 膜发生
，表达载体最终进入细胞核，发生转化。
③核移植。将转基因的BEF 作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为 。
将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了 重组细胞发育的作用。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至 ，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤检测。DNA 水平检测：利用PCR 技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以 为阳性对照，
检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA 水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛
乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA 进行 处理，以去除DNA 污染，
再经逆转录形成cDNA，并以此为 ，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因
牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？ 。
24．（2023·天津·统考高考真题）基因工程：制备新型酵母菌
（1）已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需
的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是 （填“细胞内”和“细胞外”）
（2）同源切割是一种代替限制酶、DNA 连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的
小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用
同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A．B，已知酵母菌体内DNA 有许多A-B 序列位点可
以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物 对目的基因进行PCR。
（3）已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-
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氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。
（i）导入目的基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，
因此在导入一种目的基因后，要切除UGA 基因，再重新导入。研究人员在UGA 基因序列两端加上酵母菌
DNA 中不存在的同源C．C 序列，以便对UGA 基因进行切除。C．C 的序列方向将影响切割时同源序列的
配对方式，进而决定DNA 片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式 进行连接。
（ii）切去UGA 基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。
（4）综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图 。
25．（2023·天津·统考高考真题）某植物四号染色体上面的A 基因可以指导植酸合成，不能合成植酸的该
种植物会死亡。现有A3-和A25-两种分别由A 基因缺失3 个和25 个碱基对产生的基因，已知前者不影响植
酸合成，后者效果未知。
（1）现有基因型为AA25-的植物，这两个基因是 基因。该植物自交后代进行PCR，正向引物与A25-缺
失的碱基配对，反向引物在其下游0．5kb 处，PCR 后进行电泳，发现植物全部后代PCR 产物电泳结果均
具有明亮条带，原因是 ，其中明亮条带分为较明亮和较暗两种，其中较明亮条带代表基因型为
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的植物，比例为 。
（2）将一个A 基因导入基因型为A3-A25-的植物的6 号染色体，构成基因型为A3-A25- A 的植物、该植物自
交子代中含有A25-A25-的比例是 。
（3）在某逆境中，基因型为A3-A3-的植物生存具有优势，现有某基因型为A3-A 的植物，若该种植物严格自
交，且基因型为A3-A3-的植物每代数量增加10%，补齐下面的表格中，子一代基因频率数据（保留一位小
数）：
代
亲代
子一代
子二代
A 基因频率
50%
%
46．9%
A3-基因频率
50%
%
53．1%
基因频率改变，是 的结果。
26．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部
分结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5。
