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第 24 章 基因工程
第 1 节 重组 DNA 技术的基本工具及 DNA 的粗提取与
鉴定
夯基
五年高考
1.★★(2024山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是(
)
A.整个提取过程中可以不使用离心机
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中
C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
答案 A
2.★★(2022山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是(
)
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
答案 B
3.★★(2021山东,13,2分)粗提取DNA时,向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并
搅拌,过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤,在得到的滤液中加入特定试剂
后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是 ( )
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B.37~40 ℃的水浴箱中保温10~15分钟
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D.加入NaCl调节浓度至2 mol/L→ 过滤 → 调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L
答案 A
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4.★★(2024湖南,5,2分)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没
有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )
A.限制酶失活,更换新的限制酶
B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
答案 B
5.★★(创新考·从限制酶特异性角度考查DNA分子的多样性)(2021湖北,7,2分)限制性
内切酶EcoRⅠ识别并切割 双链DNA,用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因
组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为( )
A.6 B.250 C.4 000 D.24 000
答案 C
6.★★★(2023新课标,6,6分)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA
连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进
行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
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D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接
答案 C
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三年模拟
7.★★★★(不定项)(2024届德州一中三模,20)研究人员用酶M和酶N两种限制酶
同时处理某DNA分子和质粒,得到的DNA片段如图所示。图中DNA片段只注
明了黏性末端处的碱基种类,其他碱基的种类未注明。下列叙述错误的是( )
A.该DNA分子和质粒上均含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点
B.根据图示信息不能确定图中形成的不同黏性末端与这两种限制酶的对应关系
C.用T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶均可以将片段乙和片段丁连接起来
D.片段乙、片段丁、片段戊可依次连接形成一个环状DNA分子
答案 D
8.★★★★(2025届青岛开学考,25)阿卡波糖为一种新型口服降血糖药,在肠道内竞
争性抑制葡萄糖甙酶,可降低多糖的分解,减缓吸收。科研人员克隆阿卡波糖合成
基因过程如图所示。
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限制酶 SpeⅠ NheⅠ CfoⅠ
↓ ↓ ↓
识别序
5'-ACTAGT-3' 5'-GCTAGC-3' 5'-GCGC-3'
列及切
3'-TGATCA-5' 3'-CGATCG-5' 3'-CGCG-5'
割位点
↑ ↑ ↑
(1)PCR扩增含有阿卡波糖合成基因的DNA片段时,需要使用耐高温的DNA聚
合酶,原因是
。该过程离不开引物,据图写出两种引物的前6个碱基序列5'
3'、5' 3'。
(2)构建基因表达载体是基因工程的核心步骤,由图可知,切割含有阿卡波糖合成
基因的DNA片段时用到的限制酶是 ,切割后的阿卡波糖
合成基因片段可通过 酶与质粒P连接。
(3)步骤③富集培养时,培养基中除含有碳源和氮源等营养物质外,还需要添加
。若利用PCR技术检测转化的酵母菌中是否含有重组质粒P,请写出简要的实验
思路和预期结果:
。
答案 (1)在PCR时,需要用高温使DNA解旋,普通的DNA聚合酶在高温下会变
性失活 -AGCTAG- -TGCGCA- (2)NheⅠ和CfoⅠ DNA连接 (3)安普霉
素 将酵母菌中的基因组DNA提取出来,利用阿卡波糖合成基因序列设计引物,
进行PCR扩增并电泳,若出现相应长度的条带,则说明酵母菌中含有重组质粒P,
反之则不含重组质粒P
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第 2 节 PCR 和电泳
提升
•考法一 引物的特点及选择:T1、T2、T5、T8
•考法二 电泳结果分析:T5、T6、T12
五年高考
1.★★★★(2024山东,5,2分)制备荧光标记的DNA探针时,需要模板、引物、
DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H O和4种脱氧
