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专题25 基因工程
1．（2023·天津·统考高考真题）根据下图，正确的是（ ）
A．子代动物遗传性状和受体动物完全一致
B．过程1 需要MII 期去核卵母细胞
C．过程2 可以大幅改良动物性状
D．过程2 为过程3 提供了量产方式，过程3 为过程1、2 提供了改良性状的方式
2．（2023·湖南·统考高考真题）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物
AT1 蛋白通过调节细胞膜上PIP2s 蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是
（ ）
A．细胞膜上PIP2s 蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s 蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1 基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
3．（2023·湖北·统考高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因
构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体
（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
1
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A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet 的培养基中能形成菌落
4．（2023·浙江·统考高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型
小鼠Gata3 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以期
获得Gata3-GFP 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2 用
于PCR 扩增，PCR 产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子无法控制GFP 基因的表达
B．翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C．2 号条带的小鼠是野生型，4 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
5．（2023·山西·统考高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3 和酶4）、DNA 连接酶为工具，将
目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限
制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
B．质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割，用T4 DNA 连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割，用T4 DNA 连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割，用E. coli DNA 连接酶连接
6．（2023·江苏·统考高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质
粒，如图1 所示。请回答下列问题：
2
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(1)分别进行PCR 扩增片段F1 与片段F2 时，配制的两个反应体系中不同的有
，扩增程序中最主要的不同是
。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R 应在下列选项中选用__________________。
A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一
过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有
。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_____________。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300 个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F 和F2-R 进行了
PCR 扩增，质粒P1~P4 的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有
。
3
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(6) 对于PCR 产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是
。
7．（2023·北京·统考高考真题）变胖过程中，胰岛B 细胞会增加。增加的B 细胞可能源于自身分裂（途径
I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了
L 基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK 中新增B 细胞的来源。
(1)EdU 和BrdU 都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA 中，掺入DNA 的EdU 和
BrdU 均能与
互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU 和BrdU 短时间内即被
降解。
(2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一
组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU 标记细胞的百分
比（如图）。图中反映DNA 复制所需时长的是从 点到 点。
(3)为研究变胖过程中B 细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，
即饲喂诱导物后小鼠的L 基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L 基因两侧已插入特异DNA 序列（x），但L 的功能正常；②Ce 酶基因：源自噬菌
体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x 间的DNA 片段丢失；③Er 基因：编码的Er 蛋白位于
细胞质，与Er 蛋白相连的物质的定位由Er 蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er 蛋白进入细
胞核。请完善制备小鼠IK 的技术路线：
→连接
到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→
→获得小鼠IK。
4
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(4) 各种细胞DNA 复制所需时间基本相同，但途径I 的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的
三倍以上。据此，科学家先用EdU 饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU 饲喂，再过t2时间后检测B 细胞被标
记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B 细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是
。
8．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新
型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB 法）。图1 与图2 分别是利用常规转化法和
CDB 法在某植物中递送基因的示意图。
回答下列问题。
(1) 图1 中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于
；从愈伤组织到幼苗的培养过程需
要的激素有生长素和
，该过程还需要光照，其作用是
。
(2)图1 中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A 的
。图1 中，含有外源基因的转化植株A 若用于生产种子，其包装需标注
。
(3)图1 与图2 中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是
。
(4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS 基因的CRISPR/Cas9 基因编辑载体
（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2 中的CDB 法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得
转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是
，图2 中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是
，依据是
。
(5)与常规转化法相比，采用CDB 法进行基因递送的优点是
（答出2 点即可）。
9．（2023·天津·统考高考真题）基因工程：制备新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多
5
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种酶，推测这些酶生效的场所应该是
（填“细胞内”和“细胞
外”）。
(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA 连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小
段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用同
源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A．B，已知酵母菌体内DNA 有许多A-B 序列位点可以
同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物
对目的基因进
行PCR。
(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳
清酸转化为对酵母菌有毒物质。
（i）导入目的基因的酵母菌应在
的培养基上
筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA 基因，
