文档文本内容
一、微生物与生物代谢类型
二、培养基定义及营养成分
三、培养基的类型
四、培养基的配制
五、无菌技术
微生物培养与应用技术（一）
一、微生物与生物代谢类型
1、微生物定义
微生物是对一切肉眼看不到或看不清楚的一群微小生物的统称，
一般需要借助显微镜来观察研究。
微生物个体微小（直径一般小于0.1 毫米），构造简单。包括细
菌、蓝藻、放线菌、支原体、衣原体等原核生物，真菌（如酵母菌
、霉菌）、原生生物等真核生物和非细胞的病毒等。
2、生物基本代谢类型
同化作用：指生物体把从外界获取的营养物质转变成自身的组成成
分，并储存能量的变化过程。
异化作用：指生物体能够把自身的一部分组成物质加以分解，释放
出其中的能量，并且把分解的终产物排出体外的变化过程。
2、生物基本代谢类型
1
二、培养基定义及营养成分
1、定义
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长
繁殖的营养基质，称为培养基。
2、营养成分
培养基中的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源、生长
因子等
二、培养基定义及营养成分
2、营养成分
①碳源
为微生物提供碳元素的物质，可分为有机碳源和无机碳源。如
CO2、NaHCO3 等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源，
异养微生物只能利用有机碳源；单质碳不能作为碳源。
注意：碳源物质&能源物质的辨析
二、培养基定义及营养成分
2、营养成分
②氮源
为微生物提供氮元素的物质，可分为有机氮源和无机氮源。有
机氮源包括牛肉膏、蛋白胨、尿素等，无机氮源包括N2、NH3、
NH4+、NO3-等，只有固氮微生物才能利用N2。
二、培养基定义及营养成分
2、营养成分
②氮源
营养物质
来源
主要成分
牛肉膏
瘦牛肉组织浸出汁浓
缩而成的膏状物质
富含水溶性糖类、有机
氮化合物、维生素、无
机盐等
蛋白胨
将肉、明胶用酸或蛋
白酶水解后干燥而成
富含有机氮化合物、也
含有一些维生素和糖类
的粉末状物质
2
二、培养基定义及营养成分
2、营养成分
③生长因子
通常指那些微生物生长所必需而且需要量很小，自身不能
合成或合成量不足机体生长需要的有机化合物。一般可分为维
生素、氨基酸、嘌呤与嘧啶这三类。
二、培养基定义及营养成分
2、营养成分
④无机盐
无机盐是微生物生长、代谢必不可少的一类营养物质。
无机盐生理功能主要是：作为酶活性中心的组成部分；构成微生
物细胞的各种组分；调节并维持细胞的渗透压平衡、pH和控制细
胞的氧化还原位；作为某些微生物生长的能源物质。
常见种类：磷酸盐、硫酸盐、氯化物，以及含有钠、
钾、钙、
镁、铁等金属元素的化合物。
二、培养基定义及营养成分
2、营养成分
注意事项：
①这几类营养成分不一定都需要一一单独添加。
②不是所有培养基都必须同时含有碳源、氮源、水、无机盐、生
长因子。
【例1】★★
对下列几种微生物的叙述正确的是（
）
①酵母菌②乳酸菌③硝化细菌④蓝藻⑤烟草花叶病毒
A. 从生态系统的成分看，①②③是分解者，④是生产者
B. 从同化作用的类型看，②是厌氧型，③④是需氧型
C. 从异化作用类型看，①②是异养型，③④是自养型
D. 从结构和成分看，①具有成形细胞核，⑤的遗传物质中不含胸腺
嘧啶
3
【例2】★★
下列关于原核细胞的叙述中，正确的是（
）
A．大肠杆菌比酵母菌物质交换效率低
B．乳酸菌在细胞质中进行无氧呼吸
C．蓝藻细胞以有丝分裂方式进行增殖
D．肺炎双球菌在线粒体内完成有氧呼吸
【例3】★★
下表是关于4 种生物的能源、碳源、氮源和代谢类型的描述，其中描
述正确的一组是（
）
A.硝化细菌、乳酸菌
B.乳酸菌、根瘤菌
C.根瘤菌、衣藻
D.硝化细菌、衣藻
三、培养基的类型
1、按照物理性质划分
2、按照成分划分
3、按照用途划分
a.液体培养基：不加凝固剂，配置成液体状态。
应用：在用液体培养基培养微生物时，通过振荡或搅拌可以增加培
养基的通气量，同时使营养物质分布均匀。液体培养基常用于大规
模工业生产，以及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研
究。
1、按照物理性质划分
三、培养基的类型
4
b.固体培养基：加入较多凝固剂，配置成固体状态，主要用于获取
单菌落，并对微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏等。
常用的凝固剂有琼脂、明胶、和硅胶。
绝大多数微生物而言，琼脂是最理想的凝固剂，由藻类(海产石
花菜)中提取的一种复杂多糖；明胶是由胶原蛋白制备得到的产物，
是最早用来作为凝固剂的物质；硅胶是由无机的硅酸钠等制成的胶
休。
三、培养基的类型
1、按照物理性质划分
c.半固体培养基：加入较少凝固剂，培养基中琼脂含量一般为
0.2％—0.7%。
应用：可用于观察微生物的运动特征、分类鉴定等。
注意事项：固体&液体培养基的判断
关键字：液体培养基：振荡、大规模工业生产等
固体培养基：凝固剂、平板、单菌落等