2
核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中,分别
加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原
则,且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能
得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有 ( )
A.①② B.②③ C.①④ D.③④
答案 D
2.★★★★(2023山东,25,10分)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒
并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽
V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外,作为载体,质
粒还需具备的结构有 (答出2个结构即可)。
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(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR
检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链
位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相
应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相
应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表
达了 ,条带2所检出的蛋白 (填“是”或“不是”)由重组
质粒上的J基因表达的。
答案 (1)RNA聚合酶 标记基因、复制原点(或限制性酶切位点) (2)F2和
R1(或“F1和R2”) a链 (3)J-V5融合蛋白 不是
3.★★★(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基
因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,
反应程序如图所示。下列叙述正确的是( )
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
答案 B
4.★★★★(不定项)(2024湖南,15,4分)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中,
分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),
子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则,以加入ddATP的体系
为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP),继续延
伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序
列,结果如图所示。下列叙述正确的是( )
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A.上述PCR反应体系中只加入一种引物
B.电泳时产物的片段越小,迁移速率越慢
C.5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列
D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
答案 AC
5.★★★★(2024江苏,23,12分)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD),科研人员将
ELP 片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP 以融合表达SOD-ELP
50 50 50
蛋白,过程如图1。其中ELP 是由人工合成的DNA片段,序列为:限制酶a识别序
50
列-(CTTCCTGGTGTTGGC) -限制酶b识别序列,50为重复次数。请回答下列问
50
题:
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(1)步骤①双酶切时,需使用的限制酶a和限制酶b分别是
。
(2)步骤②转化时,科研人员常用 处理大肠杆菌,使细胞处于感受态;转
化后的大肠杆菌采用含有
的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP
50
的大肠杆菌,应选用的一对引物是 。
(3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合,驱动转录,翻译SOD-
ELP 蛋白。已知蛋白中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa,将表达的
50
蛋白先进行凝胶电泳,然后用SOD抗体进行杂交,显示的条带应是 (从图2
中的“A~D”中选填)。
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(4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP 蛋白的方法,科研人员研究了温度、NaCl
50
对SOD-ELP 蛋白纯化效果的影响,部分结果如图3。
50
(i)20 ℃时,加入NaCl后实验效果是 。
(ii)100 ℃时,导致各组中所有蛋白质都沉淀的原因是 。
(iii)据图分析,融合表达SOD-ELP 蛋白的优点有
50
。
答案 (12分,特殊注明除外,每空1分)(1)EcoRⅠ、HindⅢ (2)CaCl 卡那霉素
2
S-F和E-R(2分) (3)启动子 C(2分) (4)(i)SOD-ELP 组纯化蛋白数量更多
50
(ii)高温使蛋白变性 (iii)低温下添加 NaCl有利于SOD蛋白纯化,杂蛋白较少,有
利于酶活性的保持(2分)
6.★★★★(2023江苏,22,12分)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,
运用重组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题:
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图1