（1）与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结
构有 （答出2 个结构即可）。
（2）构建重组质粒后，为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR 检测，若仅用一对引
物，应选择图甲中的引物 。已知J 基因转录的模板链位于b 链，由此可知引物F1 与图甲中J 基
因的 （填“a 链”或“b 链”）相应部分的序列相同。
（3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表
达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1 证明细胞内表达了 ，条带2 所检出的蛋白
（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J 基因表达的。
27．（2023·湖南·统考高考真题）基因检测是诊断和预防遗传病的有效手段。研究人员采集到一遗传病家
系样本，测序后发现此家系甲和乙两个基因存在突变：甲突变可致先天性耳聋；乙基因位于常染色体上，
编码产物可将叶酸转化为N5-甲基四氢叶酸，乙突变与胎儿神经管缺陷（NTDs）相关；甲和乙位于非同源
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染色体上。家系患病情况及基因检测结果如图所示。不考虑染色体互换，回答下列问题：
（1）此家系先天性耳聋的遗传方式是 。1-1 和1-2 生育一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率
是 。
（2）此家系中甲基因突变如下图所示：
正常基因单链片段5'-ATTCCAGATC……（293 个碱基）……CCATGCCCAG-3'
突变基因单链片段5'-ATTCCATATC……（293 个碱基）……CCATGCCCAG-3'
研究人员拟用PCR 扩增目的基因片段，再用某限制酶（识别序列及切割位点为
）酶切检测甲
基因突变情况，设计了一条引物为5′-GGCATG-3'，另一条引物为 （写出6 个碱基即可）。用上
述引物扩增出家系成员Ⅱ-1 的目的基因片段后，其酶切产物长度应为 bp（注：该酶切位点在目的
基因片段中唯一）。
（3）女性的乙基因纯合突变会增加胎儿NTDs 风险。叶酸在人体内不能合成，孕妇服用叶酸补充剂可降低
NTDs 的发生风险。建议从可能妊娠或孕前至少1 个月开始补充叶酸，一般人群补充有效且安全剂量为0.4
～1.0mg.d-1，NTDs 生育史女性补充4mg.d-1。经基因检测胎儿（Ⅲ-2）的乙基因型为-/-，据此推荐该孕妇
（Ⅱ-1）叶酸补充剂量为 mg.d-1。
28．（2023·湖北·统考高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A 为
抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
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回答下列问题：
（1）与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过
原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG 可促进细胞融合，该过程中PEG 对细胞膜的作用是 。
（2）在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT 培养基），该培养基对 和
生长具有抑制作用。
（3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
（4）构建重组质粒需要使用DNA 连接酶。下列属于DNA 连接酶底物的是 。
29．（2023·全国·统考高考真题）GFP 是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP 基因
为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
（1）构建突变基因文库，科研人员将GFP 基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出
GFP 基因的突变基因文库。通常，基因文库是指 。
（2）构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP 突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构
建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP 突变基因的转录方向）。图中①为 ；②为 ，
其作用是 ；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 。
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（3）目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿
色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是
（答出1 点即可）。
