AI 陪你拆 CyTOF 生信最佳实战(三):质量控制

前面我们整理过CyTOF数据分析的一些生信笔记，这次重新更新一下这方面的内容啦。

本交流群仅限于cytof数据处理相关细节哈，承诺不少于30篇相关教程。

本次学习帖子融入AI的各种操作。

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cytof数据资源群专辑：《cytof》。

前面的步骤：

AI 陪你拆 CyTOF 生信最佳实战（一）：从 .fcs 读起

AI 陪你拆 CyTOF 生信最佳实战（二）：prepData 构建 SCE 对象

本次学习文献

2026 年 9 月 18 日发表在iScience上，文献标题是：《Single-cell immune profiling of blood and thrombus in cancer-associated thrombosis》。

本文整合高维 CyTOF 与 scRNA-seq 图谱，对癌相关血栓（CAT）患者配对外周血与血栓做单细胞免疫表型，发现"外周 T/NK 系统性耗竭 + 血栓内髓系富集、T 细胞消亡、DN T 细胞上位"的双层免疫重编程，并在血栓 CD45⁻ 非免疫区室检出 PD-L1"越界"、血红蛋白与 FOXP3⁺CD8⁺ 调节性 T 细胞跨室正相关，为血栓–免疫互作提供了一份可挖掘的开放单细胞资源。

分析流程图

可以把 CyTOF 先记成一句话：

CyTOF 是“用金属同位素标记抗体，逐个细胞测量几十个蛋白/功能标志物”的高维单细胞蛋白检测技术。

它和 scRNA-seq 很像，都会得到“细胞 × 特征”的矩阵、聚类、UMAP、细胞注释和细胞比例比较；

但 CyTOF 测的是预先设计好的抗体信号，不是全转录组。

前提

AI 陪你拆 CyTOF 生信最佳实战（一）：从 .fcs 读起，会产生一个对象，这里面变量名是 samp 。

AI 陪你拆 CyTOF 生信最佳实战（二）：prepData 构建 SCE 对象 第二步构建 SingleCellExperiment 对象，得到 sce。

今天第三步：质量控制。

从sce开始。

质控指标

下面来绘制一些图来看数据质量情况。

每样本细胞数

# 补 sample_type（prepData 没带进来）colData(sce)$sample_type <- factor(md$sample_type[match(sce$sample_id, md$sample_id)],                                   levels = c("PBMC","thrombus"))# 每个样本当前进入 SCE 的事件数n_cells(sce)# 每样本细胞数：现在能看出 P/T 系统性差异，而不是交错噪声plotCounts(sce, group_by = "sample_id", color_by = "sample_type")

柱形图可视化：x轴是样本，y轴是每个样本中的细胞（事件）数。颜色为样本类型。

从这里可以看出：血栓样本的细胞数系统性高于外周血，但这个差距主要在样本配对内部。

相对于其他样本，两个样本的细胞数据有点异常，且都是 CAT 组外周血：

MDS：样本间相似性

# 样本间相似性：配色用 sample_type，标签保留 sample_id + patient_idpbMDS(sce, color_by = "sample_type", label_by = "sample_id")

下图每个点 表示一个样本，点之间的距离 ≈ 两个样本整体 marker 表达谱的差异。两个点挨得近 = 这两个样本"整体看起来像"。

这里可以看到：所有点都挤在原点附近的一小团里，唯独 12P 孤零零挂在 MDS dim.1 ≈ 12–13 的位置，把整个坐标系撑开了。

关于要不要删 12P，建议是暂时保留，但标记出来。

样本中位表达热图

# 样本中位表达热图：行注释加上 sample_typeplotExprHeatmap(sce, scale = "last", hm_pal = rev(hcl.colors(10, "YlGnBu")))

图的含义：

x 轴是 marker，y 轴是 样本，每个格子 = 该样本 marker 的中位表达值（arcsinh 变换后，cofactor 5）。

从图的顶部树状图看，marker 大致分成几片：CD14/CD19/Eomes/Perforin/IFNg/PD-L1/CD160 一片（主要是 type + 部分 state），CD8/CD4/CD3/FOXP3/CD45RA 一片（T 细胞相关），CTLA-4/CD27/CD45 一片等。

行聚类完全没有按实验分组分开。

看到这里，这个数据好像有点问题：

每个样本的细胞数好像有点太太太多了，我这个时候看了一下文献的数据处理方法：

1. 染色：cisplatin 死活 + Fc 阻断 + 35 抗体 panel + 过夜 Ir 插层
2. Helios 采集，重悬液里加 10% EQ Four Element Calibration Beads
3. EQ Passport 珠子归一化（"Raw FCS files were normalized using the EQ Passport bead-based normalization method"）
4. FlowJo CyTOF plugin 清洗，手工门控去 beads、死细胞、双联体、碎片
5. 导出 CD45⁺ 事件，每样本取 10,000 个，24 样本合并成 2.4×10⁵
6. R（v4.0.0）CATALYST 风格流程：arcsinh → t-SNE + Phenograph 聚类（图 2C/2D/2G/2H 和 4 用 UMAP 重嵌入）
7. 比例差异分析（配对 t 检验 + BH-FDR）

第 3 步之后的 FCS 就是我现在手里下载的数据文件：

只做了「EQ 珠子归一化」这一步预处理，门控（去beads/死细胞/双联体/碎片）和 CD45⁺ 筛选都没做，arcsinh 变换和聚类也没有。

拿到的是「归一化后、门控前」的原始采集文件。

第 4-5 步（FlowJo 门控 + CD45⁺ 导出）没有上传到 Mendeley！

哭死啊😭！

我还得找个工具去做门控吗？

上面是手动做的，我找了个文献自动做的：2025 年 2 月 12 日 发表在 Nature Communications 杂志，文献标题：《Automated cytometric gating with humanlevel performance using bivariate segmentation》。

这篇文献专门用来解决：流式/质谱细胞术（CyTOF）数据分析中最耗时的一步是人工圈门（gating）

下篇看看！