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2024 届高考生物二轮微专题
微专题07 基因工程及应用
一、考向解读（情境链接+真题评析+新题尝鲜）
考向一、同尾酶
考向二、双标记基因与影印接种法
考向三、基因编辑技术
考向四、PCR 技术及其应用
二、专题特训
一、同尾酶
【情境链接】
1.定义：来源不同，识别的碱基序列也不相同，但能切割产生相同末端的限制酶叫同尾酶。所有
平末端酶产生的末端均是相同的，但一般不把它作为同尾酶来研究。因此同尾酶一般是指能产生相同
粘性末端的限制酶。
2.实例：同尾酶中，识别序列不同的限制酶，虽然识别的碱基序列不同，但是切开的黏性末端的
碱基却能够正好相互配对，在DNA 连接酶的作用下能形成重组DNA 分子，如：限制酶BamH Ⅰ识别的碱
基序列为—G↓GATCC—，限制酶Bgl Ⅱ识别的碱基序列为—A ↓GATCT—，限制酶Mbo Ⅰ识别的碱基序
列为—↓GATC—，限制酶BamH Ⅰ切开的DNA 两条链的黏性末端中没有被配对的碱基是GATC—，限制酶
Bgl Ⅱ和限制酶Mbo Ⅰ切开的黏性末端未配对的碱基也都是GATC—。通过比较不难发现这三种限制酶
切得的黏性末端是可以相互配对连接的。类似的情况还有不少，如限制酶Sal Ⅰ与Xho Ⅰ，Hpa Ⅱ与
Taq Ⅰ等。
3.切割后重组原限制酶切割情况：同尾酶识别的靶序列不相同，但能切割产生相同的黏性末端，
因此也可以通过碱基互补配对的形式重组。同尾酶重组后碱基序列与原有两种酶识别的碱基序列均不
同，因此原有的限制酶均不再能够识别这种序列，也就不再能够重新切开。如BamH Ⅰ识别的序列是—
G↓GATCC—，Bgl Ⅱ识别的序列是—A↓GATCT—，而BamH Ⅰ与Bgl Ⅱ切开后的片段重新连接（非自身
连接）后的碱基序列是一条链是—AGATCC—，另一条链则为—GGATCT—，已经不是“回文”序列，无
论是BamH Ⅰ还是Bgl Ⅱ都无法再识别，所以无法再把其切开。
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1
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【真题评析】
1．（2023·重庆·统考高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8 个碱基短于实际长度）获得了含有
目的基因的DNA 片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述
错误的是（ ）
A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇
B．步骤①所用的酶是SpeI 和CfoI
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2 个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli 连接酶或T4连接酶
【答案】B
【分析】E.coliDNA 连接酶只能连接黏性末端；T4DNA 连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。
【详解】A、由于引物只能引导子链从5＇到3＇，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5＇
TGCGCAGT-3＇，A 正确；
B、根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheI 切割形成的，右边的黏性末端是用CfoI 切割形成
的，B 错误；
C、用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheI 和CfoI 进行切割，根据他们的识别位点以及原本DNA 的序
列，切割之后至少获得了2 个片段，C 正确；
D、图中形成的是黏性末端，而E.coliDNA 连接酶只能连接黏性末端；T4DNA 连接酶既可连接平末端，又可
连接黏性末端，D 正确。
故选B。
2．（2023·山西·统考高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3 和酶4）、DNA 连接酶为工具，将
目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限
制酶的切割位点如图所示。
2
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下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
B．质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割，用T4 DNA 连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割，用T4 DNA 连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
【答案】C
【分析】DNA 连接酶：
（1）根据酶的来源不同分为两类：E.coliDNA 连接酶、T4DNA 连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外
T4DNA 连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
（2）DNA 连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
【详解】A、酶3 切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA 连接酶连接，A 错误；
B、质粒用酶3 切割后得到平末端，目的基因用酶1 切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B 错误；
C、质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割后得到黏性末端，用T4 DNA 连接酶连接后，还能保证目的基因在
质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C 正确；
D、若用酶2 和酶4 切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少
标记基因，无法进行后续的筛选，D 错误。
故选C。
3．（2021·山东·统考高考真题）人类γ 基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该
位点结合 BCL11A 蛋白后，γ 基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ 基因表达的抑
制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ 基因上游不同长度的片段，将这些片段分别
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插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图
可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。
本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
（2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达
荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无
荧光的原因是 。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R
扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ 基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的
结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于 ，理由是 。
【答案】 SalI EcoRI 6 F7 与R 扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增
产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上
均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与
F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
【分析】1、据题意可知，科研人员扩增了γ 基因上游不同长度的片段，据图中注释可知，F1~F7 以及R
位置均为引物，故扩增的序列分别是引物F1 和引物R 之间的序列，引物F2 和引物R 之间的序列，引物F3
和引物R 之间的序列，引物F4 和引物R 之间的序列，引物F5 和引物R 之间的序列，引物F6 和引物R 之间
的序列，引物F7 和引物R 之间的序列；
2、据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后
的黏性末端相同，限制酶Xho Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶Sal Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同。
【详解】（1）据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的
扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R 端与荧光蛋白基因中限制
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酶Mun Ⅰ 识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插
入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而
扩增后的产物中可能含有Mun Ⅰ 和 Xho Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限
制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 所识别，故应该选用添加限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，据图中对限
制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相
同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶是EcoR Ⅰ ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是Sal
Ⅰ ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ 的识别位点，故对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割。综
上所述，对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割，对扩增后的产物用限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ
识别序列，然后在DNA 连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq 酶催化，合成
更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6 种酶，分别是Taq 酶、限制酶EcoR Ⅰ 、
限制酶Sal Ⅰ、限制酶Mun Ⅰ 、限制酶Xho Ⅰ 、DNA 连接酶；
（2）受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基
因的表达；基因的表达需要RNA 聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6 与
R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是
F7 与R 扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达；
（3）向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A 基因表达，产生 BCL11A 蛋白， BCL11A
蛋白与BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不
再有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F4 与引物R 之间的序列上；含 F5～F6 与 R 扩增
产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F5 的上游序列，故据此结果可推测，
BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。
【点睛】对基因工程中PCR 技术的掌握，对基因工程的第二步，基因表达载体的构建的过程的分析，双酶
切法的应用，限制酶的作用和切割特点，是解决本题的关键。
【新题尝鲜】
1．金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动物肝脏细胞中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研
人员将MT 基因导入大肠杆菌构建工程菌，利用这一工程菌吸附工业废水中的重金属。回答下列问题：
(1)为获取目的基因，从 中提取mRNA，通过 法获得MTcDNA。MTcDNA 的碱基序列与细胞中
MT 基因的碱基序列 （填“相同”或“不同”）。
(2)为了提高工程菌MT 蛋白的产量，将MT 基因与外源表达增强元件连接（图甲表示引物对应的位置）。
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利用PCR 检测连接是否成功，可选择的引物组合是 （填字母），该PCR 反应体系中需加入
酶。
A．①+③B．①+④C．③+②D．③+④
