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2024 届高考生物二轮微专题
微专题07 基因工程及应用
一、考向解读（情境链接+真题评析+新题尝鲜）
考向一、同尾酶
考向二、双标记基因与影印接种法
考向三、基因编辑技术
考向四、PCR 技术及其应用
二、专题特训
一、同尾酶
【情境链接】
1.定义：来源不同，识别的碱基序列也不相同，但能切割产生相同末端的限制酶叫同尾酶。所有
平末端酶产生的末端均是相同的，但一般不把它作为同尾酶来研究。因此同尾酶一般是指能产生相同
粘性末端的限制酶。
2.实例：同尾酶中，识别序列不同的限制酶，虽然识别的碱基序列不同，但是切开的黏性末端的
碱基却能够正好相互配对，在DNA 连接酶的作用下能形成重组DNA 分子，如：限制酶BamH Ⅰ识别的碱
基序列为—G↓GATCC—，限制酶Bgl Ⅱ识别的碱基序列为—A ↓GATCT—，限制酶Mbo Ⅰ识别的碱基序
列为—↓GATC—，限制酶BamH Ⅰ切开的DNA 两条链的黏性末端中没有被配对的碱基是GATC—，限制酶
Bgl Ⅱ和限制酶Mbo Ⅰ切开的黏性末端未配对的碱基也都是GATC—。通过比较不难发现这三种限制酶
切得的黏性末端是可以相互配对连接的。类似的情况还有不少，如限制酶Sal Ⅰ与Xho Ⅰ，Hpa Ⅱ与
Taq Ⅰ等。
3.切割后重组原限制酶切割情况：同尾酶识别的靶序列不相同，但能切割产生相同的黏性末端，
因此也可以通过碱基互补配对的形式重组。同尾酶重组后碱基序列与原有两种酶识别的碱基序列均不
同，因此原有的限制酶均不再能够识别这种序列，也就不再能够重新切开。如BamH Ⅰ识别的序列是—
G↓GATCC—，Bgl Ⅱ识别的序列是—A↓GATCT—，而BamH Ⅰ与Bgl Ⅱ切开后的片段重新连接（非自身
连接）后的碱基序列是一条链是—AGATCC—，另一条链则为—GGATCT—，已经不是“回文”序列，无
论是BamH Ⅰ还是Bgl Ⅱ都无法再识别，所以无法再把其切开。
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【真题评析】
1．（2023·重庆·统考高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8 个碱基短于实际长度）获得了含有
目的基因的DNA 片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述
错误的是（ ）
A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇
B．步骤①所用的酶是SpeI 和CfoI
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2 个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli 连接酶或T4连接酶
2．（2023·山西·统考高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3 和酶4）、DNA 连接酶为工具，将
目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限
制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
2
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A．质粒和目的基因都用酶3 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
B．质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割，用T4 DNA 连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割，用T4 DNA 连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
3．（2021·山东·统考高考真题）人类γ 基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该
位点结合 BCL11A 蛋白后，γ 基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ 基因表达的抑
制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ 基因上游不同长度的片段，将这些片段分别
插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图
可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。
本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
（2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达
荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无
荧光的原因是 。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R
扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ 基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的
结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于 ，理由是 。
【新题尝鲜】
1．金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动物肝脏细胞中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研
