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专题05 生物技术与工程模块
近几年山东卷25 题通常以具体情境，考查基因工程的原理、工具和基本操作程序，启动子的含义和功能，
PCR 技术的原理，限制酶的作用、基因表达载体的组成、启动子的作用等，题目难度系数大；其中启动子
的插入位点和插入方向、报告基因的表达等都需要学生有很强的理解信息、获取信息的能力、以及综合运
用知识解决问题的科学思维和科学探究能力，通过基因工程考查学生的结构与功能观。
1、（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部
分结构如图甲所示，其中V5 编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有
（答出2 个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，
应选择图甲中的引物 。已知J 基因转录的模板链位于b 链，由此可知引物F1 与图甲中J 基因的
（填“a 链”或“b 链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达
水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1 证明细胞内表达了 ，条带2 所检出的蛋白
（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J 基因表达的。
【答案】(1) RNA 聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
(2) F2 和R1 或F1 与R2
a 链
(3) J-V5 融合蛋白 不是
【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和
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终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA 分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是
荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
【详解】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此
RNA 聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；
②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是
安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具
备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
（2）据图甲可知，引物F2 与R1 或F1 与R2 结合部位包含J 基因的碱基序列，因此推测为了确定J 基因连
接到质粒中且插入方向正确，进行PCR 检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2 和R1 或F1 与
R2。b 是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应
该是3’-5'，非模板链（也就是a 链）是5'-3'；考虑到DNA 复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方
向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1 是前引物，在左侧，所以其配对的单链是
3’-5'的b 链，故其序列应该与a 链相应部分的序列相同。
（3）据图乙可知，用抗J 蛋白抗体和抗V5 抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1 是J-V5 融合蛋白。
抗J 蛋白抗体检测出现条带2，抗V5 抗体检测不出现条带2，说明条带2 所检出的蛋白不是由重组质粒上
的融合的J 基因表达的。
2、（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P 引发，蛋白UBC 可使P 被蛋白酶识别并降解，药
物A 可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A 治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融
合蛋白FLAG-P 和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG 是一种短肽，连接在P 或P△的氨基
端，使融合蛋白能与含有FLAG 抗体的介质结合，但不影响P 或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR 特异性扩增P 基因。用于扩增P 基因的引物需满足的条件是
、为使PCR 产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引
物的 （填“3'端”或“5'端”）。
(2)PCR 扩增得到的P 基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG 的序列形成一个融合基因，如图甲所示，
其中“ATGTGCA”为P 基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA 序列正
确，翻译出的融合蛋白中FLAG 的氨基酸序列正确，但P 基因对应的氨基酸序列与P 不同。据图甲分析，
出现该问题的原因是 。修改扩增P 基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修
改方案是 。
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(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A 和UBC 按照图乙中的组合方式分成5 组。各组
样品混匀后分别流经含FLAG 抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC 抗体检测，检测结果如图
丙所示。已知FLAG-P 和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A 的作用是 ；
由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 。
(4)根据以上结果推测，药物A 治疗该病的机理是 。
【答案】(1) 能与P 基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸
5'端
(2) P 基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA 的密
码子被错位读取。
在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1 个碱基
(3) 增强FLAG-P 与UBC 的结合 参与P 与UBC 的结合
(4)药物A 通过增强P 与UBC 结合促进P 降解。
【分析】PCR 过程：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA 解旋为单链；②温度下降到50℃左右
时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4
