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热点微练23 基因工程的操作程序（尖子生特训）
（时间：10 分钟）
1.（2022·湖南长郡中学调研）新型冠状病毒的肆虐给人们带来了严重的影响，其疫
苗的研发十分重要。下面是以复制缺陷型人5 型腺病毒（DNA 病毒）为载体的重
组新型冠状病毒疫苗的简要研制思路：
①获取与新型冠状病毒（RNA 病毒）S 蛋白（抗原）相关的DNA 片段。
②将上述DNA 片段整合到复制缺陷型人5 型腺病毒的DNA 上（失去在人体细胞
中繁殖能力的腺病毒），并使其正常表达（在宿主细胞中进行）。得到含有S 蛋白的
腺病毒，称为重组腺病毒，可作为疫苗。
结合所学知识，回答以下问题：
（1）根据研制思路，有人提出在获取S 蛋白的相关DNA 片段时，可通过分析S 蛋
白的氨基酸序列，推算出mRNA 序列，继而得到相关DNA 序列，然后用
法合成DNA；也有人提出可提取新型冠状病毒的RNA，然后通过 获得
DNA，利用 技术对相关序列进行快速大量扩增。经过这两种方法获得的
DNA 序列是否一定相同？ （填“是”或“否”）。
（2）通过检测重组腺病毒是否表达出 ，判断疫苗研制是否成功。检测方法
如下：用放射性元素标记S 蛋白的 ，然后与重组腺病毒进行
，若出现杂交带，表明相关DNA 已经整合到腺病毒的DNA 上，并成功表达。
（3）从免疫学角度看，重组腺病毒疫苗的免疫效果要优于重组蛋白疫苗（抗原蛋
白），原因是___________________________________________________。
答案 （1）（人工）化学合成 （反）逆转录 PCR 否 （2）S 蛋白 抗体 抗原
—抗体杂交 （3）重组腺病毒疫苗既能激发机体的体液免疫又能激发细胞免疫，
而重组蛋白疫苗只能激发机体的体液免疫（合理即可）
解析 （1）根据S 蛋白的氨基酸序列可以推算出相关的DNA 序列，然后可以用化
学合成的方法直接人工合成；由RNA 经（反）逆转录和PCR 技术也可以得到相关
DNA，由于密码子的简并性，这两种方法获得的DNA 序列不一定相同。
（2）要检测重组腺病毒疫苗研制是否成功，可以直接检测在重组腺病毒中是否表
达出S 蛋白，即抗原。用放射性元素标记S 蛋白的抗体，然后与重组腺病毒进行抗
原—抗体杂交，若出现杂交带，表明目的基因已经整合到腺病毒的DNA 上，并成
功表达。（3）机体清除入侵病毒的过程依赖于体液免疫和细胞免疫的共同配合。重
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组腺病毒疫苗既能激发机体的体液免疫又能激发细胞免疫，而重组蛋白疫苗只能
激发机体的体液免疫。
2.（2021·山东潍坊一模）报告基因是指一类易于检测且实验材料本身不具备的基
因。阿尔茨海默病（AD）是由淀粉样前体蛋白（APP）过量表达导致的神经系统退
变性疾病，用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因作为报告基因。将EGFP 基因与
APP 基因融合，可方便、经济、快速地筛选出促进人APP 基因mRNA 降解的药物。
研究表明，EGFP 基因与APP 基因融合后，虽能全部转录但仅可合成EGFP。EGFP
基因与APP 基因融合过程如图所示。
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（1）APP751、EGFP 基因的cDNA 是以其mRNA 为模板经 过程形成
的。
（2）据图分析，Klenow 酶的作用是____________________________。
切割pcDNA3.1 质粒获得APP751 基因时，研究人员没有选择直接用HindⅢ、
XbaⅠ同时切割，而是历经①→②→③的复杂过程，原因是
_________________________________________________________。
（3）COS－7 细胞是来源于非洲绿猴肾成纤维细胞，培养这类细胞时，为保证细胞
生长，应在合成培养基中添加 。
答案 （1）逆转录 （2）将XbaⅠ切割获得的黏性末端催化产生平末端 直接用
HindⅢ、XbaⅠ同时切割，产物两端都是黏性末端，才能与被SmaⅠ与HindⅢ酶
切的载体连接 （3）血清等一些天然成分
解析 （1）以mRNA 为模板获得cDNA 的过程称为逆转录。（2）由图分析可得，①
是用限制酶XbaⅠ来切割，得到两个黏性末端，而Klenow 酶将XbaⅠ切割获得的
黏性末端催化产生平末端，③是用限制酶HindⅢ切割，得到含黏性末端的目的基
因，可与④切割后的C1 质粒构建成基因表达载体。若直接用HindⅢ、XbaⅠ同时
切割，产物两端都是黏性末端，而经过①→②→③可使目的基因两端分别为平末
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端和黏性末端，才能与被SmaⅠ与HindⅢ酶切的载体连接。（3）细胞在体外培养
时，培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质。将细胞所需的营养物质按种类
和所需量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。在使用合成培养基培养题述
细胞时，通常要加入血清等一些天然成分。