人员将MT 基因导入大肠杆菌构建工程菌，利用这一工程菌吸附工业废水中的重金属。回答下列问题：
(1)为获取目的基因，从 中提取mRNA，通过 法获得MTcDNA。MTcDNA 的碱基序列与细胞中
MT 基因的碱基序列 （填“相同”或“不同”）。
(2)为了提高工程菌MT 蛋白的产量，将MT 基因与外源表达增强元件连接（图甲表示引物对应的位置）。
3
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利用PCR 检测连接是否成功，可选择的引物组合是 （填字母），该PCR 反应体系中需加入
酶。
A．①+③B．①+④C．③+②D．③+④
(3)将改造后的目的基因进行PCR 扩增，得到的片段末端为平末端，而载体E 只有能产生黏性末端的酶切位
点。为了能够将MT 基因与载体E 相连，可以在上述引物的 （填“5′”或“3′”）端添加能产生
黏性末端的限制酶识别序列；也可以借助中间载体P 将MT 基因接入载体E。（图乙表示载体P 和载体E 的
酶切位点及相应的酶切序列）
后者具体操作步骤如下：
①选用 酶将载体P 切开，再用DNA 连接酶将MT 基因与载体P 相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT 基因的 和 。选用 酶组合对载体P′和载体E 进行酶切，
将切下的MT 基因和载体E 用DNA 连接酶进行连接。为了提高获得重组质粒的效率，除了考虑适宜的外界条
件、目的基因的浓度外，还需考虑 （写出两点）。
(4)将重组质粒导入到用 处理的大肠杆菌中完成转化；利用含有 的培养基筛选出MT 工程
菌。
(5)通过检测发现MT 基因已经成功导入大肠杆菌，但该菌不能吸附工业废水中的重金属，可能的原因是：
。
4
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2．材料一：白细胞表面抗原2（SLA-2）在抗原呈递、机体器官移植以及免疫应答方面有着重要作用。为
进一步研究SLA-2 的结构与功能，科研人员以能稳定传代的猪肾上皮细胞为材料，构建了稳定高表达
SLA-2 基因的细胞株，过程如下图。其中，Ampr 表示氨苄青霉素抗性基因，Puror 为嘌呤霉素抗性基因，
BclI、NotI、XbaI、San3AI 为限制酶酶切位点，括号内数值表示距复制原点的长度。
限制酶
Bcl Ⅰ
Not Ⅰ
Xba Ⅰ
San3A
Ⅰ
识别序列及切割位
点
T↓GATCA
GC↓GGCCGC
T↓CTAGA
↓GATC
材料二：研究中，一般利用最小致死浓度（使某种细胞全部死亡的最小浓度）的嘌呤霉素溶液浸染细胞以
筛选出转化的猪肾上皮细胞。
(1)简要概述材料一中实验过程 。
(2)采用PCR 电泳设计实验鉴定重组质粒3，需包括实验过程以及结论（电泳图） 。
PCR 电泳图：
(3)概述材料二的实验以及判断那种细胞更好，并说明理由 。
二、双标记基因与影印接种法
【情境链接】
以培养某种大肠杆菌（如转胰岛素基因大肠杆菌），选择具有标记基因青霉素抗性基因和四环素抗
性基因，同时限制酶切点在青霉素抗性基因内部的质粒作运载体，与目的基因构建表达载体。不考虑多个
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DNA 片段的连接、目的基因的自我连接和目的基因的反向连接，将得到两种质粒：原有质粒重新连接而成
的空质粒和重组质粒。将所得质粒与没有青霉素、四环素抗性的大肠杆菌混合、转化，将得到三种大肠杆
菌，即未转化的大肠杆菌、导入空质粒的大肠杆菌和导入重组质粒的大肠杆菌。将所得大肠杆菌培养，增
加数量。然后接种到完全培养基上，得如图所示的6 个菌落。然后，用影印接种法将菌落分别接种到含有
四环素和青霉素的培养基上，培养结果如下图。
其中2 号、5 号菌落无法在两种培养基上生存，说明所含大肠杆菌没有抗性基因，即所含大肠杆菌为
未转化的大肠杆菌；1 号、4 号、6 号菌落在两种培养基中均能生存，说明其大肠杆菌两种抗性都有，即所
含大肠杆菌为转化了空质粒的大肠杆菌；3 号菌落能做含四环素的培养基上生存，说明其含有四环素的抗
性，不能在含青霉素的培养基上生存，说明不含有青霉素的抗性（抗性基因酶切插入目的基因后丧失其作
用），综合分析其大肠杆菌含有重组质粒。3 号菌落所含大肠杆菌即是要选择培养的大肠杆菌。
【真题评析】
1．（2022·天津·高考真题）研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1 导入谷
氨酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
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(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1 中含有KanR（卡那霉素抗性基因）和SacB 两个标记基
因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物 和 ，并在引物的 （5＇∕3＇）端
引入Xho Ⅰ酶识别序列，进行PCR 扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
(2)PCR 扩增载体3 中筛选效率较高的标记基因RpsL（链霉素敏感基因）时，引物应包含
（EcoR Ⅰ∕Hind Ⅲ∕Xho Ⅰ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2 构建高效筛选载体4。
(3)将改进的P1 基因整合到载体4 构建载体5。将载体5 导入链霉素不敏感（由RpsL 突变造成）、卡那霉
素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5 的菌株，应采用含有 的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1 基因脱离载体5 并整合到受体菌拟核DNA，且载体5 上其他DNA 片段
全部丢失。该菌的表型为__________。