（4）新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP 突变
基因进行测序，发现其碱基序列与GFP 基因的不同，将该GFP 突变基因命名为YFP 基因（黄色荧光蛋白
基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP 基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
30．（2023·全国·统考高考真题）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙
肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA 病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因
工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
（1）接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是 。
（2）制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞
中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启
动子并驱动目的基因转录的酶是 。
（3）目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取 进行
DNA 分子杂交，DNA 分子杂交时应使用的探针是 。
（4）若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
31．（2023·浙江·统考高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。
某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体
融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：
（1）根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备
的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼
苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的 为外植体。
（2）植物细胞壁的主要成分为 和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。
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在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的 失活。对处理
后的原生质体在显微镜下用 计数，确定原生质体密度。两种原生质体1 1∶混合后，通过添加适
宜浓度的PEG 进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是 。
（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板
中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于 。下列各项中能说明这些
愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？
A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂
B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂
C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂
D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂
（4）愈伤组织经 可形成胚状体或芽。胚状体能长出 ，直接发育形成再生植株。
（5）用PCR 技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA 序列a，乙植物细胞质具有特异性
DNA 序列b；M1、M2为序列a 的特异性引物，N1、N2为序列b 的特异性引物。完善实验思路：
Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR 扩增的 。
Ⅱ．将DNA 提取物加入PCR 反应体系， 为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列
b。
Ⅲ．得到的2 个PCR 扩增产物经 后，若每个PCR 扩增产物在凝胶中均出现了预期的
个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
32．（2023·湖南郴州·统考一模）我国有7000 年的种植水稻的历史，如今水稻已经成为我国重要作物。生
产实践中获得具有杂种优势的杂合种子是提高水稻产量的重要途径，同时寻找抗病、耐旱、耐盐、耐高温
