文档文本内容
一、PCR基本原理
二、PCR基本过程
三、PCR条件小结
四、PCR实验流程
五、PCR的应用
PCR技术
一、PCR基本原理
1、PCR概况
即多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,
PCR), 是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,它能以极少量的DNA
为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难于对样品
进行分析研究的问题,被广泛地应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、
古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。
一、PCR基本原理
2、体内DNA复制回顾
以亲代DNA为模板合成子代DNA的过程。
①定义:
②场所：
主要在细胞核中，随着染色体的复制而完成。
③时期：
主要是有丝分裂的间期和减数第一次分裂的间期。
④复制条件
①模版：亲代DNA的2条链
②原料：4种游离的脱氧核苷酸
③酶：解旋酶、DNA聚合酶等
④能量：由ATP水解提供
注意：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3’端延伸DNA 链
。因此，DNA 复制需要引物。当引物与DNA 母链通过碱基互补配对
结合后，DNA聚合酶就能从引物的3’端开始延伸DNA 链，因此DNA
的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸。
2、体内DNA复制回顾
1
2、体内DNA复制回顾
⑤复制原则：碱基互补配对
⑥复制的意义：
DNA分子通过复制，将遗传信息从亲代传给子
代，从而保持了遗传信息的连续性。
2、体内DNA复制回顾
⑦过程
a.解旋：利用细胞提供的能量，在解旋酶的作用下，DNA分子氢键
断裂，两条螺旋的双链解开;
b.合成子链：以解开的每一段母链为模版，在DNA聚合酶的作用下
，利用细胞中游离的4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原
则，各自合成与母链互补的一段子链;
2、体内DNA复制回顾
⑦过程
c.子链延伸：随模版链解旋过程的进行，新合成的子链也在不断
延伸.同时，每段新链与其对应的模版链盘绕成双螺旋结构;
d.形成2个新的DNA分子：复制结束，1个DNA分子形成2个完全
相同的DNA分子，新复制的2个子代DNA分子，通过细胞分裂分
配到2个子细胞中去;
2、体内DNA复制回顾
2
⑦过程
2、体内DNA复制回顾
前导
链
后随
链
⑦过程
2、体内DNA复制回顾
⑧DNA复制特点
a.半保留复制b.边解旋边复制
c.半不连续
d.多起点复制（仅限真核生物）
e.新链的合成方向：5’端3’端
f.双向复制
2、体内DNA复制回顾
⑧DNA复制特点
2、体内DNA复制回顾
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3、PCR的基本条件
①细胞内DNA复制主要参与成分：
主要参与成分
在DNA复制中的作用
解旋酶
打开DNA 双链
DNA 母链
提供DNA 复制的模板
4 种脱氧核苷酸
合成子链的原料
DNA 聚合酶
催化合成DNA 子链
引物
使DNA 聚合酶能够从引物的3’端开始
连接脱氧核苷酸
ATP
提供能量
a.原理：利用DNA 双链复制的原理，将目的基因的核苷酸序列
不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。
b.前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序
列合成引物。
c.需要条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的两种引物、4
种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA
复制在体外反复进行。
3、PCR的基本条件
②PCR的原理、前提及基本条件：
3、PCR的基本条件
c.需要条件：
DNA模板
两种引物
4种脱氧核苷酸耐热的DNA聚合酶
温度控制
缓冲液、Mg2+：
②PCR的原理、前提及基本条件：
③PCR与体内DNA复制的比较：
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几个问题：
a.为什么不需要解旋酶？
DNA变性与复性示意图
③PCR与体内DNA复制的比较：
几个问题：
a.为什么不需要解旋酶？
DNA 复制过程中，双链的解开是进行DNA 复制的前提。在
体外，可以通过控制温度来实现这一过程.在80—100℃的温度范
围内，DNA 的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变
性.当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA 链又会重新结合成
双链。
PCR 利用了DNA 的热变性原理，通过控制温度来控制双链
的解聚与结合。
③PCR与体内DNA复制的比较：
几个问题：
b.为什么需要耐热的DNA聚合酶？
高温解决了DNA 双链的打开问题，但是会导致DNA 聚合酶
失活。
耐高温的TaqDNA聚合酶的发现和应用，不仅解决了上述问
题，且大大增加了PCR 的效率，使PCR 技术趋于自动化。
③PCR与体内DNA复制的比较：
几个问题：
c.为什么需要两种引物？
③PCR与体内DNA复制的比较：
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③PCR与体内DNA复制的比较：
几个问题：
d.为什么不需要ATP？
③PCR与体内DNA复制的比较：
二、PCR基本过程
PCR 一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性
