2区5分!天然产物发文模板|GEO公共数据库挖掘+转录组+PPI 网络+湿实验验证,拆解纳米蛹虫草抗气道炎症完整研究逻辑!

在壳聚糖纳米粒制备过程中，80%甲醇GRC提取物中形成了沉淀，表明纳米粒形成不成功（图1A）。热水GRC提取物中未形成沉淀，加入三聚磷酸钠（TPP）后离心获得了纳米粒沉淀，用于后续制备（图1B）。为了比较GRC和GCN的抗氧化活性和储存稳定性，采用TAC assay分析了三种不同样品——4 °C储存的GRC、室温储存的GRC和室温储存的GCN。结果表明，GCN表现出比GRC更高的抗氧化能力，并在室温储存20天后显示出改善的稳定性（图1C）。此外，GRC中腺苷含量为0.36 ± 0.00 mg/g（表1）。

图1. 蛹虫草在发芽木豆（GRC）上生长制备的GRC包封壳聚糖纳米粒及其抗氧化活性和储存稳定性。(A) 加入壳聚糖后80%甲醇GRC提取物（左）和热水GRC提取物（右）的比较；甲醇提取物中观察到沉淀形成，而热水提取物中未检测到沉淀。(B) 通过14,240 × g离心获得的热水GRC提取物负载壳聚糖纳米粒。(C) 4°C和室温储存的GRC以及室温储存20天的壳聚糖纳米粒负载GRC（GCN）的总抗氧化能力（TAC）。TAC以每毫克样品的抗坏血酸当量（AAE）μg表示。实验重复三次，结果以平均值±标准差（SD）表示。组间统计学显著比较采用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey诚实显著差异（HSD）事后检验进行分析。a–c，不同字母的柱在Tukey HSD检验中p < 0.05时差异显著。

DLS分析显示PM2.5颗粒范围为391.06 ± 0.18 nm至492.50 ± 0.22 nm，平均大小为318 ± 33.7 nm（n = 3；图2A）。与PM处理组（50、100和200 μg/mL）和未处理对照组相比，PM和LPS联合处理以浓度依赖性方式显著降低A549细胞活力（p < 0.05）（图2B）。GCN显著恢复了PM和LPS共处理的A549细胞活力，并在200 μg/mL时表现出比GRC更强的保护作用（p < 0.05）（图2C）。EC50表示GCN或GRC对PM和LPS诱导的A549细胞活力降低产生半数最大保护效应所需的浓度。相比之下，CC50表示GCN或GRC单独使细胞活力降低50%的浓度。GRC在A549细胞中的EC50为218.19 ± 55.19 μg/mL，而GCN的EC50为145.45 ± 19.18 μg/mL，GCN降低了约1.5倍。此外，在测试实验条件下，GRC和GCN在A549细胞中的CC50值均估计为>200 μg/mL（图2D）。GCN在25–200 μg/mL浓度下未观察到显著细胞毒性，因此选择这些浓度用于后续实验（补充图S1）。TI反映了细胞毒性和保护功效之间的相对平衡[64,65]，用于比较GCN和GRC的治疗窗。计算TI以比较GCN和GRC的相对安全性，GCN的TI为15.85 ± 1.67，GRC的TI为3.49 ± 0.97。GCN的TI超过了可行药物候选物通常接受的最低阈值10，与GRC相比增加了约4.5倍，表明对PM和LPS诱导的A549细胞活力降低的安全性和保护功效有统计学显著增强（独立样本t检验，p < 0.001），支持GCN进一步治疗开发的潜力。

为建立稳健的氧化应激模型，首先评估了暴露于PM和LPS的A549细胞中细胞内ROS产生。PM和LPS联合刺激使细胞内ROS水平较对照组显著增加11.60 ± 0.54倍，较单独PM处理细胞增加2.31 ± 0.16倍（p < 0.05），表明PM和LPS对氧化应激诱导具有协同效应（图3A,B）。基于这一验证的氧化应激条件，我们接下来研究了GCN的细胞内ROS清除活性。GCN处理显著抑制了PM和LPS诱导的细胞内ROS产生，将ROS水平降至相对于刺激组的0.20 ± 0.05倍（p < 0.05），如荧光强度降低所示。此外，GCN表现出比GRC显著更强的抗氧化活性，GCN处理细胞中的细胞内ROS水平比GRC处理细胞低0.59 ± 0.00倍（p < 0.05；图3C,D）。总之，这些结果表明PM和LPS联合暴露有效诱导细胞内氧化应激，而GCN在这些氧化应激条件下有效减弱ROS过度产生，支持其抗氧化功效。