再重新导入。研究人员在UGA 基因序列两端加上酵母菌DNA 中不存在的同源C．C’序列，以便对UGA
基因进行切除。C．C’的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA 片段在切割后是否可
以顺利重连，如图，则应选择方式
进行连接。
（ii）切去UGA 基因的酵母菌应在
的培养基上筛选培养。
(4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图
。
6
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10．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部
分结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是
。除图甲中标出的结构外，作为载体，质
粒还需具备的结构有
（答出2 个结构即
可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，
应选择图甲中的引物
。已知J 基因转录的模板链位于b 链，
由此可知引物F1 与图甲中J 基因的 （填“a 链”或“b 链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达
水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1 证明细胞内表达了
，
条带2 所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J 基因表达的。
11．（2023·全国·统考高考真题）GFP 是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP 基因
为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库，科研人员将GFP 基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP
基因的突变基因文库。通常，基因文库是指
。
(2) 构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP 突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建
表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP 突变基因的转录方向）。图中①为
；②为
，其作用是
；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是
。
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(3) 目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色
荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是
（答出1 点即可）。
(4) 新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP 突变基
因进行测序，发现其碱基序列与GFP 基因的不同，将该GFP 突变基因命名为YFP 基因（黄色荧光蛋白基
因）。若要通过基因工程的方法探究YFP 基因能否在真核细胞中表达，实验思路是
。
12．（2023·全国·统考高考真题）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙
肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA 病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因
工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是
。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表
达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是
。能识别载体
中的启动子并驱动目的基因转录的酶是
。
(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取
进行DNA 分子杂交，DNA 分子杂交时应使用的探针是
。
(5) 若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
。
13．（2023·浙江·统考高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。
某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体
融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：
(1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备
的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼
苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的 为外植体。
(2)植物细胞壁的主要成分为
和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处
理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的
失活。对处理后的原生质体在显微镜下用
计数，确定原生质体
密度。两种原生质体1∶1 混合后，通过添加适宜浓度的PEG 进行融合；一定时间后，加入过量的培养基
进行稀释，稀释的目的是
。
(3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，
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并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于
。
下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？
A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂
B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂
C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂
D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂
(4)愈伤组织经 可形成胚状体或芽。胚状体能长出
，直接发育形成再生植株。
(5)用PCR 技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA 序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA
序列b；M1、M2为序列a 的特异性引物，N1、N2为序列b 的特异性引物。完善实验思路：
Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR 扩增的
。
Ⅱ．将DNA 提取物加入PCR 反应体系，
为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序
列b。
Ⅲ．得到的2 个PCR 扩增产物经
后，若每个PCR 扩增产物在凝胶中均出现了预
期的 个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
14．（2023·广东·统考高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行
诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI 基因发生一个碱基G 到A 的替
换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株
的种子大小应与
植株的种子大小相近。
(2)用PCR 反应扩增DAI 基因，用限制性核酸内切酶对PCR 产物和
进行切割，用
DNA 连接酶将两者连接。为确保插入的DAI 基因可以正常表达，其上下游序列需具备
。
(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个
位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目
的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基
因组中插入了
。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养
基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株
（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得
的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因
植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR 扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核
酸内切酶X 切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置
的条带涂黑。
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。
1．（2022·辽宁·统考高考真题）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5 是我国自主研发的转基因品种。为给监管转
基因生物安全提供依据，采用PCR 方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（
）
A．预变性过程可促进模板DNA 边解旋边复制
B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
2．（2022·河北·统考高考真题·多选）人染色体DNA 中存在串联重复序列，对这些序列进行体外扩增、电
泳分离后可得到个体的DNA 指纹图谱。该技术可用于亲子鉴定和法医学分析。下列叙述错误的是
（ ）
A．DNA 分子的多样性、特异性及稳定性是DNA 鉴定技术的基础
B．串联重复序列在父母与子女之间的遗传不遵循孟德尔遗传定律
C．指纹图谱显示的DNA 片段属于人体基础代谢功能蛋白的编码序列
D．串联重复序列突变可能会造成亲子鉴定结论出现错误
3．（2022·天津·高考真题）研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1 导入谷氨
酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
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(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1 中含有KanR（卡那霉素抗性基因）和SacB 两个标记基
