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【真题解析】分子生物学实验技术题怎么破?常考实验技术题详解!
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由于26成绩太多仍在统计中，在此仅放出部分成绩作为展示。
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无论是生化还是分子
初试还是复试
都可能会考察到分子实验
要求大家重视起来
今天就来给大家解析几道常考的
分子生物学实验技术题！
实验一·简答
什么是PCR技术？其原理和步骤是什么？（北京科技大学 2009，西北工业大学 2021）
参考答案
PCR技术是一种体外快速扩增DNA序列的技术。
原理：典型的PCR由高温使DNA变性，两条链解开，引物与模板退火，二者配对，DNA聚合酶以四种dNTP为底物合成与模板链互补的新链。
步骤：（1）设计一对引物以便有效地扩增目的 DNA，并尽可能减少可能出现的非特异性引物。
（2）优化反应体系，以便获得最好的扩增效果，该体系包括：适量模板，引物，四种dNTP，Mg+。
（3）选择三个温度进行热循环，变性：94℃，45-60s；退火：55℃，1min；延伸：72℃，1min，开始时热变性 5-10min，热循环 25-30 个周期，最后延伸10min。
（4）扩增完后取一定量反应物，检测扩增效果。
实验二·简答
三种印迹技术western，southern，northern的原理及步骤区别。（中国科学院 2019）
参考答案
答：印迹（blotting）：将待检测的生物大分子经电泳等方法分离后转移并固定在膜（如：硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜）上，然后用特异性识别物质（如探针）去识别，最后经显色反应（同位素放射自显影、荧光、化学发光等）在膜上显示出结果——印迹。
Southernblot是分析DNA的杂交技术，Northernblot是分析RNA的，而Westernblot是分析蛋白质的。
Southern和Northern原理基本相同，都是利用DNA或RNA的复性过程，但过程上也有区别，主要是Southern是先电泳后变性，而Northern是先变性后电泳；Sourthern是碱变性，而Northern采用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜等变性，因为采用碱变性会导致RNA水解，Southern和Northern是基于DNA和RNA分子之间碱基互补配对的特异性识别能力，而Western则抗原抗体之间的免疫反应。
Southern和Northern时使用带有标记（如同位素标记或荧光标记）的DNA或RNA探针去识别并结合到待检测核酸上，然后直接显影；而Western Blotting时要先用待检测蛋白的“一抗”结合到待检测蛋白上，再用可识别“一抗”并偶联某种没得“二抗”去检测“一抗”，最后通过显色反应的信号来显示待检测蛋白的存在与否及量的多少。
实验三·论述
什么是基因敲除技术，论述利用ES细胞构建基因敲除动物模型的原理、流程及应用。（暨南大学 2019）
参考答案
答：（1）基因敲除技术的概念
基因敲除技术又称基因打靶技术，是指通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除。
（2）利用ES细胞构建基因敲除动物模型
①原理
通常意义上的基因敲除主要利用外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，用设计的同源DNA片段代替靶基因片段来进行精确的定点修饰和基因改造从而达到基因敲除的目的。
②流程
a．重组基因载体的构建
把目的基因和细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因的载体上，成为重组载体。此重组载体即为基因打靶载体，载体包括外源目的基因、同源基因片段及标记基因。基因敲除是为了使某一基因失去生理功能，所以一般设计为替换型载体。
b．ES细胞的获得
目前基因敲除一般采用胚胎干细胞（ES细胞），最常用的动物是小鼠，也可采用兔、猪或鸡等的胚胎干细胞。
c．导入受体细胞
用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入同源的ES细胞中，使外源DNA与ES细胞基因组中相应部分发生同源重组，这样重组载体的DNA序列就整合到内源基因组中，从而得以表达。
d．筛选
用选择性培养基筛选已发生同源重组的细胞，常用的方法有正-负筛选法（最常用）、标记基因的特异位点表达法以及PCR法。
e．表型研究
观察被击中细胞的生物学特征，将已击中的ES细胞转入胚胎使其生长。通过观察嵌合体小鼠的生物学性状的变化进而了解目的基因的变化对小鼠生物学性状的影响，达到研究目的基因的目的。
f．得到纯合体
由于同源重组常发生在一对染色体上的一条染色体中，因此如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。
③应用
通过对生物体染色体基因组遗传信息的定向改造，使改造后的性状表达，并使改造后的遗传信息在生物活体内遗传，从而就能研究基因的功能，阐明生物体的遗传进化，了解疾病发生的分子机制，评价整体动物模型及新型预防、治疗疫苗等。基因敲除技术是后基因组时代基因功能研究的重要技术手段之一。具体应用包括：
a．用于建立生物模型。在基因功能、代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。
b．疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗。通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响，对了解疾病的根源或寻找基因治疗的靶目标有重大的意义。
c．为定向改造生物、培育新的生物品种提供了重要的技术支持。
d．提供廉价的异种移植器官。将异源分子的基因敲除，则动物的器官将能用于人体的疾病治疗。
e．免疫学中的应用。同异源器官移植相似，异源的抗体用于人体时或多或少会有一定的免疫排斥，使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。而如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，则将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。
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