A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感
B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C．卡那霉素和链霉素都敏感
D．卡那霉素和链霉素都不敏感
(5)可采用 技术鉴定成功整合P1 基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
2．（2019·江苏·统考高考真题）图1 是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0 具有四
环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：
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（1）EcoRV 酶切位点为
，EcoR V 酶切出来的线性载体P1 为 末端。
（2）用TaqDNA 聚合酶进行PCR 扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体
P1 用酶处理，在两端各添加了一个碱基为 的脱氧核苷酸，形成P2；P2 和目的基因片段在
酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3 的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C 三类菌落，
其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是
（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是 、 。
（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR 鉴定。图2 所示
为甲、乙、丙3 条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR 鉴定时应选择的一对引物是 。某学
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生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp 片段，原因是 。
3．（2019·天津·统考高考真题）B 基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，
但在卵细胞中不转录。为研究B 基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。
据图回答：
（1）B 基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中 。
A．含B 基因的染色体缺失 B．DNA 聚合酶失活
C．B 基因发生基因突变 D．B 基因的启动子无法启动转录
（2）从水稻体细胞或 中提取总RNA，构建 文库，进而获得B 基因编码蛋白的序列。
将该序列与Luc 基因（表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光）连接成融合基因（表达的蛋白质能保留两
种蛋白质各自的功能），然后构建重组表达载体。
（3）在过程①、②转化筛选时，过程 中T-DNA 整合到受体细胞染色体DNA 上，过程
在培养基中应加入卡那霉素。
（4）获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是 。
A．将随机断裂的B 基因片段制备成探针进行DNA 分子杂交
B．以Luc 基因为模板设计探针进行DNA 分子杂交
C．以B 基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA 杂交
D．检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
（5）从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵
细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明 。
【新题尝鲜】
1．番茄枯萎病是番茄主要病害之一。研究人员拟从新鲜蚯蚓粪中筛选出对番茄枯萎病有良好抑制效果的
甲细菌，以期为番茄枯萎病提供生物防治。将蚯蚓粪加入无菌水中制成悬浮液，利用营养琼脂培养基
（NA）进行分离后，将获得的不同甲菌株分别接种至细菌营养肉汤培养基（NB）。培养48h 后，进行“平
板对峙实验”【该实验的操作：在有马铃薯葡萄糖培养基（PDA）的空白平板一侧放置一直径为5mm 番茄枯
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萎病菌的菌块，在平行另一侧放置直径5mm 的经过处理（滴加甲菌液或清水）的滤纸片】，每组做3 次重
复，实验流程见图1．
(1)将3g 采集的蚯蚓粪加入盛有 mL 无菌水的三角瓶中，充分振荡，即成10-2稀释液，步骤I 使用的接
种方法是 ，实验流程先I 后Ⅱ的目的是 。
(2)以下对“平板对峙实验”的叙述，正确的有哪些？
A．对照组滤纸片用无菌水处理
B．实验组滤纸片用甲菌菌液处理
C．放置滤纸后随即测量并计算抑制率
D．该实验结果不能说明抑菌效果
(3)已知筛选的甲菌株能合成并分泌一种能抑制番茄枯萎病菌生长的细胞壁降解酶（PMG）。现研究人员获
取得到PMG 基因，并将其导入番茄细胞中，预期得到抗枯萎病的转基因植株。含PMG 基因的DNA 片段、Ti
质粒的结构及限制酶切割位点如图2 所示。
①大量扩增PMG 目的基因可以用 （中文名称）技术，扩增时所用的直接能源物质是 。
②根据图2 信息，将PMG 基因与Ti 质粒构建重组DNA 分子时，应选用的限制酶是 。
③将农杆菌放于 的CaCl2溶液中处理，使其变为感受态细胞，再在低温条件下将农杆菌与重组质粒混
合，最后进行短暂的 处理，该短暂处理的目的是 。将农杆菌涂布接种于添加有 的LB 固体培养