(3)将改造后的目的基因进行PCR 扩增，得到的片段末端为平末端，而载体E 只有能产生黏性末端的酶切位
点。为了能够将MT 基因与载体E 相连，可以在上述引物的 （填“5′”或“3′”）端添加能产生
黏性末端的限制酶识别序列；也可以借助中间载体P 将MT 基因接入载体E。（图乙表示载体P 和载体E 的
酶切位点及相应的酶切序列）
后者具体操作步骤如下：
①选用 酶将载体P 切开，再用DNA 连接酶将MT 基因与载体P 相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT 基因的 和 。选用 酶组合对载体P′和载体E 进行酶切，
将切下的MT 基因和载体E 用DNA 连接酶进行连接。为了提高获得重组质粒的效率，除了考虑适宜的外界条
件、目的基因的浓度外，还需考虑 （写出两点）。
(4)将重组质粒导入到用 处理的大肠杆菌中完成转化；利用含有 的培养基筛选出MT 工程
菌。
(5)通过检测发现MT 基因已经成功导入大肠杆菌，但该菌不能吸附工业废水中的重金属，可能的原因是：
。
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【答案】(1) 动物肝脏细胞 逆转录/反转录 不同
(2) B TaqDNA 聚合酶/耐高温的DNA 聚合酶
(3) 5′ EcoRV 启动子 终止子 XhoI 和PstI 质粒的浓度、质粒的纯度、DNA
连接酶的浓度DNA 连接酶活性
(4) CaCl2 卡那霉素
(5)转入大肠杆菌中的MT 基因不表达/表达量少/表达不及预期
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）
目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）分析题意，金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动物肝脏细胞中的金属结合蛋白，为获取
目的基因，可从动物肝脏细胞中提取mRNA，通过逆转录（反转录）法获得MTcDNA；MTcDNA 是经过逆转录
得到的，该过程中由于成熟的mRNA 已经经过剪切等过程，不含内含子等非编码序列，故MTcDNA 的碱基序
列与细胞中MT 基因的碱基序列不同。
（2）PCR 扩增时，应选择一对引物，引物需要与模板的3’端结合，本操作中将MT 基因与外源表达增强元
件连接，利用PCR 检测连接是否成功，需要扩增表达增强元件和目的基因，结合题图可知，可选择的引物
组合是①+④ ，故选B；由于PCR 过程中所需温度较高，故PCR 反应体系中需加入TaqDNA 聚合酶/耐高温的
DNA 聚合酶。
（3）PCR 扩增时与引物的3‘端结合，’为了能够将MT 基因与载体E 相连，可以在上述引物的5′端添加
能产生黏性末端的限制酶识别序列。
①PCR 所用的DNA 聚合酶扩增出的M 基因的末端为平末端，则可用EcoRV 酶将载体P 切开，形成平末端，
由于T4DNA 连接酶可以连接平末端，所以用T4DNA 连接酶将M 基因与载体P 相连，构成重组载体P′。
②由于载体P'不具有表达M 基因的启动子和终止子，所以选用XhoI 和PstI 酶组合对载体P'和载体E 进行
酶切，将切下的M 基因和载体E 用DNA 连接酶进行连接，得到含有启动子和终止子的表达载体；为了提高
获得重组质粒的效率，除了考虑适宜的外界条件、目的基因的浓度外，还需考虑质粒的浓度、质粒的纯度、
DNA 连接酶的浓度DNA 连接酶活性等。
（4）将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法，故可将重组质粒导入到用CaCl2处理的大肠杆菌
中完成转化；结合图示可知，重组质粒含有的标记基因是卡那霉素，故利用含有卡那霉素的培养基筛选出
MT 工程菌。
（5）由于转入大肠杆菌中的MT 基因不表达/表达量少/表达不及预期，故通过检测发现MT 基因已经成功导
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入大肠杆菌，但该菌不能吸附工业废水中的重金属。
2．材料一：白细胞表面抗原2（SLA-2）在抗原呈递、机体器官移植以及免疫应答方面有着重要作用。为
进一步研究SLA-2 的结构与功能，科研人员以能稳定传代的猪肾上皮细胞为材料，构建了稳定高表达
SLA-2 基因的细胞株，过程如下图。其中，Ampr 表示氨苄青霉素抗性基因，Puror 为嘌呤霉素抗性基因，
BclI、NotI、XbaI、San3AI 为限制酶酶切位点，括号内数值表示距复制原点的长度。
限制酶
Bcl Ⅰ
Not Ⅰ
Xba Ⅰ
San3A
Ⅰ
识别序列及切割位
点
T↓GATCA
GC↓GGCCGC
T↓CTAGA
↓GATC
材料二：研究中，一般利用最小致死浓度（使某种细胞全部死亡的最小浓度）的嘌呤霉素溶液浸染细胞以
筛选出转化的猪肾上皮细胞。
(1)简要概述材料一中实验过程 。
(2)采用PCR 电泳设计实验鉴定重组质粒3，需包括实验过程以及结论（电泳图） 。
PCR 电泳图：
(3)概述材料二的实验以及判断那种细胞更好，并说明理由 。
【答案】(1)提取细胞总RNA 通过RT-PCR，获得目的基因（SLA-2 基因），质粒1 和目的基因同时使用
Xba Ⅰ和Not Ⅰ两种限制酶进行切割，再使用DNA 连接酶连接，构建重组表达载体，将其导入大肠杆菌细
胞内增殖，提取质粒，再用Xba Ⅰ和Not Ⅰ两种限制酶切割该质粒和质粒2，使用DNA 连接酶连接后获得质
粒3，将其导入猪肾上皮细胞，从中筛选出产抗原肽猪肾上皮细胞。
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(2)PCR 实验过程及结论：①变性：高温解开DNA 的两条链；②复性：引物与解开的DNA 单链进行结合；③
延伸：在Taq 酶的作用下，按照碱基互补配对原则，合成子链DNA，重复上述过程30 个循环后，将PCR 产
物（重组质粒3）用Not Ⅰ和San3A Ⅰ完全酶切获得的序列为963、1277、3305，之后进行电泳，则对应的
电泳如图：
(3)
为确定最小致死浓度，科研人员利用未转化的猪肾上皮细胞进行了相关实验，结果如图，随着嘌呤霉素溶
液浓度的增加，细胞数量在下降，当嘌霉素筛选浓度为4.0μg·mL-1时，细胞数量为0，此时的浓度即为
最佳浓度。根据结果最佳致死浓度既可以让大部分没有抗性的细胞死亡又不会让具有抗性的细胞死亡，在
该浓度下未发生转化的细胞全部死亡，能存活生长的即为已转化的细胞。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）由图可知：实验过程是，提取细胞总RNA 通过RT-PCR，获得目的基因（SLA-2 基因），质粒
1 和目的基因同时使用Xba Ⅰ和Not Ⅰ两种限制酶进行切割，再使用DNA 连接酶连接，构建重组表达载体，
将其导入大肠杆菌细胞内增殖，提取质粒，再用Xba Ⅰ和Not Ⅰ两种限制酶切割该质粒和质粒2，使用DNA
连接酶连接后获得质粒3，将其导入猪肾上皮细胞，从中筛选出产抗原肽猪肾上皮细胞。
（2）PCR 实验过程及结论：①变性：高温解开DNA 的两条链；②复性：引物与解开的DNA 单链进行结合；
③延伸：在Taq 酶的作用下，按照碱基互补配对原则，合成子链DNA，重复上述过程30 个循环后，将PCR
产物（重组质粒3）用Not Ⅰ和San3A Ⅰ完全酶切获得的序列为963、1277、3305，之后进行电泳，则对应
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的电泳如图：
（3）研究中，一般利用最小致死浓度（使某种细胞全部死亡的最小浓度）的嘌呤霉素溶液浸染细胞以筛
选出转化的猪肾上皮细胞。为确定最小致死浓度，科研人员利用未转化的猪肾上皮细胞进行了相关实验，
结果如图，随着嘌呤霉素溶液浓度的增加，细胞数量在下降，当嘌霉素筛选浓度为4.0μg·mL-1时，细胞
数量为0，此时的浓度即为最佳浓度。根据结果最佳致死浓度既可以让大部分没有抗性的细胞死亡又不会
让具有抗性的细胞死亡；在该浓度下未发生转化的细胞全部死亡，能存活生长的即为已转化的细胞。
二、双标记基因与影印接种法
【情境链接】
以培养某种大肠杆菌（如转胰岛素基因大肠杆菌），选择具有标记基因青霉素抗性基因和四环素抗
性基因，同时限制酶切点在青霉素抗性基因内部的质粒作运载体，与目的基因构建表达载体。不考虑多个
DNA 片段的连接、目的基因的自我连接和目的基因的反向连接，将得到两种质粒：原有质粒重新连接而成
的空质粒和重组质粒。将所得质粒与没有青霉素、四环素抗性的大肠杆菌混合、转化，将得到三种大肠杆
菌，即未转化的大肠杆菌、导入空质粒的大肠杆菌和导入重组质粒的大肠杆菌。将所得大肠杆菌培养，增
加数量。然后接种到完全培养基上，得如图所示的6 个菌落。然后，用影印接种法将菌落分别接种到含有
四环素和青霉素的培养基上，培养结果如下图。
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其中2 号、5 号菌落无法在两种培养基上生存，说明所含大肠杆菌没有抗性基因，即所含大肠杆菌为
未转化的大肠杆菌；1 号、4 号、6 号菌落在两种培养基中均能生存，说明其大肠杆菌两种抗性都有，即所
含大肠杆菌为转化了空质粒的大肠杆菌；3 号菌落能做含四环素的培养基上生存，说明其含有四环素的抗
性，不能在含青霉素的培养基上生存，说明不含有青霉素的抗性（抗性基因酶切插入目的基因后丧失其作
用），综合分析其大肠杆菌含有重组质粒。3 号菌落所含大肠杆菌即是要选择培养的大肠杆菌。
【真题评析】
1．（2022·天津·高考真题）研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1 导入谷
氨酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1 中含有KanR（卡那霉素抗性基因）和SacB 两个标记基
因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物 和 ，并在引物的 （5＇∕3＇）端
引入Xho Ⅰ酶识别序列，进行PCR 扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
(2)PCR 扩增载体3 中筛选效率较高的标记基因RpsL（链霉素敏感基因）时，引物应包含
（EcoR Ⅰ∕Hind Ⅲ∕Xho Ⅰ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2 构建高效筛选载体4。
(3)将改进的P1 基因整合到载体4 构建载体5。将载体5 导入链霉素不敏感（由RpsL 突变造成）、卡那霉
素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5 的菌株，应采用含有 的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1 基因脱离载体5 并整合到受体菌拟核DNA，且载体5 上其他DNA 片段
全部丢失。该菌的表型为__________。
A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感
B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C．卡那霉素和链霉素都敏感
D．卡那霉素和链霉素都不敏感
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(5)可采用 技术鉴定成功整合P1 基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
【答案】(1) 1 4 5＇
(2)Xho Ⅰ
(3)卡那霉素
(4)B
(5)PCR
【分析】PCR 反应过程:变性→复性→延伸。变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA 解聚为单链，复性：
温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合，延伸：72℃左右时，Taq 酶有最
大活性，可使DNA 新链由5'端向3'端延伸。
【详解】（1）据图可知，根据引物箭头方向可知，要想复制KanR（卡那霉素抗性基因），需要引物1 和
4，因此为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物1 和4。PCR 时，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端
开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的，因此在引物的5'端引入Xho Ⅰ酶识别
序列。
（2）据图可知，载体4 中RpsL（链霉素敏感基因）的两侧具有Xho Ⅰ酶识别序列，载体3 中不含Xho Ⅰ酶
识别序列，如果将载体2 和载体3 连接形成高效筛选载体4 时，需要的引物应该含有Xho Ⅰ酶识别序列。
（3）基因表达载体中的标记基因，有利于目的基因的初步检测，据题意可知，载体5 中含有RpsL（链霉
素敏感基因）和KanR（卡那霉素抗性基因），将载体5 导入链霉素不敏感（由RpsL 突变造成）、卡那霉
素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5 的菌株，应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。
（4）据题意可知，载体5 导入的是链霉素不敏感（由RpsL 突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌，受体菌
中P1 基因脱离载体5 并整合到受体菌拟核DNA，且载体5 上其他DNA 片段全部丢失，因此该菌的表型为卡
那霉素敏感、链霉素不敏感，B 正确，ACD 错误。
故选B。
（5）通过PCR 技术可以检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA 中或目的基因是否转录出了mRNA，
因此可采用PCR 技术鉴定成功整合P1 基因的菌株。
2．（2019·江苏·统考高考真题）图1 是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0 具有四
环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：
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（1）EcoRV 酶切位点为
，EcoR V 酶切出来的线性载体P1 为 末端。
（2）用TaqDNA 聚合酶进行PCR 扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体
P1 用酶处理，在两端各添加了一个碱基为 的脱氧核苷酸，形成P2；P2 和目的基因片段在
酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3 的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C 三类菌落，
其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是
（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是 、 。
（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR 鉴定。图2 所示
为甲、乙、丙3 条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR 鉴定时应选择的一对引物是 。某学
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生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp 片段，原因是 。
【答案】 平 胸腺嘧啶（T） DNA 连接 B A 类菌落含有P0 C 类菌落未转入质粒
乙丙 目的基因反向连接
【分析】基因表达载体的基本结构包括复制原点、目的基因、标记基因、启动子、终止子等。根据题干信
息和图形分析，P0 是载体质粒，其含有的氨苄青霉素抗性基因（ampr）和四环素抗性基因（tetr）都属于
标记基因，可用于检测目的基因是否导入受体细胞；EcoRV 酶为限制酶，其切割质粒后会破坏四环素抗性
基因（tetr）。
【详解】（1）根据题意分析，EcoRV 酶识别的序列是-GATATC-，并且两条链都在中间的T 与A 之间进行切
割，因此其切出来的线性载体P1 为平末端。
（2）依题意并据图分析，目的基因两侧为黏性末端，且露出的碱基为A，则在载体P1 的两端需要各加一
个含有碱基T 的脱氧核苷酸，以便形成具有黏性末端的载体P2，再用DNA 连接酶将P2 与目的基因连接起来
形成重组质粒P3。
（3）根据以上分析已知，限制酶（EcoRV 酶）切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗
性基因，因此含有重组质粒P3 的菌落在含有四环素的培养基中应该不能生长，而在含有氨苄青霉素的培养
基中能生长，结合表格分析可知，应该选择B 类菌落。根据表格分析，A 类菌落在氨苄青霉素和四环素的
培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C 类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导
入任何质粒。
（4）据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR 技术的原理分析，PCR 鉴定时应该选择的一对引物是乙和
丙；根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物（甲、乙）从某一菌落的质粒中扩增出了400bp
的片段，说明其目的基因发生了反向连接。
【点睛】解答本题的关键是识记并理解基因工程的四个基本步骤，尤其是对核心步骤——构建基因表达载
体步骤的理解，明确基因表达载体的几个必须的成分及其作用，进而结合题干要求分析答题。
3．（2019·天津·统考高考真题）B 基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，
但在卵细胞中不转录。为研究B 基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。
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据图回答：
（1）B 基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中 。
A．含B 基因的染色体缺失 B．DNA 聚合酶失活
C．B 基因发生基因突变 D．B 基因的启动子无法启动转录
（2）从水稻体细胞或 中提取总RNA，构建 文库，进而获得B 基因编码蛋白的序列。
将该序列与Luc 基因（表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光）连接成融合基因（表达的蛋白质能保留两
种蛋白质各自的功能），然后构建重组表达载体。
（3）在过程①、②转化筛选时，过程 中T-DNA 整合到受体细胞染色体DNA 上，过程
在培养基中应加入卡那霉素。
（4）获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是 。
A．将随机断裂的B 基因片段制备成探针进行DNA 分子杂交
B．以Luc 基因为模板设计探针进行DNA 分子杂交
C．以B 基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA 杂交
D．检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
（5）从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵
细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明 。
【答案】 D 精子 cDNA ② ① BCD B 基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成
胚
【分析】基因工程的基本操作程序：
1、目的基因的获取：（1）目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因。（2）获取方法：①从基因文库中获
取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR 技术扩增目的基因。
2、基因表达载体的构建:（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目
的基因能够表达和发挥作用。（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。①启动子：是一段有特殊
结构的DNA 片段，位于基因的首端，是RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得
所需的蛋白质。②终止子：也是一段有特殊结构的DNA 片段，位于基因的尾端。③标记基因的作用：是为
了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗
性基因。
3、将目的基因导入受体细胞:（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳
定和表达的过程。（2）常用的转化方法：常用方法有农杆菌转化法、显微注射技术、Ca2+处理法。（3）
重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
4、目的基因的检测和表达：（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA 上是否插入了目的基因，方法是采
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用DNA 分子杂交技术。（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与
mRNA 杂交。（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗
体进行抗原--抗体杂交。（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性
状。
【详解】（1）通过题干信息可知，B 基因可以在体细胞和精子中，说明含B 基因的染色体未缺失，也没有
发生基因突变，AC 错误；基因表达过程中的转录需要RNA 聚合酶，不是DNA 聚合酶，B 错误；B 基因在卵细
胞中不能转录，可能是B 基因的启动子在卵细胞中不能启动转录，D 正确；故选D。
（2）通过题干信息可知，水稻的体细胞和精子中B 基因可表达，故可从水稻的体细胞和精子中提取RNA。
通过逆转录产生DNA，从而构建cDNA 文库，进而获得B 基因编码蛋白的序列。
（3）图示中过程①表示筛选含有目的基因的重组质粒的农杆菌，图示中质粒有抗卡那霉素标记基因和抗
潮霉素标记基因，如果选择培养基中加入的是卡那霉素，起作用的是抗卡那霉素标记基因。过程②表示用
含有重组质粒的农杆菌转化水稻细胞的过程，该过程将其T-DNA 整合到水稻细胞染色体DNA 上。
（4）获得转基因植株，鉴定筛选方式有：①DNA 分子杂交技术，即以Luc 基因为模板设计探针进行DNA 分
子杂交，故A 错误；B 正确；②用标记的目的基因作探针与mRNA 杂交，即以B 基因编码蛋白的序列为模板
设计探针与从卵细胞提取的mRNA 杂交，C 正确；③检测目的基因是否翻译成蛋白质，通过（2）可知B 基
因与Luc 基因连接形成B-Luc 融合基因，即可通过Luc 基因表达，检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧
光，D 正确；故选BCD。
（5）转基因植株含有促进B 基因在卵细胞转录的启动子，推测转基因植株分离出的只含一个染色体组的胚
是由未受精的卵细胞发育形成的，而非转基因水稻卵细胞中B 基因不能转录，卵细胞在未受精时不进行发
育，由此表明B 基因表达能使卵细胞不经受精作用直接发育成胚。
【点睛】本题考查了基因工程的相关知识，要求考生能够识记基因工程的操作步骤；明确农杆菌转化法在
植物基因工程中的应用；并能够掌握植物组织培养技术的过程等知识。
【新题尝鲜】
1．番茄枯萎病是番茄主要病害之一。研究人员拟从新鲜蚯蚓粪中筛选出对番茄枯萎病有良好抑制效果的
甲细菌，以期为番茄枯萎病提供生物防治。将蚯蚓粪加入无菌水中制成悬浮液，利用营养琼脂培养基
（NA）进行分离后，将获得的不同甲菌株分别接种至细菌营养肉汤培养基（NB）。培养48h 后，进行“平
板对峙实验”【该实验的操作：在有马铃薯葡萄糖培养基（PDA）的空白平板一侧放置一直径为5mm 番茄枯
萎病菌的菌块，在平行另一侧放置直径5mm 的经过处理（滴加甲菌液或清水）的滤纸片】，每组做3 次重
复，实验流程见图1．
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(1)将3g 采集的蚯蚓粪加入盛有 mL 无菌水的三角瓶中，充分振荡，即成10-2稀释液，步骤I 使用的接
种方法是 ，实验流程先I 后Ⅱ的目的是 。
(2)以下对“平板对峙实验”的叙述，正确的有哪些？
A．对照组滤纸片用无菌水处理
B．实验组滤纸片用甲菌菌液处理
C．放置滤纸后随即测量并计算抑制率
D．该实验结果不能说明抑菌效果
(3)已知筛选的甲菌株能合成并分泌一种能抑制番茄枯萎病菌生长的细胞壁降解酶（PMG）。现研究人员获
取得到PMG 基因，并将其导入番茄细胞中，预期得到抗枯萎病的转基因植株。含PMG 基因的DNA 片段、Ti
质粒的结构及限制酶切割位点如图2 所示。
①大量扩增PMG 目的基因可以用 （中文名称）技术，扩增时所用的直接能源物质是 。
②根据图2 信息，将PMG 基因与Ti 质粒构建重组DNA 分子时，应选用的限制酶是 。
③将农杆菌放于 的CaCl2溶液中处理，使其变为感受态细胞，再在低温条件下将农杆菌与重组质粒混
合，最后进行短暂的 处理，该短暂处理的目的是 。将农杆菌涂布接种于添加有 的LB 固体培养
基上筛选含有重组质粒的农杆菌。用阳性农杆菌感染植物细胞，目的基因就会随 整合到植物染色体DNA
中，最后通过 技术培育出完整的转基因植株。
④为确定转PMG 基因番茄植株能抗枯萎病，在个体水平上的检测方法是 。
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【答案】(1) 297 平板划线法 先分离纯化，再扩大培养
(2)AB
(3) 聚合酶链式反应 dNTP BamHI 和Hind Ⅲ 低温、低浓度 热刺激#加热#热
使外源DNA 分子更容易进入农杆菌，提高转化效率 氨苄青霉素 T-DNA 植物组织培养或者组
培 用番茄枯萎病菌感染转PMG 基因的番茄植株，观察其抗病情况
【分析】分析图形：Ⅰ为接种，根据NA 培养基是菌落的形态可知，接种的方法为平板划线法；Ⅱ为将NA
培养基中获取的不同菌株分别接种至NB 培养基；Ⅲ为接种后进行平板对峙实验。
【详解】（1）为了将原液稀释10-2，可将3g 采集的蚯蚓粪加入盛有297mL 无菌水的三角瓶中，充分振荡。
据图可知，NA 培养基中是各种线的分布，故步骤Ⅰ使用的接种方法是平板划线法。Ⅰ为接种，Ⅱ为将NA
培养基中获取的不同菌株分别接种至NB 培养基，实验流程先I 后Ⅱ的目的是先分离纯化，再扩大培养。
（2）AB、本实验的目的是探究甲菌菌液是否对番茄枯萎病有良好抑制，故实验组滤纸片用甲菌菌液处理，
对照组滤纸片用无菌水处理，AB 正确；
C、由于对照组没有用甲菌菌液处理，故培养至对照组枯萎病菌菌落长满时，通过对滴加甲菌菌液的实验
组统计后，开始测量并计算抑制率，C 错误；
D、通过对比对照组和实验组的实验结构，可以说明该实验的抑菌效果，D 错误。
故选AB。
（3）①PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA 片段的核酸合成技术，目的基因可
以用聚合酶链式反应技术进行大量扩增。PCR 技术扩增时所用的直接能源物质是dNTP，dNTP 转变为脱氧核
苷酸过程中，脱去磷酸基团，释放特殊化学键中的能量。
②由图2 可知，两个标记基因上均有Bcl I 的识别位点，所以不能用Bcl I，而质粒上无KpnI 的识别位点，
所以构建表达载体应选用BamHI 和Hind Ⅲ。
③将农杆菌放在低温（高温对细菌不利）、低浓度的CaCl2溶液中（低浓度能避免细胞失水），使细胞膜
的通透性改变，成为感受态细胞，该状态为容易从周围环境中吸收外源DNA 的状态，进而可提高转化效率。
最后进行短暂的热刺激处理，使外源DNA 分子更容易进入农杆菌，提高转化效率。卡那霉素抗性基因被限
制酶Hind Ⅲ破坏，因此将农杆菌涂布接种于添加有氨苄青霉素的LB 固体培养基上筛选含有重组质粒的农
杆菌。用农杆菌感染植物细胞时，目的基因会随T-DNA 整合到植物染色体DNA 中，最后通过植物组织培养
技术培育出完整的转基因植株。
④为确定转PMG 基因番茄植株能抗枯萎病，在个体水平上检测为用番茄枯萎病菌感染转PMG 基因的番茄植
株，观察其抗病情况。
2．表观遗传调节异常是肿瘤发生发展的重要因素之一，N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA 上最常见的
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一种修饰。研究发现，胃癌细胞中存在m6A 去甲基化酶（ALKBH5）过表达和STC2（癌症相关基因）mRNA 的
