夜雨聆风
一、设备基础结构与配套部件
1. 罐体主体
5L玻璃/不锈钢罐体，额定装液量3–4L（种子培养推荐装液3L，预留通气、搅拌泡沫空间）；夹套水冷/电加热控温；内置搅拌桨、空气分布器、消泡探头。
2. 罐盖接口
搅拌电机、pH电极、DO溶氧电极、温度探头、消泡电极、接种口、取样口、进气口、排气口、酸碱补料口、消泡剂补料口。
3. 控制系统
PLC控制器、搅拌调速、温度自动控温、pH自动酸碱流加、DO联动（转速/通气联动）、罐压显示、蠕动泵（酸/碱/消泡/补料）。
4. 辅机
空压机、0.2μm无菌空气过滤器、循环冷水机、高压蒸汽灭菌锅、火焰接种圈、硅管、管夹、硅胶O圈、电极保护套。
二、使用前安全与检查总则
1. 电源可靠接地，电控、电机、电极接头严禁进水、进蒸汽；灭菌前电极插头套锡纸/防水护套。
2. 所有O型密封圈薄涂食品级硅脂，开裂、硬化立即更换；管路无老化漏液。
3. 空压机输出压力≤0.2MPa，发酵运行罐压稳定0.02–0.05MPa微正压，防止倒吸染菌。
4. 蒸汽灭菌压力≤0.15MPa（121℃），严禁超压。
5. 冷水机提前开机，保证换热冷却能力。
三、完整标准操作流程（分7大阶段）
阶段1：罐体清洗、配培养基、电极预校准
1. 拆罐清洗：罐体、桨叶、管路、取样阀、接种口用去离子水冲洗；蛋白残留用1%NaOH浸泡30min，清水冲净，无肉眼残渣、无异味。
2. 配制种子培养基倒入罐内，定容至工艺体积（≤4L），按需添加消泡剂。
3. 电极初次校准（灭菌前）
- pH电极：两点校准（4.0、6.86/9.18缓冲液），冲洗擦干装入罐盖接口锁紧。
- DO溶氧电极：极化30min，空气斜率校准备用。
4. 密封罐盖：均匀拧紧罐盖螺栓，所有管路夹紧封闭；进气、排气、补料、取样管口用8层纱布+牛皮纸包扎；电极线缆接头锡纸包裹防水汽。
5. 管路封堵：进气、补料、取样硅胶管用管夹夹紧；仅排气口微开泄压。
阶段2：高压蒸汽灭菌（121℃，20–30min）
1. 将整罐平稳放入灭菌锅，放平避免液体溢出。
2. 灭菌程序：升温至121℃，恒温20–30min（芽孢菌延长至30min）；全程罐内压力≤0.15MPa。
3. 灭菌结束：缓慢泄压，严禁快速放气造成负压倒吸污染；待灭菌锅压力归零、温度降至80℃以下再取出罐体。
4. 冷却防护：取出后置于发酵台，静置降温，禁止立刻高速搅拌；1h内仅低速≤100rpm运行，防止机械密封干磨异响损坏。
阶段3：设备就位、管路连接、二次DO校准
1. 罐体固定到位，连接夹套循环冷水进出水管，开启冷水机。
2. 无菌空气管路连接：空压机→预过滤器→0.2μm终端无菌滤器→罐进气口；松开进气管夹，排气保持微开，建立罐内0.03MPa正压。
3. 电极接线：pH、DO、温度、消泡电极插头对接控制器，去掉锡纸护套。
4. 控制器开机，输入工艺参数（温度、基础转速、通气量、pH设定）。
5. 溶氧零点+满度校准（运行校准，关键）
- 稳定通气、搅拌运行5min；
- 空气环境下DO校准100%；如需零点可通入氮气校准0%；校准完成锁定。
6. 补料管路排空：酸碱、消泡剂瓶灭菌后连接蠕动泵，排尽管路气泡，管夹夹紧备用。
阶段4：无菌接种（防染菌核心操作）
1. 前置条件：罐温降至菌种适宜温度、罐压稳定0.02–0.03MPa、搅拌低速运行、通气稳定。
2. 降压准备：缓慢关小进气，罐压降至0.01MPa以内，避免开盖喷液。
3. 火焰无菌屏障：接种口套酒精浸润火焰圈，点燃形成完整火焰环，全程不熄火。
4. 开盖操作：火焰保护下旋松接种帽，余气排净后完全取下，盖子始终置于火焰内，不触碰台面。
5. 种子液无菌转移
- 种子瓶外壁75%酒精擦拭，瓶口过火灼烧2–3s；