基上筛选含有重组质粒的农杆菌。用阳性农杆菌感染植物细胞，目的基因就会随 整合到植物染色体DNA
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中，最后通过 技术培育出完整的转基因植株。
④为确定转PMG 基因番茄植株能抗枯萎病，在个体水平上的检测方法是 。
2．表观遗传调节异常是肿瘤发生发展的重要因素之一，N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA 上最常见的
一种修饰。研究发现，胃癌细胞中存在m6A 去甲基化酶（ALKBH5）过表达和STC2（癌症相关基因）mRNA 的
m6A 修饰水平降低的异常现象。科研人员利用基因工程技术实现ALKBH5 基因沉默和STC2 基因的过表达，
以研究ALKBH5 介导的m6A 甲基化修饰对胃癌细胞迁移的影响。
(1)已知STC2 基因的α 链为转录的模板链，据图1 分析，利用PCR 扩增目的基因时，需要在引物
的5′端添加BamH Ⅰ识别序列和强启动子序列，在引物 的5′端添加Sac Ⅰ识别序列。目的基
因两端用不同限制酶切割的原因是 。
(2)为确保目的基因正确插入质粒，需要选择 限制酶切割质粒。将重组质粒导入大肠杆菌时，
可利用潮霉素和卡那霉素筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，试简要表述筛选思路： 。
(3)研究人员分别用不同方式处理胃癌细胞，并测得胃癌细胞迁移标志蛋白含量如下：
根据结果推测ALKBH5 基因影响胃癌迁移的机理是 。
三、基因编辑技术
【情境链接】
1.定义：CRISPR/Cas9 基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引
导核酸内切酶Cas9 到一个特定的基因位点进行切割(如图)。CRISPR 复合体中sgRNA 的主要功能是与靶向
基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9 蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
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2．作用：从功能上来看，CRISPR/Cas9 系统相当于基因工程中的限制酶，该系统广泛存在于细菌中，
作用是切割外源DNA，使之失效，起到保护自身的目的(或抵抗外源DNA 的入侵，保护自身或清除入侵的病
毒DNA)。
3．优点：若用CRISPR/Cas9 基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，避免了因目的基
因随机插入宿主细胞DNA 引起的生物安全性问题。
4．特异性：CRISPR/Cas9 基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”，sgRNA 的识别序列越
短，特异性差，容易与其他片段结合造成编辑出错，基因编辑的脱靶率越高。
【真题评析】
1．（2021·浙江·统考高考真题）采用CRISPR/Cas9 基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基
因定点插入到受精卵的Y 染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配，通过观
察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是（ ）
A．基因编辑处理的受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液
B．基因编辑处理的受精卵经体外培养至2 细胞期，须将其植入同期发情小鼠的子宫，才可获得表达
EGFP 的小鼠
C．分离能表达EGFP 的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
D．通过观察早期胚胎的荧光，能表达 EGFP 的即为雄性小鼠胚胎
2．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一
种新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB 法）。图1 与图2 分别是利用常规转化法
和CDB 法在某植物中递送基因的示意图。
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回答下列问题。
(1)图1 中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长
素和 ，该过程还需要光照，其作用是 。
(2)图1 中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A 的 。图1 中，
含有外源基因的转化植株A 若用于生产种子，其包装需标注 。
(3)图1 与图2 中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。
(4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS 基因的CRISPR/Cas9 基因编辑载体
（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2 中的CDB 法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得
转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ，图2 中，鉴定导入幼苗中的基因编
辑载体是否成功发挥作用的方法是 ，依据是 。
(5)与常规转化法相比，采用CDB 法进行基因递送的优点是 （答出2 点即可）。
3．（2021·海南·高考真题）CRISPR/Cas9 是一种高效的基因编辑技术，Cas9 基因表达的Cas9 蛋白像一
把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA 双链以敲除目标基因或插入新的基因。
