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DIA-NN 引擎源码考古 · 1.7.12 · 第五回 · 干扰踢出局,定量端上桌 ~

发布时间：2026-11-07 08:58:05 最近访问：2026-11-07 08:58:06

上一回《DIA-NN 引擎源码考古 · 1.7.12 · 第四回 · 打分不算完，越揉越靠谱 ~》，咱们把打分之后的下半场走完了：学权重、算 q 值、做校准，三个部件装进 process() 的循环里转了 12 圈。转完之后手里是什么？一份按可信度盖好戳的名单。

可小编在上一回收尾就留了话：分打完了，机器转完了，事儿还没完。先交代个前提：一次分析喂进来的往往不止一个数据文件，一个样本一次进样就是一个 Run，前面那套打分判峰是各个 Run 分头跑的，每个 Run 各出一份自己的定性结果、各量一份自己的定量数。可最后吐给用户的是一张总报表，得先把这几个 Run 的结果综合到一起。

综合之前，有两笔账得先结：名单里可能混着浑水摸鱼的，各个 Run 报出来的数字口径也还不齐。这一回就是这台机器吐出结果之前的最后一道工序，也是本系列主线的最后一棒，就是一道除渣工序，一套交账体系。

除渣，是把抢了别人信号通道的候选挤出局；交账，是把各个 Run 量出来的数拉平对齐，再从单条肽段一路算到蛋白和基因层，落成报表。写完这一篇，“怎么找、怎么判、怎么出定量结果” 这条三段路就走到头了。

本篇范围
这一篇只讲打分之后的收官：干扰怎么精修、定量怎么产出、报告怎么落盘。

起手：名单有了，账还没结

先对对账。前四回排下来的路是这样的：数据进门报到、建库下锅（第一回、第二回），一条候选找位置、认峰、打分、选峰（第三回），打完的分再折算成可信度，机器循环校表（第四回）。

到这一步，每条候选都有了自己的成绩单：序列是什么、在哪儿出峰、总分多少、q 值多可信。按说可以交差了？还差两笔。

第一笔是浑水摸鱼的问题。干扰大体从哪儿来？跟几个文件没关系，就在单次进样内部、碎裂那一步：几条共洗脱的前体又落进同一个隔离窗（共隔离），被一起打碎，碎出来的信号天然叠在同一批碎片通道上，你中有我，分不开。于是一条候选顶着 “可信” 的戳，不代表它出的那个峰真是它自己的：同一次进样里两条不同的候选共用了一条信号通道，分数高的那条把光都占了，分数低的那条其实是在蹭信号，却也混进了名单。

第二笔是数字口径的问题。哪怕名单干净了，单条肽段的信号强度是各样本在自己的那次进样里分别量出来的：这个样本上样多、那个样本上样少，不同进样之间仪器的响应也对不齐。同一个肽段，样本 A 量出一个数、样本 B 量出另一个数，差距里混着技术差异，不拉平就没法比，拉平了才叫定量结果。

这两笔账就是本篇的两个主角。先清账，再算账。顺带垫一句：这是咱讲故事的顺序，引擎里这两件事其实咬合成环，精修的判据得先有数才算得出，清完账数字还要重算，后文会看到这环怎么转。

除渣：抢通道的，挤出去

先说除渣。它的主刀是 remove_ifs()（L9135），全名大意是 “移除干扰碎片的受害者”；外面还套着一层调度的 refine_ids()（L9185）。这爷俩干的事儿，说白了，判据就一行，白纸黑字写着一条候选如果解释不动自己名下的信号，那就该怀疑它压根是来蹭信号的，出局。

怎么判定 “蹭信号”

想象两条肽段共洗脱（在色谱上挨着出峰）、又共隔离，碎出来的离子撞了车：你家的定量通道里，混着我家的峰。谁是主谁是客？引擎的办法很朴素。拿高分那条当 “主场”，把它名下的碎片通道全列出来，再去看排名比它靠后的每一条候选（L9131 按分数排的队，主场永远从高分看起）。

如果后来者的碎片跟主场的通道对得上，不光是对得上，连它那个峰的形状相关性都能被这些共享通道解释得七七八八（判据是一行算术：共享通道的相关性总和，差不多顶得上它全部的相关性，留的余量就是命令行上那个 InterferenceCorrMargin，默认 3.0，L9175–L9177），那它就没什么自己的东西了，全是蹭的。