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有
,扩增程序中最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用 。
图2
A.ATGGTG------CAACCA C.GACGAG------CTGCAG
B.TGGTTG------CACCAT D.CTGCAG------CTCGTC
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直
接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有
。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,下列叙述错误的有 。
A.稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板,用引
物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据
图中结果判断,可以舍弃的质粒有 。
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(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认,原
因是 。
答案 (1)模板和引物 退火温度 (2)CD (3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶
(4)ABC (5)P3、P4 (6)电泳条带仅能显示扩增片段的大致长度,不能呈现碱基
序列
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三年模拟
7.★★★(不定项)(教考衔接:选必3第3章第2节探究·实践)(2024届潍坊三模,20)下列
关于DNA片段扩增及电泳鉴定实验的说法,错误的是( )
A.放入PCR仪前,需要对离心管进行离心,使反应液集中在底部
B.配制琼脂糖溶液时,需要根据DNA片段的大小调节琼脂糖浓度
C.电泳时需要的两种缓冲液分别含有核酸染料和指示剂
D.电泳时,需要根据电泳槽阳极至阴极之间的距离设定电压
答案 C
8.★★★(不定项)(2025届济宁实验中学开学考,20)为了获得未知序列的碱基序列,可
以通过利用已知序列设计的引物对未知序列进行扩增,再对其扩增产物进行测序,
其过程如图。下列说法正确的是( )
A.图示过程中需要用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶
B.环化阶段,可选用E.coliDNA连接酶或T4 DNA连接酶
C.以环化的DNA为模板进行PCR时,应选择引物2和引物3
D.若1个DNA分子用PCR技术扩增n次,则需要2n+1-2个引物
答案 ABD
9.★★★(不定项)(2024届威海二模,20)ω-3多不饱和脂肪酸(ω-PUFAs)有预防心血
管疾病的作用,但大多数动物体内不能合成。科研人员利用转染技术(将外源
DNA转入受体细胞的技术)将ω-PUFAs-合成酶基因(fat-1基因,含1 229 bp)导入
小鼠受精卵中,培育出转基因小鼠,基本流程如图甲所示。图乙表示提取不同实验
组别小鼠受精卵DNA后,利用fat-1基因的引物进行PCR扩增后的电泳结果。下
列说法错误的是( )
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A.采用农杆菌转化法可确保图甲中转染的效果
B.PCR扩增3轮后,只含一种引物的DNA分子的比例为1/4
C.由图乙可知,只有2组转染成功
D.若fat-1基因单点插入,则转基因小鼠相互交配产生的大多数后代体内能合成
ω-PUFAs
答案 A
10.★★★(不定项)(2024届临沂二模,20)丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的
一种传染病。为研制针对HCV的多肽疫苗,某研究小组构建LTB-R9-Bp融合基
因的过程如图,进而构建出融合基因表达载体,其中LTB是一种免疫增强剂基
因,R9-Bp是HCV两个相连的包膜蛋白基因。下列说法正确的是( )
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A.PCR反应体系中需加入待扩增的模板、引物、原料以及耐高温的DNA聚合
酶
B.若要大量扩增LTB-R9-Bp融合基因,可选择引物P2和引物P3继续进行PCR
C.融合基因表达载体的组成元件有融合基因、标记基因、启动子和终止密码子
等
D.若利用转基因植物生产该疫苗,需用到基因工程、植物组织培养和抗原—抗体
杂交技术
答案 AD
11.★★★★(不定项)(2024届青岛三模,18)科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序
列(RBD)拼接成融合基因2RBD和3RBD,探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白
能否模拟RBD的天然构象并获得高效免疫原性。为鉴定重组质粒是否构建成功,
将重组质粒用NcoⅠ和SacⅠ双酶切处理后电泳,结果如图,其中泳道1为双酶切
pNZ8149-2RBD,两个条带大小分别为2 507 bp和2 020 bp。将构建好的重组质粒
分别导入工程菌中进行表达产物的检测。下列说法正确的是( )
A.PCR扩增融合基因时,在引物的3'端添加相应限制酶的识别序列
B.据图可知,融合基因3RBD的长度为2 686 bp
C.泳道2呈现一个条带的原因是酶切pNZ8149-3RBD后产生的两个片段大小相
近
D.从工程菌细胞表面提取蛋白质进行检测,从而进一步比较两者的免疫原性
答案 BCD
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12.★★★★(2025届日照开学考,25)科学家利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛
素有两种方法:“AB”法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种
DNA片段,利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素;“BCA”法
是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因,利用工程菌获得胰岛素。两种方
法使用同一种质粒作为载体。
