文档文本内容
一、微生物的接种
二、土壤中分解尿素细菌的分离和计数
三、分解纤维素微生物的分离
微生物培养与应用技术（二）
一、微生物的接种
1、接种定义
是将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基
上的操作技术。
接种是微生物实验及研究中的一项最基本操作，无论微
生物的分离、培养、纯化或鉴定，以及微生物的形态、生理
实验和观察研究都必须进行接种。
2、纯化
纯化培养的原理是想方设法在培养基上得到由一个细胞繁
殖而来的肉眼可见的菌落，即获得较纯的菌种，而纯化关键步
骤就是接种。
2、纯化
在一定的培养条件下（相同的温度、ＰＨ及培养时间），
同种微生物表现出稳定的菌落特征。
形态
突起
边缘
1
3、接种的方法
常用的接种方法有两种：
平板划线法与稀释涂布平板法
①
平板划线法
通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚
集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
优点：可以得到单菌落并观察菌落特征；对混合菌进行分离。
3、接种的方法
①
平板划线法
3、接种的方法
①
平板划线法
接种的关键是严格的无菌操作，相关注意事项如下：
a. 一切操作均应在火焰旁边进行；
b. 棉塞应该始终夹在手中，如掉落应更换无菌棉塞；
c. 如不慎使棉塞触及火焰着火，切勿用口吹，应将其迅速塞入试管
，因管内氧气不足灭火；
d. 接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器皿
上，以免造成污染，如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒
液擦净，凡吸过菌液的吸管或滴管应立即放入有消毒液的容器内。
3、接种的方法
2
①
平板划线法
e. 挑取和移接微生物纯培养物用的接种环及接种针，应采用易于迅速
加热和冷却的镍铬合金等金属制备，使用时用火焰灼烧灭菌,转移液
体纯培养物时，应采用无菌吸管或无菌移液枪;
f. 第一次划线及每次划线之前都需要灼烧接种环,灼烧接种环，待其
冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种;
g. 划线时最后一区不要与第一区相连;
h. 划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破;
3、接种的方法
②稀释涂布平板法
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分
别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的
菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培
养基表面形成单个的菌落。
优点：可以得到单菌落并观察菌落特征，并且可以计数。
3、接种的方法
②稀释涂布平板法
操作：分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。
系列稀释操作：
3、接种的方法
②稀释涂布平板法
操作：分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。
涂布平板操作：
3、接种的方法
3
②稀释涂布平板法
a. 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
b. 取少量菌液，滴加到培养基表面。
c. 将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽冷却8～
10s．才能进行涂布，以免温度太高杀死菌种。
d. 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。
3、接种的方法
涂布平板操作：
接种之后进行培养：
将接种后的培养基和一个未接种的培养基（作对照）都放入
恒温箱中，37℃培养12h和24h，分别观察并记录结果。
二、土壤中分解尿素细菌的分离和计数
1、原理：
筛选：以尿素作为唯一氮源的选择培养基；
鉴定：酚红培养基
2、实验流程：
23
2
稀释及涂
布培养
制备培
养基
土壤
取样
培养与
观察
计数
①土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，
将样品装入事先准备好的信封中。
土壤中的微生物，大约70%～90%是细菌。细菌适宜在酸碱度接
近中性的潮湿土壤生长，绝大多数分布在距地表3～8cm 的土壤层，
因此在土壤取样时，一般要铲去表层土。
2、实验流程：
②样品的稀释及涂布培养
样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际
操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得
的菌落数在30～300 之间、适于平板计数。测定土壤中细菌的数
量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养。
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②样品的稀释及涂布培养
将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体
积为250 mL），充分摇匀，吸取上清液1 mL，转移至盛有9 mL的生
理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至106稀释度，选用104、105和
106倍的稀释液进行平板培养。
2、实验流程：
②样品的稀释及涂布培养
2、实验流程：
90ml
无菌
水
③微生物的培养与观察
将涂布好的培养皿放在37 ℃温度下培养。随着培养时间的延长，
会有不同的菌落产生。注意观察选择培养基中菌落的数量、形态等，
并做好记录。
挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红的斜面培养基中，
观察能否产生对应的颜色反应。
2、实验流程：
③微生物的培养与观察
斜面培养基
脲酶检验
2、实验流程：
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④细菌计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在
同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并
根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。
2、实验流程：
④细菌计数
计数方法：
显微镜直接计数法：如采用血球计数板计数
活菌计数法：
用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度
足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一
个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多
少活细菌。
活菌计数法：
注意事项：
a.涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml 较为适宜，如果过少菌液不易
涂布开；过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不