三、培养基的类型
1、按照物理性质划分
三、培养基的类型
1、按照物理性质划分
c.半固体培养基：加入较少凝固剂，培养基中琼脂含量一般为
0．2％—0．7%。
应用：可用于观察微生物的运动特征、分类鉴定等。
1、按照物理性质划分
三、培养基的类型
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2、按照成分不同划分
天然培养基：这类培养基含有化学成分还不清楚或化学成分不恒定的
天然有机物，也称非化学限定培养基。
牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培养基就属于此类。基因克隆技术中常
用的LB(Luria—Bertani)培养基也是一种天然培养基。
常用的天然有机营养物质包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏、豆芽汁
、玉米粉、土壤浸液、麸皮、牛奶、血清、稻草浸汁、羽毛浸汁、胡
萝卜汁、椰子汁等，嗜粪微生物可以利用粪水作为营养物质。
三、培养基的类型
2、按照成分不同划分
应用：天然培养基成本较低，除在实验室经常使用外，也适于用
来进行工业上大规模的微生物发酵生产。
三、培养基的类型
2、按照成分不同划分
合成培养基：是由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基，也称
化学限定培养基。高氏I号培养基和查氏培养基就属于此种类型。
应用：配制合成培养基时重复性强，但与天然培养基相比其成本较高
，微生物在其中生长速度较慢，一般适于在实验室用来进行有关微生
物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等
方面的研究工作。
三、培养基的类型
3、按照用途划分
基础培养基、加富培养基、鉴别培养基、选择培养基
三、培养基的类型
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3、按照用途划分
①基础培养基：
含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基，如牛肉膏
蛋白胨培养基。
应用：基础培养基可以用来作为一些特殊培养基的基础成分。
三、培养基的类型
3、按照用途划分
②加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营
养丰富的培养基，用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物。
这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。
应用：加富培养基可以用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物，
以及从环境中富集和分离某种微生物。
三、培养基的类型
③鉴别培养基：
是用于鉴别不同类型微生物的培养基。
在培养基中加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后
能产生某种代谢产物，而这种代谢产物可以与培养基中的特殊化学
物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征
性变化，可将该种微生物与其他微生物区分开来。
三、培养基的类型
3、按照用途划分
③鉴别培养基：
应用：鉴别培养基主要用于微生物的快速分类鉴定，以及分离和筛
选产生某种代谢产物的微生物菌种。
常见例子：伊红-美蓝培养基，鉴别大肠杆菌，使其出现带金属光泽
深紫色菌落。
刚果红培养基，鉴别能分解纤维素的微生物，在这里微生物周围形
成透明圈。
三、培养基的类型
3、按照用途划分
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3、按照用途划分
③鉴别培养基：
刚果红培养基
伊红-美蓝培养基
培养基名称加入化学物质
微生物代谢
产物
培养基特征
性变化
主要用途
酪素培养基
酪素
胞外蛋白酶
蛋白水解圈
鉴别产蛋白
酶菌株
明胶培养基
明胶
胞外蛋白酶
明胶液化
鉴别产蛋白
酶菌株
油脂培养基油脂、土温、
中性红指示剂
胞外脂肪酶
由淡红色变
成深红色
鉴别产脂肪
酶菌株
淀粉培养基
可溶性淀粉
胞外淀粉酶
淀粉水解圈
鉴别产淀粉
酶菌株
培养基名称加入化学物质
微生物代谢
产物
培养基特征
性变化
主要用途
H2S试验培
养基
醋酸铅
H2S
产生黑色沉
淀
鉴别产H2S
菌株
糖发酵培养
基
溴甲酚紫
乳酸、醋酸、
丙酸等
由紫色变成
黄色
鉴别肠道细
菌
远藤氏培养
基
碱性复红、亚
硫酸钠
酸、乙醛
带金属光泽
深红色菌落
鉴别水中大
肠菌群
伊红-美蓝培
养基
伊红、美蓝
酸
带金属光泽
深紫色菌落
鉴别水中大
肠菌群
3、按照用途划分
④选择培养基：
用来将某种或者某类微生物，从混杂的微生物群体中分离出来的培养
基。
根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同