(1)“AB”法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列,原因是
。上述两种方法获取的目的基因中,不含人胰岛素基因启动子
的方法是 。
(2)对人工合成的胰岛素基因进行测序,发现其两端附近无限制酶EcoRⅠ、
BamHⅠ的酶切位点。已知胰岛素基因表达时以①链为模板,如图是利用基因工
程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。
为保证人胰岛素基因能正确连接到用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ处理的图1所示
质粒上,且利用表达载体上的启动子在受体菌中以①链为模板进行转录,则应在配
对到②链的引物5'端添加6个碱基,序列为5'- -3'。PCR扩增过
程中,最早经过 轮循环后,便可获得两端均携带限制酶识别序列的所需双链目
的基因。
(3)若使用一种限制酶切割目的基因和载体后,会存在目的基因的正向或反向两种
连接产物, (填“可以”或“不可以”)通过电泳来区分两种产物,在凝胶
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中DNA分子的迁移速率与
(答出两点)等有关。
答案 (1)绝大多数氨基酸都有几个密码子(或密码子具有简并性/一种氨基酸可
能对应多种密码子) AB和BCA (2)GGATCC 3(或三) (3)不可以 凝胶的
浓度、DNA分子的大小和构象
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第 3 节 基因工程的基本操作程序
提升
•考法 限制酶的选择:T1、T2、T4、T9
五年高考
1.★★★★(2021山东,25,12分)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A
蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的表达被抑制。通过改变该结
合位点的序列,解除对γ基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。
科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进
行转化和荧光检测,以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所
示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限
制酶识别序列。据图可知,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ,
在R末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中,从产物扩增到载体
构建完成的整个过程共需要 种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R
扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞
无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是
。
(3)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,
而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引
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物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列,据此结果可推
测,BCL11A蛋白结合位点位于 ,
理由是
。
答案 (1)SalⅠ(2分) EcoRⅠ(2分) 6(3分) (2)F7与R扩增产物不含完整的
启动子,荧光蛋白基因不表达(2分) (3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列
之间的区段上(1分) 根据有无荧光情况判断,F1~F4与R扩增产物上均有结合位
点,因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);F5~F6与R扩增产物上均
无结合位点,可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点
位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上(2分)
2.★★★★★(2024山东,25,12分)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大
豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L,可培育耐盐碱大豆品系。在载体
上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列,将载体导入大豆细
胞后,其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载
体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
图甲:载体信息
LB/RB:T-DNA的边界序列;Kanr:卡那霉素抗性基因;Ampr:氨苄青霉素抗性基因
图乙:目标基因L部分序列
图丙:限制酶识别序列、切割位点及电泳结果
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(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时,所用的引物越短,引物特
异性越 (填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时,形成的单链突
出末端为黏性末端,若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA,理论上可产生的黏性末端
最多有 种。载体信息如图甲所示,经BsaⅠ酶切后,载体上保留的黏性末
端序列应为5'- -3'和5'- -3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞,使用抗生素 筛选到具有该抗生素
抗性的植株①~④。为了鉴定基因编辑是否成功,以上述抗性植株的DNA为模板,