蹭的下场很干脆：ID 直接作废（L9178–L9180）。这里头还有个细节，主场也得讲武德：如果两条本来就在同一个洗脱峰群里（同 Elution group），那真有可能是天然共流出，不算蹭，放过（L9143）。

从本窗口挤到邻窗口

refine_ids()（L9185）是调度层。它先在同一个采集窗口里来一遍（L9194），再把眼光放远：向前后各看 MaxIfsSpan 个窗口（默认 4，L178），凡是质量窗口罩得住主场质量（含同位素偏移）的邻窗口，也进去挤一遍（L9197–L9201）。

不过邻窗口的候选跟主场不排在同一个队里，谈不上谁排名靠后，主客就换个比法，直接比分数，分数压过主场的一个不碰，只往弱里挤（L9142）。道理跟本窗口一个样，归根到底看谁的证据更硬：分数是从峰形、共流出这些原始证据里攒出来的，两条候选抢同一份信号，谁的分高，谁更像那个真峰，信号就判给谁。被清出去的永远是分数更低、又解释不动自己名下信号的那条，不然反客为主，倒把真峰给清了。

还有一个开关叫 StrictIntRemoval（默认关，L207）：打开的话，就顺着主场的质荷比往前后继续追，凡窗口罩得住主场的邻窗都进去挤，前后各最多再追 “主场峰宽” 的 1/4 那么多的窗口（L9204–L9212），挤得更狠。

挤完还得重排队

挤人这件事儿不是一锤子买卖。整条编排在 process() 的收尾（L10549–L10558）：先来一遍垃圾清理（remove_rubbish()，L9094），然后来了个很多人想不到的重头戏，就是挤人之前先定量一轮（L10552），定量完才开始循环 “按分数重排队（map_ids()，L9120）→ 挤人（refine_ids()）→ 重算 q 值”。

为什么要先定量再挤？因为挤人的判据要用信号量说话，信号量得先算出来。为什么挤完还要重排队、重算 q 值？因为挤掉一条，队伍就短一截，可信度的分母跟着变，戳得重盖。名单和数字是互相成全的，不是先出名单后出数字的单向流水账。

这个循环默认跑一轮（IDsInterference = 1，L205，命令行 --int-removal 可调，L1845），也就是说默认 “挤一遍就收手”。想多挤几轮、或者放宽共享余量，旋钮都在命令行上（--int-margin，L1847；--strict-int-removal，L1849）。

交账：定量怎么产出

除完渣，名单干净了，该算账了。定量这块儿的活分四步走：单条肽段在自己样本里定信号量，跨样本把量纲拉平，再汇总到蛋白和基因层，最后把报表落盘。

第一步：单 Run 里，肽段的信号量怎么定

管这摊活的是 quantify()（L4086）。一条肽段碎成一二十个离子，可不是条条都记账：库里的碎片按峰高排着队（L3572），进定量账本的只有排头的几条，最多 6 条封顶（TopF，L776、L7813）。定信号量这事儿分三步走：先把每个碎片的数定下来，再挑出可信的碎片，最后合成一笔肽段的量。

先把每个碎片的数定下来

每个碎片对应一条提取离子流（XIC）：从二级谱里把这个碎片的信号按质荷比挑出来，顺着出峰顺序连成一条曲线（L7249–L7252）；定量就取认下的那个峰，从出峰到收峰逐扫描加起来，得一个峰面积，不是拿峰高充数（L7910、L7945–L7949）。这笔账只用二级的碎片离子峰，一级的母离子峰不掺和，引擎只另记一笔 MS1 面积（L7892），不进这条肽段的定量。

曲线里还可能混着共隔离带进来的杂信号，冒头的尖刺会把面积吹大。引擎默认留了个心眼：挑一条最有代表性的当标尺，就是峰形跟其他碎片最合拍的那条（L7466–L7472），别的碎片照着比例封顶，超出应有形状的部分当干扰剪掉，封顶的线也不卡死，卡在应有形状的 1.5 倍上（FilterFactor，L246、L7949），剪剩下的面积才入账（L7919–L7951；--no-ifs-removal 可关，L2093）。

剪除归剪除，底账都留着：每个碎片其实记两笔数，毛面积和剪后面积都留了档（qTotal 和 qFiltered，L2912–L2915）；想复核的人翻默认报表就看得到，Fragment.Quant.Raw 和 Fragment.Quant.Corrected 两列就是（L5819、L5898–L5899）。