，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微
生物的生长，有利于所需微生物的生长。
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④选择培养基：
常见类型：
a.依据某些微生物的特殊营养需求设计
如：利用以纤维素或石蜡油作为唯一碳源的选择培养基，可以从混
杂的微生物群体中分离出能分解纤维素或石蜡油的微生物; 利用以
蛋白质作为唯一氮源的选择培养基，可以分离产胞外蛋白酶的微生
物; 缺乏氮源的选择培养基可用来分离固氮微生物。
④选择培养基：
常见类型：
b.在培养基中加入某种化学物质, 这种化学物质没有营养作用, 对所
需分离的微生物无害, 但可以抑制或杀死其他微生物。
如：在培养基中加入青霉素、四环素或链霉素, 可以抑制细菌和放
线菌生长, 而将酵母菌和霉菌分离出来。现代基因克隆技术中也常用
选择培养基, 筛选含有重组质粒的基因工程菌株。
在培养基中加入高浓度的NaCl可得到金黄色葡萄球菌。
④选择培养基：
常见类型：
其它例子（仅供了解）：
在培养基中加入数滴10% 酚可以抑制细菌和霉菌的生长, 从而由混杂
的微生物群体中分离出放线菌;
在培养基中加入亚硫酸铋, 可以抑制革兰氏阳性细菌和绝大多数革兰氏
阴性细菌的生长, 而革兰氏阴性的伤寒沙门氏菌可以在这种培养基上
生长;
在培养基中加入染料亮绿或结晶紫, 可以抑制革兰氏阳性细菌的生长,
从而达到分离革兰氏阴性细菌的目的;
④选择培养基：
注意：有的培养基可以同时是选择+鉴别培养基
当要分离金黄色葡萄球菌时, 在培养基中加入7.5%NaCl 、甘露
糖醇和酸碱指示剂。
金黄色葡萄球菌可耐高浓度NaCl, 且能利用甘露糖醇产酸。因此
，能在上述培养基生长，而且菌落周围培养基颜色发生变化，则该菌
落有可能是金黄色葡萄球菌。
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3、按照用途划分
除上述四种主要类型外，培养基按用途划分还有很多种，比如：分
析培养基常用来分析某些化学物质( 抗生素、维生素) 的浓度，还
可用来分析微生物的营养需求；还原性培养基专门用来培养厌氧型
微生物；
病毒和立克次氏体目前一般不能利用人工培养基来培养, 需要接种
在动植物体内、动植物组织中才能增殖。常用的培养病毒与立克次
氏体的动物有小白鼠、家鼠和豚鼠, 鸡胚也是培养某些病毒与立克
次氏体的良好营养基质。
三、培养基的类型
小结：
小结：
四、培养基的配制
①选择适宜的营养物质
总体而言，所有微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、
无机盐、生长因子、水及能源，但由于微生物营养类型复杂，不同微
生物对营养物质的需求是不一样的，因此首先要根据不同微生物的营
养需求配制针对性强的培养基。
②营养物质浓度及配比合适
培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓
度过低时不能满足微生物正常生长所需，浓度过高时则可能对微生物
生长起抑制作用。
1、培养基的配制原则
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③控制pH条件
各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH条件各不相同，
一般来讲，细菌与放线菌适于在pH7～7.5范围内生长，酵母菌和霉
菌通常在pH4.5～6范围内生长。
值得注意的是，在微生物生长繁殖和代谢过程中，由于营养物质
被分解利用和代谢产物的形成与积累，会导致培养基pH发生变化，
若不对培养基pH条件进行控制，往往导致微生物生长速度下降或(和)
代谢产物产量下降。因此，为了维持培养基pH的相对恒定，通常在
培养基中加入pH缓冲剂，常用的缓冲剂是一氢和二氢磷酸盐(如
KH2PO4 和K2HPO4)组成的混合物。
④灭菌处理
以牛肉膏蛋白胨固体培养基为例：
计算→称量→溶(熔)化→调pH→灭菌→倒平板
2、培养基的配制流程
四、培养基的配制
①计算：根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算制作100mL 的
培养基时，各种成分的用量。
②称量：准确地称取各种成分。
③溶化：将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯，加入少量的水，
加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。往烧
杯中加入称量好的蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌，使其溶解。加入
琼脂加热使其熔化。在此过程中不断用玻璃棒搅拌，防止琼脂糊底而
导致烧杯破裂。当琼脂完全熔化后，补加蒸馏水至100mL。
2、培养基的配制流程