CRISPR/Cas9 基因编辑技术的工作原理如图所示。
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回答下列问题。
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9 重组质粒，需对含有特定sgRNA 编码序列的DNA 进行酶切处理，然后将
其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是 。
(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是 。
(3)过程③~⑤中，SgRNA 与Cas9 蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA 可识别并与目标DNA 序列特异性结
合，二者结合所遵循的原则是 。随后，Cas9 蛋白可切割 序列。
(4)利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除一个长度为1200bp 的基因，在DNA 水平上判断基因敲除是否成功
所采用的方法是 ，基因敲除成功的判断依据是 。
(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9 质粒中获得重组
质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA 中，构建得到能大
量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9 重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组
DNA 的编辑过程： 。
【新题尝鲜】
1．CRISPR/Cas9 是目前应用最广泛的基因组编辑技术，能对DNA 分子中的基因进行编辑，引入人们想要的
基因或破坏已有的基因。使用该技术，需要向要进行编辑的细胞中加入以下主要组分：人工合成的向导
RNA 和一种来自细菌的核酸酶Cas9 蛋白。其原理是向导RNA 与DNA 分子中希望被编辑的序列通过碱基互补
配对结合后，Cas9 蛋白再结合上去对与向导RNA 结合的DNA 进行切割，使DNA 双链断裂，过程如下图所示。
回答下列问题：
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(1)据图推测，向导RNA 的作用是 ；Cas9 蛋白的作用是 。
(2)当DNA 双链断裂后，可导入目的基因，目的基因的导入往往需要利用基因工程方法构建基因表达载体，
基因表达载体上除了含有目的基因和标记基因，还必须有 、 。
(3)目的基因在与运载体结合前需要用PCR 技术进行大量扩增，该过程需要 酶，该酶与普通DNA 聚
合酶相比，其特点是 。
(4)与传统的限制酶切割基因技术相比，CRISPR/Cas9 基因编辑技术的明显优点是 。
2．研究表明羊乳中的β-乳球蛋白（BLG）是人体主要过敏源，图为研究人员利用基因编辑技术敲除山羊
中BLG 基因同时敲入人乳铁蛋白（hLF）基因并获得转基因山羊的操作过程。
图中sgBLG /Cas9 复合物中，sgBLG 为能准确识别图中山羊DNA 特定序列的RNA，并引导Cas9 蛋白对DNA
进行切割。检测发现过程②中，hLF 基因成功插入在母羊乙成纤维细胞中的一条常染色体上。
(1)上述操作过程中的目的基因是 ，获得该目的基因的主要方法是 。
(2)Cas9 蛋白类似于基因工程中常用到的 酶，但Cas9 蛋白特性与该酶的区别是 。
(3)图中复合物1 所识别的DNA 序列为5’-TATACTGGC-3’，则sgBLG 的序列为 。（单选）
A．5’-AUAUGACCG-3’
B．5’-GCCAGTATA -3’
C．5’-ATATGACCG-3’
D．5’-GCCAGUAUA-3’
(4)下列①—⑥生物技术中，过程①②运用到的技术有 ，过程③④⑤中，运用到的技术有 。
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（编号选填）
①显微注射技术②动物细胞培养技术③胚胎移植技术④DNA 重组技术⑤动物细胞融合技术⑥细胞核移植技
术
(5)与图中获得的转基因山羊性状最相似的是母羊 。（单选）
A．甲
B．乙
C．丙
D．丁
(6)科研团队想进一步获得纯合能稳定遗传“人乳铁蛋白基因”的转基因山羊，其技术路线的设计思路是
。
四、PCR 技术及其应用
【情境链接】
1.PCR 技术与病毒检测
新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光 PCR 鉴定。实时荧光 PCR 扩增目的基因，需额外添加
荧光标记探针(一小段单链 DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在
PCR 过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA 聚合酶水解，R 与Q 分离后，R 发出的荧光可被检测到(如
图甲)，通过实时荧光PCR 检测新型冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙。
2. 基因定点突变与基因改造
重叠延伸PCR 技术是一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图
中的引物2 和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA 片
段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和
治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR 技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47 位
的天冬酰胺