m6A 修饰水平降低的异常现象。科研人员利用基因工程技术实现ALKBH5 基因沉默和STC2 基因的过表达，
以研究ALKBH5 介导的m6A 甲基化修饰对胃癌细胞迁移的影响。
(1)已知STC2 基因的α 链为转录的模板链，据图1 分析，利用PCR 扩增目的基因时，需要在引物
的5′端添加BamH Ⅰ识别序列和强启动子序列，在引物 的5′端添加Sac Ⅰ识别序列。目的基
因两端用不同限制酶切割的原因是 。
(2)为确保目的基因正确插入质粒，需要选择 限制酶切割质粒。将重组质粒导入大肠杆菌时，
可利用潮霉素和卡那霉素筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，试简要表述筛选思路： 。
(3)研究人员分别用不同方式处理胃癌细胞，并测得胃癌细胞迁移标志蛋白含量如下：
根据结果推测ALKBH5 基因影响胃癌迁移的机理是 。
【答案】(1) C B 可以减少目的基因及质粒的自身环化、使目的基因定向连接到质粒上，以
增大目的基因正向（正确）连接的概率
(2) BamH Ⅰ、Sac Ⅰ 依次使用含卡那霉素的培养基和含潮霉素的培养基筛选，能够在含卡那霉素
培养基中生长，而不能在含潮霉素培养基中生长的大肠杆菌即为导入重组质粒的大肠杆菌
(3)ALKBH5 基因过表达导致STC2 基因表达的mRNA 去甲基化，进而导致STC2 基因过表达而引起癌细胞迁移
【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受
体细胞、目的基因的检测与鉴定。
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【详解】（1）据图1 分析，利用PCR 扩增目的基因STC2 时，在DNA 复制过程中，子链的延伸方向是从5′
端到3′端，且STC2 基因的α 链为转录的模板链，需要在引物C 的5′端添加BamHI 识别序列和强启动子
序列，在引物B 的5′端添加SacI 识别序列。目的基因两端用不同限制酶切割的原因是：可以减少目的基
因及质粒的自身环化、使目的基因定向连接到质粒上，以增大目的基因正向（正确）连接的概率。
（2）图1 显示，目的基因STC2 的两侧有BamH Ⅰ、Sac Ⅰ的识别位点，二者且不会把强启动子切割掉，因
此为确保目的基因正确插入质粒，需要选择BamH Ⅰ、Sac Ⅰ限制酶切割质粒。将重组质粒导入大肠杆菌时，
可利用潮霉素和卡那霉素筛选出导入重组质粒的大肠杆菌。由于限制酶BamH Ⅰ和Sac Ⅰ破坏了潮霉素抗性
基因，故可依次使用含卡那霉素的培养基和含潮霉素的培养基筛选，能够在含卡那霉素培养基中生长，而
不能在含潮霉素培养基中生长的大肠杆菌即为导入重组质粒的大肠杆菌。
（3）根据结果可知，ALKBH5 基因沉默会减少癌细胞迁移量，STC2 基因过表达会恢复癌细胞迁移量。因此
推测ALKBH5 基因过表达导致STC2 基因表达的mRNA 去甲基化，进而导致STC2 基因过表达而引起癌细胞迁
移。
三、基因编辑技术
【情境链接】
1.定义：CRISPR/Cas9 基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引
导核酸内切酶Cas9 到一个特定的基因位点进行切割(如图)。CRISPR 复合体中sgRNA 的主要功能是与靶向
基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9 蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
2．作用：从功能上来看，CRISPR/Cas9 系统相当于基因工程中的限制酶，该系统广泛存在于细菌中，
作用是切割外源DNA，使之失效，起到保护自身的目的(或抵抗外源DNA 的入侵，保护自身或清除入侵的病
毒DNA)。
3．优点：若用CRISPR/Cas9 基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，避免了因目的基
因随机插入宿主细胞DNA 引起的生物安全性问题。
4．特异性：CRISPR/Cas9 基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”，sgRNA 的识别序列越
短，特异性差，容易与其他片段结合造成编辑出错，基因编辑的脱靶率越高。
【真题评析】
1．（2021·浙江·统考高考真题）采用CRISPR/Cas9 基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基
因定点插入到受精卵的Y 染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配，通过观
察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是（ ）
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A．基因编辑处理的受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液
B．基因编辑处理的受精卵经体外培养至2 细胞期，须将其植入同期发情小鼠的子宫，才可获得表达
EGFP 的小鼠
C．分离能表达EGFP 的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
D．通过观察早期胚胎的荧光，能表达 EGFP 的即为雄性小鼠胚胎
【答案】B
【分析】分析题意可知，通过基因编辑技术将EGFP 基因定点插入到受精卵的Y 染色体上，使含有该Y 染色
体的小鼠能够发出绿色荧光，转基因鼠将Y 染色体传递给子代的雄性个体，通过观察荧光可确定早期胚胎
的性别。
【详解】A、依据胚胎在不同发育阶段对培养条件的特定需要，受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚
胎需用不同成分的培养液，A 正确；
B、基因编辑处理的受精卵一般经体外培养至桑椹胚或囊胚阶段，进行胚胎移植，可获得表达EGFP 的小鼠，
B 错误；
C、分离能表达EGFP 的胚胎干细胞，通过核移植、早期胚胎培养、胚胎移植等技术，可获得大量的转基因
小鼠，C 正确；
D、由分析可知，通过基因编辑技术将Y 染色体用绿色荧光蛋白基因标记，通过观察早期胚胎的荧光，能表
达EGFP 的个体含有Y 染色体，即为雄性小鼠胚胎，D 正确。
故选B。
2．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一
种新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB 法）。图1 与图2 分别是利用常规转化法
和CDB 法在某植物中递送基因的示意图。
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回答下列问题。
(1)图1 中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长
素和 ，该过程还需要光照，其作用是 。
(2)图1 中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A 的 。图1 中，
含有外源基因的转化植株A 若用于生产种子，其包装需标注 。
(3)图1 与图2 中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。
(4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS 基因的CRISPR/Cas9 基因编辑载体
（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2 中的CDB 法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得
转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ，图2 中，鉴定导入幼苗中的基因编
辑载体是否成功发挥作用的方法是 ，依据是 。
(5)与常规转化法相比，采用CDB 法进行基因递送的优点是 （答出2 点即可）。
【答案】(1) 脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要
(2)遗传特性 转基因标识
(3)Ti 质粒中的T-DNA 能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA 整合到一起
(4) 荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根 观察幼苗是否表现出白化特征 PDS 缺失会导
致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS 基因的敲除
(5)操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
【分析】植物组织培养过程是：离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织，然后再分化生成根、
芽，最终形成植物体。植物组织培养依据的原理是植物细胞的全能性。
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【详解】（1）图1 中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于脱分化过程，该过程的本质是使细胞失去原来
特定的结构和功能；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和细胞分裂素，这两种激素的比值
能调控愈伤组织的分化方向，该过程还需要光照，因为叶绿素的形成需要光；且叶绿体利用光能制造有机
物，供试管苗生长发育。
（2）图1 中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A 的遗传特性。图
1 中，含有外源基因的转化植株A 若用于生产种子，其包装需标注转基因种子，即进行转基因标识。
（3）图1 与图2 中，农杆菌侵染植物细胞时，利用了农杆菌含有的Ti 质粒的作用，Ti 质粒中的T-DNA 能
将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA 整合到一起。
（4）已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS 基因的CRISPR/Cas9 基因编辑载
体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2 中的CDB 法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获
得转化植株B，该过程中通过荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根即为阳性毛状根段，图2 中，鉴定
导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是观察幼苗是否表现出白化特征，因为PDS 缺失会导
致植株白化，而白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS 基因的敲除。
（5）与常规转化法相比，采用CDB 法进行基因递送的优点主要表现在操作方法简单，不需要借助植物组织
培养技术进行操作，且培养周期较短。
3．（2021·海南·高考真题）CRISPR/Cas9 是一种高效的基因编辑技术，Cas9 基因表达的Cas9 蛋白像一
把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA 双链以敲除目标基因或插入新的基因。
CRISPR/Cas9 基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9 重组质粒，需对含有特定sgRNA 编码序列的DNA 进行酶切处理，然后将
其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是 。
(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是 。
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(3)过程③~⑤中，SgRNA 与Cas9 蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA 可识别并与目标DNA 序列特异性结
合，二者结合所遵循的原则是 。随后，Cas9 蛋白可切割 序列。
(4)利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除一个长度为1200bp 的基因，在DNA 水平上判断基因敲除是否成功
所采用的方法是 ，基因敲除成功的判断依据是 。
(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9 质粒中获得重组
质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA 中，构建得到能大
量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9 重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组
DNA 的编辑过程： 。
【答案】(1)DNA 连接酶
(2)感受态细胞法/Ca2+处理法
(3) 碱基互补配对 目标（目的）DNA（基因）
(4) DNA 分子杂交技术 经编辑过的DNA 片段（从受体细胞中提取的基因组DNA）与标记的目标
（对应）基因（探针）杂交，若无杂交带，则敲除成功
(5)表达Cas9 蛋白和sgRNA，两者形成复合体；sgRNA 识别并结合目标DNA 序列；引导Cas9 蛋白切割目标
DNA 序列
【分析】基因工程技术的基本步骤包括目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；
目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA 连接酶，限制酶负责切割，DNA 连接酶负责连接，因
此为构建CRISPR/Cas9 重组质粒，需对含有特定sgRNA 编码序列的DNA 进行酶切处理，然后将其插入到经
相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA 连接酶。