种脱氧核苷酸在耐高温的DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA 链。
【详解】（1）引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P 基
因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA 聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加
到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。
（2）融合基因转录出的mRNA 序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG 的氨基酸序列正确，但P 基因对应
的氨基酸序列与P 不同，说明P 基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA 中，限制酶识别序列对
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应的最后两个碱基与P 基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改
变，可通过在EcoRⅠ识别序列3'端添加1 个碱基，使其碱基数目加上FLAG 的碱基数目为3 的倍数，这样
能保证P 基因转录出的mRNA 上的读码框不改变，能够正常翻译。
（3）①组仅添加UBC，处理后，用UBC 抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC 和FLAG-P，出现杂交
带；③组添加UBC、药物A 和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A 的作用是促进UBC 与FLAG-P 的
结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂
交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC 结合的关键序列。
（4）根据（3）的分析推测，药物A 促进UBC 与FLAG-P 的结合，从而促进蛋白P 被蛋白酶识别并降解，
达到治疗的目的。
【点睛】本题难点在于分析翻译出错的原因，需要结合翻译相关知识对图进行仔细分析方可得出结论。
3、（2021·山东·高考真题）人类γ 基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结
合 BCL11A 蛋白后，γ 基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ 基因表达的抑制，可对
某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ 基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达
载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图
可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。
本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
（2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表
达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细
胞无荧光的原因是 。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R
扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ 基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的
结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于 ，理由是 。
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【答案】 SalI EcoRI 6 F7 与R 扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增
产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上
均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与
F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
【分析】1、据题意可知，科研人员扩增了γ 基因上游不同长度的片段，据图中注释可知，F1~F7 以及R 位
置均为引物，故扩增的序列分别是引物F1 和引物R 之间的序列，引物F2 和引物R 之间的序列，引物F3
和引物R 之间的序列，引物F4 和引物R 之间的序列，引物F5 和引物R 之间的序列，引物F6 和引物R 之
间的序列，引物F7 和引物R 之间的序列；
2、据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的
黏性末端相同，限制酶Xho Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶Sal Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同。
【详解】（1）据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的
扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R 端与荧光蛋白基因中限制
酶Mun Ⅰ 识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，
需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增
后的产物中可能含有Mun Ⅰ 和 Xho Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶
Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 所识别，故应该选用添加限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，据图中对限制酶的注释
可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端
添加的序列所对应的限制酶是EcoR Ⅰ ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是Sal Ⅰ ；荧光蛋白基
因中含有限制酶EcoR Ⅰ 的识别位点，故对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割。综上所述，对载体使用
限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割，对扩增后的产物用限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，然后在DNA 连
接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq 酶催化，合成更多的产物，故从产物扩
增到载体构建完成的整个过程共需要6 种酶，分别是Taq 酶、限制酶EcoR Ⅰ 、限制酶Sal Ⅰ、限制酶Mun Ⅰ
、限制酶Xho Ⅰ 、DNA 连接酶；