再挑出可信的碎片

给每个碎片记一笔 “形迹可信度”：峰形相关性越高，这个碎片的数越可信（L4098–L4106）。这里头有道入场券：只有 q 值过 MaxQuantQvalue 那道线（默认 0.01）的鉴定才准给碎片计分，信不过的 Run 不投票（L223、L4098）。同一条碎片在各个 Run 里的相关性取平均、合在一起排序，这个平均值就是下文排队择优用的分数。

排好队就择优：卡一道分数线，线以上的碎片拿来当定量依据，正常就是最好的前 3 个（L4138–L4141）。不过入选有个前提：分数得过 -1 这道坎。为什么偏偏是 -1？这分数是相关系数的平均，天然在 -1 到 1 之间，再差也高过 -1，可扣过分的必然跌到坎下，所以这道坎就是 “罚没罚过” 的分界，扣法待会儿就讲。于是第三好的那个要是被扣过，就只用前 2 个；第二好的也被扣过，就只用最好的那条，宁可少用也不凑数（L4139）。

挑碎片这一步是各 Run 合伙挑的，挑定之后每个 Run 各量各的数。不想要这道择优也有开关 --no-fr-selection，可引擎自己都说不推荐（L2094）；另有 --restrict-fr，库里注释不让用的碎片直接扣到负无穷，一票否决（L4130–L4134、L2095）。

还有个讲究：如果这个碎片跟邻居（同洗脱峰群里的其他肽段）共用通道，它量出来的数就不纯。引擎把这种 “共享碎片” 找出来，一家伙扣掉 2.0 分（L4124），分数直接跌破 -1（L4139），等于踢出定量名单。配置开关 ExcludeSharedFragments 管着这道闸（L4108–L4128，--no-fr-exclusion 可关，L2096）。跟除渣那节同一个哲学，用一句话说就是名下要有自己说得清的信号，量出来的数才算数。

最后合成一笔肽段的量

合起来的办法是加和，不搞平均：留下的碎片面积直接加起来，就是这条肽段在本 Run 里的信号量（L4152）；另外按量加权平均出一个相关性，当这笔量的 “质量” 备注（L4153–L4156），报表里 Quantity.Quality 那列就是它（L5878）。

第二步：跨 Run 拉平，三件套

每个样本里的信号量都有了自己的 “小九九”，可这几个数出自不同的进样，口径不齐，不拉平没法比。接下来是跨 Run 拉平（L4266 起），把各样本的量纲拉到一把尺上。这一步在那份源码观察报告里就点过名：跨样本那几步里有一笔 “归一化”，这一节把它拆开讲透。

门槛和开关先交代

这一步不需要任何 “匹配 Run” 之类的开关：翻遍 1.7.12 的引擎和 GUI 源码，压根没有 “Match between runs” 这个选项。它只认一个条件：多个 Run 合出一张总报表，就拉平。反过来，单 Run 分析，或者各个 Run 各出各的报告（--individual-reports，L2055），这步直接跳过（L4266）。

GUI 里管这一步的旋钮只有一个：“Cross-run normalisation” 下拉框，一共 3 档（GUI 源码 Form1.cs L705–L716）。Global 只跑前两件，对应 --global-norm；默认的 RT-dependent 再加上按出峰时间的局部微调；RT & signal-dep. (experimental) 连按信号强度那轮也打开，对应 --sig-norm。它选的是 “怎么拉”，不是 “拉不拉”。

这批开关在命令行上另有入口，GUI 和命令行两套参数怎么对照，早前命令行参数那篇里盘过。

另一个容易看混的选项是 “Unrelated runs”：勾上它，拉平照跑不误。它管的是另一摊：质量精度和 RT 扫描窗不再全实验共用一套，改成每个 Run 各自推断（勾上后引擎收到 --individual-mass-acc --individual-windows，L2053–L2054）。进门报到的仪器参数归它，交账的拉平不归它。

三件套把量纲拉平

回头看拉平本身，引擎做的是三件事。

头一件是总量对齐。拿所有可信鉴定（q 值过 NormalisationQvalue 那道线；q 值是什么、怎么算的，第四回里结过账）的信号量求个总和，各样本的总和向平均水平靠（L4268–L4292）。这一步管的是 “这个样本上样多、那个样本上样少” 的粗账。