（2）大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（3）根据题图可知：在CRISPR/Cas9 基因编辑技术中，SgRNA 是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导
Cas9 切割与SgRNA 配对的靶基因DNA 序列。Cas9 能借助SgRNA 分子与目标DNA 进行特异性结合的原因在于
SgRNA 分子上的碱基序列与目标DNA 分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现SgRNA 与目标DNA 特
定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9 在功能上属于限制酶，可切割目标DNA 特定的核苷酸序列。
（4）可利用DNA 分子杂交技术判断基因敲除是否成功，即利用经编辑过的DNA 片段（从受体细胞中提取的
基因组DNA）与标记的目标（对应）基因（探针）杂交，若无杂交带，则敲除成功。
（5）根据图示可知：CRISPR/Cas9 重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的
产物是Cas9 蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA 可识别并与目标DNA 序列特异性结合，引导Cas9
蛋白切割目标DNA 序列。
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【新题尝鲜】
1．CRISPR/Cas9 是目前应用最广泛的基因组编辑技术，能对DNA 分子中的基因进行编辑，引入人们想要的
基因或破坏已有的基因。使用该技术，需要向要进行编辑的细胞中加入以下主要组分：人工合成的向导
RNA 和一种来自细菌的核酸酶Cas9 蛋白。其原理是向导RNA 与DNA 分子中希望被编辑的序列通过碱基互补
配对结合后，Cas9 蛋白再结合上去对与向导RNA 结合的DNA 进行切割，使DNA 双链断裂，过程如下图所示。
回答下列问题：
(1)据图推测，向导RNA 的作用是 ；Cas9 蛋白的作用是 。
(2)当DNA 双链断裂后，可导入目的基因，目的基因的导入往往需要利用基因工程方法构建基因表达载体，
基因表达载体上除了含有目的基因和标记基因，还必须有 、 。
(3)目的基因在与运载体结合前需要用PCR 技术进行大量扩增，该过程需要 酶，该酶与普通DNA 聚
合酶相比，其特点是 。
(4)与传统的限制酶切割基因技术相比，CRISPR/Cas9 基因编辑技术的明显优点是 。
【答案】(1) 能与特定的DNA 分子进行碱基互补配对，引导Cas9 蛋白定点切割DNA 识别并定点
切割DNA，使DNA 双链断裂
(2)启动子 终止子
(3)TaqDNA 聚合酶 耐高温
(4)定点编辑基因，实验操作更加精准、高效
【分析】1、绝大多数氨基酸都有几个密码子，这一现象称作密码子的简并。
2、基因表达载体的组成是：目的基因、启动子、终止子、标记基因，其中启动子位于基因的首端，是RNA
聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
3、分析题图：CRISPR 基因转录的sgRNA 可指引Cas9 到一个特定的基因位点进行切割，使相应部位的核苷
酸之间的磷酸二酯断裂。
【详解】（1）根据图示可知，向导RNA 能够与目标DNA 的部分碱基序列配对，进而特异性识别细胞核DNA
分子中的有关序列，向导RNA 可指引Cas9 结合到特定的切割位点，Cas9 在特定切割位点进行切割，使相
应部位的核苷酸之间的磷酸二酯断裂，最终DNA 双链断裂，故向导RNA 的作用是能与特定的DNA 分子进行
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碱基互补配对，引导Cas9 蛋白定点切割DNA；Cas9 蛋白的作用是识别并定点切割DNA，使DNA 双链断裂。
（2）基因表达载体上除了含有目的基因和标记基因，还必须有启动子、终止子。
（3）目的基因在与运载体结合前需要用PCR 技术进行大量扩增，该过程需要TaqDNA 聚合酶，与普通DNA
聚合酶相比，其特点是耐高温。
（4）利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术将目的基因导入受体细胞，可使目的基因精确定点敲入，实验操作更
加精准、高效。
2．研究表明羊乳中的β-乳球蛋白（BLG）是人体主要过敏源，图为研究人员利用基因编辑技术敲除山羊
中BLG 基因同时敲入人乳铁蛋白（hLF）基因并获得转基因山羊的操作过程。
图中sgBLG /Cas9 复合物中，sgBLG 为能准确识别图中山羊DNA 特定序列的RNA，并引导Cas9 蛋白对DNA
进行切割。检测发现过程②中，hLF 基因成功插入在母羊乙成纤维细胞中的一条常染色体上。
(1)上述操作过程中的目的基因是 ，获得该目的基因的主要方法是 。
(2)Cas9 蛋白类似于基因工程中常用到的 酶，但Cas9 蛋白特性与该酶的区别是 。
(3)图中复合物1 所识别的DNA 序列为5’-TATACTGGC-3’，则sgBLG 的序列为 。（单选）
A．5’-AUAUGACCG-3’
B．5’-GCCAGTATA -3’
C．5’-ATATGACCG-3’
D．5’-GCCAGUAUA-3’
(4)下列①—⑥生物技术中，过程①②运用到的技术有 ，过程③④⑤中，运用到的技术有 。
（编号选填）
①显微注射技术②动物细胞培养技术③胚胎移植技术④DNA 重组技术⑤动物细胞融合技术⑥细胞核移植技
术
(5)与图中获得的转基因山羊性状最相似的是母羊 。（单选）
A．甲
B．乙
C．丙
D．丁
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(6)科研团队想进一步获得纯合能稳定遗传“人乳铁蛋白基因”的转基因山羊，其技术路线的设计思路是
。
【答案】(1)人乳铁蛋白基因 PCR 技术
(2)限制性内切核酸酶 Cas9 蛋白没有限制性内切核酸酶具有专一识别DNA 分子特定核苷酸序列的特性
(3)D
(4) ①④ ②③⑥
(5)B
(6)用图中获得的转基因山羊与普通山羊进行得到子代，通过基因检测，筛选出带有目的基因的雌雄子代
进行杂交获得含人乳铁蛋白基因的纯合子代；通过图相关流程，分别选择雌雄个体作为目的基因受体细胞
的供体，从而获得含有人乳铁蛋白基因雌、雄转基因山羊，然后进行杂交来获得含人乳铁蛋白基因的纯合
子代
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目
的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效
的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②检测目的
基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体
水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）依据题意：利用基因编辑技术敲除山羊中BLG 基因同时敲入人乳铁蛋白（hLF）基因并获得
转基因山羊，可知目的基因是人乳铁蛋白基因。PCR 技术可以体外扩增人乳铁蛋白基因，从而获得更多数
量的人乳铁蛋白基因。
（2）题干中“引导Cas9 蛋白对DNA 进行切割”，说明Cas9 蛋白可以切割DNA 分子，所以与限制性内切核
酸酶作用类似。sgBLG 为能准确识别图中山羊DNA 特定序列的RNA，并引导Cas9 蛋白对DNA 进行切割，说
明Cas9 蛋白没有限制性内切核酸酶具有专一识别DNA 分子特定核苷酸序列的特性。
（3）sgBLG 为能准确识别图中山羊DNA 特定序列的RNA，转录的方向是从DNA 模板的3’到5’，因此转录
产生的RNA 序列是5’-GCCAGUAUA-3’，故选D。
（4）过程①是将目的基因插入到母羊乙成纤维细胞中的一条常染色体上，此过程涉及DNA 重组技术，过程
②是将重组DNA 分子导入母羊乙成纤维细胞中，重组DNA 分子导入动物细胞一般使用显微注射技术，故选
①④。③④⑤是将含有目的基因的受体细胞通过核移植技术获得重组细胞，再通过动物细胞培养技术获得
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早期胚胎，最后通过胚胎移植技术获得转基因山羊，故选②③⑥。
（5）转基因山羊几乎所有的核DNA 都来自母羊乙，因此与图中获得的转基因山羊性状最相似的是母羊乙。
（6）获得纯合能稳定遗传“人乳铁蛋白基因”的转基因山羊，其技术路线的设计思路是用图中获得的转
基因山羊与普通山羊进行得到子代，通过基因检测，筛选出带有目的基因的雌雄子代进行杂交获得含人乳
铁蛋白基因的纯合子代；通过图相关流程，分别选择雌雄个体作为目的基因受体细胞的供体，从而获得含
有人乳铁蛋白基因雌、雄转基因山羊，然后进行杂交来获得含人乳铁蛋白基因的纯合子代。
四、PCR 技术及其应用
【情境链接】
1.PCR 技术与病毒检测
新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光 PCR 鉴定。实时荧光 PCR 扩增目的基因，需额外添加
荧光标记探针(一小段单链 DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在
PCR 过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA 聚合酶水解，R 与Q 分离后，R 发出的荧光可被检测到(如
图甲)，通过实时荧光PCR 检测新型冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙。
2. 基因定点突变与基因改造
重叠延伸PCR 技术是一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图
中的引物2 和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA 片
段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和
治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR 技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47 位
的天冬酰胺
(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理见图。
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【真题评析】
1．（2023·浙江·统考高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生
型小鼠Gata3 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以
期获得Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2
用于PCR 扩增，PCR 产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子无法控制GFP 基因的表达
B．翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C．2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
【答案】B
【分析】PCR 技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA 复
制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP 基因整合Gata3 基因的右侧，启动子启动转录后，可以使
GEP 基因转录，Gata3 基因的启动子能控制GFP 基因的表达，A 错误；
B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA 从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译
时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白，B 正确；
C、整合GFP 基因后，核酸片段变长，2 号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP 基因纯合子，4 号个体只有
小片段，是野生型，C 错误；
D、用引物1 和引物3 进行PCR 扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好的区分片段，D 错误。
故选B。
2．（2022·辽宁·统考高考真题）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5 是我国自主研发的转基因品种。为给监
管转基因生物安全提供依据，采用PCR 方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（
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）
A．预变性过程可促进模板DNA 边解旋边复制
B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
【答案】B
【分析】PCR 过程为：①变性，当温度上升到90℃以上时，氢键断裂，双链DNA 解旋为单链；②复性，当
温度降低到50℃左右是，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合；③延伸，温度上升到72℃左右，
溶液中的四种脱氧核苷酸，在DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA 链。
【详解】A、预变性是使模板DNA 充分变性，A 错误；
B、后延伸过程后延伸是为了让引物延伸完全并让单链产物完全退火形成双链结构，可使目的基因的扩增
更加充分，B 正确；
C、延伸过程需引物参与，C 错误；
D、转基因品种不只需要检测是否含有目的基因，还要检测是否表达，还有安全性问题，D 错误；
故选B。
3．（2023·江苏·统考高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构
建质粒，如图1 所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的
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不同是 。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R 应在下列选项中选用______。