（2）受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白
基因的表达；基因的表达需要RNA 聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6
与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能
是F7 与R 扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达；
（3）向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A 基因表达，产生 BCL11A 蛋白，
BCL11A 蛋白与BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的
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受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F4 与引物R 之间的序列上；含 F5～F6
与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F5 的上游序列，故据此
结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。
【点睛】对基因工程中PCR 技术的掌握，对基因工程的第二步，基因表达载体的构建的过程的分析，双酶
切法的应用，限制酶的作用和切割特点，是解决本题的关键。
山东高考生物试卷情境化试题以科技论文为情境材料的居多，其次是以生产生活实际为材料。纵观近三年
的山东高考题，25 题以科技论文为情境的频率比较高，也有基础知识的考查，但是分值不多，在有限的时
间内，很多同学做不到最后一个大题，或者是走马观花式的做了，没有深入研究题干信息，匆匆作答，正
答率可想而知。针对这种情况，在平时的训练中，多搜集科技论文背景素材，比如各种PCR 技术可以做专
题复习，多总结归纳，对于考查基础知识的填空，做到零失误，提高生物总成绩。
1．人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，近年研究发现，结肠癌等多种恶
性肿瘤细胞的hCGβ 基因也有表达，hCGβ 与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ 疫苗已成
为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图为其制备的基本方案。回答下列问题：
注：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔；AOX1 为甲醇氧化酶基因的启动子，
只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达；各种限制酶对应的线条所指为其识别序列。
(1)图示hCGβ 基因是人工合成的目的基因，在设计引物对其扩增时，为防止目的基因与质粒的自身环化并
保证连接的方向性，可在其两端添加 限制酶的识别序列。经实验得知该基因扩增引物长度为10 个核苷
酸时特异性强、效率高，已知目的基因①处的碱基序列为CCTTTCAGCTCA—，则设计该端对应引物的序
列是5＇ -3＇。
(2)图示 hCGβ 基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是 。从生产控制的角度分析，选用
AOX1 作为hCGβ 基因启动子的优点是 。
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(3)阶段Ⅱ大肠杆菌作为受体菌是利用了大肠杆菌 的特点，从而实现重组DNA 的扩增，然后在含有
的培养基中筛选得到含hCGβ 基因表达载体的大肠杆菌后进一步进行扩增。
(4)阶段Ⅳ需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分 （a.氨苄青霉素
b.组氨酸c.无机盐d.琼脂），可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ 基因表达载体的目的菌株。将此
菌株扩大培养后，离心取上清液，依据 原理进行检测。若上清液中能检测到hCGβ 蛋白，则说明hCGβ
基因得以表达。
【答案】(1) XhoⅠ、Mum Ⅰ CTCGAGCCTTTCAGCT
(2) 有利于hCGβ 进入内质网加工 可以通过控制培养液中甲醇作为唯一碳源，来控制hCGβ 基因
表达
(3) 繁殖快，易培养、遗传物质少 氨苄青霉素
(4) a、b 抗原和抗体特异性结合
【分析】图中Ⅰ为基因表达载体的构建过程，Ⅱ是将重组DNA 导入大肠杆菌，Ⅲ是提取并鉴定所需要的
重组质粒，Ⅵ是将选择的重组质粒导入酵母菌内，Ⅴ是筛选符合要求的酵母菌，Ⅵ是提取目的基因的产物。
【详解】（1）hCGβ 基因是人工合成的目的基因，在设计引物对其扩增时，为防止目的基因与质粒的自身
环化并保证连接的方向性，可在其两端添加限制酶识别序列，Sma Ⅰ会破坏目的基因，不能添加Sma Ⅰ识别
序列；EcoR Ⅰ会破坏质粒上的氨苄青霉素抗性基因（标记基因），不能添加EcoR Ⅰ识别序列；Sal Ⅰ会破坏
质粒上的组氨酸合成酶基因，不能添加Sal Ⅰ识别序列；Xho Ⅰ识别序列与Sma Ⅰ识别序列相似，会破坏目
的基因，不能添加Sal Ⅰ识别序列。因此，在hCGβ 基因两端应添加XhoⅠ、Mum Ⅰ限制酶识别序列。根据转
录方向和质粒AOX1 启动子位置确定，在①处插入了Xho Ⅰ的识别序列CTCGAG，则①处的碱基序列为5
＇-CTCGAGCCTTTCAGCTCA-3＇，互补链中，碱基序列为3＇-GAGCTCGGAAAGTCGAGT -5＇,对其设
计引物序列为5＇-CTCGAGCCTTTCAGCTCA-3＇，由于经实验得知该基因扩增引物长度为10 个核苷酸时
特异性强、效率高，加上Xho Ⅰ的识别序列CTCGAG，总共16 个碱基，因此设计该端对应引物的序列是5
＇-CTCGAGCCTTTCAGCT-3＇。
（2）甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔，因此hCGβ 基因需要与甲序列一起构
建形成融合基因，其目的是有利于hCGβ 进入内质网中加工，并分泌到细胞外。AOXⅠ为甲醇氧化酶基因
的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达，因此选用AOX1 作为hCGβ 基因启动子，可以
通过控制培养液中甲醇的有无，来控制hCGβ 基因的表达hCGβ 蛋白的合成。
（3）由于线性质粒上含有氨苄青霉素基因，因此导入环化质粒的大肠杆菌具有氨苄青霉素抗性，因此应
在含有氨苄青霉素的培养基中筛选得到含hCGβ 基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。
（4）由于环状质粒中含有组氨酸合成酶基因和氨苄青霉素抗性基因，且筛选重组质粒时大肠杆菌是在含
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有氨苄青霉素的培养基上培养的，因此为筛选导入重组质粒的酵母菌，培养基中不需要再加入组氨酸和氨
苄青霉素（即a 和b），但需要加入无机盐和琼脂，形成固体培养基，以筛选目的菌体。 hCGβ 是一种分
泌蛋白，可被分泌到细胞外，将培养物离心后分出细胞和培养液两部分，细胞经破碎处理后，再次离心取
上清液，可获得较多的hCGβ，用抗hCGβ 单克隆抗体分别进行检测，即抗原—抗体杂交法，原理为抗原与
抗体特异性结合。若培养液及上清液中均能检测到hCGβ 蛋白，则说明hCGβ 基因在酵母菌细胞中得到表
达，并能分泌到细胞外。
2．“凤凰虫”是一种重要的药用昆虫，其H 基因编码的抗菌肽HI-3 具有良好的抗菌、抗癌作用。科研人