通过PCR扩增目标基因L,部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示,PCR
产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是
,其中纯合的突变植株是 (填序号)。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株,该植株具有抗生素抗性,检测发现
其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代,
其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ,筛选出的敏感植
株可用于后续的品种选育。
答案 (1)低 44 GTTT CAAT (2)卡那霉素 SacⅠ ④ (3)1/4
3.★★(2023辽宁,8,2分)CD163蛋白是PRRSV(病毒)感染家畜的受体。为实时监
控CD163蛋白的表达和转运过程,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接
在一起(如图),使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去( )
A.CD163基因中编码起始密码子的序列
B.CD163基因中编码终止密码子的序列
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C.RFP基因中编码起始密码子的序列
D.RFP基因中编码终止密码子的序列
答案 B
4.★★★(2023湖北,4,2分)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)
作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制
酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错
误的是( )
A.若用Hind Ⅲ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养
基中能形成菌落
答案 D
5.★★★[2022福建,21(一)]美西螈具有很强的再生能力。研究表明,美西螈的巨噬
细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制,科研人员制备
了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体,具体方法如下。回答下列问题:
(一)基因工程抗原的制备
(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列,合成引物,利用PCR扩增CD14片段。已
知DNA聚合酶催化引物的3'-OH与加入的脱氧核苷酸的5'-P形成磷酸二酯键,
则新合成链的延伸方向是 (填“5'→3'”或“3'→5'”)。
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(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ
分别酶切CD14和载体后连接,CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的
两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定,理由是
。
(3)培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌,分离纯化目的蛋白。
答案 (1)5'→3' (2)正向连接的重组DNA有这两种酶切位点(限制酶的识别序
列);而反向连接的重组DNA会形成新的序列,没有这两种酶的酶切位点(没有限
制酶的识别序列)
6.★★★★(2024湖南,21,13分)百合具有观赏、食用和药用等多种价值,科研人员
对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题:
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(1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前,先用 去除
细胞壁获得原生质体,使原生质体融合,得到杂种细胞后,继续培养,常用
(填植物激素名称)诱导愈伤组织形成和分化,获得完整的杂种植株。
(2)单倍体育种。常用 的方法来获得单倍体植株,鉴定百合单倍体植株
的方法是
。
(3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因
L,该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒
的结构示意图,其中基因gus编码GUS酶,GUS酶活性可反映启动子活性。
①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L,首先
选用 酶切,将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接,再导入烟草。随
机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫,结果如图c。
由此可知:三种病原微生物都能诱导pL的活性增强,其中 的诱导作用最强。
②现发现栽培种百合B中也有L,但其上游的启动子与野生百合不同,且抗病性弱。
若要提高该百合中L的表达量,培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种,简要
写出实验思路:
。
答案 (1)纤维素酶和果胶酶 生长素和细胞分裂素 (2)花药离体培养 利用显
微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目 (3)①HindⅢ和BamHⅠ 交
链格孢 ②利用转基因技术将百合B中L的启动子替换为野生百合中L的启动
子pL
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三年模拟
7.★★★(2024届省实验中学二模,15)由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端,且
无合适的限制酶识别序列,需借助中间载体P将目的基因接入载体E。如图为两
种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述正确的是( )