A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过
程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300 个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
【答案】(1) 模板（片段F1、片段F2）、引物 退火温度
(2)CD
(3)限制性内切核酸酶（限制酶）
(4)ABC
(5)P3、P4
(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的碱基序列
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【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因——
DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋
白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）PCR 反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR 扩
增片段F1 与片段F2 时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR 过程需要
两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。不同的PCR 反应体系中，模板和引物
是不同的：扩增 程序中依据不同引物设置不同的退火温度是最重要的环节，恰当地选择退火温度，尽量
避免引物与 模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。而对于延伸时间而言，以常用的Taq DNA
聚 133 合酶为例，催化DNA 延伸的速度为1000~2000 bp/min，通常在实验室中可根据目的片段大小在
30s~2min 的时长内大致设置廷伸时间，一般不雪要精确控制。
（2）由图1 可知，引物F2-F 用于扩增F2 片段，引物F1-R 用于扩增F1 片段，C 选项中5'-GACGAG-3'能与
AnBI 中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F 选用C。D 选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP 中的右
侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R 选用D。
（3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性
末端，之后再用DNA 连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，
由于PCR 产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内切核
酸酶（限制酶）和DNA 连接酶。
（4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于
30，A 错误；
B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B 错误；
C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，
故不会出现大量杂菌形成的菌落，C 错误；
D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落
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无需进一步划线纯化，D 正确。
故选ABC。
（5）EGFP 为720bp，AnBI 为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA 分子的大小，无法确定待检测DNA 分子的碱基序列，因
此对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
【新题尝鲜】
1．成纤维细胞生长因子21 (FGF21) 是一种调节机体代谢的分泌型蛋白，具 有降低血糖、提高胰岛素
敏感性等生理活性。但由于 FGF21 稳定性差，导致 FGF21 药效较差。科研人员以含有 FGF21 基因
(F) 的重组质粒 pSUMO-FGF21(p-F)为 模板，对 F 进行定点突变，构建含突变基因的突变质粒
pSUMO-mmtFGF21(p-mF)， 从而实现对FGF21 的改造，部分过程如下图所示。
回答下列问题：
(1)改变FGF21 中的氨基酸，使某两个氨基酸R 基之间形成共价键，可提高FGF21 的 稳定性。这首先需
要在数据库中检索 FGF21 的氨基酸序列和 ，据此设计 并对蛋白质结构进行模拟验
证。
(2)通过PCR 可实现对FGF21 基因 (F)的定点突变。
①应选择下图中的哪对引物进行定点突变
A．1 和4 B．2 和 3 C．1 和 3 D．2 和4)
②突变引物长度不能过短，否则会由于 ，突变失败。
③将引物、 p-F、缓冲液、无菌水、 DNA 聚合酶和 等加入微量离心管中，构 成PCR 体系进行
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反应。
(3)限制酶DpnI 可识别并切割腺嘌呤被甲基化的5'-GATC-3'序列。选择突变质粒时， 将
Dpn I 与 PCR 产物混合，置于37℃下处理1h， 可使 p-F 被切割而p-mF 不被 切割，原因
是 。为确保p-F 被充分切割，可适当增加酶量或 。
(4)在转化大肠杆菌时，用低温和 CaCl 溶液处理大肠杆菌细胞，使其成为
₂
细胞， 与酶切产
物混合后置于冰上30 分钟，再通过短暂热刺激处理，使质粒进入细胞中。 最后取适量菌液涂布在
(填“含”或“不含”)背霉素的平板上进行筛选。 当平板上长出菌落则表明发生了突变。为证实这一
结果，可随机挑取单菌落抽提质粒并进行 。
【答案】(1) 基因序列 突变位点
(2) B 特异性下降 dNTP
(3) p-F 的腺嘌呤被甲基化而 p-mF 的腺嘌呤没有被甲基化 适当延长处理时间
(4) 感受态 含 测序
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：
①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；
②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；
③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活
性鉴定等。
【详解】（1）改变FGF21 中的氨基酸，这首先需要在数据库中检索 FGF21 的氨基酸序列和基因序列，据
此设计基因序列的突变位点，进而改变氨基酸的序列，并对蛋白质结构进行模拟验证。
（2）①在该图中，应选择引物2 和3 进行定点突变，因为引物2、3 识别的序列内具有突变序列。
②突变引物长度不能过短，否则会由于DNA 序列的特异性下降，与模板序列的碱基差距过大，无法与模板
序列进行碱基配对导致突变失败。
③PCR 反应体系包括将引物、 p-F、缓冲液、无菌水、 DNA 聚合酶和dATP、dGTP、dTTP、dCTP，即还需
要dNTP。
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（3）由于限制酶DpnI 可识别并切割腺嘌呤被甲基化的5'-GATC-3'序列，选择突变质粒时， 将Dpn I 与
PCR 产物混合，置于37℃下处理1h， 可使 p-F 被切割而p-mF 不被 切割，原因是p-F 的腺嘌呤被甲基
化而 p-mF 的腺嘌呤没有被甲基化。
（4）用低温和CaCl2溶液处理大肠杆菌细胞，使大肠杆菌成为感受态细胞；使重组质粒进入细胞后，因为
重组质粒含有青霉素抗性基因，如果重组质粒进入细胞，并能正常表达，则该细胞具有青霉素抗性，因此
取适量菌液涂布在含青霉素的平板上进行筛选；为证实平板上长出菌落发生了突变，可随机挑取单菌落抽
提质粒并进行测序，明确突变基因是否位于质粒上。
8．人绒毛膜促性腺激素（HCG）是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，由a 链和β 链
（hCGβ）结合而成。近年研究显示，hCGβ 也可表达于结肠癌等多种恶性肿瘤细胞，与肿瘤的发生、发展
及转移有一定关系。研发抗hCGβ 疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图1 为其制备的基本方案。
(1)构建基因表达载体。图中获取hCGβ 基因的方法属于. ，hCGβ 基因需要与甲序列一起构建形成
融合基因，其目的是 。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，在重组酶作
用下发生同源切割，将目的基因直接插入。本方案中研究人员运用同源切割的方式在hCGβ 基因两端加上
一组同源序列A、B，然后将hCGβ 基因与线性质粒载体混合后，在重组酶和DNA 连接酶的作用下可形成环
化质粒。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶是 。
(2)扩增基因表达载体。阶段Ⅱ将环化质粒导入用 处理的大肠杆菌，然后在含有 的培养基
中筛选得到含hCGβ 基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。
(3)鉴定基因表达载体。为了检验目的基因是否融合成功，提取大肠杆菌中的质粒为模板，设计相应的引
物对融合基因进行PCR，再将扩增产物进行电泳。电泳时需将待测样品与上样缓冲液混合后加入加样孔，
缓冲液中含有的溴酚蓝作为电泳指示剂，以防 。电泳后得到图2 所示结果，据图可判断 号
样品最符合要求。
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(4)导入受体细胞。阶段IV 时，需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些
成分 （A．氨苄青霉素B．组氨酸C．无机盐D．琼脂），可在此培养基上生长的酵母菌即为含有
hCGβ 基因表达载体的目的菌株。
(5)目的基因检测与鉴定。转化成功后的酵母菌菌株接种到液体培养基中，30℃恒温摇床上培养后获得培
养物。将培养物离心后分出细胞和培养液两部分，细胞经 处理后，再次离心取上清液，用抗hCGβ
单克隆抗体分别进行检测。若培养液及上清液中均能检测到hCGβ 蛋白，则说明 。
(6)发酵罐生产。从生产控制的角度分析，选用AOX1 作为hCGβ 基因启动子的优势在于 。
【答案】(1) 化学合成法 有利于hCGβ 进入内质网中加工，并分泌到细胞外 限制酶
(2) CaCl2 氨苄青霉素
(3) 条带迁移出凝胶 3
(4)AB
(5) 破碎 hCGβ 基因在酵母菌细胞中得到表达，并能分泌到细胞外
(6)可以通过控制培养液中甲醇的有无，来控制hCGβ 基因的表达hCGβ 蛋白的合成
【分析】图示Ⅰ为基因表达载体的构建过程，Ⅱ是将重组DNA 导入大肠杆菌，Ⅲ是提取并鉴定所需要的重
组质粒，Ⅵ是将选择的重组质粒导入酵母菌内，Ⅴ是筛选符合要求的酵母菌，Ⅵ是提取目的基因的产物。
【详解】（1）根据题图可知，图示获取hCGβ 基因是通过查询基因数据库中hCGβ 的基因序列后通过人工
合成的。甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔，因此hCGβ 基因需要与甲序列一
起构建形成融合基因，其目的是有利于hCGβ 进入内质网中加工，并分泌到细胞外。传统重组质粒构建过
程需要使用限制酶和DNA 连接酶，而该过程是运用同源切割的方式在hCGβ 基因两端加上一组同源序列
A、B，然后将hCGβ 基因与线性质粒载体混合后，在重组酶和DNA 连接酶的作用下可形成环化质粒，该过
程没有使用限制酶。
（2）将重组质粒导入大肠杆菌时，应先用CaCl2处理大肠杆菌，使其成为感受态。由于线性质粒上含有氨
苄青霉素基因，因此导入环化质粒的大肠杆菌具有氨苄青霉素抗性，因此应在含有氨苄青霉素的培养基中
筛选得到含hCGβ 基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。
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（3）电泳时需将待测样品与上样缓冲液混合后加入加样孔，缓冲液中含有的溴酚蓝作为电泳指示剂，通
过该指示剂可显示溴酚蓝在凝胶中的扩散速率，而溴酚蓝在凝胶中的扩散速率比DNA 的扩散速率快，故可
以防止条带迁移出凝胶。环化质粒的长度为630+320=940kb，因此电泳结果为3 图示的，说明受体细胞含
有环化质粒，符合要求。
（4）由于环状质粒中含有组氨酸合成酶基因和氨苄青霉素抗性基因，且筛选重组质粒时大肠杆菌是在含
有氨苄青霉素的培养基上培养的，因此为筛选导入重组质粒的酵母菌，培养基中不需要再加入组氨酸和氨
苄青霉素，但需要加入无机盐和琼脂，形成固体培养基，以筛选目的菌体。
（5）hCGβ 是一种分泌蛋白，可被分泌到细胞外，将培养物离心后分出细胞和培养液两部分，细胞经破碎
处理后，再次离心取上清液，可获得较多的hCGβ，用抗hCGβ 单克隆抗体分别进行检测。若培养液及上
清液中均能检测到hCGβ 蛋白，则说明hCGβ 基因在酵母菌细胞中得到表达，并能分泌到细胞外。
（6）AOX Ⅰ为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达，因此选用AOX1
作为hCGβ 基因启动子，可以通过控制培养液中甲醇的有无，来控制hCGβ 基因的表达hCGβ 蛋白的合成。
1．同尾酶是指切割不同的DNA 片段后能产生相同黏性末端的一类限制酶，下列四种限制酶中属于同尾酶的
是（ ）
A．①③
B．②④
C．①③和②④
D．①④
【答案】A
【分析】限制性核酸内切酶（限制酶）：能够识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条
链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。经限制切割产生的DNA 片段末端通
常有两种形式：黏性末端和平末端。
【详解】同尾酶是指切割不同的DNA 片段后能产生相同黏性末端的一类限制酶，平末端不属于黏性末端，
故②④不属于同尾酶。限制酶切割后，①产生的黏性末端为CATG，③产生的黏性末端为CATG，因此①③产
生的黏性末端都为CATG 的相同黏性末端，符合同尾酶的定义，A 正确,BCD 错误。