基因并对其调控机制进行深入研究对水稻遗传改良具有重要意义。
（1）自然条件下，科研人员从水稻品种ZH11 中筛选出雄性不育突变体（hms1）。利用雄性不育突变体进
行杂交水稻育种的优势是 。
（2）科研人员获得纯合稻瘟病抗性突变体 M，并对野生型（WT）和抗性突变体 M 的 R 基因进行测序
分析，结果如图。
由图可知，突变体的第591 位发生了 ，可能导致第 位及之后的氨基酸发生改变，从而引起该蛋白
质空间结构发生变化。
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（3）若需要对M 的R 基因进行PCR 扩增处理，已知引物1 为 5'-TCA-3'，则引物2 应为 。
（4）某研究所提取水稻品种 nonabokra 的两个耐盐基因 qgslc-1 和 Salto1 并导入普通水稻zhonghua11，
从而筛选出成功整合的耐盐水稻植株（两个耐盐基因都表达才表现为高耐盐性状，表达一个为中耐盐，不
表达即为不耐盐）。如下图表示两个基因随机整合的三种情况，让三株转基因水稻植株自交，若自交后代
性状分离及其比例为 ，则为甲整合情况；若自交后代性状分离及其比例为 ，则为乙整合情况；若
自交后代性状分离及其比例为 ，则为丙整合情况。
【33．（2023·湖南郴州·统考一模）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构
建质粒，如图1 所示。请回答下列问题：
（1）进行 PCR 扩增时需要耐高温的DNA 聚合酶，为使其活化应在 PCR 反应缓冲液中加入 （填
“Ca2+”或“Mg2+”）。
（2）有关基因序列如图2，引物 F2-F、F1-R 应在下列选项中分别选用 。
A．5'-ATGGTG------CAACCA-3'
B．5'-TGGTTG------CACCAT-3'
C．5-GACGAG------CTGCAG-3
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D．5-CTGCAG------CTCGTC-3
（3）将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在酶的作用下可形成环形质粒，直接用于转化细菌。这一
过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要是 。
（4）构建好的重组质粒除了含有目的基因、标记基因，还要有 ，用以控制目的基因的表达。
（5）如何将重组质粒导入大肠杆菌？ 。
（6）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，符合要求的质粒为 。
34．（2023·浙江宁波·镇海中学校联考一模）某DNA 病毒对动物养殖业危害十分严重。研究人员拟以该病
毒抗原蛋白A 来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：
（1）获取基因A：用于制备蛋白A 的基因称为 ，获取该基因的常用方法是先建立 ，
用一定方法“钓取”相应基因克隆片段后通过 技术扩增，扩增的原料是 。下列对引
物的叙述错误的是 。
A．两个引物之间不应有互补性 B．引物自身不存在互补序列
C．引物与模板链复制起始端碱基互补 D．引物的碱基包含AGCU 四种
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（2）工程菌转化：将工程菌放于低温、低浓度 溶液中，造成细胞膜通透性改变，成为
细胞，通过一定手段将外源DNA 导入细胞完成转化。
（3）筛选获得杂交瘤细胞：在杂交瘤细胞筛选中，常使用特殊选择培养基如 培养基，该培养
基对 和 两类细胞的存活和繁殖具有抑制作用。
（4）特定杂交瘤细胞的培养和单克隆抗体的筛选：特定杂交瘤细胞培养常用搅拌式发酵罐，培养时需注
意控制如 等条件（写出2 点）。发酵罐中营养物质通常需加入葡萄糖、氨基酸、激素、无机盐
和 ，以及诱导抗体分泌的化学物质，如丁酸钠。发酵罐内细胞增殖形成 （细胞株/细
胞系），其分泌的抗体可利用 技术筛选。罐内上清液中单克隆抗体含少量杂质，可采用
方法纯化。
35．（2023·江苏连云港·东海县石榴高级中学校考模拟预测）基因工程可以赋予生物新的性状，科研人员
利用基因工程技术以期待获得具备抗旱特性的小麦。请回答下列问题：
（1）研究发现，某些植物的种子脱水数十年后复水仍能够恢复活性，原因是细胞中积累了海藻糖。科研
人员拟将酵母菌的海藻糖合成酶基因（TPS）转入小麦中。下图标注了载体、TPS 基因的酶切位点和预期
的基因表达载体的结构，表格列举了限制酶的识别序列。
酶
识别序列
BamHI
5GGATCC
SacI
5GAGCTC
HindⅢ
5AAGCTT
XbaI
5TCTAGA
①科研人员利用PCR 技术获得大量的TPS 基因。
现将2 种引物的一侧添加限制酶识别序列，这样TPS 基因的PCR 产物和载体用相同的限制酶切割后，可利
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用 酶将TPS 基因拼接到载体的切口处，形成基因表达载体。
②从图分析，在TPS 基因两侧引入的是 限制酶的酶切位点。设计的引物序列为
（2）图中Bar 基因是抗除草剂基因。基因表达载体转入细胞后，在获得的植株叶片上涂抹除草剂，筛选出
7 株抗除草剂个体。Bar 基因作为载体上的 基因辅助筛选TPS 转基因植株。