A.构建重组载体P时,应选择EcoRⅤ进行酶切,再用T4 DNA连接酶连接
B.为了便于该目的基因接入载体E,可用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P
C.载体P不能作为基因表达载体,是因为它不含起始密码子和终止密码子
D.若受体细胞表现出抗性基因的相应性状,表明重组载体成功导入受体细胞
答案 A
8.★★★(不定项)(2025届日照开学考,20)如图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质
粒的技术流程,其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因,GUS基因仅在真核细胞中表达,
表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是( )
A.构建重组质粒时需要的限制酶有PstⅠ、XhoⅠ和EcoRⅠ
B.在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌
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C.用农杆菌转化植物愈伤组织选择呈现蓝色的组织进行培养
D.为进一步改良品种,可将启动子替换为除草剂诱导型启动子
答案 AC
9.★★★★(2024届潍坊四县联考,25)L-天冬酰胺酶因其能水解L-天冬酰胺(丙烯酰
胺的前体),而有效降低油炸食品中潜在致癌物质丙烯酰胺的含量,在食品安全领
域受到高度关注。某科研机构欲利用pET22b质粒将L-天冬酰胺酶基因导入对
氨苄青霉素敏感的宿主菌中,以构建高效表达L-天冬酰胺酶的菌株。图1是L-天
冬酰胺酶基因附近的限制酶切点以及基因两侧的部分碱基序列,图2是pET22b
质粒的结构模式图及其涉及的限制酶切点,其中的LacZ基因编码产生的半乳糖
苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质,使菌落呈蓝色,否则菌落为白色。
图2
(1)利用PCR从提取的DNA中扩增目的基因时需要引物,引物的作用是
。要将L-天冬酰胺酶基因导入pET22b质粒中,需使用的两种限制酶是
。
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(2)若图1下方的序列为目的基因的部分碱基序列,则获取目的基因时设计B端的
引物序列是 (只写出16个碱基即可)。
(3)科研人员将转化后的宿主菌接种在含氨苄青霉素和X-gal的固体培养基上,以
此筛选出成功导入重组质粒的宿主菌。
①若只使用限制酶EcoRⅠ构建重组质粒,导入重组质粒的菌落呈现 色,这
些菌落 (填“能”“不能”或“不一定能”)产生L-天冬酰胺酶,理由
是
。
②若使用(1)中的限制酶处理,则菌落呈 色的为符合要求的宿主菌,理由是
。
(4)能够发挥作用的L-天冬酰胺酶是由4个亚基形成的,如果选择大肠杆菌作为受
体菌,只能从大肠杆菌中提取到4条单链肽链,不能得到有活性的L-天冬酰胺酶,
原因是
。
答案 (1)使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 KpnⅠ、
EcoRⅠ (2)3'-TAAGTTGTCTCTTAAG-5' (3)①白 不一定能 只使用
EcoRⅠ切割目的基因和质粒产生的黏性末端相同,构建的重组质粒可能是目的
基因和质粒反向连接而成的,目的基因无法正常表达 ②白 重组质粒由于LacZ
基因被切断,无法合成半乳糖苷酶以分解X-gal,因此菌落呈白色 (4)大肠杆菌细
胞内无内质网和高尔基体等细胞器,不能对多肽链进行加工
10.★★★★★(2024届烟台三模,25)研究人员拟培育转fat1基因和fat2基因的转双
基因猪,为避免fat1蛋白和fat2蛋白相互融合影响功能,利用重叠延伸PCR技术
在fat1基因和fat2基因之间插入具有自剪切功能的2A连接肽基因,构建fat1-2A-
fat2融合基因。2A基因的转录产物可通过“核糖体跳跃”断开位于2A肽尾端
甘氨酸(G)和脯氨酸(P)之间的肽键,将2A基因编码的蛋白分割成2个独立蛋白。
图甲表示利用重叠延伸PCR技术成功构建融合基因的过程。图乙表示构建成功
的包含融合基因的重组质粒的部分片段,F1~F4、R1~R4表示引物。
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(1)利用PCR技术可实现在体外快速大量扩增DNA,其与细胞内DNA复制的共
同点是 (答出2点)。若图乙中融合基因的
b链为模板链,则图甲PCR1中的引物甲与图乙中的引物 的绝大部分序
列相同。
(2)PCR1和PCR2需要分开单独进行,原因是 。
PCR3不需要引物,高温加热后fat1-2A和2A-fat2的双链解开,其中能正常延伸形
成融合基因的是 (填序号)形成的杂交链。
(3)图乙构建的重组质粒中未标注出的必需元件还有 。为确定
fat1基因连接到重组质粒中且插入2A序列的上游,需进行PCR检测,若仅用一对
引物,应选择图乙中的引物 。所融合基因经图丙中的过程表达产生fat1
和fat2两种蛋白,经检测发现通过该技术表达的fat1蛋白较正常fat1蛋白的相对
分子质量大,据该融合基因的结构和表达原理推测,原因是
。
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答案 (1)都需要模板、引物、DNA聚合酶,原料都是脱氧核苷酸 R4 (2)引物
甲和引物丁部分碱基互补配对,影响子链的合成 ①、④ (3)复制原点、标记基
因 F1、R3 fat1基因后面连接了2A序列,使fat1蛋白后面连接了2A肽的部分
片段
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第 4 节 基因工程的应用和蛋白质工程
提升
五年高考
1.★★★★(2020山东,25,11分)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉,直链淀粉所占
比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻,
实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑,从而获得了3个
突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,所需的酶
是 ,重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和
表达的过程称为 。