员开展了利用酵母菌生产抗菌肽HI-3 的一系列研究。
(1)利用PCR 技术从“凤凰虫”基因组中扩增H 基因时发现，引物长度越短，扩增得到的DNA 片段种类越
（填“单一”或“复杂”），原因是 。
(2)已知H 基因编码链序列：5'- GGATCCTCTAGA∙∙∙∙∙∙TCGAGATGCTGCTG -3'，PCR 扩增H 基因时，结合
到编码链上的引物序列是 （要求：按照5'→3'方向写出5'端的前8 个碱基）。
(3)由于抗菌肽HI-3 会损伤酵母细胞，组成型表达（持续表达）H 基因的酵母菌最大种群数量偏低，限制了
最终产量。科研人员通过构建诱导型启动子来降低抗菌肽HI-3 对酵母菌的伤害。在酵母菌基因组DNA 中
插入P 基因（指导合成P 蛋白）和S 基因（指导合成S 蛋白），使质粒上H 基因的表达受红光控制。红光
调控H 基因表达的原理如下图所示。
由图可知，S 蛋白与启动子Jub 结合后会抑制 发挥作用，导致H 基因无法转录；红光下，P 蛋白能
够 ，解除S 蛋白的抑制作用，从而启动H 基因的表达。
(4)发酵后菌体和产物分离是发酵工艺的基本环节。定位于细胞表面的F 蛋白可使酵母细胞彼此结合，进而
沉淀在发酵罐底部。科研人员引入蓝光激活系统，在酵母菌基因组中插入了两个均能合成E 蛋白的基因
（E1、E2），使F 基因的表达受到蓝光控制，如下图所示。
图中E2 基因持续性表达少量的E 蛋白时，酵母细胞具有接受蓝光刺激的能力；蓝光照射后，F 基因的表达
被激活，原因是 。
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【答案】(1) 复杂 引物长度越短，特异性越差，基因组中能与引物结合的位点越多
(2)5'-CAGCAGCA-3'
(3) RNA 聚合酶 与结合在启动子上的S 蛋白结合
(4)蓝光照射后，E1 基因表达出大量E 蛋白与启动子CYC 结合，激活F 基因表达
【分析】引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR 的引物长度通常
为20〜30 个核苷酸，引物使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。一般来说，引物越短，
其非特异性越强，PCR 扩增后产物的种类越多。
【详解】（1）引物长度会影响PCR 扩增的特异性强度，一般来说，引物长度越短，引物的特异性强度越
低，基因组种能与引物结合的碱基序列位点越多，因此，引物长度越短，PCR 扩增产物DNA 片段种类越
复杂。
（2）引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，已知H 基因编码链的编码区序
列是：5'-GGATCCTCTAGA∙∙∙∙∙∙TCGAGATGCTGCTG-3'，根据DNA 分子的反向平行结构以及引物与模板
链的碱基互补配对原则可推知，扩增H 基因的编码区段时，结合到编码链上的引物序列是5'-
CAGCAGCA-3'。
（3）启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位，RNA 聚合酶识别并结合启动子后开始转录，图中S 蛋白与
Jub 结合后，导致RNA 聚合酶无法正常结合该启动子，抑制了RNA 聚合酶发挥作用；由图可知，红光下，
P 蛋白与S 蛋白结合了，解除S 蛋白的抑制作用，从而启动H 基因的表达。
（4）依据题意可知，科研人员引入蓝光激活系统目的是激活F 基因表达产生F 蛋白，使酵母细胞彼此结合，
进而沉淀在发酵罐底部，与CYC 相连的E1 基因的作用是接受照射蓝光后，快速表达大量E 蛋白，进而激
活F 基因的表达。
3．为获得转R—GFP 融合基因纯合小鼠，科研人员将红色荧光蛋白基因（RFP）插入含Gata3 基因的载体
中，然后导入小鼠受精卵，获得能正常表达两种蛋白质的杂合子雌、雄小鼠各一只。利用荧光蛋白活体成
像系统进行检测，发现两者均为阳性RFP 转基因小鼠。相关限制酶识别序列及限制酶识别位点如图甲所示，
A、B、C、F、R 为不同引物。
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(1)在PCR 反应溶液中常添加 ，其作用是 。在利用PCR 扩增RFP 编码区序列的过程中，需要设计引
物F 和R，在两个引物的（填“3'”或“5'”） 端需分别插入 的限制酶识别序列，以使RFP 基因能正确
插入载体中。用于扩增RFP 编码区序列的引物需满足的条件是 。
(2)在RFP 基因的扩增及重组载体的构建过程中，需要的工具酶有 。
(3)将实验获得的两只雌、雄杂合子小鼠（P）进行杂交获得F1若干，选取1～5 五只小鼠，从中提取含
Gata3 基因的相关DNA 片段，设计了引物A 和C 用于PCR 扩增，扩增产物电泳结果如图乙所示，则 小
鼠是Gata3—RFP 基因纯合子小鼠；若用引物A 和B 进行PCR 扩增， （填“能”或“不能”）区分
RFP 转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子，原因是 。
(4)为制备大量单链DNA 片段，研究人员常采用不对称PCR 技术。其基本原理是采用不等量的一对引物，
经若干次循环后，低浓度的引物（限制性引物）被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物（非限制性引
物）的延伸产物，结果获得大量单链DNA（ss—DNA）。若反应体系中原有100 个模板DNA，最初10 个
循环后限制性引物耗尽，再进行20 个循环，理论上可制备ss—DNA 个（用科学计数法表示），在这30
个循环中ss—DNA 的产生量主要受 的影响。
【答案】(1) Mg2+ 激活DNA 聚合酶的活性 5' Sal Ⅰ、EcoR Ⅰ 分别与两条模板链
（RFP 编码区序列）3'端的碱基序列互补
(2)Taq DNA 聚合酶、DNA 连接酶、限制酶
(3) 1 和5 不能 两种阳性小鼠提取的相关DNA 片段扩增产物的电泳结果均只有一条条带
(4) 2.048×106 限制性引物和非限制性引物比例
【分析】选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的
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抗性基因（至少保留一个）；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向
连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。
DNA 重组技术的基本工具包括 “分子手术刀”--限制酶、“分子缝合针”--DNA 连接酶、“分子运输
车”--基因进入受体细胞的载体。
【详解】（1）PCR 的全称是聚合酶链式反应，真核细胞和细菌细胞的DNA 聚合酶的活性需要Mg2+来激
活，所以PCR 反应溶液中添加Mg2+，其作用是激活DNA 聚合酶的活性。若要对RFP 基因进行扩增，需
在引物的5’端添加限制酶识别序列，因为引物对应区段也属于调控序列，若在3’端添加限制酶识别序列，
会导致限制酶的切割位点位于调控序列内部，进行相应酶切时，调控序列会被破坏。RFP 基因的终止子在
右侧（即转录方向为从左到右），故插入的调控序列应颠倒进行插入，即设计的时候：R 引物末端插入对
应下方载体的Xho Ⅰ酶切位点，F 引物末端插入对应下方载体的Mun Ⅰ酶切位点，又因为RFP 基因中含有
的Xho Ⅰ位点，因此不能用Xho Ⅰ酶来切，否则会破坏基因序列。结合题干当中所给的5 种限制酶的识别序
列，Xho Ⅰ和Sal Ⅰ互为同尾酶；Mun Ⅰ和EcoR Ⅰ互为同尾酶（即切割不同的DNA 片段但产生相同的黏性末
端的一类限制性内切酶）。因此可通过使用同尾酶进行替代，即剪切扩增产物时，F 末端添加的序列所对
应的限制酶应选择Sal Ⅰ，这样可以与下方载体中Xho Ⅰ的酶切位点结合；同理R 末端应选用与Mun Ⅰ同尾
的EcoR Ⅰ剪切。这样利用产生相同黏性末端的同尾酶对扩增产物和载体进行酶切，可以保证既能得到有效