（3）现对筛选出的抗除草剂个体进行DNA 水平的检测。请填写表格，完成实验设计：
组别
植株编号1-7
对照组1
对照组2
模板
①
基因表达载体或TPS 基因片段
②
PCR 体系中其他物质
扩增缓冲液、水、引物、③、④
电泳预期结果
⑤
有条带
没有条带
① ；② ；③ ；④ ；⑤ 。
（4）下图为用探针检验某一转海藻糖合成酶基因抗旱植物基因型的原理，相关基因用R 和r 表示。若被检
植株发生A 现象，不发生B、C 现象，则被检植物的基因型为 。
36．（2023·河南·校联考模拟预测）从胡萝卜中提取的橘黄色β-胡萝卜素具有预防白内障等医用价值。图1
为提取β-胡萝卜素的装置图。胡萝卜素脱饱和酶参与β-胡萝卜素的合成。科学家将β-胡萝卜素脱饱和酶基
因（基因M）转入水稻愈伤组织细胞，经培育、筛选出含有β-胡萝卜素的“黄金大米”。图2 表示利用
PCR 技术扩增基因M 并且同时在一端添加限制酶EcoRI 酶切位点的过程示意图。回答下列问题：
（1）利用图1 装置提取胡萝卜素，该装置在加热瓶口安装冷凝管的目的是 。⑤⑥萃取过
程采用水浴加热是因为 。
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（2）提取的胡萝卜粗品通过 法进行鉴定。如图表示鉴定结果示意图，其①－中属于其他
色素或杂质的是 （填序号）。
（3）双链的解开是进行DNA 复制的前提，PCR 过程中在80~100℃的温度范围内，DNA 双链分开，这个
过程称为 。PCR 复制过程需要引物，原因是 。若引物2 与基因M 末端互补的部
分序列为5-GCAT……-3，则完整的引物2 的序列应为 ，经3 轮PCR 可以得到等长的成功添加
了限制酶EcoRI 酶切位点的基因M 有 个。
37．（2023·江苏连云港·东海县石榴高级中学校考模拟预测）某科研人员从苏云金芽孢杆菌中获取Bt 毒蛋
白基因，并将其导入大豆叶肉细胞，培育出抗虫的转基因大豆，主要过程如下图。请回答下列问题：
（1）为了正确扩增Bt 毒蛋白基因，并能与图中质粒正确连接，需根据 、 设计两种引物。PCR 时引
物的作用是 。
(2)PCR 扩增产物可根据 不同，可以用 技术鉴定。结果发现有目的基因以外的杂带存在，分析可能的
原因有 。解决方案一般是在目的基因的 （填“内部”或“上、下游”）重新设计引物进行PCR。
A．引物特异性不强 B．退火温度过低 C．模板DNA 污染 D．引物碱基序列过长
（3）图中①为
请写出HindIII 和BamHI 的识别序列分别是 、 。①②过程所需
要用到的酶有 。
（4）过程③筛选抗虫能力强的大豆，应从 水平上检测。
38．（2023·山西运城·校联考模拟预测）植物细胞壁中含大量不能被猪消化的多聚糖类物质，如半纤维素
多聚糖、果胶质（富含半乳糖醛酸的多聚糖）等。研究人员通过现代生物技术培育出转多聚糖酶基因
（manA）猪，主要流程如图所示，图中neo 为标记基因，回答下列问题：
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（1）图中获取目的基因采用的限制酶是BamHI 和BglⅡ，但是处理后的目的基因后并不能避免自身环化，
原因是 。处理质粒应采用的限制酶是 。
（2）图中通过PCR 技术扩增目的基因的前提是 ，以用于制备PCR 扩增需要的引物，引物的作
用是 。基因工程的核心环节是图中的 （填标号）。
（3）如果要一次性获得更多的转基因猪，可在囊胚期对早期胚胎进行胚胎分割，操作时要注意 。
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获得的转基因猪中的manA 主要在 中进行表达。
39．（2023·全国·校联考模拟预测）猕猴桃美味可口、营养丰富，市场需求高，现欲将来自拟南芥的抗病
基因X 转入猕猴桃，培育抗病猕猴桃品系。
注：启动子35S：真核细胞启动子，启动下游基因在真核细胞内的表达；
绿色荧光蛋白基因：作为报告基因并与目的基因融合表达，通过荧光强度可反映目的基因表达量；卡那霉
素、潮霉素：2 种抗生素，通过抑制核糖体功能对细菌、动物、植物产生广谱杀伤作用。
限制性酶
NheI
XbaI
BglⅡ
BamHI
识别序列及酶切位点
回答下列问题：
（1）构建表达载体。根据上述信息，为使基因X 定向插入Ti 质粒，需分别在引物F 和R 的末端添加限制
性酶 的碱基序列。
（2）转化农杆菌。将构建好的表达载体与经 处理制备的农杆菌悬液混合、再经约42℃短暂的热刺
激转化。将其慢摇复苏后转移至添加有 的LB 培养液中振荡培养12h，该过程的培养目的是 ，
最终在选择培养基平板上挑选目标单菌落。
（3）下列方案中，哪几项不适用于鉴定单菌落是否转化成功的？_______
A．提取各个单菌落质粒并用（1）中所选限制性酶酶切消化，后通过电泳检测有无基因X
B．以F 和R 为引物对各个单菌落进行PCR 扩增，后通过电泳检测有无基因X
C．用抗X 蛋白的单克隆抗体作探针来鉴定各个单菌落的蛋白质成分
D．用特定波长光源作激发光观察鉴定各个单菌落是否发出绿色荧光
（4）转化植物愈伤组织。选取野生猕猴桃长势健康的幼嫩枝条一支，在超净台中消毒后用 冲洗，
再 后接种到若干培养基中，使其在适宜条件下诱导发生 过程；接着向其中倒入目标菌悬液，侵
染后部分愈伤组织细胞的染色体上已整合了T—DNA，但是由于 ，所以不能马上使用潮霉素来杀