(2)根据启动子的作用推测,Wx基因启动子序列的改变影响了
,从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比,3个突变品系中Wx基因
控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列
(填:“发生”或“不发生”)改变,原因是
。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响,科研人员需要检测Wx基因转录产
生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA,经
过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的
cDNA,原因是
。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示,据图推测糯性最强的品系为
,原因是
。
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答案 (除注明外,每空1分)(1)限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶)和DNA连
接酶 转化 (2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合
成酶的碱基序列中不含启动子 (3)逆转录(或反转录) 引物是根据Wx基因的
一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)(2分) (4)
品系3 品系3的Wx mRNA量最少,控制合成的直链淀粉合成酶最少,直链淀粉
合成量最少,糯性最强(2分)
2.★★★★★(2022山东,25,12分)某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可使
P被蛋白酶识别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探
索药物A治疗该病的机理,需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-
PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或PΔ的氨基端,
使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或PΔ的功能。
(1)为构建重组载体,需先设计引物,通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基
因的引物需满足的条件是 。
为使PCR产物能被限制酶切割,需在引物上添加相应的限制酶识别序列,该限制
酶识别序列应添加在引物的 (填“3'端”或“5'端”)。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个
融合基因,如图甲所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组
载体导入细胞后,融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG
的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析,出现该问
题的原因是 。
修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题,具体修改
方案是 。
图甲
(3)融合蛋白表达成功后,将FLAG-P、FLAG-PΔ、药物A和UBC按照图乙中的
组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介
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质结合的物质并用UBC抗体检测,检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和
FLAG-PΔ不能降解UBC,由①②③组结果的差异推测,药物A的作用是
;由②④组或③⑤组的差异推测,PΔ中缺失的特定序列的作用是
。
(4)根据以上结果推测,药物A治疗该病的机理是
。
答案 (1)能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸(2分) 5'端(2
分) (2)P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一
个氨基酸,导致mRNA的密码子被错位读取(2分) 在引物中的EcoRⅠ识别序列
3'端添加1个碱基(2分) (3)增强FLAG-P与UBC的结合(1分) 参与P与UBC
的结合(1分) (4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解(2分)
3.★(2024浙江1月选考,1,2分)关于生物技术的安全与伦理问题在我国相关法规明
令禁止的是( )
A.试管动物的培育
B.转基因食品的生产
C.治疗性克隆的研究
D.生物武器的发展和生产
答案 D
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三年模拟
4.★★(2025届青岛开学考,14)草鱼是我国养殖产量最大的水产品种之一,武汉高泽
霞教授团队找到并敲除控制草鱼肌间刺产生的关键基因B,成功培育出“无刺”
草鱼,实验过程如图。下列说法错误的是( )
A.可从鱼刺中提取mRNA进行逆转录获得cDNA,从中找到与鱼刺发育有关的基
因
B.PCR扩增时反应体系中需加入模板、原料、引物、耐高温的DNA聚合酶、
Mg2+等
C.利用基因编辑技术获得一条敲除基因B的杂合体少刺草鱼,通过一代杂交可获
得遗传性状稳定的无刺鱼
D.养殖遗传性状稳定的无刺鱼时,应避免与野生鱼杂交,否则可能会造成生态威胁
答案 C
5.★★★(不定项)(2024届历城二中三模,20)W是一种具有特定功能的人体蛋白质。
某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路,制备一种膀胱生物反应器来
获得W,基本过程如图。下列叙述正确的是( )
A.步骤①是基因工程的核心步骤,需要使用的工具酶有限制性内切核酸酶、DNA
连接酶和载体
B.与乳腺生物反应器相比,用膀胱生物反应器生产W所选的启动子不同
C.从题述流程可知,制备生物反应器涉及胚胎工程中的主要技术有体外受精、胚
胎移植
D.鉴定W蛋白基因是否成功表达可以检测转基因动物的尿液中是否存在W蛋
白