和延伸三步。
一
个
循
环
①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA 解聚为单链。
②复性（退火）：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补
配对与两条单链DNA 结合。
③延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在
TaqDNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA
链。
二、PCR基本过程
①变性：90℃以上，如95℃
②复性：50℃左右，如55℃
③延伸：72℃左右
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二、PCR基本过程
PCR 一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性
和延伸三步。
从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，
并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA 单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA 的
延伸。
这样，DNA 聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA
序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。
一个问题：
最少需要多少次循环，才能获得DNA目的片段的完整拷贝？
二、PCR基本过程
二、PCR基本过程
三、PCR条件小结
可以是DNA，也可以是RNA，当用RNA作为模板时，
需要进行反转录合成cDNA；DNA模板含量合适，可以减
少PCR多次循环带来的碱基错配。
1、模板DNA：
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2、引物：
①引物的长度过短会影响PCR的特异性，要求有16-30bp。
②引物过长使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度(72℃)
，亦会影响产物的特异性。
③四种碱基应随机分布，不要有连续3个以上的相同嘌吟或嘧
啶存在。尤其是引物3'端，不应有连续3个G或C，否则会使引
物与核酸的G或C富集区错误互补，从而影响PCR的特异性。
三、PCR条件小结
3、4种脱氧核苷酸：
由四种dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP ）提供
，每种的浓度应相等。
4、TaqDNA聚合酶：
催化合成DNA子链，是热稳定性比较好的工具酶，但应注意在-
20℃保存。
5、温度控制：
6、缓冲液、Mg2+：提供PCR反应合适的酸碱度与某些离子，
Taq酶的活性需要Mg2+。
1、实验操作
四、PCR实验流程
1、实验操作
①在PCR 实验中，需要用到微量离心管，它是一种薄壁塑料管
、总体积为0.5mL。具体操作时，用微量移液管，按照一定的配
方在微量离心管中依次加入各组分。
四、PCR实验流程
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1、实验操作
PCR反应体系的配方
10倍浓缩的扩增缓冲液
5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸
的等量混合液
1μL
20mmol/L的引物Ⅰ
2.5μL
20mmol/L的引物Ⅱ
2.5μL
H2O
28-33μL
1-5U/mL的TaqDNA聚合酶
1-2U
模板DNA
5-10μL
总体积
50μL
注:模板DNA在用量在1pg-1mg之间
1、实验操作
②再参照下表的设置设计PCR 仪的循环程序即可。
变性
复性
延伸
预变性
94℃,5min
——
——
30次
94℃,30s
55℃,30s
72℃,1min
最后1次
94℃,1min
55℃,30s
72℃,1min
四、PCR实验流程
2、注意事项
①为避免外源DNA 等因素的污染，PCR 实验中使用的微量离心
管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。
②PCR 所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前
，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
四、PCR实验流程
2、注意事项
③在微量离心管中添加反应成分是，每吸取一种试剂后，移液器上
的枪头都必须更换。
所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击
管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离
心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR 仪中进行反
应。
四、PCR实验流程
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2、注意事项
四、PCR实验流程
3、结果分析
将TBE 缓冲液加入电泳槽中，使缓冲液高出凝胶面3-4mm,
再将20μL DNA 标准溶液与2μ L 蓝色的缓冲液充分混匀后，加到
凝胶板的加样孔中。别取3 支微量离心管，标记管号，分别加入
20μL PCR 产物和2μL 蓝色加样缓冲液。混合后分别加到3 个凝
胶板上的小池中，然后进行电泳。电泳完成后，染色观察。
四、PCR实验流程
①方法一：电泳
①方法一：电泳
DNA 在260nm 的紫外线波段有一强烈的吸收峰，可以
利用这一特点进行DNA 含量的测定。
②方法二：
在260mm 的紫外线波段测定吸收峰