第二件是找稳肽再对齐。全体肽段里挑一批 “老实人”，判据是变异系数小（信号波动除以均值，L4309 一带算的），按比例挑（NormalisationPeptidesFraction，L2133），拿老实人的量再拉一遍（L4294–L4351）。这一步管的是 “总量看着齐了，但个别老实肽段还差口气” 的细账。

第三件是局部微调，叫 LocalNormalisation，设计了 2 轮（L4353–L4355）：第一轮按出峰时间（RT-dependent）在时间轴上分段微调；第二轮按信号强度再校一遍，但这轮默认不跑，得喊 --sig-norm 才开工（L2138）。要关也关得掉：--global-norm 把局部微调整步关掉，只留前两件（L2136），--no-rt-norm 专关时间轴那轮（L2137）。

拉平归拉平，原始量不丢：报表里原始量和归一量并排给，Precursor.Quantity 旁边就是 Precursor.Normalised（L706–L707），蛋白、基因层同款（L691–L694）。嫌这三件套拉得不合适，回头拿原始量自己算就行。

三个 RT，最后一回对表
到这里，“RT” 这个词在本系列出现过三次，正好借本篇收个总账。第一次是校准对表（第四回：把库 iRT 折算成本次进样时间轴的样条）；第二次是 RT/iRT 预测模型（进数据之前报理论出峰位置）；第三次就是这节的 RT-dependent normalisation（定量归一里按出峰时间分段微调）。三者管的都是 “时间”，但一个管对表、一个管预测、一个管拉平定量，别混。

第三步：从肽段到蛋白，再到基因

蛋白的量怎么来

先说答案：从肽段到蛋白，引擎说白了就干一件事，就是挑出这个蛋白名下最强的几条肽段，把量加起来，这个和就是蛋白量。 这套办法就叫 Top N 求和（quantify_proteins()，L5590），没有比值，没有拟合，就是加法。

举个例子：蛋白甲在这个样本里检出 5 条肽段，量分别是 100、80、60、20、10。默认只取最强的 1 条，蛋白量就是 100（TopN 默认 1，L234）；把 N 调成 3，蛋白量就是 100 + 80 + 60 = 240。N 由命令行 --top N 说了算（L2080–L2081），就这么直白。

不过这个 “挑” 有讲究：每个蛋白、每个样本各挑各的（L5626–L5637）。蛋白甲在样本 A 里最强的是那条 100，到了样本 B 里最强的可能是另一条，各挑各的，互不相干。挑的时候比的是归一量（L5623）；挑定之后原始量、归一量各加一笔和（L5639），报表里 PG.Quantity、PG.Normalised 两列就是（L691–L692）。

挑强之前其实还有一道粗筛，就是可信线，它不是一刀切：先看这个蛋白在这个样本里最好的 q 值，它比 0.01 好，线就按 0.01 算；它比 0.01 差，线就抬到它的水平（L5630–L5631）。这条 0.01 的地板就是 ProteinQuantQvalue，命令行 --protein-quant-qvalue 可调（L224、L2077）。q 值不过线的没资格进 Top N 竞争：鉴定硬的蛋白，过 0.01 的全都上场；鉴定软的，就只有最好那拨 q 值的上场（L5633）。

顺带交代两个名头：说 “肽段” 时，账本上其实记的是前体，也就是 “肽段＋电荷态”，报表一行一条；说 “蛋白” 时，默认其实是推断出来的蛋白组（InferPGs，L331），PG.Quantity 里的 PG 就是 protein group 的意思（L691）。

把这套动作排开，就是源码里的 4 趟扫描（L5606–L5646）：第 1 趟划可信线，第 2 趟挑 Top N，第 3 趟加和，第 4 趟把和写回头上每个肽段的账里。蛋白的账，到这儿就结完了。

基因的量怎么来

这层不是另起炉灶：先把蛋白按基因注释归堆，一堆算一个基因分组（generate_gene_groups()，L5328–L5346），没有基因注释的肽段不进这本账（L5616–L5618）；然后拿同一套 Top N 求和原样再跑一遍，基因分组的和就有了（L5641），落在 Genes.Quantity、Genes.Normalised 两列（L693–L694）。