- 快速倒入种子液（常规接种量5%–10%），避免液体溅到接种口外壁；
- 立刻旋紧接种帽，熄灭火焰圈，开大进气恢复罐压0.03–0.05MPa。
6. 恢复参数：提升搅拌、通气至工艺设定值，开始发酵计时。
阶段5：种子发酵过程监控与参数调节
1. 常规工艺参数参考（通用细菌/真菌种子罐）
- 装液：3L/5L罐
- 通气量：0.5–2 vvm（1.5–6 L/min）
- 搅拌转速：200–800 rpm（需氧菌高转速，厌氧菌低转速）
- 罐压：0.02–0.05 MPa（全程正压）
- pH：自动流加酸碱维持设定值，每2h记录一次；
- DO溶氧：不低于20%，偏低时提高转速、加大通气、适当提升罐压；
- 消泡：泡沫触发探头自动泵入消泡剂，禁止过量添加影响菌体。
2. 取样操作（无菌取样）
1. 取样阀外壁75%酒精擦拭，小火灼烧阀门；
2. 先放掉少量废液冲洗管路，再收集种子液；
3. 取样完成灼烧阀门，关紧管路夹，维持罐内正压。
4. 检测项目：OD600、镜检（有无杂菌）、pH、残糖、菌体形态。
3. 过程记录
每30–60min记录：温度、转速、通气量、罐压、pH、DO、消泡添加量、取样OD；出现DO骤降、pH异常、泡沫突增立即排查染菌或代谢异常。
阶段6：发酵终点放罐、转移二级发酵
1. 种子成熟判定：OD达标、镜检无杂菌、菌体活力良好；
2. 缓慢降低转速、减小通气，罐压降至0.01MPa；
3. 无菌转移：通过出料管路/接种口火焰保护转移至下一级发酵罐，全程保持无菌正压；
4. 放罐完成后立即清洗罐体，禁止培养基长时间滞留结垢。
阶段7：批次后清洗、电极保养、设备收纳
1. 残液排空，罐内加清水低速搅拌冲洗；1%碱水循环搅拌30min去除蛋白、多糖残留，清水冲至中性。
2. 拆卸电极：
- pH电极：冲洗干净，浸泡3M KCl保护液存放；
- DO电极：冲洗擦干，套保湿保护套避光存放；
- 消泡探头、温度探头清水擦拭，晾干。
3. 管路、硅胶管全部拆开冲洗，晾干存放；O圈拆下涂抹硅脂，单独收纳防变形。
4. 排空夹套冷水，关闭冷水机、空压机、控制器总电源；松罐盖螺栓，避免密封圈长期受压永久变形。
5. 长期停用：空罐灭菌一次，擦干内部，盖半开通风存放。
四、关键注意事项（防染菌、防设备损坏）
无菌管控
1. 任何操作（开盖、取样、接种）罐内必须保持正压，绝对禁止负压；
2. 空气过滤器滤芯阻力升高、使用满6个月直接更换，不清洗复用；
3. 硅胶管老化、发白、开裂立即更换，管路无死角积液。
电极保护
1. 电极不可长时间高温灭菌，每次灭菌时间不超30min；
2. 禁止干放pH电极，长期停用浸泡KCl；DO电极严禁干燥存放；
3. 每次实验结束必须清洁电极探头，避免蛋白包裹造成漂移。
机械与密封
1. 灭菌后高温阶段禁止高速搅拌，防止机械密封烧毁、漏液；
2. 搅拌运行异响立刻停机，检查轴封润滑、桨叶紧固；
3. 玻璃罐体避免磕碰，禁用硬质钢丝刷打磨内壁。
安全操作
1. 灭菌、火焰操作配备湿抹布，酒精远离高温电器；
2. 酸碱流加管路防漏，溅洒皮肤立即大量清水冲洗；
3. 设备故障（超温、超压、电机过载）先切断气源、停止搅拌再断电排查。
五、常见故障快速处理
1. 染菌（杂菌检出）：管路灭菌不彻底/过滤器失效/接种负压倒吸；更换滤芯，延长灭菌时间，规范火焰接种。
2. DO持续偏低：通气不足、转速过低、培养基粘度大、过滤器堵塞；加大风量、升转速、更换空气滤。
3. pH失控漂移：pH电极污染、未校准；重新清洗、两点校准电极。
4. 搅拌异响、漏液：机械密封高温干磨、O圈老化；更换密封件，灭菌后低速冷却再升速。
5. 泡沫无法控制：消泡探头脏污、消泡剂管路堵塞；清洗探头，疏通补料管路。