因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物 和 ，并在引物的 （5＇∕3＇）端
引入XhoⅠ酶识别序列，进行PCR 扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
(2)PCR 扩增载体3 中筛选效率较高的标记基因RpsL（链霉素敏感基因）时，引物应包含
（EcoRⅠ∕HindⅢ∕XhoⅠ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2 构建高效筛选载体4。
(3)将改进的P1 基因整合到载体4 构建载体5。将载体5 导入链霉素不敏感（由RpsL 突变造成）、卡那霉
素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5 的菌株，应采用含有 的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1 基因脱离载体5 并整合到受体菌拟核DNA，且载体5 上其他DNA 片
段全部丢失。该菌的表型为__________。
A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感
B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C．卡那霉素和链霉素都敏感
D．卡那霉素和链霉素都不敏感
(5)可采用 技术鉴定成功整合P1 基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
4．（2022·重庆·统考高考真题）改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下乘凉梦”的一种可能
途径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui 基因，并开展了相关探索。
步骤I：
步骤II：
(1) 花药培养能缩短育种年限，原因是
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。在步骤I 的花药培养过
程中，可产生单倍体愈伤组织，将其培养于含
的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。I
中能用于制造人工种子的材料是 。
(2) 步骤II 中，eui 基因克隆于cDNA 文库而不是基因组文库，原因是
；在构建重组Ti 质粒时使
用的工具酶有 。为筛选含重组Ti 质粒的菌株，需在
培养基中添加 。获得的农杆菌菌株经鉴定后，应侵染I 中的
，以获得转基因再生植株。再生植株是否含有eui 基因的鉴定方法是 ，移栽后
若发育为更高且丰产的稻株，则可望“禾下乘凉”。
5．（2022·江苏·统考高考真题）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究
纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
(1)纤毛结构如图1 所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能
是 。
(3) 某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X 是否发生了变异，对基因X 进行了PCR 扩
增与产物测序。从细胞样品中分离DNA 时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA 分离出来，溶
液中添加NaC1 至2．0mo1/L 的目的是 。PCR 扩增时，需在
催化下，在引物 端进行DNA 链的延伸，获得扩增产物用于测
序。
(3)为研究蛋白质X 在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP 与X 的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，
可示其在细胞内位置。将X-GFP 基因融合片段M 导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M 重组质粒（在
EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。
分步实验目标
简易操作、结果、分析
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PCR 鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融
合片段M 中有白色的箭头，代表方向）
①选择图Ⅱ引物 ；
②PCR 目的产物约为 bp。
确保M 及连接处序列正确，Y-M 的连接
处上游含有Hind III+EcoR V 的识别序
列，下游含有EcoR V+BamH I 的识别序
列
③质粒测序，图Ⅲ中正确的是 （选填序列编号）
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M 分别导入细
胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在
纤毛基部，说明 。
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z 表达的变化，采用荧光定量PCR 法检测健康人与病人基因Z 的转录水平。
采集样本、提取总RNA，经 形成cDNA 作为模板，PCR 扩增结果显示，在总cDNA 模板量
相等的条件下，健康人Ct 值为15，而病人Ct 值为20（Ct 值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR 循环
数）。从理论上估算，在PCR 扩增20 个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的
倍。
6．（2022·河北·统考高考真题）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶
抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答
下列问题：
(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是 。
(2) 是实施基因工程的核心。
(3)利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的
上，此方法的不足之处是
。
(4) 为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有
（写出两点即可）。
(5) 确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的
以鉴定其抗性程度。下图为
三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析
（填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是
。
(6)基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生 。
导致昆虫朝着一定的方向不断进化。提此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了
抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是
（写出两点即可）。
7．（2022·北京·统考高考真题）生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E 物质）污染
会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖
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细胞等存在E 物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经
济且快速的水体E 物质监测方法。
(1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是
。
(2)为监测E 物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE 和酵母来源的UAS 是
两种诱导型启动子，分别被E 物质-受体复合物和酵母来源的Gal4 蛋白特异性激活，启动下游基因表达。
与方案1 相比，方案2 的主要优势是
，因而被用于制备监测鱼（MO）。
(3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM 需经MO 和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，
需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将
选项的序号填入相应的方框中。
Ⅰ.启动子：
。
①ERE ②UAS ③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P 生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P 肌）
Ⅱ.基因：
。
A．GFP B．Gal4 C．雌激素受体基因（ER） D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）
(4)SM 不育的原因是：成体SM 自身产生雌激素，与受体结合后
造成不育。
(5)使拟用于实际监测的SM 不育的目的是
。
8．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P 引发，蛋白UBC 可使P 被蛋白酶识别并降解，药
物A 可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A 治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融
合蛋白FLAG-P 和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG 是一种短肽，连接在P 或P△的氨基
端，使融合蛋白能与含有FLAG 抗体的介质结合，但不影响P 或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR 特异性扩增P 基因。用于扩增P 基因的引物需满足的条件是
、为使PCR 产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引
物的 （填“3'端”或“5'端”）。
(2)PCR 扩增得到的P 基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG 的序列形成一个融合基因，如图甲所示，
其中“ATGTGCA”为P 基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA 序列正
确，翻译出的融合蛋白中FLAG 的氨基酸序列正确，但P 基因对应的氨基酸序列与P 不同。据图甲分析，
出现该问题的原因是
。修改扩增P 基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是