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除残留农杆菌。最终筛选出的愈伤组织继续诱导培养获得 ，包埋形成 ，便于远距离运输、
快速繁殖转基因猕猴桃品种。
40．（2023·贵州·统考模拟预测）如图甲为基因工程中常用的某一质粒载体，将目的基因插入Ampr或Tetr
中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。图乙表示限制酶
BamHI 的识别序列和切割位点。
据图回答下列问题：
（1）图甲质粒中存在复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 。该质粒中还含有启动子，启动子是
指 。该质粒中的标记基因是指 。
（2）用限制酶BamHI 切割目的基因和质粒后，可用 （填“E·coliDNA 连接酶”“T4DNA 连接酶”或
“E·coliDNA 连接酶或T4DNA 连接酶”）进行连接。
（3）目的基因和图甲所示的质粒用限制酶BamHI 切割后，再用DNA 连接酶连接得到重组质粒，将其导入
受体细胞。若受体细胞在含有氨苄青霉素的培养基上能生长， （填“能”或“不能”）判断该受体
细胞中含有重组质粒，原因是 。
（4）为了检测目的基因是否转录出了mRNA，可用标记的目的基因片段作为探针与mRNA 杂交，该杂交
技术称为 。为了检测目的基因转录的mRNA 是否翻译成 ，常用抗原—抗体杂交技术。
41．（2023·陕西商洛·校联考一模）草甘膦是一种非选择性内吸传导型茎叶处理除草剂，其机理是抑制与
植物多种代谢途径有关的EPSP 合酶的活性。科研人员试图培育抗草甘膦作物，主要过程如图所示。请回
答下列问题：
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（1）科研人员从草甘膦严重污染的土壤中分离出一株高抗草甘膦菌株——假单胞杆菌G6，利用 技
术扩增其基因组，得到具有抗草甘膦特性的G6 基因，该基因的表达对EPSP 合酶的活性具有 （“促
进”或“抑制”）作用。
（2）通过①过程将G6 基因插入Ti 质粒的 ，并利用农杆菌将重组DNA 导入矮牵牛细胞，通过②过
程可将目的基因插入矮牵牛染色体DNA 的原理是 。
(3)③过程可通过 技术将经过培养、筛选后的矮牵牛细胞培育得到转基因矮牵牛植株。抗草甘
膦基因来自假单胞杆菌G6，但经检测它可以在水稻细胞中表达，其原因是细菌和植物共用
。
（4）科研人员通过④过程对转基因矮牵牛进行个体生物学水平鉴定，最为合理有效的方法是 ，
为了使结果更具有说服力，进行该过程时可选择 作为对照。
42．（2023·湖南永州·统考一模）在医药领域，单克隆抗体在疾病诊断和病原体鉴定中发挥重要作用，但
鼠源的单抗容易在人体内引发人抗鼠抗体反应（HAMA），从而消弱其治疗的有效性。科学家对鼠源杂交
瘤抗体进行改造，生产出效果更好的鼠一人嵌合抗体，主要流程如下图所示。回答下列有关问题：
（1）抗体由两条L 链和两条H 链组成，每条链都含V 区和C 区，其中决定抗体特异性的是 区。
（2）获取VL 基因和VH 基因时，通常先从生长状态良好的杂交瘤细胞中提取 ，再通过反转录法来
合成。图中的Sp2/0 细胞最可能是 细胞。
（3）为了便于嵌合基因与载体连接，需在扩增嵌合基因时在引物的 端加上特定的限制性酶切位点，
且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是 。
（4）上述基因表达载体中，除含有嵌合基因外，还应含有启动子和 （答出两个即可），其中启动子
的作用是 。
43．（2023·福建龙岩·福建省龙岩第一中学校考模拟预测）心脏移植是挽救终末期心脏病患者生命唯一有
效的手段，然而心脏移植过程中会发生缺 血再灌注损伤（IRI），可能导致心脏坏死。研究发现，IRI 通过
促进Caspase8 蛋白等一系列凋亡蛋白的表达，导致细胞凋亡最终引起器官损伤。根据Caspase8 基因合成的
小干扰RNA（siRNA）可以使Gaspase8 基因沉默，有效抑制IRI 所致的器官损伤。图1 是利用猪的心肌细
胞开展siRNA 作用研究的示意图，图2 是此研究可能用到的4 种限制酶及其切割位点。回答下列问题：
（1）图1 中步骤②构建重组质粒需要使用多种工具酶。常用的DNA 连接酶有E.coli DNA 连接酶和T4
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DNA 连接酶。图2 中 酶切割后的DNA 片段可以用T4 DNA 连接酶连接。DNA 连接酶催化目的基因
片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
（2）图1 中步骤③将重组质粒导入猪的心肌细胞最常用的方法是 。siRNA 对应DNA 序列是在心肌细
胞中表达产生siRNA，siRNA 与RISC 组装形成基因沉默复合物，通过 ，从而降低IRI 引起的细胞凋
亡。
（3）研究人员根据Caspase8 基因的碱基序列，设计了三种序列分别导入猪的心肌细胞，通过测定靶基因
Caspase8 的mRNA 含量来确定最优序列。测定mRNA 含量时，需提取心肌细胞的总RNA，经过 过程
得到cDNA，再进行PCR 扩增，测定PCR 产物量，结果如图3 所示。据此判断最优序列是 。
（4）与直接将siRNA 导入猪的心肌细胞相比，通过重组质粒将siRNA 对应的DNA 序列导入心肌细胞，其
优点是 （答出1 点）。
（5）为了解决心脏移植供体短缺问题，许多科学家正在研究用猪心脏代替人的心脏。选用猪的心肌细胞