3.（2021·1 月联考湖南卷，22）p53 基因是一种抑癌基因，在恶性肿瘤患者中突变率
达50%以上。与人相比，大象体内含有多对p53 基因，推测是其很少患肿瘤的主要
原因。设计实验探究人p53 基因在乳腺肿瘤细胞中的作用。回答下列问题：
（1）利用PCR 技术扩增p53 基因。首先根据p53 基因的核苷酸序列，设计并合成
，其能与变性p53 基因单链结合，在 催化作用下延伸，如此循环
多次。
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（2）p53 基因表达载体的构建。如图所示，表达载体上除了标注的DNA 片段外，在
p53 基因上游还必须拥有的DNA 片段（箭头所示）是 ，其作用机理是
。外源p53 基因插入载体中至少需要两种工具酶，包括准确切割DNA 的限制性内
切核酸酶和将双链DNA 片段“缝合”起来的 。
（3）乳腺肿瘤细胞培养。完成伦理学审查和病人知情同意书签署后，将患者乳腺肿
瘤组织块剪碎，制成细胞悬液在适宜的条件下培养。培养环境中所需的主要气体
包括细胞代谢必需的 和维持培养液pH 值的 。保持培养环境处
于无菌无毒条件的操作包括________________________________________（答出
两点即可）。
（4）检测p53 基因表达对乳腺肿瘤细胞增殖的影响。分别将空载体和p53 基因表
达载体转入肿瘤细胞培养，采用特殊方法检测细胞增殖情况，并从培养的肿瘤细
胞中提取蛋白质，用相应的 进行杂交，检测p53 基因翻译成蛋白质的情
况，探索杂交带强度与细胞增殖率相关性。
答案 （1）引物 耐高温的DNA 聚合酶 （2）启动子 RNA 聚合酶识别和结合
的位点，启动转录 DNA 连接酶 （3）O2 CO2 对培养液进行无菌处理；在培养
液中添加一定量的抗生素；定期更换培养液 （4）抗体
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解析 （1）利用PCR 技术扩增目的基因，首先利用目的基因的核苷酸序列合成引
物，引物与目的基因单链结合，在耐高温的DNA 聚合酶的作用下延伸子链。
（2）构建基因表达载体时，目的基因的上游必须有启动子，它是RNA 聚合酶识别
和结合的部位，启动目的基因的转录过程。将目的基因插入载体需要切割目的基
因和载体的限制酶和将二者双链DNA 片段“缝合”的DNA 连接酶。（3）动物细
胞培养所需的气体环境是95%的空气和5%的CO2。其中O2是细胞代谢所必需的，
CO2的作用是维持培养液的pH，为保证无菌的培养环境，实验前应对培养液进行
无菌处理；在培养液中添加一定量的抗生素；定期更换培养液，去除细胞代谢的废
物，保持无毒的环境。
（4）检测基因表达产物蛋白质，可采用抗原—抗体杂交法。提
取肿瘤细胞中蛋白质，用p53 蛋白抗体进行杂交，检测p53 基因翻译成p53 蛋白的
情况。
4.（2022·江西九江模拟）与新型冠状病毒相关的实验室检测技术，对新型冠状病毒
的诊断与防控尤为重要。新型冠状病毒检测最常见的方法是荧光定量RT－PCR
（逆转录聚合酶链式反应），RT—PCR 的具体过程如下图。回答下列问题。
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（1）过程Ⅰ和Ⅱ都需要加入缓冲液、原料、酶和引物等，其中加入的酶分别是
、 。
（2）RT－PCR 过程通过对 的控制影响酶的活性和DNA 分子结构，从而
使得整个反应过程有序地进行。
（3）过程Ⅱ拟对单链cDNA 进行n 次循环的扩增，理论上需要 个引物B。
（4）新型冠状病毒的检测方法还可采用病毒抗原检测、病毒抗体检测，这些检测方
法的原理是_________________________________________________________。
检测到新冠病毒感染者抗体的时间滞后于病毒核酸和抗原的理由是
，因此 检测对传染性极高的新型冠状病毒疑似患者早期确诊意义不大。
答案 （1）逆（反）转录酶 耐高温的DNA 聚合酶 （2）温度 （3）2n－1
（4）抗原和抗体发生特异性结合 病毒进入人体后，刺激人体免疫系统产生相应
的抗体需要一段时间 病毒抗体
解析 （1）过程Ⅰ是由mRNA 形成cDNA 的过程，表示逆转录过程，需要加入逆
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转录酶；过程Ⅱ是PCR 过程，需要加入耐高温的DNA 聚合酶。（2）PCR 技术的原
理是模拟生物体内DNA 分子复制的过程，利用DNA 分子热变性原理，通过控制
温度控制DNA 分子结合。（3）双链DNA 进行n 次循环的扩增会得到2n个DNA 分
子，则单链DNA 进行n 次循环的扩增会得到2n－1个DNA 分子，其中有2n－1－1 个
DNA 分子中两条链全为新合成的，有1 个DNA 分子只有一条链是用引物B 合成
的。由于引物数目等于新合成的DNA 链的数目，合成该2n－1－1 个DNA 分子需要
引物数目为2（2n－1－1），其中引物A 与B 各占一半，所以需要引物B 为2n－1－1 个，
最后再加上含有cDNA 链的那1 个DNA 分子合成需要的一个引物B，因此共需要
引物B 的数目为2n－1。（4）新型冠状病毒的检测还可采用抗原—抗体杂交的方法，
其原理是抗原与抗体的特异性结合。
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