14
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。
(3) 融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A 和UBC 按照图乙中的组合方式分成5 组。各组
样品混匀后分别流经含FLAG 抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC 抗体检测，检测结果如图
丙所示。已知FLAG-P 和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A 的作用是
；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中
缺失的特定序列的作用是 。
(4)根据以上结果推测，药物A 治疗该病的机理是 。
9．（2022·湖南·高考真题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，
具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a 是 ，物质b 是 。
在生产过程中，物质b 可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是
。
(2) 蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有
、 和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基
本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所
示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的
（填“种类”或“含量”）有关，
导致其活性不同的原因是
。
(3) 若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要
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写出实验设计思路
。
10．（2022·广东·高考真题）“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于
某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）
为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对 ，利用PCR 技术，在优化反应
条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合
成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是
，终止子的作用是
。
(4) 培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是
，此外丙酮的积累会伤
害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(5) 这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了 ，体现了循环经济
特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于
，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
11．（2022·全国·统考高考真题）新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作
用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA 病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR 法。这种方法的基本原
理是先以病毒RNA 为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是 ，再通过PCR 技
术扩增相应的DNA 片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR 引物时必须依据新冠病毒RNA 中的
来进行。PCR 过程每次循环分为3 步，其中温度最低的一步是 。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果为阴
性而抗体检测结果为阳性，说明 （答出1 种情况即
可）；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明
。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）的
编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操
作流程是
。
12．（2022·福建·统考高考真题）美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生
的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14 的单克
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隆抗体，具体方法如下。回答下列问题：
（一）基因工程抗原的制备
(1)根据美西螈CD14 基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR 扩增CD14 片段。已知DNA 聚合酶催化引
物的3’—OH 与加入的脱氧核苷酸的5’—P 形成磷酸二酯键，则新合成链的延伸方向是
（填“ 5’→3’ ”或“ 3’→5’ ”）。
(2) 载体和CD14 片段的酶切位点及相应的酶切 抗性基因序列如图1 所示。用Xho I 和Sal 1 分别酶切CD14
和载体后连接，CD14 接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA．可进一步用这两种限制酶
对CD14 的连接方向进行鉴定，理由是
。
培养能表达CD14 蛋白的大肠杆菌，分离纯化目的蛋白。
（二）抗CD14 单克隆抗体的制备流程如图2 所示：
(3)步骤①和步骤⑤分别向小鼠注射 和 。
(4)步骤②所用的SP2/0 细胞的生长特点是 。
(5)吸取③中的上清液到④的培养孔中，根据抗原—抗体杂交原理，需加入
进行专
一抗体检测，检测过程发现有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14 抗体，原因是
。
(6)步骤⑥从 中提取到大量的抗CD14 抗体，用于检测巨噬细胞。
1．（2021·江苏·高考真题）下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是（
）
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A．分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA 序列
B．该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上
C．若要获得除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组
D．获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
2．（2021·湖北·统考高考真题）某实验利用PCR 技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引
物与模板完全配对）外，还有2 条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产
生，以下措施中有效的是（ ）
A．增加模板DNA 的量
B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间
D．提高复性的温度
3．（2021·湖北·统考高考真题）限制性内切酶EcoRI 识别并切割
双链DNA，用EcoRI
完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA 片段的平均长度（碱基对）约为（ ）
A．6
B．250
C．4000
D．24000
4．（2021·山东·统考高考真题）我国考古学家利用现代人的 DNA 序列设计并合成了一种类似磁铁的“引
子”，成功将极其微量的古人类 DNA 从提取自土壤沉积物中的多种生物的 DNA 中识别并分离出来，用
于研究人类起源及进化。下列说法正确的是（ ）
A．“引子”的彻底水解产物有两种
B．设计“引子”的 DNA 序列信息只能来自核 DNA
C．设计“引子”前不需要知道古人类的 DNA 序列
D．土壤沉积物中的古人类双链 DNA 可直接与“引子”结合从而被识别
5．（2021·江苏·高考真题）某小组为研究真菌基因m 的功能，构建了融合表达蛋白M 和tag 标签的质粒，
请结合实验流程回答下列问题：
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(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞 ，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m 片段。
②为了获得融合tag 标签的蛋白M，设计引物P2 时，不能包含基因m 终止密码子的编码序列，否则将导致
。
③热启动PCR 可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA 聚合酶（Taq 酶）以外的各成分混合后，加
热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR 扩增，下列叙述正确的有
A．Taq 酶最适催化温度范围为50～60℃
B．与常规PCR 相比，热启动PCR 可减少反应起始时引物错配形成的产物
C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
D．PCR 产物DNA 碱基序列的特异性体现了Taq 酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将Sma I 切开的载体A 与添加同源序列的m 混合，用特定DNA 酶处理形成黏性末端，然后降温以促进
，形成A-m 结合体。将A-m 结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA 聚合酶及
酶等，完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A—m 仍能被Sma I 切开，则Sma I 的酶切位点可能在
。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3 基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，然后涂布于无尿
嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是
。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag 标签，说明 ，