片段，又能使之正确转录。引物是能够与DNA 母链特定的碱基序列互补配对的单链核酸片段，由于扩增
目的基因时有两条模板链，设计引物时，两种引物要分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。
（2）在RFP 基因的扩增及重组载体的构建过程中，需要限制酶，且载体构建过程中用到DNA 扩增技术，
所以还需要Taq DNA 聚合酶，载体构建完成还需要DNA 连接酶将DNA 片段连接起来。
（3）Gata3-RFP 基因为大片段，故结合图乙可知1 小鼠是Gata3-RFP 基因纯合子小鼠。由图乙可知，RFP
转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子两种阳性小鼠提取的相关DNA 片段扩增产物的电泳结果均只有一条
条带，故用引物A 和B 进行PCR 扩增，不能区分RFP 转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子。
（4）100 个模板DNA，最初10 个循环后限制性引物耗尽，再进行20 个循环，理论上可制备Ss-DNA：
100×20×210=2.048×106。根据题干“经若干次循环后，低浓度的引物（限制性引物）被消耗尽，以后的循
环只产生高浓度引物（非限制性引物）的延伸产物”可知，该过程中ss-DNA 的产生量主要受限制性引物
和非限制性引物比例的影响。
4．植物蔗糖转运蛋白（SUT）主要负责植物体内蔗糖的长距离运输，影响植物的生长和发育，决定作物的
产量和品质。SUT 基因家族中的StSUT2 基因主要在花和老叶中表达，科学家借助Gateway 克隆技术通过
构建StSUT2 植物超表达载体，为初探其功能提供基础。Gateway 克隆技术包括TOPO 反应和LR 反应（如
图一、图二所示）。
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(1)获得大量StSUT2 基因：首先从植物的 细胞中提取总mRNA，经过 过程获得cDNA，根据StSUT2
基因两端的序列设计引物进行PCR 扩增，获得大量的StSUT2 基因。
(2)构建入门载体：利用图一中的TOPO 反应将目的基因PCR 产物连入入门载体，该载体上的相应序列可被
拓扑异构酶（TOPO）识别并在相应位点断开磷酸二酯键，形成一端为平末端，一端为黏性末端的载体，
并将其与拓扑异构酶酶切后的StSUT2 基因进行连接。拓扑异构酶与基因工程的 酶功能相似。为确保
StSUT2 基因定向连接入门载体，在扩增StSUT2 基因时，可在引物中引入5'— —3'序列。
(3)构建StSUT2 基因超表达载体：LR 反应可借助入门载体上的attL 位点和超表达载体上的attR 位点，将入
门载体中的目的基因与超表达载体中的相应片段实现同源重组，得到所需载体。请结合图二中的LR 反应
过程，在下图三的方框中画出含StSUT2 基因的超表达载体 。
(4)StSUT2 基因超表达及检测：通过比较含StSUT2 基因入门载体的转基因植物细胞、含StSUT2 基因超表
达载体的转基因植物细胞和非转基因植物细胞中的 ，从而确定StSUT2 基因是否成功超量表达。
【答案】(1) 花或老叶 逆转录
(2) 限制酶和 DNA 连接酶 CACC
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(3)
(4)StSUT2 转运蛋白含量
【分析】PCR 过程：
①变性：当温度上升到90℃以上时，DNA 解旋为单链；
②温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA 结合；
③延伸：再将温度上升到72℃左右，反应体系中的4 种脱氧核苷酸在耐高温的TaqDNA 聚合酶的作用下，
根据碱基互补配对原则合成新的DNA 链。
【详解】（1）为获得大量StSUT2 基因，应首先从植物的花或老叶细胞中提取总mRNA，通过逆转录过程
获得cDNA，然后根据StSUT2 基因两端的序列设计两种引物进行PCR 扩增，进而获得大量的StSUT2 基因。
（2）载体上的相应序列可被拓扑异构酶（TOPO）识别并在相应位点断开磷酸二酯键，形成一端为平末端，
一端为黏性末端的载体，并将其与拓扑异构酶酶切后的StSUT2 基因进行连接。因此拓扑异构酶与基因工
程的限制酶和 DNA 连接酶功能相似。由于目的基因左侧碱基序列为GTGG，因此在扩增StSUT2 基因时，
可在引物中引人5'—CACC—3'序列，以确保StSUT2 基因定向连接人门载体。
（3）因为LR 反应可借助入门载体上的attL 位点和超表达载体上的attR 位点，将入门载体中的目的基因与
超表达载体中的相应片段实现同源重组，因此StSUT2 基因的超表达载体为：
（4）为确定StSUT2 基因是否成功超量表达，可通过比较含StSUT2 基因入门载体的转基因植物细胞、含
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StSUT2 基因超表达载体的转基因植物细胞和非转基因植物细胞中的StSUT2 转运蛋白含量。
5．某研究所为研究水稻叶肉细胞中miR5810（一种小分子RNA）和MRLP6 蛋白之间的关系，分别探究了
两者对水稻光合色素含量和净光合速率的影响，结果如图一所示。同时，研究人员利用双荧光素酶技术探
究了转录因子NFYB7 与miR5810 基因表达的关系。该项研究揭示了一种调节光合作用的分子机制，为水
稻高光合育种提供了新思路。
(1)水稻中的光合色素分布在 ，可用 提取。矿质元素是指除C、H、O 以外，植物根系从土壤中吸收
的元素，合成叶绿素分子所需要的矿质元素是 。
(2)miR5810 会 （填“促进”或“抑制”）MRLP6 蛋白合成， （填“升高”或“降低”）光合色素
的含量，进而调节光合作用速率。
(3)双荧光素酶技术可通过测定荧光强度的比值（LUC/REN），实现对目标基因表达水平的定量分析。LUC
和REN 是两种催化不同底物的荧光素酶，通过分别添加不同的荧光素测其荧光强度，计算荧光强度之比。
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相比较NFYB7 基因表达载体（如图二）与双荧光素酶基因表达载体（如图三）共转化细胞，只转化双荧
光素酶基因表达载体的细胞中，荧光强度LUC/REN 比值降低，原因是 。
(4)综上所述，NFYB7—miR5810—MRLP6 调节水稻光合作用速率的可能分子机制是 。
【答案】(1) 叶绿体类囊体薄膜上 无水乙醇 N、Mg
(2) 抑制 降低
(3)转录因子NFYB7 与miR5810 基因启动子结合，增强了LUC 基因的表达，而REN 基因表达量相同。
(4)NFYB7 与miR5810 基因的启动子结合增强其表达，miR5810 含量升高抑制了MRLP6 蛋白质的合成，导
致光合色素含量降低，从而抑制了光合作用。
【分析】光合色素主要分布在叶绿体的类囊体膜上，包括叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素。由于光
合色素是脂溶性的，故用有机溶剂无水乙醇进行提取。光合色素的作用是吸收、传递和转化光能。
【详解】（1）水稻中的光合色素分布在叶绿体类囊体薄膜上，由于光合色素是脂溶性物质，所以可用无
水乙醇提取。叶绿素含有C、H、O、N、Mg，因此矿质元素是指除C、H、O 以外，植物根系从土壤中吸
收的元素，合成叶绿素分子所需要的矿质元素是N、Mg。
（2）据图1 分析，miR5810 过表达总光合色素含量低、净光合速率低；MRLP6 低表达总光合色素含量低、
净光合速率也低，两者的影响一致，说明miR5810 过表达抑制MRLP6 蛋白合成，从而降低光合色素的含
量，进而调节光合作用速率。
（3）据图分析，由于转录因子NFYB7 与miR5810 基因启动子结合，增强了LUC 基因的表达，即LUC 荧