作受体细胞是因为猪的内脏构造、大小、血管分布与人的极为相似，而且与灵长类动物相比，可导致人类
疾病的病毒要少得多。将猪心脏移植到人体面临的最大挑战是免疫排斥，以下哪些技术，能有效解决免疫
排斥这一问题（ ）
A．细胞融合
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B．基因敲除
C．选猿猴细胞为受体细胞
D．转入一些人类特有蛋白基因，将猪细胞伪装成人细胞
E．导入抑制抗原决定基因表达的调节因子
44．（2023·四川成都·校联考二模）为了能让绵羊作为人的抗胰蛋白酶的生物反应器，科学家将人的抗胰
蛋白酶基因与绵羊乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，培育出了能够合成人的抗胰蛋白酶的转
基因绵羊。回答下列问题：
（1）获取人的抗胰蛋白酶基因可以采用从人体细胞中获取基因片段，这种方法的缺点是 ，如
果基因 ，也可以用
合成仪直接合成，获取的目的基因可以通过 进行扩增。
（2）目的基因和启动子等组件的整合过程需要用到的工具酶是 ，启动子在基因表达过程中的
作用是 ，选择乳腺蛋白基因的启动子的原因是 。
（3）将重组
导入受精卵的方法通常选用 ，受精卵在体外培养到阶段 时再将其
移植到受体母羊的子宫中进行发育。
45．（2023·吉林长春·统考模拟预测）癌细胞表面蛋白“PDL-1”与T 细胞表面蛋白“PD-1”特异性结合后，
可抑制T 细胞活性并启动其凋亡程序，导致肿瘤细胞发生免疫“逃逸”。研究者对“PD-1”基因进行克隆、
表达及生物学活性鉴定，为制备抗体打基础。研究中所用引物a 和β 碱基序列见图1，几种常用限制酶名
称及识别序列与酶切位点见图2:
（1）首先提取细胞中的mRNA 逆转录生成eDNA 作为模板：设计含有不同的限制酶切位点的α 和β 序列
为引物，通过 技术扩增目的基因。
（2）为保证目的基因和载体正向连接，选用图中的名称为 的限制酶将质粒和目的基因进行切割，
再用DNA 连接酶构建表达载体。该表达载体的组成，除了目的基因、标记基因（抗卡那霉素基因）外，
还必须具有 等（写出2 点即可）。
（3）而后一定温度下，与经过Ca2+处理的感受态大肠杆菌混合培养在含 培养基中，可筛选出已经完
成转化的大肠杆菌，继续培养该种大肠杆菌以扩增重组DNA。
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（4）将扩增后的“载体A/PD-1 重组DNA”转入可高度表达外源基因的原代293T 细胞。一段时间后，为确
定PD-1 基因是否表达，检测细胞膜表面是否具有 研究中还会有一步骤是只将载体A 转入293T 细胞，
其目的是 。
46．（2023·广东东莞·校考模拟预测）幽门螺杆菌（Hp）是慢性胃炎、淋巴增生性胃淋巴瘤的主要致病菌，
该菌的Ipp20 基因能合成其特有的蛋白质，据此，研究者利用基因工程制备Hp 疫苗。已知lpp20 基因表达
时，双链DNA 的一条链是编码链，另一条链是模板链，如图1；四种限制酶及其识别序列如图2；三种质
粒如图3，箭头表示限制酶的切割位点；操作步骤如图4。回答下列问题：
（1）转录产生的mRNA 前8 个碱基序列为 （方向为5'→3'）。若通过PCR 技术大量扩增Ipp20 基
因的编码区段，则需要设计一对引物，其中结合到编码链上的引物序列是 （方向为5'→3'，写出5'端
8 个碱基序列）。
（2）据图1、2、3 分析，构建基因表达载体时，应选用的限制酶是 ，最适合用作载体的质粒是 。
（3）图4 中为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，通常采用影印法（使用无菌的线毡布压在培养基A 的菌
落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B 上、结果如图所示）。培养基A、B 中应分别添加 ，
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符合实验要求的菌落是 （填写数字），判断依据是 。
47．（2023·广东东莞·校考模拟预测）新冠病毒（+RNA）的刺突蛋白S 通过与人体黏膜细胞表面的ACE2
受体结合而进入细胞，是宿主抗体的重要作用位点。下图1 是科研人员利用新冠病毒的+RNA 提取S 蛋白
基因和S 蛋白受体结合域RBD 基因作为抗原基因序列，研制新冠病毒双抗原疫苗的技术路线。已知PCR1
与PCR2 要分别进行，然后将产物混合，使用引物1 和引物4 进行PCR3，最终获得大量S-RBD 融合基因
（1300bp）。请分析回答：
（1）片段1 与片段2 连接形成S-RBD 融合基因。在PCR3 对其进行扩增的过程中，需要使用 酶，
该酶的作用是 。
（2）为初步检测过程B 构建是否成功，对重组pX 系列质粒及其酶切产物进行凝胶电泳检测，结果如图
2。据图可知，酶切时用到的酶是 ，重组质粒pX2 和pX5 构建成
功的依据是 。
（3）在工程菌的筛选时，可先后用两种抗生素进行培养实验。鉴定pX 质粒是否导入工程菌还可以采用的
方法是 。
48．（2023·广东·校考模拟预测）家禽的饲料中富含谷物，纤维素是谷物的重要成分，但家禽消化道中缺
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少能降解纤维素的酶，将其添加到饲料中，以提高家禽养殖效率。枯草芽孢杆菌能分泌一种可降解纤维素