后续实验可借助tag 标签进行蛋白M 的分离纯化。
6．（2021·海南·高考真题）CRISPR/Cas9 是一种高效的基因编辑技术，Cas9 基因表达的Cas9 蛋白像一把
“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA 双链以敲除目标基因或插入新的基因。
CRISPR/Cas9 基因编辑技术的工作原理如图所示。
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回答下列问题。
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9 重组质粒，需对含有特定sgRNA 编码序列的DNA 进行酶切处理，然后
将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是 。
(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是 。
(3)过程③~⑤中，SgRNA 与Cas9 蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA 可识别并与目标DNA 序列特异
性结合，二者结合所遵循的原则是 。随后，Cas9 蛋白可切割
序列。
(3) 利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除一个长度为1200bp 的基因，在DNA 水平上判断基因敲除是否成
功所采用的方法是 ，基因敲除成功的判断依据是
。
(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9 质粒中获得重组
质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA 中，构建得到能
大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9 重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因
组DNA 的编辑过程：
。
7．（2021·福建·统考高考真题）微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广
泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT 基因导入大肠杆菌构
建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MTcDNA 的核苷酸序列设计了相应的引物（图1 甲），通过PCR 扩增MT 基因。已知A 位
点和B 位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为
。
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(2)本实验中，PCR 所用的DNA 聚合酶扩增出的MT 基因的末端为平末端。由于载体E 只有能产生黏性末
端的酶切位点，需借助中间载体P 将MT 基因接入载体E。载体P 和载体E 的酶切位点及相应的酶切序列
如图1 乙所示。
①选用 酶将载体P 切开，再用 （填“T4DNA 或“E·coli81DNA”）连接酶将MT 基
因与载体P 相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT 基因的 和 。选用 酶组合对载体P′和载体E 进
行酶切，将切下的MT 基因和载体E 用DA 连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用 离子处
理的大肠杆菌，筛出MT 工程菌。
(3)MT 基因在工程菌的表达量如图2 所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT
工程菌，理由是 。
8．（2021·辽宁·统考高考真题）PHB2 蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2 蛋白抑制
人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2 基因），大小
为0．9kb（1kb=1000 碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
(1)为获取phb2 基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经
过程得到cDNA，将其作为
PCR 反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1 为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2 基因（该基因序列
不含图1 中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2 基因两端分别引入 和
两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2 基因和载体进行连接时，可选用 （填
“E．coliDNA 连接酶”或“T4DNA 连接酶”）。
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相关限制酶的识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcoRI
G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
PstI
CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnI
G↓GTACC
CCATG↑G
BamHI
G↓GATCC
CCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、
4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，
号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M 为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb 的DNA 分子条带未出现在图中
(5)将纯化得到的PHB2 蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24 小时后，检测处于细胞周期
（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是
将细胞阻滞在细胞周期的 （填“G1”或“S”或“G2/M”）期。
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9．（2021·天津·统考高考真题）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸
能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的
工程菌株。下图1 为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2 为构建表达载体时所需的关键条件。
(1)乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为 。
(2)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG 转变为真核生物偏好的ATG，且能通
过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1 和2。其中引物1 的5′端序列应考虑
和 。
②将上述PCR 产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有
，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录
系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列 （能/不能）在大肠杆菌中高效
表达。
③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在 的固体
培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。
(3)以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提
高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。
A．进一步优化发酵条件
B．使用乳酸菌LDH 基因自身的启动子
C．敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因
D．对转基因酿酒酵母进行诱变育种
10．（2021·北京·统考高考真题）新冠病毒（SARS-CoV-2）引起的疫情仍在一些国家和地区肆虐，接种疫
苗是控制全球疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多种，其中我国科学家已研发出的腺病毒载体重组新冠
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病毒疫苗（重组疫苗）是一种基因工程疫苗，其基本制备步骤是：将新冠病毒的S 基因连接到位于载体上
的腺病毒基因组DNA 中，重组载体经扩增后转入特定动物细胞，进而获得重组腺病毒并制成疫苗。
(1)新冠病毒是RNA 病毒，一般先通过 得到cDNA，经 获取S 基因，
酶切后再连接到载体。
(2)重组疫苗中的S 基因应编码________。
A．病毒与细胞识别的蛋白
B．与病毒核酸结合的蛋白
C．催化病毒核酸复制的酶
D．帮助病毒组装的蛋白
(3)为保证安全性，制备重组疫苗时删除了腺病毒的某些基因，使其在人体中无法增殖，但重组疫苗仍然可
以诱发人体产生针对新冠病毒的特异性免疫应答。该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗→
→ →诱发特异性免疫反应。
(4)重组疫苗只需注射一针即可完成接种。数周后，接种者体内仍然能检测到重组腺病毒DNA，但其DNA
不会整合到人的基因组中。请由此推测只需注射一针即可起到免疫保护作用的原因
。
11．（2021·山东·统考高考真题）人类γ 基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位
点结合 BCL11A 蛋白后，γ 基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ 基因表达的抑制，
可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ 基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入
表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图
可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是
，在 R 末端添加的序列所对
应的限制酶是
。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要
种