光强度增加，而REN 基因表达量相同，即REN 荧光强度不变，所以荧光强度LUC/REN 比值降低。
（4）NFYB7—miR5810—MRLP6 调节水稻光合作用速率的可能分子机制是NFYB7 与miR5810 基因的启
动子结合增强其表达，miR5810 含量升高抑制了MRLP6 蛋白质的合成，导致光合色素含量降低，从而抑
制了光合作用。
6．研究发现，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，蓖麻毒素蛋白（RTA）可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，
从而引起细胞死亡。TAT 是一种短肽，可转导蛋白进入细胞，含有氧依赖性降解区域ODD（多肽）的融合
蛋白可以适应低氧条件稳定存在，但在常氧条件下会被蛋白酶降解。科研人员以RTA 作为抑制肿瘤细胞增
殖的活性分子，利用TAT 的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，并利用ODD 的作用减轻RTA 对正常细胞
的毒性，分别构建了含TAT-RTA（660bp）和TAT-RTA-ODD（870bp）融合基因的表达载体，并成功得到
相关融合蛋白。
(1)可采用PCR 的方法获取融合基因TAT-RTA，需要根据TAT 和RTA 基因设计引物，引物的作用是
。已知RTA 基因和欲得到的TAT-RTA 融合基因的结构如图1 所示，TAT 基因编码链序列
5'ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，为顺利构建表达载体，需要在引物1 的5′端
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加入 酶切位点，引物2 的5′端加入 酶切位点，利用TAT 和RTA 核酸序列设计引
物时，要求在RTA 蛋白的前端引入TAT 短肽，请根据要求写出引物1 （写出引物5′端的12 个
碱基即可）。
(2)载体的部分结构如图2 所示，His 标签由连续的6 个组氨酸构成，可用于对重组融合蛋白进行分离纯化，
将PCR 得到的TAT-RTA 融合基因和载体双酶切后，再用 酶连接。但是在研究时，发现融合
蛋白中没有His 标签蛋白，据图分析原因是 。可通过引物2 的特殊设计使His 标签正常表达，
请结合图1 和图2 写出引物2 （引物中如需添加碱基补足对应的密码子，可以添加任意碱
基）。
【答案】(1) 与模板DNA 单链互补配对实现连接，并且使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱
氧核苷酸 BamH Ⅰ Xbo Ⅰ 5'GGATCCATGAGC3'
(2) DNA 连接酶 限制酶2 识别序列后面的一个碱基A 与His 标签基因编码链的前两个碱基CA 编
码一个氨基酸，导致His 标签基因对应的mRNA 的密码子被错位读取
5'CTCGAGTAGAACTGGCTGCTCGGCGG3'
【分析】多聚酶链式反应扩增DNA 片段：
（1）PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 中游离脱氧核苷酸为
原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子链
的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要原
因是DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。
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（2）PCR 反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】（1）PCR 中，引物的作用是与模板DNA 单链互补配对实现连接，并且使DNA 聚合酶能够从引
物的3'端开始连接脱氧核苷酸。据图1 可知，TAT-RTA 融合基因TAT 靠近启动子一侧有BamH Ⅰ的位点，
RTA 靠近终止子一侧有Xbo Ⅰ的位点，则引物1 的 5′端加入BamH Ⅰ，引物2 的5′端加入Xbo Ⅰ。TAT 基因
编码链序列5'ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，由于其5'端需插入BamH Ⅰ的识
别位点，根据碱基互补配对原则可知，其对应的引物的5'端应包含BamH Ⅰ的识别序列，故设计为
5'GGATCCATGAGC3'，以便BamH Ⅰ切出相应的黏性末端。
（2）切割后的DNA 片段需要用DNA 连接酶连接成完整DNA 分子。由图2 可知， 限制酶2 识别序列与
His 标签序之间多出一个碱基A，这一个碱基A 与His 标签基因编码链的前两个碱基CA 编码一个氨基酸，
导致His 标签基因对应的mRNA 的密码子被错位读取，导致不能正确编码出His 标签蛋白，所以可在A 碱
基左右侧再（随意）插入两个碱基，方可不打乱His 标签基因，结合图1 引物2 的方向、Xbo Ⅰ的识别序列
及碱基互补配对原则可知，引物2 为5'CTCGAGTA（TA 为补充碱基）G（与模版链配对的）
AACTGGCTGCTCGGCGG3'。
7．fat1 基因和fat2 基因控制的酶分别调控两种多不饱和脂肪酸的合成，两种酶的共同表达对于细胞内多不
饱和脂肪酸的合成具有协同效应。2A 肽是一种来源于病毒的短肽，受2A 基因序列控制。2A 基因的转录
产物可以通过“核糖体跳跃”断开位于2A 肽尾端甘氨酸和脯氨酸之间的肽键，将2A 基因编码的蛋白分割
成2 个独立蛋白。图甲表示科研人员利用重叠延伸PCR 技术成功构建融合基因fat1—2A—fat2 的过程。图
乙表示构建成功的包含融合基因的重组质粒的部分片段，F1~F4、R1~R4 表示引物。通过基因工程成功实
现了fat1 基因和fat2 基因在小鼠体内的共同表达，大大提高了细胞内多不饱和脂肪酸的含量。
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(1)利用PCR 技术可以实现在体外快速大量进行DNA 扩增，其与细胞内DNA 复制的共同点是 （答出2
点）。若图乙中融合基因的b 链为模板链，则图甲PCR1 中的引物甲与图乙中的引物 的绝大部分序列相
同。
(2)PCR1 和PCR2 需要分开单独进行，原因是 。PCR3 不需要引物，高温加热后fatl—2A 和2A—fat2 的
双链解开，其中能正常延伸形成融合基因的是 （填序号）形成的杂交链。
(3)为了确定fatl 基因连接到质粒中且插入2A 序列的上游，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，应选择图
乙中的引物_ 。融合基因经下图中的过程表达产生fatl 和fat2 两种蛋白，经检测发现通过该技术表达的fat1
蛋白的分子量较正常fat1 蛋白的分子量大，依据该融合基因的结构和表达原理推测，原因是 。
【答案】(1) 都需要模板、引物、DNA 聚合酶、原料都是脱氧核苷酸(答出2 点即可) R4
(2) 引物甲和引物丁部分碱基互补配对,影响子链的合成 ①、④
(3)F1、R3 fatl 基因后面连接了2A 序列,使fat1 蛋白后面连接了2A 肽的部分片段
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）PCR 技术与细胞内DNA 复制的共同点是都需要模板、引物、DNA 聚合酶、原料都是脱氧
核苷酸；若图乙中融合基因的b 链为模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左
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向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链(也就是a 链)是5'-3';考虑到DNA 复制的方向是子链的