的酶，需使用图1 中质粒作为载体，图2 为含W 基因的DNA 片段。回答下列问题：
（1）常见的乳酸菌除乳酸杆菌外，还有 。家禽肠道内的乳酸杆菌可利用葡萄糖通过细胞呼吸
产生酸性物质，抑制有害细菌的生长和繁殖，维持肠道的正常功能，请写出相关的反应式
。
（2）利用PCR 技术扩增W 基因时，用到的DNA 聚合酶与普通的酶相比，具有的特点是 。扩增
完成后，常采用 法来鉴定PCR 的产物。为得到含W 基因的乳酸杆菌，可采用平板划线法纯
化乳酸杆菌，进行划线操作要注意： （写出2 点即可）。
(3)W 基因以乙链为转录模板链，转录时mRNA 自身延伸的方向为5'→3'。下表是几种限制酶的识别序列及
切割位点，图1、图2 标注了相关限制酶的酶切位点。为获得能正确表达W 基因的重组质粒，应分别使用
哪些限制酶对质粒和含W 基因的DNA 片段进行切割？ 。
限制酶
EcoRⅠ
BamHⅠ
KpnⅠ
MfeⅠ
HindⅢ
识别位
点
5'
G↓AATTC
﹣
﹣
3'
3'
CTTAA↑G
﹣
﹣
5'
5'
G↓GATCC
﹣
﹣
3'
3'
CCTAG↑G
﹣
﹣
5'
5'
G↓GTACC
﹣
﹣
3'
3'
CCATG↑G
﹣
﹣
5'
5'
C↓AATTG
﹣
﹣
3'
3'
GTTAA↑C
﹣
﹣
5'
5'
A↓AGCTT
﹣
﹣
3'
3'
TTCGA↑A
﹣
﹣
5'
49．（2023·广东东莞·校考一模）赤霉素与其受体 GID 结合后，可以促进植物茎秆伸长。蓝光能够激活蓝
光受体 CRY，抑制赤霉素的作用，为探究该机理，研究者分别构建了含有 His-CRY 和 GST-GID 融合基
因的表达载体，表达出相应的融合蛋白。His 和 GST 均为短肽，它们与其他蛋白形成的融合蛋白能与
His 或 GST 抗体结合，且不影响其他蛋白的结构和功能。
（1）构建含上述融合基因的表达载体。
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①结合图 1 分析，欲使 His 短肽连在 CRY 的氨基酸序列前端（氨基端），则应在 （填“F 引物”
或“R 引物”）的 （填“5'”或“3'”）端加上 His 短肽的编码序列。
②为使融合基因能与载体相连接，还需在 F 引物和 R 引物上添加相应的酶切位点序列，该序列应该位于
His 短肽编码序列的 （填“5'”或“3'”）端。
③用同样的方法扩增 GST-GID 融合基因，并构建相关表达载体。
（2）将两个表达载体同时导入拟南芥细胞，一段时间后裂解细胞，将含有 His 抗体的磁珠加入裂解液中，
充分孵育后收集磁珠，将磁珠上的蛋白（磁珠蛋白）分离下来，进行抗原-抗体杂交，结果如图 2。
①由图可知 His-CRY 和 GST-GID 融合基因的表达情况是 。对磁珠蛋白进行 His 抗体检测的目
的是 。
②图示结果说明，蓝光的作用机理是 。
50．（2023·广东·统考高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行
诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI 基因发生一个碱基G 到A 的替
换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
（1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因
植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
（2）用PCR 反应扩增DAI 基因，用限制性核酸内切酶对PCR 产物和 进行切割，用DNA 连接酶
将两者连接。为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
（3）转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入
多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获
得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
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①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基
因组中插入了 。
T
②
1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养基
中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 （填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3
代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR 扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切
酶X 切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带
涂黑 。
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