酶。
（2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表
达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细
胞无荧光的原因是
。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R
扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ 基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的
结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于
，理由是
。
12．（2021·浙江·统考高考真题·节选）回答下列（一）小题：
（一）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以
及药物毒性与安全性评价等。
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（1）由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体
，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼
每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。
（2）为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载
体形成
，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、
并有利于获得含该目的基因的 DH5α 阳性细胞克隆，质粒载体应含有
（答出2 点即可）。提取质粒后，采用
法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并
观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。
（3）为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用
分散斑马鱼囊胚的内细胞
团，取分散细胞作为初始材料进行
培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为
，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。
13．（2021·河北·统考高考真题）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用
植物修复技术将土壤中的Cd 富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），
可降低土壤中Cd 的含量。为提高植物对Cd 污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd 转运蛋白
（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
（1）为获取YCF1 基因，将酵母细胞的全部DNA 提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，
这个群体称为
。
（2）将DNA 序列插入Ti 质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是
。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是
。
（3）进行前期研究时，将含有YCF1 基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是
。研究者进一步获得了转YCF1 基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材
料的目的是
。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd 污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同
器官中Cd 含量（图2）。据图1 可知，与野生型比，转基因植株对Cd 具有更强的
（填“耐性”或“富集能力”）；据图2 可知，对转基因植株的
进行后续处理对于缓解土壤
Cd 污染最为方便有效。
（5）已知YCF1 特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高
Cd 环境的原因是
。
相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd 污染土壤修复植物的优势在于
（写出两点即可）。
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14．（2021·全国·统考高考真题）PCR 技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，
医生进行了相关操作：①分析PCR 扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR 扩增DNA 片
段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是
（用数字序号表示）。
（2）操作③中使用的酶是
。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、
三步，其中复性的结果是
。
（3）为了做出正确的诊断，PCR 反应所用的引物应该能与
特异性结合。
（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指
。
该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
15．（2021·广东·统考高考真题）非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体
系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4 步酶促反应的非
细胞合成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造
成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR 技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有
。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA 模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA 模板时必须除去蛋
白，方法有 。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21 作为受体细胞、pET20b 为表达载体分别进行4 种酶的表达。表达载体
转化大肠杆菌时，首先应制备
细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用
的方法有 。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH 等条件下，将4 种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。
若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是
。在分子水平上，可以通过改变
，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
16．（2021·全国·高考真题）用DNA 重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生
物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4 种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
（1）常用的DNA 连接酶有E. coli DNA 连接酶和T4DNA 连接酶。上图中
酶
切割后的DNA 片段可以用E. coli DNA 连接酶连接。上图中
酶切割
后的DNA 片段可以用T4DNA 连接酶连接。
（2）DNA 连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是
。
（3）DNA 重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA 分子上有复制原点，可以保证质粒在受
体细胞中能
；质粒DNA 分子上有
，便于外源
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DNA 插入；质粒DNA 分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的
宿主细胞，方法是
。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指
。
一、单选题
1．回文序列是一段特定的核苷酸片段，其特点是一条核苷酸链与其互补链从5'端到3'端的碱基序列相同。
短回文序列往往是限制酶的识别位点，下列叙述正确的是（ ）
A．回文序列中（A+T）的数目与（C+G）的数目相等
B．回文序列可能会存在于质粒中
C．限制酶作用于回文序列的氢键
D．短回文序列均由6 个核苷酸组成
2．为研究拟南芥植株E 基因的功能，科研人员将T-DNA 插入到E 基因中，导致其发生突变，突变后的基
因记为e。为验证某拟南芥植株的基因型，科研人员根据基因E 和T-DNA 的序列，设计了三种引物，引物
的结合位置如图所示。已知完整的E 基因和T-DNA 整合后，因片段长度过大，不能完成整个融合基因的
PCR 扩增。科研人员提取该植株的总DNA，分别用引物“I+III”组合及“II+III”组合进行PCR，两种引物
组合均能完成扩增。拟南芥植株的基因型为（ ）
A．Ee
B．EE
C．ee
D．EE 或Ee
【3．科研人员为研究昆虫中的热激蛋白基因（GdHsp60） 的功能，利用显微注射技术将绿色荧光蛋白基
因对应的双链 RNA 片段（dsGFP） 和热激蛋白基因对应的双链RNA 片段（dsGdHsp60）分别导入昆虫
幼虫，一段时间后检测热激蛋白的表达量以及昆虫幼虫的结冰点，结果如图。下列叙述错误的是（ ）
A．dsGFP 对热激蛋白的表达没有显著影响
B．dsGdHsp60 抑制了热激蛋白基因的转录或翻译
C．对照组和 dsGdHsp60 组利用“减法原理”控制自变量
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D．推测当机体受到冷胁迫时，GdHsp60 基因大量表达
4．下列有关PCR 的叙述，错误的是（ ）
A．退火温度和延伸时间均与引物有关
B．常用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物
C．PCR 时需加入DNA 聚合酶和解旋酶
D．可用细胞的基因组DNA 作为模板
5．下列关于DNA 重组技术基本工具的说法，正确的是（ ）
A．DNA 连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成氢键