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答案 BCD
6.★★★★(教考衔接:选必3第3章第4节思考·讨论)(2025届临沂开学考,25)阅读材料,
回答下列问题:
材料一:绿色荧光蛋白(简称GFP)是一种具有自发荧光的蛋白质,适用于多种实验条件。通过将GFP融合
到目标蛋白的编码基因上,可以实现对该蛋白的表达和定位的实时监测。虽然GFP应用广泛,但仍然存在
一些局限,如较低的亮度、荧光强度等。
材料二:2022年4月,科研人员从水母体内提取到了一种新型荧光蛋白StayGold,其稳定性更强、分辨
率更高,但是在结构上存在天然局限性,结合其晶体结构,科研人员对StayGold进行理性设计突变,最终获
得了一个与StayGold一样的光稳定性和荧光强度基本一致的单体形式的mStayGold荧光蛋白。
(1)若要体外获得大量的绿色荧光蛋白基因,可采用PCR技术,该技术即
反应,包括 三个基本步骤的循环,扩增时需要在样本中加入酶、引
物和含Mg2+缓冲液,其中缓冲液中Mg2+作用是 。
(2)单体形式的mStayGold荧光蛋白的构建是通过 工程实现的,该工程是
工程的延伸。其基本思路包括:从预期的蛋白质功能出发
→
推测应有的氨基酸序列 找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列
→ → →
。
(3)据图分析,在构建含mStayGold基因的表达载体时,从提高目的基因和载体的
正确连接效率角度考虑,应该选择 作为切割质粒和目的基因的限制酶,
原因是 。(注:NeoR是
新霉素抗性基因;AmpR是氨苄青霉素抗性基因)
答案 (1)聚合酶链式 变性、复性和延伸 激活DNA聚合酶 (2)蛋白质 基
因 设计预期的蛋白质结构 获得所需要的蛋白质 (3)EcoRⅠ和PstⅠ
EcoRⅠ和PstⅠ这两种酶能切割质粒和目的基因,且能得到不同的黏性末端,避免
质粒和目的基因自连及反接
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7.★★★★(2025届济南摸底考,25)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病,我国
科学家将该病毒相关基因改造为r2HN,使其在水稻胚乳特异表达,制备获得r2HN
疫苗,并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题:
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动
子,若使r2HN仅在水稻胚乳表达,GtP应为 启动子。Nos为终止子,其
作用为 。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此,
可选择限制酶 和 对r2HN基因与载体进行酶切,用于表达载体
的构建。
图1
(2)利用 方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情
况,可通过PCR技术检测 ,通过 技术检测是否翻译出
r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后,通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植
株自交一代后,r2HN纯合体植株的占比为 。选择纯合体进行后续研
究的原因是 。
(4)制备r2HN疫苗后,为研究其免疫效果,对实验组鸡进行接种,对照组注射疫苗溶
剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的 细胞(细胞
毒性T细胞)水平,结果如图2所示。据此分析,获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡
的 免疫和 免疫。
图2
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是
。(答出两点即可)
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答案 (1)水稻胚乳细胞 终止转录 HindⅢ EcoRⅠ (2)农杆菌转化 r2HN
mRNA 抗原—抗体杂交 (3)1/4 纯合体自交后代不发生性状分离 (4)CD8+T
体液 细胞 (5)不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高
8.★★★★(2025届枣庄开学考,25)天然T4溶菌酶由164个氨基酸构成,大多耐热
性差,不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造T4溶菌酶基因,并将改造的基
因与质粒重组后导入大肠杆菌,最终获得耐高温的T4溶菌酶。回答下列问题:
(1)科学家希望利用蛋白质工程技术,对T4溶菌酶进行改造,基本思路是从
出发
→
设计预期的T4溶菌酶结构
→ →
找到并改变相对应的
脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因
→
获得所需要的T4溶菌酶。
(2)研究发现T4溶菌酶的第3位异亮氨酸(密码子为AUU、AUC、AUA)变为半
胱氨酸(密码子为UGU、UGC),该半胱氨酸可以与第97位半胱氨酸之间形成一
个二硫键,从而使T4溶菌酶的耐热性得到大幅度提升。科学家利用PCR定点突
变技术对T4溶菌酶基因的编码序列进行改造(如图1),要选择的图中的引物组合
最好是 。
(3)科学家又发现若将第78位氨基酸由脯氨酸(密码子为CCU)替换为天冬氨酸
(密码子为GAU),耐热性提升幅度更大。可运用大引物PCR进行定点突变,相关
原理如图2所示。进行第一次PCR时所用的突变上游引物的合理设计是
,至少需要 次循环,才能获得相应的大引物。用所获得的大引物、模板和
其他引物等进行第二次PCR,要获得带有突变位点的、适于与质粒构建基因表达
载体的改良基因,引物应选用大引物两条链中的 (填“①”或“②”)。
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(4)为了使扩增后的T4溶菌酶基因能够与图3中的质粒A正确连接,设计引物时
需要在两种引物的 (填“3'”或“5'”)端连接上限制酶 识
别和切割的序列。
图3
答案 (1)预期的蛋白质功能 推测应有的氨基酸序列 (2)②③ (3)含有定点突
变的碱基并能与DNA模板碱基互补配对 2 ② (4)5' SamⅠ和BamHⅠ
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