④调pH：培养霉菌时需将pH 调至酸性，培养细菌时需将pH
调至中性或微酸性。
⑤灭菌：
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，放入
高压灭菌锅，在压力为100kPa，温度为121℃的条件下，灭菌
15～30min。
2、培养基的配制流程
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⑤灭菌：
注意事项：
a.灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此高压锅内冷空气必
须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力，防止达到压
强后内部温度过低;
b.灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，
当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，打开盖子，取出灭
菌物品。
2、培养基的配制流程
⑥倒平板：
待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
倒平板操作：
a.将灭过菌的培养皿放在火焰
旁的桌面上，右手拿装有培养
基的锥形瓶，左手拔出棉塞；
b.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速
通过火焰；
1
2
3
4
⑥倒平板：
倒平板操作：
c.用左手将培养皿打开一条稍大
于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中
的培养基（约10～20mL）倒入
培养皿，左手立即盖上培养皿的
皿盖；
d.等待平板冷却凝固后，将平板
倒置过来放置，使皿盖朝下，皿
底在上。
1
2
3
4
为何平板要倒置放置？
⑥倒平板：
我叫平板，
凭什么让我
倒着？？？
2、培养基的配制流程
目的：防止培养皿盖
上凝结的水珠落入培
养皿造成污染，还可
防止培养基表面的水
分挥发。
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⑥倒平板：
2、培养基的配制流程
以牛肉膏蛋白胨固体培养基为例：
计算→称量→溶(熔)化→调pH→灭菌→倒平板
2、培养基的配制流程
四、培养基的配制
【例4】★★
（2011 重庆）下列有关细菌培养的叙述，正确的是
（
）
A．在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌
B．在培养基中加入青霉素可抑制真菌而促进细菌生长
C．向液体培养基中通入氧气能促进破伤风杆菌的生长
D．在半固体培养基中接种细菌培养后可以观察其运动
【例5】★★
有关培养基的表述正确的是（
）
A.任何培养基都必须含有碳源、氮源、无机盐、水等
B.固体培养基一定需要加入琼脂
C.培养基配制的一般流程是计算、称量、溶化和倒平板
D.生长因子可以由培养基中的天然成分提供
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【例6】★★
下列关于配制培养基的叙述，正确的是（
）
A．配制培养基的过程中，溶化后就分装灭菌
B．加入青霉素可得到放线菌
C．培养自生固氮菌时不需要加氮源
D．发酵工程一般用半固体培养基
【例7】★★
农田土壤的表层，自生固氮菌的含量比较多，将用表层土制成的稀
泥浆，接种到特制的培养基上培养，可将自生固氮菌与其它细菌分
开，对培养的要求是（
）
①加抗生素②不加抗生素③加氮素④不加氮素
⑤加葡萄糖⑥不
加葡萄糖．
A．①③⑤B．②④⑥C．①④⑥D．②④⑤
五、无菌技术
1、定义
指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及
其干扰的一系列操作方法和有关措施。
目的：防止外来杂菌入侵，获得纯净的培养物。
2、实现无菌的常用方法
消毒
灭菌
①消毒：
采用相对较为温和物理或化学方法，杀死物体表面或内部部分
的微生物（不包括芽孢和孢子）。
常见的消毒方法：煮沸消毒法、紫外线消毒法、巴氏消毒法以
及利用化学药品消毒等
五、无菌技术
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①消毒：
常用消毒方法
主要操作
适用对象
煮沸消毒法
100oC煮沸5-6min
耐高温的液体或物品
巴氏消毒法
70-75oC煮30min或80oC
煮15min
牛奶等不耐高温的液体
紫外线消毒
30W紫外灯照射30min
接种室、接种箱、超净
工作台
化学药物消毒
体积分数50%-70%的乙
醇
食醋3-5mL/m3熏蒸
石灰水1-3%
升汞0.1%
高锰酸钾
过氧化氢
结晶紫
皮肤及器械消毒
空气消毒
地面消毒
植物组织表面消毒
皮肤消毒
清洗伤口
外用紫药水、浅创伤口
消毒
2、实现无菌的常用方法
①消毒：
五、无菌技术
2、实现无菌的常用方法
消毒
灭菌
②灭菌：