B．限制酶切割DNA 后一定能产生黏性末端
C．质粒是基因工程中唯一的载体
D．微生物中的限制性核酸内切酶对自身DNA 无损害作用
6．某小组通过PCR（假设引物长度为8 个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA 片段，并用限
制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（ ）
A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇
B．步骤①所用的酶是SpeI 和CfoI
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2 个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli 连接酶或T4连接酶
7．CD163 蛋白是PRRSV 病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163 蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋
白RFP 基因与CD163 基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去
（ ）
A．CD163 基因中编码起始密码子的序列
B．CD163 基因中编码终止密码子的序列
C．RFP 基因中编码起始密码子的序列
D．RFP 基因中编码终止密码子的序列
8．常见的启动子可分为三类：组织特异型启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达；组成型启动子，
驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达；诱导型启动子，通常在光、盐等信号作用下，使目的基因
的转录水平有所提高。下列叙述正确的是（ ）
A．启动子是一段有特殊序列结构的DNA 片段，是DNA 聚合酶识别和结合的部位
B．细胞分化与组织特异型启动子的调控有关，与组成型启动子无关
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C．乳腺生物反应器的构建需要将组成型启动子与目的基因连接
D．植物在长日照下开花，与诱导型启动子被激活有关
9．一种天然蛋白t-PA 能高效降解因血浆纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药，但是心梗
患者注射大剂量的t-PA 会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA 第84 位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低
其诱发出血的副作用。据此，先对天然t-PA 基因的碱基序列进行改造，然后再采取传统的基因工程方法表
达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良t-PA 蛋白。（注：下图表示相关的目的基因、载体及限制酶。
pCLY11 为质粒）下列不正确的是（ ）
A．改造后的t-PA 基因的黏性末端如上图所示，则需要选用限制酶XmaⅠ和NheⅠ切割质粒pCLY11
B．成功转入重组质粒的受体细胞在培养基上会出现白色菌落
C．以上技术制造出性能优异的改良t-PA 过程被称为蛋白质工程
D．改良t-PA 基因的表达可在一定程度上降低发颅内出血的概率
10．载体是基因工程中携带外源DNA 片段（目的基因）进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型
主要有基因克隆载体和基因表达载体。下图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图，下列相关叙述正
确的是（ ）
A．重组载体A、重组载体B 分别是基因表达载体和基因克隆载体
B．载体A 和载体B 都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因
C．必须把目的基因插入重组载体A 的启动子和终止子之间
D．培养细菌A 和细菌B 的培养基在营养成分和功能上没有明显差异
11．亚洲棉的突变型光籽和野生型毛籽是一对相对性状。研究人员发现，亚洲棉某突变体的光籽表型与8
号染色体的880kb 至903kb 区间相关，研究人员根据野生型毛籽棉的该区间设计连续的重叠引物进行
PCR，经过琼脂糖凝胶电泳后结果如图所示。下列选项错误的是（ ）
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A．应提取该突变体和野生型亚洲棉的8 号染色体上的DNA 进行PCR 扩增
B．该突变体出现的根本原因是引物6 对应的区间发生了碱基对的替换
C．凝胶中的DNA 分子经染色后可以在波长为300nm 的紫外灯下被检测出来
D．该突变体的出现改变了该种群的基因频率，为生物进化提供了原材料
12．新冠病毒、甲流病毒等微生物都会导致高烧等症状，靠临床表现难以进行区分和鉴定，多重 PCR—电
泳技术，可对多种病原体同时进行鉴别检测。多重 PCR—电泳技术指在同一个 PCR 反应体系中加入多对
引物，扩增相应的目的基因，产生不同长度的片段﹐再通过电泳进行分离和识别。下列相关叙述错误的是
（ ）
A．多重 PCR 过程中，不同引物的碱基排列顺序不能互补
B．PCR 过程复性阶段的温度过低，会导致非特异性条带增加
C．在电场作用下，带电分子一般向着与它所带电荷相同的电极移动
D．不同大小和构象的 DNA 分子在电泳时，迁移的速率不同
13．研究人员通过PCR 扩增质粒pDNR-LIB 中的sacB 基因，该基因的产物对蔗糖敏感，是一种常见的反
选择标记基因。tetA 是四环素抗性基因，利用基因工程将sacB 基因插入到质粒pAH162 上，构建含有tetA-
sacB 双重选择系统的重组质粒，即pAH162-sacB,具体过程如图所示。将pAH162-sacB 导入大肠杆菌验证其
双重选择作用。下列分析错误的是（ ）
A．将sacB 基因插入到pAH162 上需要的限制酶是BamHI、EcoRI
B．需用Ca2+处理大肠杆菌细胞使其能主动吸收周围环境中的DNA 分子
C．为保证正向连接，PCR 时应在sacB 基因上游引物的5'端添加BamHI 识别序列
D．大肠杆菌能在含四环素的培养基中生长说明双重选择系统的重组质粒构建成功
14．RDX 是一种弹药使用后残留的危险污染物。研究人员将两个源于细菌的RDX 降解酶基因 XplA 和
XplB 插入柳枝稷草染色体中，如图所示，使柳枝稷草获得降解实弹射击场土壤中RDX 的能力。若要通过
PCR 检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的XplA 和 XplB 基因，应选择的引物组合是（ ）
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A．引物 1+引物3
B．引物 1+引物4
C．引物2 +引物3
D．引物2+引物4
15．某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3 基因一端，如图
甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1 只，交配以期获得Gata3-GFP 基因纯合子
小鼠。为了鉴定交配获得的4 只新生小鼠的基因型，设计了引物1 和引物2 用于PCR 扩增，PCR 产物电泳
结果如图乙所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3 基因的启动子可以控制GFP 基因的表达
B．翻译时先合成Gata3 蛋白，再合成GFP 蛋白
C．4 号条带的小鼠是野生型，2 号条带的小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子
D．若用引物1 和引物3 进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
16．科研人员将目的基因J 与质粒构建重组表达载体，该质粒的部分结构如图所示，下列叙述错误的是（
）
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A．除图中标出的结构外，质粒还需具备的结构有复制原点、标记基因、限制酶切位点等
B．与图中启动子结合的酶是RNA 聚合酶
C．用PCR 检测J 基因连接到质粒中且方向正确可选用的一对引物是F1和R2
D．若J 基因转录的链位于b 链，可知引物F1与基因J 的b 链相应部分序列相同
17．表观遗传调节异常是肿瘤发生发展的重要因素之一，N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA 上最常
见的一种修饰。研究发现，胃癌细胞中存在m6A 去甲基化酶（ALKBH5）过表达和STC2（癌症相关基
因）mRNA 的m6A 修饰水平降低的异常现象。科研人员利用基因工程技术实现ALKBH5 基因沉默和STC2
基因的过表达，以研究ALKBH5 介导的m6A 甲基化修饰对胃癌细胞迁移的影响（其中STC2 基因的α 链为
转录的模板链）。研究人员分别用不同方式处理胃癌细胞，并测得胃癌细胞迁移标志蛋白含量如图3 所示。
下列说法正确的是（ ）
注：A、B、C、D 为四种引物序列；BamHⅠ、HindⅢ、SacⅠ为限制酶
A．PCR 反应体系需要加入耐高温的DNA 聚合酶，该酶主要在复性过程起作用
B．利用PCR 扩增目的基因时，需要在引物B 的5＇端添加BamHⅠ识别序列和强启动子序列
C．为确保目的基因正确插入质粒，需要选择限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割质粒
D．据图3 可知，ALKBH5 基因过表达导致STC2 基因表达的mRNA 去甲基化
18．科研人员利用PCR 技术扩增X 基因片段，需加入两种引物，引物结合位置如图甲所示。PCR 循环后
产生五种DNA 分子，如图乙所示。下列叙述正确的是（ ）
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A．利用DNA 聚合酶和DNA 连接酶才能完成PCR 扩增过程
B．如果加入大量引物1 和引物2，会干扰正常的PCR 扩增过程
C．在第四轮复制后，会出现8 个片段
D．经过第二轮PCR 后会出现①②③④五种DNA 分子
19．用限制酶BamHⅠ、HindⅢ单独或联合切割某DNA 分子（长度为14 kb），在完全酶切（每个切点都被
切断）时得到的DNA 片段长度如图所示（1 kb 即1000 个碱基对）。下列说法错误的是（ ）
A．该DNA 分子上没有BamHⅠ的酶切位点
B．该DNA 分子上有2 个HindⅢ的酶切位点
C．该DNA 分子为环状DNA 分子
D．用BamHⅠ和HindⅢ联合切割该DNA 分子，最多可能得到7 种不同长度的线性片段
20．Cre-loxP 系统能实现特定基因的敲除(如图1)。把几种荧光蛋白基因和Cre 酶能识别并切割的序列
(loxP1 和loxP2)串在一起，构建表达载体T(如图2)。部分荧光蛋白基因会被Cre 酶随机“剪掉”,且两个
loxP1 之间或两个loxP2 之间的基因，最多会被Cre 酶敲除一次，剩下的部分得以表达，随机呈现不同的颜
色。下列说法错误的是（ ）
A．构建表达载体T 时用到的工具包括限制酶、DNA 连接酶
B．若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre 酶),其肌肉组织细胞呈无色