易形成单菌落。
b.通常选用一定稀释范围的样品液进行培养以保证获得的菌落数在30-
300 之间、适于计数的平板。
c.该实验每克样品中的菌株数=C÷V×Ｍ
Ｃ代表某一稀释度下平板上的平均菌落数，Ｖ代表涂布在平板上接种
的稀释液体积，Ｍ代表稀释倍数
活菌计数法：
注意事项：
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活菌计数法：
注意事项：
d.同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示实验
不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便
于数据统计，减少误差。
e.设置对照实验，提高实验结果的可信度。
f.统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。
三、分解纤维素微生物的分离
纤维素背景：
纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含
量最丰富的多糖类天然有机高分子化合物，棉花是自然界中纤维素含
量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素，许多商
品纤维素都是由天然纤维素制得的，如水溶性的羧甲基纤维素钠、不
溶于水的微晶纤维素。
纤维素背景：
纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶
、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三
种酶将纤维二糖分解成葡萄糖，正是在这三种酶的协同作用下，纤
维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养，也可以为人
类所利用。
三、分解纤维素微生物的分离
1、筛选原理
刚果红（CR）是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形
成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形
成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就
可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
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三、分解纤维素微生物的分离
2、实验流程
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2
梯度
稀释
选择
培养
土壤
取样
将样品涂布到鉴别纤维素
分解菌的培养基
挑选产生透明圈
的菌落
三、分解纤维素微生物的分离
注意：关于刚果红染色法拓展
方法一：先培养微生物再加入刚果红进行颜色反应
优点：显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用
缺点：操作繁琐,加入的刚果红会使菌落之间发生混杂
方法二：在倒平板时就加入刚果红
优点：不存在菌落的混杂问题
缺点：a.在纤维素粉和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质,可以使能
够产生淀粉酶的微生物产生假阳性反应。
b.有些微生物有降解色素的能力，长时间培养会分解刚果红
形成明显的透明圈，很难区分。
【例1】★★
用平板划线法或稀释涂布平板法都可以纯化大肠杆菌．二者的共同点
有（
）
①可以用相同的培养基②都要使用接种针进行接种
③都需要在火焰旁进行接种④都可以用来计数活菌．
⑤只能应用于固体培养基接种⑥接种培养后均可获得单菌落⑦接种用
具都需进行严格灭菌
A．①③⑥⑦
B．①③④⑥⑦
C．①②③④⑥⑦
D．①③⑤⑥⑦
【例2】★★
如图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法
正确的是（
）
A．图中只有②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行
B．步骤①中待倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖
C．步骤③中，每次划线前后都需对接种环进行灼烧处理
D．培养过程中每隔一周观察一次
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【例3】★★
（2015 上海）在涂布有大肠杆菌的培养基上进行抑菌实验，在a 、
b 、c 处分别贴浸有不同抗生素（浓度相同）的无菌滤纸片，d 处
滤纸片浸有无菌水。培养后的结果如图。以下判断错误的是
（
）
A．a处抑菌效果小于b处
B．b处的滤纸片没有沥干
C．c处抗生素无效
D．d为对照
【例4】★★★
35-40%的甲醛水溶液（福尔马林）可作为防腐剂，其防腐的原理是使
蛋白质变性。自然界中有能分解甲醛的细菌和真菌。下图为分离和纯
化分解甲醛细菌的实验过程。请分析回答：
（1）②过程的目的是
，③过程培养出的是。上述实验中，不需
要进行灭菌处理的是
。
（2）由③→④的接种可选用____法，通过培养能获得。经过⑤过
程后，取样测定甲醛浓度，选出，再分离、培养菌株。此菌种异化
作用的类型是____ 。
【例4】★★★
（3）为研究甲醛初始浓度对菌株降解甲醛能力的影响，进行了相应实
验并得到如下结果。由图可知，当甲醛的初始浓度小于1200mg/L时，
菌株
；当甲醛的初始浓度增高至1600mg/L时，48小时后菌株对甲醛
的降解能力很弱，甚至失去降解能力，其原因可能是
。
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【例4】★★★
（3）为研究甲醛初始浓度对菌株降解甲醛能力的影响，进行了相应实
验并得到如下结果。由图可知，当甲醛的初始浓度小于1200mg/L时，
菌株
；当甲醛的初始浓度增高至1600mg/L时，48小时后菌株对甲醛
的降解能力很弱，甚至失去降解能力，其原因可能是
。
【答案】（3）可以完全降解甲醛甲醛浓度过高，使菌体蛋白质变性
，从而降低了细菌降解甲醛的能力
点对点练习
【例5】★★★
（2014 新课标Ⅰ）植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解，回答下
列问题：
（1）分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3 种组分
组成的复合酶．其中的葡萄糖苷酶可将分解成
．
（2）在含纤维素的培养基中加入刚果红（CR）时，CR可与纤维素
形成色复合物．用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养
基上会出现以该菌的菌落为中心的
．
（3）为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某
同学设计了甲、乙两种培养基（成分见下表）：
注：“+”表示有，“﹣”表示无．
据表判断，培养基甲（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维
素分解菌，原因是；培养基乙（填“能”或“不能”）用于分离
和鉴别纤维素分解菌，原因是．
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