缺了怎么办：MaxLFQ 补位

可光求和有个软肋：某条肽段在这个样本里恰好没检出，和就瘸了。还拿蛋白甲说事，5 条里缺了 2 条，加出来的和就比别的样本系统性地小一号，缺得越多亏得越多。基因层的招牌解法是 MaxLFQ，默认开着（L233，--no-maxlfq 可关，L2079），蛋白层可没这待遇（L5648）。它的思路一句话能说明白，白话讲就是真实量是多少说不清，但同一个基因分组在两个样本里的比值，可以拿共同检出的肽段两两地估出来。

先说说它的出身。MaxLFQ 出自一篇专门的方法论文（Cox 等，Molecular & Cellular Proteomics，2014），说的是一套挺复杂的非标定量校准方案，招牌做法是 “延迟归一＋最大肽段比值”。方法是公开发表的，谁都能实现，不少软件都在用，MaxQuant 只是其中最有名的一种。

说回这一版的实现：参与估算的量是归一量取对数（L5380），q 值过线的才参评；两个样本共同检出的肽段，才给这两个样本贡献一个比值（L5412）。所有样本两两的比值凑成一个方程组：每对样本的比值先取中位数（L5413–L5419），再装进方程（L5421–L5428），解出来的那组量，既互相自洽，又不怕个别肽段缺失。

这里有个小机关：光有比值定不出绝对量，全体平移一把，比值纹丝不动。源码的办法是给方程加一小份正则化，把每个样本的解往它的参考值上轻轻拽一把（系数 0.0001，L5430–L5434），量纲这才落了地。参考值就是这个样本里量最大的那条肽段的量（L5385–L5391），所以 MaxLFQ 的量跟肽段量是同一把尺。

细节上还有两个兜底。一是全程在对数空间里算，比值变加减，稳健；二是整个基因分组合计检出的肽段不足 2 条，就不进方程组，各样本直接退回样本内参考值（L5394–L5397），宁可粗一点也不瞎解。方程组本身用最小二乘来解（L5437）。

这套方程组在基因层跑了 2 轮：先按基因分组算一轮，检出的肽段都进账；再算一轮 “基因独有” 版，只让蛋白独有（Proteotypic，一条肽段只对应一个蛋白）的肽段进方程组（L5648–L5663、L5379），结果落在 Genes.MaxLFQ.Unique 列（L696）。还有个提醒：样本数超 2000 个的话这段会慢得感人，源码里自己都写了警告（L5649–L5650）。

那句警告还有个坑：日志文案把 MaxLFQ 写成了 protein quantification，其实它站在基因层的分支里（L5648、L5650）。查这种事得看接线，不能信字面。

再记一条考古注脚：1.7.12 这一版，MaxLFQ 只接在基因层，蛋白层只有 Top N 求和；后来的版本报表里多出了 PG.MaxLFQ 一列，蛋白层也能给 MaxLFQ 量了。本文的账只对 1.7.12 源码负责，新版本就点到为止。

算完量，可信度戳也顺手盖好：蛋白组、基因分组各有各的 q 值（group_qvalues()，L5463，收尾调用 L5666），报表里 PG.Q.Value、GG.Q.Value 两列就是（L703–L704）。

第四步：报表落盘

账都算完了，最后是交账清单。默认的主报告就是那个熟悉的 report.tsv（L256），由 report()（L5802）落笔；基因层另有 report.genes.tsv（gene_report()，L5976），里面 Top N 量、MaxLFQ 量并排给：Genes.Quantity、Genes.Normalised、Genes.MaxLFQ、Genes.MaxLFQ.Unique，外加一枚 GG.Q.Value 戳（L6001）。

想要宽表的话，还有四张矩阵：前体级、蛋白组级、基因分组级、基因独有级各一张（L5669、L5719，调用处 L5969–L5972）。别看都是宽表，装的量各有各的来路：前体级装前体归一量（L5688），蛋白组装 Top N 归一量，基因分组装 MaxLFQ 量，基因独有装 Unique 量（L5763–L5765），各自按各自的 q 值戳过线进表。

矩阵默认不出，得开 --matrices（L1834），各 Run 各出报告的模式下也不出（L5968）；进表还有 q 值过滤线 MatrixQValue，命令行 --matrix-qvalue 可调，钳在 0.001 到 0.05 之间（L1885–L1886）。

统计类的还有三件套：stats_report（L6023）、tic_report（L6055）、XIC_report（L6066）。蛋白层的可信度戳也在收尾前统一盖好（calculate_protein_qvalues()，L10045）。