C．若小鼠细胞含一个表达载体T(含Cre 酶),其脑组织细胞只能呈红色或黄色
D．若小鼠细胞含两个表达载体T(含Cre 酶),其脑组织细胞可能出现两种颜色
二、多选题
21．雌蚊会叮咬人类，可传播多种传染病。研究者利用CRISPR/Cas9 基因编辑系统（可以实现对双链
DNA 的精确切割）和同源重组修复技术修改了蚊虫受精卵的某个基因，使拥有该基因的受精卵发育成雄蚊，
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且该基因可遗传给子代，使群体中雄蚊比例升高。下列有关说法正确的是（ ）
A．CRISPR/Cas9 基因编辑系统作用于DNA 的磷酸二酯键
B．转基因灭蚊技术通过提高蚊虫的死亡率来达到灭蚊的目的
C．转基因灭蚊技术具有效果显著、可持续等特点
D．该技术有可能造成目的基因扩散，导致基因污染
22．如图是将人的生长激素基因导入细菌B 细胞内制造“工程菌”的示意图．已知细菌B 细胞内不含质粒
A，也不含质粒A 上的基因．判断下列说法正确的是（ ）
A．将重组质粒导入细菌B 常用的方法是Ca2+处理法
B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细
菌
C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A 的细菌
D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长
23．图1 为某种质粒简图，图2 表示某外源DNA 上的目的基因，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶
EcoRI、BamHI、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述正确的是（ ）
A．在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA 的切割，则可选EcoRI
B．如果将一个外源DNA 分子和一个质粒分别用EcoRI 酶切后，再用DNA 连接酶连接，形成一个含
有目的基因的重组DNA，此重组DNA 中EcoRI 酶切点有1 个
C．为了防止质粒和含目的基因的外源DNA 片段自身环化，酶切时可使用BamHI 和HindⅢ两种限制
酶同时处理
D．一个图1 所示的质粒分子经EcoRI 切割后，含有2 个游离的磷酸基团
24．交错PCR 能实现同源基因的重组（如图，仅示单链）。第一轮延伸15s，获得短产物①②。在第二轮
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开始时（95℃）产物①②与原来模板分开，然后（55℃）随机地与不同模板交错结合，延伸15s，合成交
错产物③④。每一轮扩增仅延伸一小段，经过多轮“产物-模板”交替结合、延伸，最终扩增出交错重组基
因产物。相关叙述正确的是（ ）
A．交错PCR 原理是DNA 半保留复制
B．交错PCR 延伸温度设定为55℃可增加交错次数
C．上一轮交错产物需与模板链严格配对才能继续下一轮扩增
D．若交错循环20 轮，一共产生220 个DNA 分子
25．为增加油菜种子含油量，科研人员尝试将酶D 基因（图甲左）与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进
入叶绿体）基因（图甲右）连接，构建融合基因后导入Ti 质粒（图乙），最终获得转基因油菜品种，以下
叙述正确的是（ ）
A．用ClaⅠ切割酶D 基因和转运肽基因所在片段，再利用DNA 连接酶连接获得融合基因
B．用XbaI 和SacI 同时切割融合基因所在片段和载体片段，连接后获得重组Ti 质粒
C．将油菜细胞接种在含卡那霉素的固体培养基上筛选成功导入融合基因的细胞
D．转基因油菜的酶D 基因只表达于含叶绿体的细胞，并在叶绿体内转录、翻译
三、综合题
26．金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中具有金属结合能力的蛋白质，决定该蛋白质合成的基
因结构如图1 所示，其中B 链为转录的模板链。科研人员利用图2 所示质粒构建枣树的MT 基因重组DNA
分子并导入大肠杆菌细胞，获得对重金属镉（Cd）具有吸附能力和耐受能力的MT 工程菌。回答下列问题：
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（注：XhoI、KpnI、PstI 为不同限制酶的识别位点：LacZ 基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以催化无色物质
X-gal 产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色：amp 基因为氨苄青霉素抗性基因。）
(1)为了使PCR 扩增后的产物按照正确的方向与已被酶切的载体连接，克隆MT 基因时应选择的引物组合是
，并在其5′末端分别添加限制酶 的识别序列。
(2)构建重组DNA 分子启动子是 识别并结合的部位。
(3)导入、筛选和鉴定MT 工程菌。
①将得到的混合物导入到用 处理的大肠杆菌完成转化实验
②将菌液稀释并涂布在含X-gal 和氨苄青霉素的培养基上进行培养后，随机挑取 的单菌落可获得MT
工程菌。
③欲进一步对MT 工程菌进行鉴定，可将挑取出的MT 工程菌与普通大肠杆菌分别接种至含 的LB
液体培养基中，置于恒温培养箱中培养，适宜时间后检测菌种数量。
27．猪源大肠杆菌会引起仔猪发生肠炎、肠毒血症等疾病。LTB 和ST1 是猪源大肠杆菌肠毒素基因，融合
基因LTB—ST1 的表达产物LTB—ST1 融合蛋白可有效预防仔猪黄痢。构建融合基因的方法如下图1 所示。
请回答：
(1)猪源大肠杆菌与猪细胞在结构上最主要的区别是 ，猪源大肠杆菌与猪的种间关系为
。
(2)在对LTB 基因与ST1 基因进行PCR 过程中，DNA 解旋的方法是 ，若引物中C 或G 的碱基
数量越高，则复性的温度会 （选填“升高”、“降低”或“不变”）。
(3)图1 中限制酶1 使得LTB 基因中的 键断裂。为保证经酶处理后的LTB 基因与ST1 基因能够
正常连接，限制酶1 与限制酶2 在选取时需满足 的特点，可见这种融合基因的方法具有局限性。
(4)为突破限制酶选取的局限性，研究人员通过重组PCR 技术构建了LTB—ST1 融合基因，如图2 所示，请
回答：
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①重组PCR 技术依据的生物学原理是 。PCR1 和PCR2 需要在两个不同反应体系中进行的原因
是 ，两个反应体系中加入的物质中不同的是 。下列序列中符合引物P2 与引物P3
的5’末端碱基序列要求的是：
A．5’ATCGGACTTG···3’ B．5’ATCGGAGAAC···3’
C．5’TAGCCTGAAC···3’ D．5’CAAGTCCGAT···3’
②重组PCR 技术不仅可用于构建融合基因，还可用于研究基因定点突变。若要在两个基因连接处实现基因
定点突变，可对 进行设计，后通过重组PCR，使新合成的DNA 中含有突变位点，从而实现基
因的定点突变。
28．结合所学知识及下列资料，完成相关设计。
资料一：人原癌基因 erbB2 编码的p185 蛋白可存在于肿瘤细胞膜上，erbB2 的过量表达与肿瘤细胞侵袭、
转移密切相关，人体自身免疫系统通常不会产生相应抗体。
注：Pl 为山羊乳腺特异性表达启动子，P2 为四环素诱导启动子(必须在四环素存在时才能起作用)；限制酶
Mbo I、XbaI 与 ScaI 的识别序列均不相同。
(1)鼠源单克隆抗体的获取
抗体由 细胞分泌，可将 注入小鼠体内，经杂交瘤技术获得相应的鼠源单克隆抗体， 以期治疗
肿瘤。
资料二：鼠源抗体的恒定区易被人体免疫系统识别而失去作用，研制、接种人-鼠嵌合抗体(简称M 抗体)可
降低免疫排斥， 用于肿瘤治疗。鼠源、人源抗体结构如图甲所示。
(2)M 抗体的设计
可将图示中的 与 组合，设计出M 抗体。
资料三：获得相关基因后，利用PCR 技术进行融合得到目的基因，可选择与乳腺细胞表达载体pBC1 构建
重组DNA 分子。 目的基因、表达载体pBCl 如图乙所示。
(3)重组DNA 分子的构建
①PCR 扩增图示目的基因时需加入 种引物和 酶。
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②本实验应选择限制酶 切割目的基因与pBCl 载体，将酶切产物正确连接后形成重组 DNA 分子， 以
便后续通过荧光检测筛选。
资料四：培育转基因小鼠，让目的基因在小鼠乳腺中表达。经检测，M 抗体的相关基因都能表达，也能组
装并分泌M 抗体。
(4)转基因小鼠的培育
①通常将重组DNA 分子导入小鼠的 (填细胞名称)，在培养液中加入 后，发出 荧光的即为
目标细胞，再经过 等胚胎工程技术获得转基因小鼠。
②通过 技术检测小鼠乳汁中的M 抗体水平，发现其含量较低，原因可能有 、M 抗体的组装及
分泌过程受阻等。
29．水蛭素是一种小分子蛋白质，对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现的最强凝血酶天然特异
抑制剂，在心脑血栓疾病治疗中均有显著作用。天然水蛭素主要从医用水蛭的唾液腺中分离出来，产量有
限，因此利用基因工程制备重组水蛭素成为抗血栓治疗的研究热点之一。通过基因工程生产水蛭素的方法
如下图所示。EcoRI 和BamHI 为两种限制性内切核酸酶
回答下列问题：
(1)获取目的基因：从 中获取mRNA。在设计用于cDNA 扩增的特异性引物时，为方便扩增
产物与载体的连接，应在引物中加上
(2)构建重组质粒：按图所示，选用的限制性内切核酸酶为 ，原因是 。目的基
因和质粒可以“拼接”成功的原因是 。
(3)导入大肠杆菌；为提高大肠杆菌的转化效率，可将大肠杆菌放于低温、 （“高”或
“低”）浓度的CaCl2 溶液中，可使细胞膨胀通透性增加，制备成 ，促进重组质粒的转入。
(4)筛选与检测：将大肠杆菌培养在添加 的LB 固体培养基上，可筛选得到转入重组质粒的大
肠杆菌。还可以用 技术更加精准地鉴定大肠杆菌细胞中是否转入了水蛭素基因。
(5)生产：在规模化的发酵生产中，需监控发酵过程的营养供给、 等变化。采用低温（4℃）
离心、萃取方法分离和提纯水蛭素，低温处理的目的是 ，其理由是
(6)通过上述方法生产的水蛭素的抗凝血活性低于天然野生型水蛭素，可通过设计和改造 获
得抗凝血活性高的水蛭素。
30．表观遗传调节异常是肿瘤发生发展的重要因素之一，N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA 上最常
见的一种修饰。研究发现，胃癌细胞中存在m6A 去甲基化酶（ALKBH5）过表达和STC2（癌症相关基
因）mRNA 的m6A 修饰水平降低的异常现象。科研人员利用基因工程技术实现ALKBH5 基因沉默和STC2
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基因的过表达，以研究ALKBH5 介导的m6A 甲基化修饰对胃癌细胞迁移的影响。
(1)已知STC2 基因的α 链为转录的模板链，据图1 分析，利用PCR 扩增目的基因时，需要在引物
的5′端添加BamHⅠ识别序列和强启动子序列，在引物 的5′端添加SacⅠ识别序列。目的基因两端
用不同限制酶切割的原因是 。
(2)为确保目的基因正确插入质粒，需要选择 限制酶切割质粒。将重组质粒导入大肠杆菌时，可
利用潮霉素和卡那霉素筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，试简要表述筛选思路： 。
(3)研究人员分别用不同方式处理胃癌细胞，并测得胃癌细胞迁移标志蛋白含量如下：
根据结果推测ALKBH5 基因影响胃癌迁移的机理是 。
39