5’-3'，引物基础上延伸的 方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向 是3'-5'；图中fat1 片段中F1 是前
引物，在左侧，所以其配 对的单链是3’-5'的b 链，故图甲PCR1 中的引物甲与图乙中的R4 链相应部分的
序列相同；
（2）利用重叠延伸PCR 连接fat1 和fat2 基因过程中引物2 和引物3 的侧翼序列是互补配对的，若置于同
一反应体系，会发生结合而失去作用，不能扩增目的基因，因此PCR1 体系与PCR2 体系应分别独立进行；
高温加热后fatl—2A 和2A—fat2 的双链解开，其中能正常延伸形成融合基因的是①、④形成的杂交链；
（3）为了确定fatl 基因连接到质粒中且插入2A 序列的上游，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，应选择
图乙中的引物F1、R3 ；由图可知， fatl 基因后面连接了2A 序列，使fat1 蛋白后面连接了2A 肽的部分片
段，因此该技术表达的fat1 蛋白的分子量较正常fat1 蛋白的分子量大。
8．磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA 的动态变化，研
究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA 结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建
有效监测细胞PA 变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA 含量。无缝克隆技术连接DNA 片段的机理和
构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题。
注：bar 为草胺膦抗性基因；Kanr为卡那霉素抗性基因。
(1)无缝克隆时，T5 核酸外切酶沿 （填“5´→3´或“3´→5´”）的方向水解DNA，其目的是形成 。
T5 核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而过程①选择的温度为50℃，目的是降低酶活性， 。
(2)过程②两个片段复性后存在“缺口”的原因是 ，过程③所需的酶有 。
(3)与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有________。
A．不受限制酶切位点的限制
B．不会引入多余碱基，不会出现移码突变
C．操作相对简单，成功率高
D．不需要使用PCR 技术扩增目的基因
(4)PCR 扩增PABD 基因时需依据 的核苷酸序列设计引物R1。据图分析扩增目的片段的所用的引物
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F1 和R2 可对应下表中的 （填序号）。
①
5´-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3´
②
5´-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC-3´
③
5´-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA-3´
④
5´-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA-3´
(5)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有 的MS 培养基上
进行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中 ，
了解PA 的分布和含量。
【答案】(1) 5'→3' 黏性末端 防止过度水解DNA
(2) 过程①形成的黏性末端大于互补配对的区段（同源序列） DNA 聚合酶和DNA 连接酶
(3)ABC
(4) PABD 基因一端的核苷酸序列和载体一端 ①、④
(5) 草胺膦 绿色荧光点的分布
【分析】PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：
（1）模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成
的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
（2）模板DNA 与引物的退火（复性）：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模
板DNA 单链的互补序列配对结合。
（3）延伸：DNA 聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA 链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA
聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA 片段长度。
【详解】（1）由图可知，无缝克隆时，过程①中T5 核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA，以形成黏性末
端。温度能影响酶活性，T5 核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而过程①选择的温度为50℃，目的是降
低酶活性，防止过度水解DNA。
（2）过程②在退火的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的
黏性末端大于互补配对的区段（同源序列），因此在过程②退火后存在“缺口”。过程③缺口处DNA 链
的补齐，可以看作DNA 分子的复制过程，所需的酶有DNA 聚合酶（DNA 聚合酶将游离的单个脱氧核苷
酸加到子链3′末端）和DNA 连接酶（将两个DNA 片段进行连接）。
（3）传统的酶切再连法需要用特定的限制酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA 连接酶对目的基因
和质粒进行连接，在该过程会形成多个小片段，操作复杂，而无缝克隆技术构建重组质粒是不受限制酶切
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位点的限制，不会引入多余碱基，不会出现移码突变，操作时间短，成功率高，ABC 正确，D 错误。
故选ABC。
（4）用于PCR 扩增的引物是根据一段已知目的基因（PABD 基因）的核苷酸序列来设计的，由图可知，
PABD 基因（目的基因）需要用载体进行连接，因此PCR 扩增PABD 基因时需依据PABD 基因一端的核苷
酸序列和载体一端的核苷酸序列设计引物R1。由重组DNA 图可知，GFP 基因和PABD 基因进行连接，
PCR 扩增GFP 基因时需根据GFP 基因一端的核苷酸序列和PABD 基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而
设计引物F1 仅需根据PABD 基因一端的核苷酸序列，因此引物F1 的碱基序列比引物R2 的碱基序列短，
因此扩增目的片段的引物F1 对应于下表中的①。PCR 扩增GFP 基因时需根据GFP 基因一端的核苷酸序列
和PABD 基因一端的核苷酸序列引物R2，即引物R2 的一部分能与引物F1 进行碱基互补配对，综上所述，
R2 对应于下表中的④。
（5）由图可知，bar（草胺膦抗性基因）为标记基因，位于T-DNA 上，农杆菌中的Ti 质粒上的T-DNA 可
转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获
得的种子进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS 培养基上进行筛选和鉴定。由题意“将高度专一的PA