指用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和
孢子）。
常见的灭菌方法：灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌等
五、无菌技术
2、实现无菌的常用方法
常用灭菌方法
主要操作
适用对象
灼烧灭菌
在酒精灯火焰的充
分燃烧层灼烧
接种环、接种针或其他金属
工具，试管口或瓶口等
干热灭菌
干热灭菌箱
160~170oC 加热
1~2h
耐高温的、需要保持干燥的
玻璃器皿（吸管、培养皿
等）、金属用具等
高压蒸汽灭菌
100kpa,
121oC 持
5~30min
培养基、无菌水、工作服等
物品的灭菌，
也可用于玻璃器皿的灭菌
②灭菌：
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2、实现无菌的常用方法
②灭菌：
②灭菌：
拓展：过滤灭菌
是通过过滤介质吸附或筛除去除微生物的方法。过滤灭菌主要
用于那些不适合高温高压灭菌的，例如细胞培养液，里面含有细胞
生长必须的一些营养成分，氨基酸等。
过滤灭菌的有效性主要取决于被滤溶液中存在的微生物，所以
要根据被滤溶液中存在的微生物情况，选择适宜孔径的滤膜，如常
见规格，孔径0.22μm或0.3μm的滤膜。
拓展：过滤灭菌
3、主要内容
主要包括三个方面：
无菌环境设施、无菌实验器材、无菌操作方法
①无菌环境设施：
无菌环境只是相对而言，指人们利用物理的方法或化学的
方法，在某一可控制空间内使微生物数量降低至最低限度，接
近于无菌的一种空间。
主要方法：无菌室无菌柜
超净工作台
五、无菌技术
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3、主要内容
②无菌实验器材：
凡是实验中使用的器材，能灭菌处理的必须灭菌，如玻璃器皿（
包括注射器、吸管、滴管、三角瓶、试管等）、培养基、无菌衣、口
罩等，无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处理，例如无菌室内的凳
、试管架、天平等，这些虽然无法灭菌，但是可以消毒，可用化学药
品熏蒸、喷洒或擦拭。
五、无菌技术
③无菌操作方法：
a.对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒;
b.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭
菌;
c.为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰
附近进行;
注意：通常，可在酒精灯旁进行实验；小规模的操作可以使用
无菌箱或超净工作台，工作量大的使用无菌室，要求严格的可
在无菌室内再结合使用超净工作台。
3、主要内容
③无菌操作方法：
d. 实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相
接触；
e. 使用过的培养基及培养物等必须经过灭菌处理后才能丢弃，
以防止培养物的扩散；
【例8】★★
下列操作属于灭菌方法的是（
）
A．接种前用酒精棉球擦拭双手和工作台面
B．接种中试管口等易被污染的部位通过火焰
C．牛奶在80℃下煮15min 以杀死其中的微生物
D．氯化汞溶液浸泡外植体1～2min 后无菌水冲洗
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【例9】★★
（2015 江苏）做“ 微生物的分离与培养” 实验时，下列叙述正确的
是（
）
A．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启
锅盖
B．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
C．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
D．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
【例10】★★
在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿
进行__________ （消毒、灭菌）；操作者的双手需进行清洗和
_________（消毒、灭菌）；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其
原因是紫外线能使蛋白质变性，还能________________________。若
用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及培养物必须经过
___________处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。
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