故选A。
2．通过PCR 的定点诱变技术获得的改良基因两侧的碱基序列和大肠杆菌的质粒（有氨苄青霉素抗性基因、
LacZ 基因及一些酶切位点）结构如下图所示，研究者欲将改良基因导入大肠杆菌的质粒中保存。下列叙述
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正确的是（ ）
A．使用PCR 技术扩增时需要一个引物、多个dNTP 及Mg2+等
B．实现质粒和改良基因的高效连接应选用限制酶SmaI
C．构建重组质粒需用到的酶有Xma Ⅰ、Nhe Ⅰ和DNA 连接酶
D．在含氨苄青霉素和β-半乳糖苷的培养基上，白色菌落的大肠杆菌含重组质粒
【答案】D
【分析】PCR 技术的原理是模拟生物体内DNA 分子复制的过程，利用DNA 分子热变形原理，通过控制温度
控制控制DNA 分子的解聚和结合，DNA 分子体内复制过程DNA 的解旋是在解旋酶的作用下实现的；过程：
①高温变性：DNA 解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA 上；③中温延伸：合成子链。
【详解】A、使用PCR 技术扩增时需要一对引物，A 错误；
B、选择Sma Ⅰ，获得的是平末端，无法与改良基因上的黏性末端连接，B 错误；
C、从各种限制酶的酶切位点分析，除使用Xma Ⅰ外，还需使用Bgl Ⅱ切除相应黏性末端，产生GATC 的黏
性末端与改良基因CTAG 一侧进行连接，同时需要用DNA 连接酶构建基因表达载体，C 错误；
D、LacZ 基因编码的酶能分解β—半乳糖苷，产生蓝色物质，菌落为蓝色，如果没有分解，则菌落为白色，
因此可以将菌液涂布在含氨苄青霉素和β—半乳糖苷的平板上，由于重组质粒的LacZ 基因在重组过程中
被切断，即构建改良基因质粒时破坏了LacZ 基因，不能编码相应的酶分解β—半乳糖苷，菌落呈现白色，
所以白色菌落含有重组质粒，D 正确。
故选D。
3．用氨苄青霉素抗性基因（AmpR)、四环素抗性基因（TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有
目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒），并导入受体菌中。根
据题目所提供的信息，下列叙述正确的是（ ）
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A．若用ScaI 酶切质粒，所得产物经凝胶电泳可形成3 个条带
B．若用HindIII 和ScaI 酶切，一定可防止目的基因与质粒的反向连接
C．若用PvuI 酶切，在含四环素培养基中形成的菌落，一定含有目的基因
D．若用SphI 酶切，筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含四环素的培养基中长成菌落，再影印接种到
含氨苄青霉素的培养基中
【答案】A
【分析】题图分析，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有Sca Ⅰ和Pvu Ⅰ的酶切位点，四环素抗性基因
（TetR）内含有Hind Ⅲ、Sph Ⅰ和Sal Ⅰ的酶切位点。
【详解】A、若用ScaI 酶切质粒，由于图示质粒中有两个酶切位点，因而能得到三种DNA 片段，即完整的
片段和两个短片段，所得产物经凝胶电泳可形成3 个条带，A 正确；
B、若用HindIII 和ScaI 酶切，由于质粒中有两个ScaI 酶的切割位点，因而不一定能防止目的基因与质粒
的反向连接，B 错误；
C、若用PvuI 酶切，则会破坏氨苄青霉素抗性基因，则重组质粒中只有四环素抗性基因，因此成功导入重
组质粒的受体细胞具有对四环素的抗性，同时若导入的是空质粒，则受体细胞依然也具有对四环素的抗性，
进而可推测，在含四环素培养基中形成的菌落，不一定含有目的基因，C 错误；
D、若用Sph Ⅰ酶切，则会破坏四环素抗性基因（TetR），氨苄青霉素抗性基因（AmpR）不受影响，则重组
质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中
能形成菌落，在含Tet 的培养基中不能形成菌落，因此，筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含氨苄青霉
素的培养基中长成菌落，再影印接种到含四环素的培养基中，则只在含氨苄青霉素的培养基上生长的菌落
即为目的菌，D 错误。
4．CRISPR/Cas9 系统主要由向导RNA（SgRNA）和Cas9 蛋白两部分组成，SgRNA 可引导Cas9 蛋白到特定基
因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法正确的是（ ）
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A．Cas9 蛋白相当于限制酶，切割特定基因位点的脱氧核糖和碱基之间的化学键
B．向导RNA 可以在逆转录酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸
C．CRISPR/Cas9 基因编辑技术有时会因SgRNA 错误结合而出现“脱靶”现象，一般SgRNA 序列越长，脱
靶率越低
D．对不同目标DNA 进行编辑时，使用Cas9 蛋白和相同的sgRNA 进行基因编辑
【答案】C
【分析】限制酶能够识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷
酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
【详解】A、Cas9 蛋白切割特定基因位点，相当于限制酶，作用于脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，A 错
误；
B、向导RNA 是以DNA 的一条链为模板通过转录形成的，可以在RNA 聚合酶的催化下合成，合成的原料包括
四种核糖核苷酸，B 错误；
C、CRISPR/Cas9 技术编辑基因有时会因SgRNA 错误结合而出现“脱靶”现象，SgRNA 的序列越短，可识别
的DNA 上的特定碱基序列越短，越容易发生脱靶现象，即脱靶率越高，C 正确；
D、在对不同目标DNA 进行编辑时，应使用Cas9 蛋白和不同的sgRNA 结合进而实现对不同基因的编辑，D 错
误。
故选C。
5．CRISPR/Cas9 系统由单链的向导RNA（SgRNA）和内切核酸酶Cas9 构成，为高效获得特定基因敲除的斑
马鱼系，科研人员利用基因编辑技术（原理如下图所示），用化学方法合成特定的SgRNA,与Cas9mRNA 一
起注射到斑马鱼细胞，筛选出特定基因敲除的斑马鱼。下列说法错误的是（ ）
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A．改造后的受体细胞经培养发育到囊胚或桑葚胚时，可将其进行冷冻保存或胚胎移植
B．图中SgRNA 通过碱基互补配对实现其引导功能
C．Cas9 蛋白的作用是破坏DNA 分子的磷酸二酯键
D．两种RNA 可通过显微注射法导入斑马鱼的卵细胞
【答案】D
【分析】采用的“CRISPR/Cas9”基因编辑技术，其原理是由一条经人为构建的单链向导RNA 引导Cas9 蛋
白到特定的基因位点进行切割，其中向导RNA 可与解螺旋的靶向基因进行碱基互补配对，从而起到其导向
作用，Cas9 蛋白是一种核酸内切酶，其切割的化学键是磷酸二酯键。
【详解】A、改造后的受体细胞经培养发育到囊胚或桑葚胚时，可将其进行冷冻保存根据需要再利用，或
胚胎移植后产生所需变异个体，A 正确；
B、SgRNA 通过与DNA 的碱基互补配对完成对目标DNA 的识别，从而实现Cas9 蛋白对DNA 分子的定位，引导
Cas9 蛋白到DNA 的特定基因位点进行切割，B 正确；
C、Cas9 蛋白能对基因位点进行切割，破坏特定部位的磷酸二酯键，C 正确；
D、用化学方法合成特定的SgRNA，与Cas9mRNA 一起注射到斑马鱼细胞，两种RNA 通过显微注射法导入斑
马鱼的受精卵，不是卵细胞，D 错误。
故选D。
6．重叠延伸PCR 可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示（凸起处代表突变位点）。下列说法正确的是
（ ）
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A．过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率
B．过程①需3 轮PCR 才能得到图中所示PCR 产物
C．过程②的产物都可以完成延伸过程
D．若过程④得到16 个突变的基因则需要消耗15 个通用引物RP2
【答案】D
【分析】PCR 是聚合酶链式反应的缩写，是一项在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。通过这一
技术，可以获取大量的目的基因。PCR 扩增反应需要两种引物、模板DNA、原料（4 种脱氧核苷酸）、酶
（耐高温的DNA 聚合酶）。PCR 反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】A、由图可知，过程①需要把两对引物分别加入两个扩增体系中以提高扩增效率，A 错误；
B、过程①至少需3 轮PCR 才能得到图中所示PCR 产物，即两个引物之间的序列—等长的序列，B 错误；
C、过程②的产物不都可以完成延伸过程，因为子链只能从引物的3’端开始延伸，C 错误；
D、若过程④得到16 个突变的基因，由于模板链中不含有通用引物，则产生的16 个突变基因中共需要消耗
16×2-2=30 个通用引物，而需要通用引物RP2 的数量为30÷2=15 个，D 正确。
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故选D。
7．大引物PCR 定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮
PCR 反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物（使单链DNA 延伸出互补链），第一轮产物作第二轮PCR
扩增的大引物，过程如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．第一轮PCR 与第二轮PCR 的复性温度可能不同
B．定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录
C．第二轮PCR 所用的引物是第一轮PCR 的产物DNA 的两条链
D．将某功能蛋白的第17 位Cys 改造成Ser，属于蛋白质工程
【答案】C
【分析】PCR 原理：在高温作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷酸为原料，
合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3 端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子链的5'端自
3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要原因是DNA 聚
合酶只能从3'端延伸DNA 链。
【详解】A、为了使两轮PCR 反应在同一支试管中进行，第二轮PCR 的退火（复性）温度应该比第一轮高，
故设计引物时应考虑不同的退火（复性）温度，A 正确；
B、启动子和终止子分别控制转录的开始和终止，故定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行
转录，B 正确；
C、第一轮产物作第二轮PCR 扩增的引物外，第二轮PCR 仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一
条链的延伸，C 错误；
D、蛋白质工程是指通过基因改造或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，将某功
能蛋白的第17 位Cys 改造成Ser，属于蛋白质工程，D 正确。
8．某研究小组拟用限制酶和DNA 连接酶为基本工具，对目的基因和质粒进行切割、连接，以构建含目的基
因的重组表达载体。该小组前期研究获得如下2 个信息：①4 种限制酶的识别用列及切割位点、目的基因
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所在的外源DNA 片段中各种酶识别位置以及质粒上4 种酶的识别位置（如下图）；②有些不同种类的酶能
识别DNA 分子中不同核苷酸序列，但切割产生相同黏性末端，这样的限制酶称为同尾酶。下列有关叙述错
误的是（ ）
A．构建重组表达载体时，目的基因和质粒均用酶3 切割，用E•coli DNA 连接酶连接成功率最高
B．构建重组表达载体时，目的基因用酶2 切割，质粒用酶4 切割，用T4DNA 连接酶连接成功率最高
C．目的基因和质粒均用酶1 切割，用T4DNA 连接酶连接构建重组表达载体既方便操作又容易成功
D．酶1 和酶3 属于同尾酶，切割产生相同的黏性末端，但不适宜使用二者来构建重组表达载体
【答案】ABC
【分析】限制酶能够识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸
之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平末端。
【详解】A、构建重组表达载体时，使用同一种限制酶切割目的基因和质粒，容易造成二者自身环化，也
容易造成目的基因和质粒反向连接，成功率不高，A 错误；
B、酶2 和酶4 切割产生的末端不相同，无法连接成新的片段，B 错误；
C、酶1 的切割位点在目的基因序列中间，会破坏目的基因， C 错误；
D、酶1 和酶3 属于同尾酶，二者切割产生相同的黏性末端，但酶1 会破坏目的基因，不适宜使用二者来构
建重组表达载体，D 正确。
故选ABC。
9．基因工程操作中经常用到多种工具，回答下列有关问题：
(1)图甲是与DNA 有关的五种酶分子的作用，除 （从酶1-5 中选填）之外，其余的酶均作用于DNA 的
键。其中酶2 与酶4 起作用时的区别有 （至少答出1 点）。
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(2)同尾酶在基因工程中有特殊用途，当准备连接的两个DNA 分子中没有相同的限制酶识别序列时，可以用
同尾酶切割后进行连接，据此推测同尾酶是指 。
(3)图乙表示利用载体A 和基因m 构建基因表达载体的过程，基因m 中不存在与载体A 相同的限制酶切点。
据图可知，科研人员首先将载体A 用SmaI 切出 末端后形成线状DNA，而后在对基因m 进行PCR 扩增时，
设计的两种引物均需具备基因m 的末端序列及载体A 的同源序列。载体A 上的tet 是四环素抗性基因，Ampr