结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA 变化的荧光探针，并测
定拟南芥细胞内PA 含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA 的动态变
化。
9．经过不懈努力，我国科研人员从野生玉米“大刍草”中，成功找回玉米人工驯化过程中丢失的一个控
制高蛋白含量的优良基因 THP9，将此高蛋白基因克隆出来并转移到玉米细胞内，获得转基因高蛋白玉米
新品种。
EcoRⅠ
BamHⅠ
KpnⅠ
MfeⅠ
HindⅢ
5′-G↓AATTC-3′
5′-CTTAA↑G-3′
5′-G↓GATCC-3′
5′-CCTAG↑G-3′
5′-G↓GTACC-3′
5′-CCATG↑G-3′
5′-C↓AATTG-3′
5′-GTTAA↑C-3′
5′-A↓AGCTT-3′
5′-TTCGA↑A-3′
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(1)THP9 基因游离的磷酸基团侧为 （填“5′”或“3′”）端，已知图中THP9 基因转录方向为
从左往右，则 THP9 基因转录时的模板链是 链。
(2)构建基因表达载体时，若科研人员需将 THP9 基因整合到如图质粒上，应使用限制酶
切割图中质粒，使用限制酶 切割图中含 THP9 基因的DNA 片段，以获得能正确
表达THP9 基因的重组质粒。
(3)为了筛选出含重组质粒的受体细胞，应在添加 的选择培养基上培养，培养后获得的菌
落不能判定是否含有重组质粒，原因是 。
(4)研究人员常用DNA 分子杂交技术检测 THP9 基因有没有整合到受体细胞的染色体 DNA 上。检测时常
使用 标记的目的基因单链片段作为探针。
【答案】(1) 5′ 乙
(2) MfeⅠ、HindⅢ EcoRⅠ、HindⅢ
(3) 氨苄青霉素 含未重组质粒（或普通质粒）的受体细胞也能正常生长
(4)放射性同位素（或荧光分子等）
【分析】常用PCR 特异性地快速扩增目的基因。PCR 是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA 半保
留复制的原理，在体外提供参与DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复
制的技术。
【详解】（1）THP9 基因游离的磷酸基团侧为5′端，已知图中THP9 基因转录方向为从左往右，RNA 聚合
酶沿着子链的5'端延伸，即图中的乙链是模板链。
（2）图中THP9 基因转录方向为从左往右，即启动子位于左端，终止子位于右端，因为该基因右侧只有一
个酶切位点，故一定用Hind Ⅲ切割质粒和目的基因，对于质粒来说，不能用EcoRI 进行切割（含两个切
割位点，切成片段了），不能用BamHI 切割（会切断启动子），那么在Hind Ⅲ的左侧只有MfeI 序列，而
目的基因不能用该酶切割，与MfeI 能形成相同黏性末端的是EcoRI，故质粒用MfeI、Hind Ⅲ切割，目的
基因用EcoRI、Hind Ⅲ切割。
（3）为了筛选出含重组质粒的受体细胞，应在添加氨苄青霉素的选择培养基上培养，培养后获得的菌落
不能判定是否含有重组质粒，原因是含未重组质粒（或普通质粒）的受体细胞也能正常生长。
（4）用DNA 分子杂交技术检测THP9 基因有没有整合到受体细胞的染色体DNA 上，该过程常使用放射性
同位素标记的目的基因单链片段作为探针。
10．CRISPR-Cas12a 系统是第二类用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR-Cas 系统，该系统主要包含crRNA
和Cas12a 蛋白两部分，crRNA 能特异性识别并结合特定的DNA 序列，从而引导Cas12a 蛋白到相应位置剪
切DNA。某科研团队基于CRISPR-Cas12a 系统对宫颈癌细胞中的KIFC1 基因进行敲除，来探讨KIFCI 基
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因在宫颈癌细胞中的功能及对宫颈癌HeLa 细胞增殖的影响。
(1)在CRISPR-Cas12a 系统中，crRNA 的序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含
种核苷酸；细菌细胞中的 也能起到类似Cas12a 蛋白的作用。若要将KIFCI 基因从目标DNA 上
剪切下来，需要设计 种crRNA。
(2)为保证目的基因与PX458 质粒正确连接，在扩增目的基因时，应在引物端加入相应的限制酶序列，其中
P1 的碱基序列为5′ 3′（写出前9 个碱基）。采用PCR 技术对一个DNA 进行扩增时，第n 次循
环共需要引物 个。
(3)
在目的基因
与PX458 质粒连接时，可用 （填“E.coliDNA 连接酶”或“T4DNA 连接酶”）进行连接。
(4)将crRNA-Cas12a 重组载体成功转染至HeLa 细胞，与对照组相比，实验组中KIFCl 蛋白表达量如图2 所
示，细胞数目的变化如图3 所示，由此可得出的结论是 ，判断依据是 。
【答案】(1) 8/八 限制酶（限制性内切核酸酶） 2/二/两
(2) CAGCTGCTC 2n
(3)T4DNA 连接酶
(4) KIFC1 基因可以促进HeLa 细胞的增殖 敲除细胞株中KIFC1 蛋白表达量明显下降，证明HeLa
细胞KIFC1 基因敲除成功：KIFCl 敲除组细胞数目显著低于对照组，表明KIFC1 敲除可使HeLa 细胞增殖
能力下降
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选和获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR
技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、
启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一
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样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细
胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检
测与鉴定：分子水平上的检测：个体水平上的鉴定。
【详解】（1）在CRISPR-Cas12a 系统中，crRNA 的序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域既
有DNA 也有RNA，故最多有种核苷酸（4 种脱氧核苷酸和4 种核糖核苷酸）；Cas12a 蛋白可以到相应位
置剪切DNA，其作用相当于限制酶；若要将KIFCI 基因从目标DNA 上剪切下来，需要有两个切口，而
crRNA 的识别具有特异性，故需要2 种crRNA。
（2）扩增目的基因时，应在引物端加入相应的限制酶序列，引物需要与模板链的3'端结合，按照碱基互补
配对原则保证子链从5'向3'延伸，结合图示可知，P1 的碱基序列为5′CAGCTGCTC3′；一个DNA 分子有两
条链，第n 次复制形成2n 个DNA，相当于新合成2n-1 个DNA 分子，合成一个DNA 分子需要两个引物，
因此需要的引物数目为2n-1×2=2n 个。
（3）T4DNA 连接酶可连接黏性末端和平末端，故在目的基因与PX458 质粒连接时，可用T4DNA 连接酶
连接。
（4）结合图示可知，敲除细胞株中KIFC1 蛋白表达量明显下降，证明HeLa 细胞KIFC1 基因敲除成功：
KIFCl 敲除组细胞数目显著低于对照组，表明KIFC1 敲除可使HeLa 细胞增殖能力下降，据此可知，KIFC1
基因可以促进HeLa 细胞的增殖。
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