(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理见图。
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【真题评析】
1．（2023·浙江·统考高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生
型小鼠Gata3 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以
期获得Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2
用于PCR 扩增，PCR 产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子无法控制GFP 基因的表达
B．翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C．2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
2．（2022·辽宁·统考高考真题）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5 是我国自主研发的转基因品种。为给监
管转基因生物安全提供依据，采用PCR 方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（
）
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A．预变性过程可促进模板DNA 边解旋边复制
B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
3．（2023·江苏·统考高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构
建质粒，如图1 所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的
不同是 。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R 应在下列选项中选用______。
A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过
程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
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(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300 个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
【新题尝鲜】
1．成纤维细胞生长因子21 (FGF21) 是一种调节机体代谢的分泌型蛋白，具 有降低血糖、提高胰岛素
敏感性等生理活性。但由于 FGF21 稳定性差，导致 FGF21 药效较差。科研人员以含有 FGF21 基因
(F) 的重组质粒 pSUMO-FGF21(p-F)为 模板，对 F 进行定点突变，构建含突变基因的突变质粒
pSUMO-mmtFGF21(p-mF)， 从而实现对FGF21 的改造，部分过程如下图所示。
回答下列问题：
(1)改变FGF21 中的氨基酸，使某两个氨基酸R 基之间形成共价键，可提高FGF21 的 稳定性。这首先需
要在数据库中检索 FGF21 的氨基酸序列和 ，据此设计 并对蛋白质结构进行模拟验
证。
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(2)通过PCR 可实现对FGF21 基因 (F)的定点突变。
①应选择下图中的哪对引物进行定点突变
A．1 和4 B．2 和 3 C．1 和 3 D．2 和4)
②突变引物长度不能过短，否则会由于 ，突变失败。
③将引物、 p-F、缓冲液、无菌水、 DNA 聚合酶和 等加入微量离心管中，构 成PCR 体系进行
反应。
(3)限制酶DpnI 可识别并切割腺嘌呤被甲基化的5'-GATC-3'序列。选择突变质粒时， 将
Dpn I 与 PCR 产物混合，置于37℃下处理1h， 可使 p-F 被切割而p-mF 不被 切割，原因
是 。为确保p-F 被充分切割，可适当增加酶量或 。
(4)在转化大肠杆菌时，用低温和 CaCl 溶液处理大肠杆菌细胞，使其成为
₂
细胞， 与酶切产
物混合后置于冰上30 分钟，再通过短暂热刺激处理，使质粒进入细胞中。 最后取适量菌液涂布在
(填“含”或“不含”)背霉素的平板上进行筛选。 当平板上长出菌落则表明发生了突变。为证实这一
结果，可随机挑取单菌落抽提质粒并进行 。
8．人绒毛膜促性腺激素（HCG）是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，由a 链和β 链
（hCGβ）结合而成。近年研究显示，hCGβ 也可表达于结肠癌等多种恶性肿瘤细胞，与肿瘤的发生、发展
及转移有一定关系。研发抗hCGβ 疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图1 为其制备的基本方案。
(1)构建基因表达载体。图中获取hCGβ 基因的方法属于. ，hCGβ 基因需要与甲序列一起构建形成
融合基因，其目的是 。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，在重组酶作
用下发生同源切割，将目的基因直接插入。本方案中研究人员运用同源切割的方式在hCGβ 基因两端加上
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一组同源序列A、B，然后将hCGβ 基因与线性质粒载体混合后，在重组酶和DNA 连接酶的作用下可形成环
化质粒。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶是 。