是氨苄青霉素抗性基因，若载体A 与基因m 经过适当的限制酶切割后形成了A-m 结合体，将结合体导入受
体细胞中，用含四环素和氨苄青霉素的培养基仍不能保证筛选出导入A-m 结合体的受体细胞，原因是 。
若用一定的方法能将基因m 插入到tet 内部，形成的A-m 结合体 （填“符合”或“不符合”）要求，
原因是 。
【答案】(1) 酶3 磷酸二酯 酶2 通常在基因工程中使用，将两个DNA 片段连接为一个DNA 分
子，无需模板；酶4 通常在DNA 复制时使用，将单个脱氧核苷酸依次连接到（引物）单链末端，需要DNA
两条母链当模板
(2)切割不同的DNA 片段（识别序列和切割位点不同）但产生相同黏性末端的一类限制酶
(3) 平 若导入的是载体A 自身，受体细胞也可以在培养基上生长 不符合 基因m 未插入
启动子与终止子之间，无法表达
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【分析】PCR 技术：（1）概念：PCR 全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 的核酸合成
技术。（2）原理：DNA 复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶）。（5）过程：①高温变
性：DNA 解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA 上；③中温延伸：合成子链。PCR 扩增中双链DNA
解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
【详解】（1）据图可知，酶1 是限制酶，酶2 是DNA 连接酶，酶3 是解旋酶，酶4 是DNA 聚合酶，酶5 是
DNA 水解酶，除酶3 作用于氢键之外，其余的酶均作用于DNA 的磷酸二酯键。其中酶2 与酶4 起作用时的区
别是酶2 通常在基因工程中使用，将两个DNA 片段连接为一个DNA 分子，无需模板；酶4 通常在DNA 复制
时使用，将单个脱氧核苷酸依次连接到（引物）单链末端，需要DNA 两条母链当模板。
（2）当准备连接的两个DNA 分子中没有相同的限制酶识别序列时，可以用同尾酶切割后进行连接，故可推
测同尾酶是指切割不同的DNA 片段（识别序列和切割位点不同），但产生相同黏性末端的一类限制酶。
（3）由图可知，先将载体A 用Sma Ⅰ切出平末端后形成线状DNA，而后在对基因m 进行PCR 扩增时，设计
的两种引物均需具备基因m 的末端序列及载体A 的同源序列，推测引物这样设计的理由是引物要与基因m
末端序列进行结合；基因m 中不存在与载体A 相同的限制酶切点，需要利用引物在基因m 两侧加上与载体A
同源序列相同的片段，以便创造出与载体A 相同的限制酶切点。若载体A 与基因m 经过适当的限制酶切割
后形成了A-m 结合体，将结合体导入受体细胞中，用含四环素和氨苄青霉素的培养基仍不能保证筛选出导
入A-m 结合体的受体细胞，原因是若导入的是载体A 自身，受体细胞也可以在培养基上生长。若用一定的
方法能将基因m 插入到tet 内部，形成的A-m 结合体不符合要求，原因是基因m 未插入启动子与终止子之
间，无法表达。
10．抗菌肽通常是由短氨基酸序列构成的小肽，具有广谱的杀菌活性，利用基因工程生产抗菌肽的难题之
一是大肠杆菌能识别外源蛋白并将其水解。某科研小组将抗菌肽基因与大肠杆菌自身的半乳糖苷酶基因连
接，组成融合基因，通过质粒构建基因表达载体并导入大肠杆菌中，以获得大量的抗菌肽。如图1、图2
为融合基因和该实验所用质粒的结构示意图。请回答下列问题：
注：EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ为不同的限制酶，Amp 为氨苄青霉素抗性基因，
⁸
Tetⁿ 为四环素抗
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性基因。
(1)分析图1 可知，利用PCR 技术扩增融合基因时，应选择的引物是 ，这样选择的理由是
（答出2 点）。
(2)为构建重组质粒并保证基因能定向插入质粒中，需选择限制酶 切割质粒和含融合基因的
DNA 片段。筛选重组质粒时，应将大肠杆菌分别接种到含氨苄青霉素和四环素的培养基上，若
，则说明重组质粒成功导入大肠杆菌细胞内。上述培养基可为大肠杆菌的生长繁殖提供的营养物质有
(3)该实验利用大肠杆菌获得抗菌肽时，将抗菌肽基因和大肠杆菌自身的半乳糖苷酶基因组成融合基因的
目的是 。
【答案】(1) 引物4 和引物5 DNA 聚合酶只能从引物的3'端延伸DNA 链；需要将限制酶的识别序
列扩增到产物中
(2) BamHI 和Hind Ⅲ 大肠杆菌能在含四环素的培养基上增殖，但不能在含氨苄青霉素的培养基
上增殖 水、碳源、氮源、无机盐
(3)防止抗菌肽被大肠杆菌中的酶水解
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增
和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、
终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）
目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）根据图示分析，利用 PCR 技术扩增融合基因时，应选择引物4 和引物5，其原因是 DNA 聚
合酶只能从引物的3'端延伸DNA 链，且需要将限制酶识别序列扩增到产物中才能让目的基因和载体拼接成
重组质粒。
（2）为构建重组质粒并保证基因能定向插入质粒中，需选择限制酶 BamH I 和Hind Ⅲ，原因是 Sma Ⅰ会
破坏目的基因，而 EcoR Ⅰ不能保证目的基因定向连接；由于构建重组质粒时破坏了氨苄青霉素抗性基因，
因此，若大肠杆菌能在含四环素的培养基上增殖，但不能在含氨苄青霉素的培养基。上增殖，则说明大肠
杆菌细胞内已导入了重组质粒；培养基可为微生物的生长提供水、碳源、氮源和无机盐等营养物质。
（3）该实验利用大肠杆菌获得抗菌肽时，将抗菌肽基因和大肠杆菌自身的半乳糖苷酶基因连接，组成融
合基因，其目的是让表达的抗菌肽含有大肠杆菌自身蛋白质的组成成分，从而防止抗菌肽被大肠杆菌中的
酶水解。
11．影响小鼠内耳形态的基因A 突变会导致遗传性耳聋，研究人员尝试进行基因治疗。
(1)CRISPR/Cas9 基因编辑系统由sgRNA 及Cas9 蛋白组成。图1 所示，sgRNA 与目标DNA 结合，引导Cas9 蛋
白切割靶序列的双链DNA，导致 键断裂。
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(2)同源重组是指在DNA 断裂的情况下，含有同源区段的DNA 之间发生的重组。科研人员尝试利用同源重组
原理对耳聋小鼠进行基因治疗。
①利用 技术扩增野生型小鼠的基因A，再用图2 中的限制酶 切割基因A 与腺病毒载体形
成黏性末端，最后利用 酶进行拼接，构建腺病毒表达载体。科研人员尝试利用该载体与耳聋小鼠
的DNA 进行同源重组，效果不佳。
②在上述基础上，科研人员又将sgRNA 基因、Cas9 基因接入了腺病毒表达载体（见图3），同时引入
sgRNA 的识别序列，目的是 。图3 所示的腺病毒表达载体还需要哪些必要的结构或基因 （多
选）。
A．启动子和终止子
B．RNA 聚合酶基因
C．标记基因
D．起始密码子和终止密码子
E．反密码子
F．复制原点
(3)将腺病毒表达载体注入耳聋小鼠的单侧耳组织细胞。为评估该治疗方案的效果，研究人员使用同一只
小鼠的非注射耳作为对照，而不是另一只没有注射腺病毒表达载体的小鼠，好处是可以排除 对实
验结果的影响。
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(4)进一步研究结果表明该方案可以有效纠正小鼠的突变基因，从而治疗小鼠的遗传性耳聋。人体内基因A
突变也会导致遗传性耳聋，欲将该方案用于临床治疗，从安全性角度还应关注 。
【答案】(1)磷酸二酯键
(2) PCR SpeI 和Sal DNA 连接酶 通过CRISPR/Cas9 基因编辑系统切割腺病毒表达载体
DNA 和耳聋模型鼠染色体DNA，使DNA 发生断裂，启动同源重组 ACF
(3)小鼠的个体差异
(4)该技术对其他功能基因是否存在非特异性编辑
【分析】1、实现基因工程的操作至少需要三种“分子工具”，即准确切割DNA 分子的 “分子手术刀”
——限制酶、将DNA 片段再连接起来的“分子缝合针”——DNA 连接酶和将体外重组好的DNA 分子导入受
体细胞的“分子运输车”——载体。
2、基因工程技术的基本步骤： 目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的
基因的检测与鉴定。
【详解】（1）DNA 分子的单体间通过磷酸二酯键相连接，Cas9 蛋白切割靶序列的双链DNA，导致靶序列磷
酸二酯键断裂。
（2）①PCR 为体外扩增DNA 分子的一项技术，若要扩增野生型小鼠的基因A，则要用到PCR 技术。如图2
所示，若要利用同源重组原理对耳聋小鼠进行基因治疗，则构建的基因表达载体中应包含同源区a、b，所
用的限制酶要能同时把基因A 中的同源区a、b 切割下来。因此，所用的限制酶是SpeI 和Sal，即能把基因
A 中的同源区a、b 切割下来，也在腺病毒载体上有相应切口。利用限制酶所获取的目的片段和腺病毒载体
片段，还要用DNA 连接酶进行连接，形成重组的基因表达载体。
②利用图2 所示的载体与耳聋小鼠的DNA 进行同源重组，效果不佳，有可能是未启动重组。将sgRNA 基因、
Cas9 基因接入了腺病毒表达载体，同时引入sgRNA 的识别序列，目的是通过CRISPR/Cas9 基因编辑系统切
割腺病毒表达载体DNA 和耳聋模型鼠染色体DNA，使DNA 发生断裂，启动同源重组。一个能正常表达的重
组基因表达载体应包含有目的基因、标记基因、启动子和终止子、复制原点，因此图3 所示的腺病毒表达
载体还需要标记基因、启动子和终止子、复制原点，故选ACF。
（3）实验过程要遵循单一变量原则，研究人员使用同一只小鼠的非注射耳作为对照，而不是另一只没有
注射腺病毒表达载体的小鼠，好处是可以排除小鼠的个体差异对实验结果的影响。
（4）欲将该方案用于临床治疗，从安全性角度还应关注该技术对其他功能基因是否存在非特异性编辑。
12．回答下列问题：
Ⅰ、下图表示某细菌细胞中某基因的表达过程。请回答：
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(1)⑤上的AGA 称为 ，③上的AGA 称为 。
(2)图中RNA 对应的DNA 片段连续复制5 次，共需要游离的胸腺嘧啶脱氧核苷酸数目为 个。
(3)杂合子Aa 连续自交，且逐代淘汰隐性个体，自交n 代后，显性个体中，杂合子所占比例是 ，
纯合子所占比例是 。若杂合子 Aa 连续自由交配n 代，且逐代淘汰隐性个体后，显性个体中，
纯合子比例为 ,杂合子比例为 。
Ⅲ、利用重叠延伸PCR 技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。
(4)PCR1 过程中，加入的引物是 ，经过 轮扩增，可以获得产物AB。
(5)PCR2 过程中，加入的引物是 ，PCR3 过程中，加入的引物是 。
(6)经过过程①获得的杂交DNA 有 种。
【答案】(1) 反密码子 密码子
(2)217
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(3) 2/（2n +1） （2n -1）/2n +1） n/（n+2） 2/（n+2）
(4) 引物a 和引物b 2
(5) 引物c 和引物d 引物a 和引物d
(6)2
【分析】题意分析，杂合子自交n 代，后代纯合子和杂合子所占的比例：杂合子所占的比例为（1/2）n，
纯合子所占的比例为1-（1/2）n。由此可见，随着自交代数的增加，后代纯合子所占的比例逐渐增多，且
无限接近于1；显性纯合子=隐性纯合子的比例无限接近于1/2；杂合所占比例越来越小，且无限接近于
0。
【详解】（1）⑤为tRNA，其上的AGA 称为反密码子，③为mRNA，其上的AGA 称为密码子。
（2）图中RNA 片段中A 和U 的含量为7/12，则其对应的DNA 片段中含有的A 和T 的比例也是7/12，而对应
的DNA 片段有24 个碱基，且DNA 分子中A 和T 的数量相等，因此该DNA 片段中含有的T 的数目为
7/12×24÷2=7 个，则该DNA 片段 连续复制5 次，共需要游离的胸腺嘧啶脱氧核苷酸数目为7×（25-1）
=217 个。
（3）杂合子Aa 连续自交，且逐代淘汰隐性个体，则自交1 代淘汰隐性个体后，杂合子的比例为2/3，自
交2 次后，产生的隐性个体的比例为2/3×1/4=1/6，Aa 的比例为2/3×1/2=1/3，AA 的比例为
1/6+1/3=1/2，则淘汰隐性个体后，Aa 所占的比例为2/5，同理求得自交3 次后n 代后，产生的隐性个体的
比例为2/5×1/4=1/10，Aa 的比例为2/5×1/2=1/5，AA 的比例为1/10+3/5=7/10，则淘汰隐性个体后，Aa
所占的比例为2/9，据此可推测，Aa 自交n 次，淘汰隐性个体后，显性个体中，杂合子所占比例是2/（2n
+1）， 纯合子所占比例是1-2/（2n +1）=（2n -1）/（2n +1）。
若杂合子 Aa 连续自由交配n 代，且逐代淘汰隐性个体后，我们可依次计算，则自由交配1 次和自交的结
果是相同的，则淘汰隐性个体后，Aa 的比例为2/3，AA 占1/3，该群体中A∶a 配子的比例为2∶1，则自由
交配2 次后，基因型为AA 个体的比例为4/9，Aa 的比例也为4/9，则淘汰隐性后，AA 和Aa 各占1/2=2/4，
该群体的A∶a 配子的比例为3∶1，则自由交配3 次后，基因型为AA 个体的比例为3/4×3/4=9/16，Aa 的
比例也为2×3/4×1/4=6/16，则淘汰隐性后，AA 和Aa 的比例依次为3/5、2/5，据此可归纳出杂合子 Aa
连续自由交配n 代，且逐代淘汰隐性个体后，显性个体中，纯合子比例为 n/（n+2），杂合子比例为
2/（n+2）。
（4）DNA 复制过程中子链的延伸方向是从5’端到3’端进行的，据此可以看出，PCR1 过程中，加入的引
物是引物a 和引物b，经过2 轮扩增，可以获得产物AB，因为第一次复制获得的子代DNA 均带有模板链，
而第二次复制才能产生图中AB 类型的DNA 片段。
（5）根据子链延伸的方向可推测，PCR2 过程中，加入的引物是引物c 和引物d，经过两轮复制可获得CD
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类型的DNA 片段，PCR3 过程中，最终获得的产物是AD，因此该过程中加入的引物是引物a 和引物d。
（6）经过过程①获得的杂交DNA 有2 种，分别是AB 上链与CD 下链和AB 下链与CD 上链构成的杂交DNA。
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