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②方法二：
在260mm 的紫外线波段测定吸收峰
具体方法如下：
①将样品进行50 倍稀释：取2μL反应液至98μL蒸馏水中
②以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm 处，将紫外分光光度计的
读数调节至零；
③加入步骤1 中的DNA 稀释液100μL 至比色杯中，测定260nm 处的
光吸收值；
④根据下面的公式计算DNA 含量：
DNA 含量（μg/mL）=50*×(260nm的读数)×稀释倍数
②方法二：
在260mm 的紫外线波段测定吸收峰从
紫外分光光度计
②方法二：
在260mm 的紫外线波段测定吸收峰
PCR能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的
DNA拷贝。
这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难于对样品
进行分析研究的问题,被广泛地应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案
（如DNA指纹技术）、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各
方面。
其它：检测基因突变、定性定量检测病毒
五、PCR的应用
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由于DNA中四种碱基排列顺序千变万化，使DNA具有多样性，而
DNA的多样性使得每个个体细胞中的DNA具有特异性，因此DNA
也可以像指纹一样用来识别身份，这种方法就是DNA指纹技术。
用于甄别犯罪嫌疑人：可以在犯罪现场留下的证据中提取DNA（从
犯罪现场获得的一滴血液、一根毛发、精液中细胞里提取DNA），
酶切后电泳获得DNA指纹图谱，再和犯罪嫌疑人的DNA指纹图谱
进行对照比较，如果完全一样或高度一致。基本就能断定这些就是
犯罪嫌疑人，从而用于侦破案件。
拓展1：DNA指纹技术：
拓展1：DNA指纹技术：
甄别犯罪嫌疑人
亲子鉴定
在含目的基因的DNA片段上用放射性同位素（或荧光分子）标记，
以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，若显示出杂交带，就表
明样品中含有目的基因。
拓展2：DNA分子杂交技术：
拓展2：DNA分子杂交技术：
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【例1】★★
PCR 是一种体外迅速扩增DNA 片段的技术，其基本原理和过程
与细胞内DNA 的复制类似．下列关于两者共同点的叙述，不正
确的是（
）
①边解旋边复制
②遵循碱基互补配对原则
③需要引物
④过程可分为变性、复性、延伸等步骤．
A．①②B．②③C．③④D．①④
点对点练习
【例2】★★
利用PCR技术扩增目的基因的过程中，需加入（
）
A．耐高温的解旋酶以保证DNA 双链完全解开
B．2 种已知核苷酸序列的引物以保证核苷酸链的延伸
C．4 种足量的核糖核苷酸以保证目的基因的扩增
D．一定量的盐酸和氢氧化钠溶液以维持pH 的稳定
点对点练习
【例3】★★
（多选）利用PCR 技术将某小段DNA分子扩增n代，需（
）
A．测定DNA 分子两端的核苷酸序列，以便设计引物对
B．2n对引物参与子代DNA 分子的合成
C．保持反应体系温度恒定，确保扩增的正常进行
D．PCR 呈指数扩增DNA 片段是因为上一轮反应的产物可作为下一
轮反应的模板
点对点练习
【例4】★★
关于DNA片段PCR 扩增实验的描述中不正确的是
（
）
A．加入的Taq 聚合酶耐高温
B．不同大小DNA 在电场中迁移速率不同
C．95℃是TaqDNA 聚合酶的最适温度
D．扩增区域由2 个引物来决定
点对点练习
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【例5】★★
PCR 技术是分子生物学实验的一种常规手段，该技术可在体外进行
DNA 的人工复制（如图所示），它可在很短时间内，将DNA 扩增几
百万倍甚至几十亿倍．下列说法不正确的是（
）
点对点练习
【例5】★★
下列说法不正确的是（
）
A．该技术应用的原理是DNA 半保留复制
B．加热至94℃的目的是使样品中DNA 的磷酸二酯键断裂
C．DNA 一条链中（A+T）/（G+C）的比值与另一条链中该比值相同
D．该技术复制过程中所需要的DNA 聚合酶可以从人体细胞获得
点对点练习
【例6】★★
SRY 基因为Y染色体上的性别决定基因，可SRY﹣PCR 法鉴定胚胎性
别，其基本程序如图．相关说法不合理的是（
）
A．提取滋养层细胞的DNA 作为扩增模板
B．用SRY 探针进行检测依据的原理是DNA 分子杂交
C．新合成的DNA 含有胚胎细胞全部的遗传信息
D．SRY 探针能与雄性胚胎样品中的DNA 配对
点对点练习
【例7】★★
（2013 江苏，多选）小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验
时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区
基因（目的基因）后再重组表达。下列相关叙述正确的是（
）
A．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列
B．用PCR 方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列
C．PCR 体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA 聚合酶
D．一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞
点对点练习
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