我们探索了基因表达数据集，以识别PM和LPS处理与正常样品之间的DEGs。鉴于香烟烟雾和PM化学成分的相似性，两者均已被报道在呼吸系统中诱导重叠的氧化应激和炎症反应[66–71]，检查了包含CS和LPS处理样品的GSE193958（n = 5）和GSE41684（n = 8）数据集，分别产生1300个（935个上调，365个下调）和651个DEGs（432个上调，219个下调）（|log FC| > 1，校正p < 0.05）[55]。此外，从GeneCards检索COPD相关靶基因（7808个蛋白编码基因，GIFtS ≥ 30以保留功能注释的疾病相关基因）[56–58]，并使用Venn图与这些DEGs取交集，识别出120个与主要PM和LPS诱导的肺部炎症状况相关的共有基因（图4A）。选择COPD作为PM和LPS触发的代表性炎症相关状况[4,72–74]，包括哮喘、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和肺炎，因为它与GSE193958和GSE41684数据集中识别的DEGs显示出显著重叠。为了探索120个共有基因的关键功能和生物学特征，使用DAVID数据库进行了GO和KEGG通路分析。GO包含三个类别：BP、MF和CC。每个类别中前五个富集术语如图4B所示。在BP分析中，共有基因显著与炎症反应（GO:0006954）、对LPS的细胞反应（GO:0071222）、免疫反应（GO:0006955）、趋化因子介导的信号通路（GO:0070098）和肿瘤坏死因子（TNF）产生的正调控（GO:0032760）相关。在MF分析中，基因主要富集于趋化因子活性（GO:0008009）、蛋白结合（GO:0005515）、细胞因子活性（GO:0005125）、相同蛋白结合（GO:0042802）和C-X-C基序趋化因子受体（CXCR）结合（GO:0045236）。对于CC分析，基因主要参与细胞外空间（GO:0005615）、细胞外区域（GO:0005576）、质膜外侧（GO:0009897）、细胞表面（GO:0009986）和细胞外基质（GO:0031012）。KEGG通路分析显示，共有基因主要与细胞因子-细胞因子受体相互作用（mmu04060）、Toll样受体信号通路（mmu04620）、TNF信号通路（mmu04668）、IL-17信号通路（mmu04657）和病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体相互作用（mmu04061）相关（图4C）。

为了研究120个共有基因之间的PPIs，将它们上传至STRING数据库，最大相互作用物数量设为0，最低要求相互作用评分设为最高置信水平（≥0.9）[59]。该分析生成了一个包含118个节点和1178条边的PPI网络（图4D）。接下来，使用Cytoscape插件CytoHubba识别网络中的关键枢纽基因。通过将MCC和Degree算法应用于PPI网络，识别出前10个枢纽基因，8个重叠基因为TNF、CXCL-10、CXCL-1、IL-6、IL-1β、CCR2、CXCL-2和CCL4。这些基因可能在PM和LPS暴露诱导的COPD中发挥关键作用（图4E）。其中，TNF、CXCL-10、IL-6、IL-1β和CXCL-2在GEO2R差异表达分析中也排名前列，并参与TNF信号通路（mmu04668）。

图4. 共有基因的功能富集分析，随后使用CytoHubba插件在蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络中筛选枢纽基因。(A) Venn图显示GSE193958和GSE41684的差异表达基因（DEGs）与慢性阻塞性肺疾病（COPD）相关靶基因之间的共有基因。(B) 共有基因的生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）富集。(C) 共有基因的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。(D) 使用STRING在线数据库构建共有基因的PPI网络。边表示共有基因之间的相互作用。(E) 使用以下方法通过CytoHubba对前10个枢纽基因进行排名：Degree和最大团中心性（MCC）评分。

为了评估GCN在炎症条件下的抗炎潜力，用PM和LPS刺激A549细胞。与刺激组相比，GCN显著降低了PM和LPS诱导的中性粒细胞趋化剂CXCL-2 mRNA表达，降低了87.9% ± 1.26（p < 0.05），表明对趋化因子诱导具有强抑制作用。尽管GRC也减弱了PM和LPS诱导的CXCL-2 mRNA表达，但GCN在相同条件下发挥了显著更强的抑制作用。此外，GCN预处理显著减弱了PM和LPS刺激的A549细胞中TNF-α的mRNA表达（p < 0.05）。值得注意的是，TNF-α mRNA水平降至相对于PM和LPS处理组的0.13 ± 0.00倍，表明GCN对细胞因子信号传导具有强效抑制作用（图5）。鉴于TRPC6在CXCL-2介导的中性粒细胞迁移和趋化性中的既定作用，我们进一步检测了TRPC6 mRNA表达。同样，GCN显著减弱了PM和LPS诱导的TRPC6 mRNA表达上调（p < 0.05），与其对CXCL-2 mRNA表达的抑制作用一致。

基于KEGG通路分析确定Toll样受体和TNF信号通路是NF-κB、MAPK和AP-1信号级联的关键调控因子，本研究旨在阐明GCN抗炎活性的分子机制。GCN显著减弱了PM和LPS诱导的细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun N端激酶（JNK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）的磷酸化，以及NF-κB信号级联的激活，包括磷酸化κB抑制剂（p-IκB）、磷酸化NF-κB（p-NF-κB），以及AP-1信号级联，包括A549细胞中磷酸化c-Jun（p-c-Jun）（p < 0.05；图6）。尽管GCN和GRC（200 μg/mL）均有效减少了PM和LPS诱导的炎症信号传导，但GCN对MAPK（ERK、JNK和p38 MAPK）和NF-κB信号通路激活的抑制作用显著强于GRC，表明其在炎症条件下具有优越的抗炎功效（p < 0.05）。总之，这些发现表明GCN通过抑制MAPK介导的NF-κB和AP-1信号传导，在PM和LPS刺激的A549细胞中发挥抗炎作用，支持其作为功能性食品来源成分用于预防或缓解PM和LPS诱导的肺部炎症的潜力。原始未裁剪的Western blot图像见补充图S2。