(2)扩增基因表达载体。阶段Ⅱ将环化质粒导入用 处理的大肠杆菌，然后在含有 的培养基
中筛选得到含hCGβ 基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。
(3)鉴定基因表达载体。为了检验目的基因是否融合成功，提取大肠杆菌中的质粒为模板，设计相应的引
物对融合基因进行PCR，再将扩增产物进行电泳。电泳时需将待测样品与上样缓冲液混合后加入加样孔，
缓冲液中含有的溴酚蓝作为电泳指示剂，以防 。电泳后得到图2 所示结果，据图可判断 号
样品最符合要求。
(4)导入受体细胞。阶段IV 时，需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些
成分 （A．氨苄青霉素B．组氨酸C．无机盐D．琼脂），可在此培养基上生长的酵母菌即为含有
hCGβ 基因表达载体的目的菌株。
(5)目的基因检测与鉴定。转化成功后的酵母菌菌株接种到液体培养基中，30℃恒温摇床上培养后获得培
养物。将培养物离心后分出细胞和培养液两部分，细胞经 处理后，再次离心取上清液，用抗hCGβ
单克隆抗体分别进行检测。若培养液及上清液中均能检测到hCGβ 蛋白，则说明 。
(6)发酵罐生产。从生产控制的角度分析，选用AOX1 作为hCGβ 基因启动子的优势在于 。
1．同尾酶是指切割不同的DNA 片段后能产生相同黏性末端的一类限制酶，下列四种限制酶中属于同尾酶的
是（ ）
A．①③
B．②④
C．①③和②④
D．①④
2．通过PCR 的定点诱变技术获得的改良基因两侧的碱基序列和大肠杆菌的质粒（有氨苄青霉素抗性基因、
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LacZ 基因及一些酶切位点）结构如下图所示，研究者欲将改良基因导入大肠杆菌的质粒中保存。下列叙述
正确的是（ ）
A．使用PCR 技术扩增时需要一个引物、多个dNTP 及Mg2+等
B．实现质粒和改良基因的高效连接应选用限制酶SmaI
C．构建重组质粒需用到的酶有Xma Ⅰ、Nhe Ⅰ和DNA 连接酶
D．在含氨苄青霉素和β-半乳糖苷的培养基上，白色菌落的大肠杆菌含重组质粒
3．用氨苄青霉素抗性基因（AmpR)、四环素抗性基因（TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有
目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒），并导入受体菌中。根
据题目所提供的信息，下列叙述正确的是（ ）
A．若用ScaI 酶切质粒，所得产物经凝胶电泳可形成3 个条带
B．若用HindIII 和ScaI 酶切，一定可防止目的基因与质粒的反向连接
C．若用PvuI 酶切，在含四环素培养基中形成的菌落，一定含有目的基因
D．若用SphI 酶切，筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含四环素的培养基中长成菌落，再影印接种到
含氨苄青霉素的培养基中
4．CRISPR/Cas9 系统主要由向导RNA（SgRNA）和Cas9 蛋白两部分组成，SgRNA 可引导Cas9 蛋白到特定基
因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法正确的是（ ）
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A．Cas9 蛋白相当于限制酶，切割特定基因位点的脱氧核糖和碱基之间的化学键
B．向导RNA 可以在逆转录酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸
C．CRISPR/Cas9 基因编辑技术有时会因SgRNA 错误结合而出现“脱靶”现象，一般SgRNA 序列越长，脱
靶率越低
D．对不同目标DNA 进行编辑时，使用Cas9 蛋白和相同的sgRNA 进行基因编辑
5．CRISPR/Cas9 系统由单链的向导RNA（SgRNA）和内切核酸酶Cas9 构成，为高效获得特定基因敲除的斑
马鱼系，科研人员利用基因编辑技术（原理如下图所示），用化学方法合成特定的SgRNA,与Cas9mRNA 一
起注射到斑马鱼细胞，筛选出特定基因敲除的斑马鱼。下列说法错误的是（ ）
A．改造后的受体细胞经培养发育到囊胚或桑葚胚时，可将其进行冷冻保存或胚胎移植
B．图中SgRNA 通过碱基互补配对实现其引导功能
C．Cas9 蛋白的作用是破坏DNA 分子的磷酸二酯键
D．两种RNA 可通过显微注射法导入斑马鱼的卵细胞
6．重叠延伸PCR 可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示（凸起处代表突变位点）。下列说法正确的是
（ ）
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A．过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率
B．过程①需3 轮PCR 才能得到图中所示PCR 产物
C．过程②的产物都可以完成延伸过程
D．若过程④得到16 个突变的基因则需要消耗15 个通用引物RP2
7．大引物PCR 定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮
PCR 反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物（使单链DNA 延伸出互补链），第一轮产物作第二轮PCR
扩增的大引物，过程如图所示。下列叙述错误的是（ ）
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A．第一轮PCR 与第二轮PCR 的复性温度可能不同
B．定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录
C．第二轮PCR 所用的引物是第一轮PCR 的产物DNA 的两条链
D．将某功能蛋白的第17 位Cys 改造成Ser，属于蛋白质工程
8．某研究小组拟用限制酶和DNA 连接酶为基本工具，对目的基因和质粒进行切割、连接，以构建含目的基
因的重组表达载体。该小组前期研究获得如下2 个信息：①4 种限制酶的识别用列及切割位点、目的基因
所在的外源DNA 片段中各种酶识别位置以及质粒上4 种酶的识别位置（如下图）；②有些不同种类的酶能
识别DNA 分子中不同核苷酸序列，但切割产生相同黏性末端，这样的限制酶称为同尾酶。下列有关叙述错
误的是（ ）
A．构建重组表达载体时，目的基因和质粒均用酶3 切割，用E•coli DNA 连接酶连接成功率最高
B．构建重组表达载体时，目的基因用酶2 切割，质粒用酶4 切割，用T4DNA 连接酶连接成功率最高
C．目的基因和质粒均用酶1 切割，用T4DNA 连接酶连接构建重组表达载体既方便操作又容易成功
D．酶1 和酶3 属于同尾酶，切割产生相同的黏性末端，但不适宜使用二者来构建重组表达载体
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9．基因工程操作中经常用到多种工具，回答下列有关问题：
(1)图甲是与DNA 有关的五种酶分子的作用，除 （从酶1-5 中选填）之外，其余的酶均作用于DNA 的
键。其中酶2 与酶4 起作用时的区别有 （至少答出1 点）。
(2)同尾酶在基因工程中有特殊用途，当准备连接的两个DNA 分子中没有相同的限制酶识别序列时，可以用
同尾酶切割后进行连接，据此推测同尾酶是指 。
(3)图乙表示利用载体A 和基因m 构建基因表达载体的过程，基因m 中不存在与载体A 相同的限制酶切点。
据图可知，科研人员首先将载体A 用SmaI 切出 末端后形成线状DNA，而后在对基因m 进行PCR 扩增时，
设计的两种引物均需具备基因m 的末端序列及载体A 的同源序列。载体A 上的tet 是四环素抗性基因，Ampr
是氨苄青霉素抗性基因，若载体A 与基因m 经过适当的限制酶切割后形成了A-m 结合体，将结合体导入受
体细胞中，用含四环素和氨苄青霉素的培养基仍不能保证筛选出导入A-m 结合体的受体细胞，原因是 。
若用一定的方法能将基因m 插入到tet 内部，形成的A-m 结合体 （填“符合”或“不符合”）要求，
原因是 。
10．抗菌肽通常是由短氨基酸序列构成的小肽，具有广谱的杀菌活性，利用基因工程生产抗菌肽的难题之
一是大肠杆菌能识别外源蛋白并将其水解。某科研小组将抗菌肽基因与大肠杆菌自身的半乳糖苷酶基因连
接，组成融合基因，通过质粒构建基因表达载体并导入大肠杆菌中，以获得大量的抗菌肽。如图1、图2
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为融合基因和该实验所用质粒的结构示意图。请回答下列问题：
注：EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ为不同的限制酶，Amp 为氨苄青霉素抗性基因，
⁸
Tetⁿ 为四环素抗
性基因。
(1)分析图1 可知，利用PCR 技术扩增融合基因时，应选择的引物是 ，这样选择的理由是
（答出2 点）。
(2)为构建重组质粒并保证基因能定向插入质粒中，需选择限制酶 切割质粒和含融合基因的
DNA 片段。筛选重组质粒时，应将大肠杆菌分别接种到含氨苄青霉素和四环素的培养基上，若
，则说明重组质粒成功导入大肠杆菌细胞内。上述培养基可为大肠杆菌的生长繁殖提供的营养物质有
(3)该实验利用大肠杆菌获得抗菌肽时，将抗菌肽基因和大肠杆菌自身的半乳糖苷酶基因组成融合基因的
目的是 。
11．影响小鼠内耳形态的基因A 突变会导致遗传性耳聋，研究人员尝试进行基因治疗。
(1)CRISPR/Cas9 基因编辑系统由sgRNA 及Cas9 蛋白组成。图1 所示，sgRNA 与目标DNA 结合，引导Cas9 蛋
白切割靶序列的双链DNA，导致 键断裂。
(2)同源重组是指在DNA 断裂的情况下，含有同源区段的DNA 之间发生的重组。科研人员尝试利用同源重组
原理对耳聋小鼠进行基因治疗。
①利用 技术扩增野生型小鼠的基因A，再用图2 中的限制酶 切割基因A 与腺病毒载体形
成黏性末端，最后利用 酶进行拼接，构建腺病毒表达载体。科研人员尝试利用该载体与耳聋小鼠
的DNA 进行同源重组，效果不佳。
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②在上述基础上，科研人员又将sgRNA 基因、Cas9 基因接入了腺病毒表达载体（见图3），同时引入
sgRNA 的识别序列，目的是 。图3 所示的腺病毒表达载体还需要哪些必要的结构或基因 （多
选）。
A．启动子和终止子
B．RNA 聚合酶基因
C．标记基因
D．起始密码子和终止密码子
E．反密码子
F．复制原点
(3)将腺病毒表达载体注入耳聋小鼠的单侧耳组织细胞。为评估该治疗方案的效果，研究人员使用同一只
小鼠的非注射耳作为对照，而不是另一只没有注射腺病毒表达载体的小鼠，好处是可以排除 对实
验结果的影响。
(4)进一步研究结果表明该方案可以有效纠正小鼠的突变基因，从而治疗小鼠的遗传性耳聋。人体内基因A
突变也会导致遗传性耳聋，欲将该方案用于临床治疗，从安全性角度还应关注 。
12．回答下列问题：
Ⅰ、下图表示某细菌细胞中某基因的表达过程。请回答：
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(1)⑤上的AGA 称为 ，③上的AGA 称为 。
(2)图中RNA 对应的DNA 片段连续复制5 次，共需要游离的胸腺嘧啶脱氧核苷酸数目为 个。
(3)杂合子Aa 连续自交，且逐代淘汰隐性个体，自交n 代后，显性个体中，杂合子所占比例是 ，
纯合子所占比例是 。若杂合子 Aa 连续自由交配n 代，且逐代淘汰隐性个体后，显性个体中，
纯合子比例为 ,杂合子比例为 。
Ⅲ、利用重叠延伸PCR 技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。
(4)PCR1 过程中，加入的引物是 ，经过 轮扩增，可以获得产物AB。
(5)PCR2 过程中，加入的引物是 ，PCR3 过程中，加入的引物是 。
(6)经过过程①获得的杂交DNA 有 种。
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