文档文本内容
一、实验相关知识
二、血红蛋白的提取
三、乳酸脱氢同工酶的提取
蛋白质的提取与鉴定
一、实验相关知识
1、实验原理
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小，所带电
荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，
可以分离不同种类的蛋白质。
一、实验相关知识
2、分离方法：凝胶色谱法
a. 概念：是根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具
有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离的方法。
b. 凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）
构成的多孔小球体，小球体内部有许多贯穿的通道。
一、实验相关知识
2、分离方法：凝胶色谱法
c. 凝胶色谱法的原理——分子筛效应
当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较
小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢
；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能
在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快.相对分子质量不同的
蛋白质分子因此得以分离。
依据的特性是：蛋白质分子量的大小
1
一、实验相关知识
2、分离方法：凝胶色谱法
c. 凝胶色谱法的原理——分子筛效应
一、实验相关知识
3、鉴定方法：电泳
a.
概念：
指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
一、实验相关知识
3、鉴定方法：电泳
b.
原理：
许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团
，在一定pH 下，这些基团会带上正电或负电.在电场的作用下，这
些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本
身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实
现样品中各种分子的分离。
一、实验相关知识
3、鉴定方法：电泳
c.
分类：
常用的有琼脂糖凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳
鉴定蛋白质的纯度，以及测定蛋白质的相对分子质量通常用
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶
电泳）。
2
3、鉴定方法：电泳
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中迁移率取决于它所带静电荷的多
少以及分子的大小等因素。
为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS。
SDS 能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复
合体在SDS 的作用下解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条
肽链分子量。SDS 能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS 复合物，
SDS 所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量，因而掩
盖了不同种蛋白质间电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的
大小。
3、鉴定方法：电泳
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
3、鉴定方法：电泳
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、实验相关知识
4、缓冲溶液
a.
概念：
在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不
引起溶液pH 发生明显变化的溶液叫做缓冲溶液。
b.
配制：
缓冲溶液通常由1-2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓
冲剂的使用比例就可以制得在不同pH 范围内使用的缓冲液。
3
一、实验相关知识
4、缓冲溶液
c.
作用：
为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，就必须
保持体外的PH与体内的一致。而在一定范围内，缓冲溶液能够
抵制外界的酸和碱对溶液pH 的影响，维持pH 基本不变。
c.
作用：
例子：
在血红蛋白整个实验中使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓
冲液模拟细胞内pH 环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便
于观察（红色）和材料的科学研究（活性）。
二、血红蛋白的提取
纯化
粗分离
样品处理
纯度鉴定
二、血红蛋白的提取
1、样品处理
血红蛋白：
血液由血浆和各种红细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的
组成中，90%是血红蛋白。血红蛋白由四个肽链组成，两个α-肽链
，两个β-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可
携带一分子氧气或二氧化碳。
本次实验可使用猪牛羊或者其它脊椎动物的血液来分离血红蛋
白。
4
二、血红蛋白的提取
1、样品处理
血红蛋白：
二、血红蛋白的提取
1、样品处理
①红细胞的洗涤
a.目的：去除杂蛋白
b.方法：低速短时间离心（如500r/min 离心2min，速度越高和时
间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），
然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细
胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的质量分数为0.9%的NaCl 溶
液洗涤，缓慢搅拌10min。
二、血红蛋白的提取
1、样品处理
①红细胞的洗涤
c.低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液不再呈黄色，
表明红细胞已洗涤干净。
二、血红蛋白的提取
1、样品处理
②血红蛋白的释放
加洗涤好的红细胞到蒸馏水中，再加40%体积的甲苯（溶解
细胞膜），置于磁力搅拌器上充分搅拌10min（加速细胞破裂）
，细胞破碎释放出血红蛋白。
5
二、血红蛋白的提取
1、样品处理
③分离血红蛋白溶液
将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min 的速度离心
10min 后，可以明显看到试管中的溶液分为4 层。从上往下数：第
一层为无色透明的甲苯层；第2 层为白色薄层固体，是脂溶性物质
的沉淀层；第3 层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液；第4
层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中液体用滤纸过滤，除去脂
溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体
。
二、血红蛋白的提取
1、样品处理
③分离血红蛋白溶液
二、血红蛋白的提取
2、血红蛋白的粗分离——透析：
①取1mL 的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL
的物质的量浓度为20mmol/L 的磷酸缓冲液中（pH 为7），透析
12h。
②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。
二、血红蛋白的提取
3、血红蛋白的纯化——凝胶色谱法
①凝胶色谱柱的装填
a.配制凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水中，充
分溶胀后配成凝胶悬浮液。
b.装填：将凝胶悬
浮液一次性的缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶
装填均匀，不能有气泡出现。
c.洗涤平衡：装填完成后，立即连接缓冲液洗脱瓶。在50cm 高的操
作压下，用300mL 的20 mmol/ L 的磷酸缓冲液充分平衡12h。
6
二、血红蛋白的提取
3、血红蛋白的纯化——凝胶色谱法
①凝胶色谱柱的装填
二、血红蛋白的提取
3、血红蛋白的纯化——凝胶色谱法
②样品加入与洗脱
加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓
慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。加透析样品：
a. 用吸管小心地将1mL 透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意不要
破坏凝胶面。
b. 样品渗入凝胶床：加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内
，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
二、血红蛋白的提取
3、血红蛋白的纯化——凝胶色谱法
②样品加入与洗脱
加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液
缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。加透析样品：
c. 洗脱：打开下端出口，小心加入物质的量浓度为20mmol/L 的磷
酸缓冲液进行洗脱。
d. 收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，
每5mL 收集一管，连续收集。
二、血红蛋白的提取
3、血红蛋白的纯化——凝胶色谱法
②样品加入与洗脱
由于血红蛋白呈现红色，因此分离过程中能够观察到一条
红色的带向下移动的现象，实验结果也一目了然。
如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能
清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱
液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效
果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。
7
二、血红蛋白的提取
3、血红蛋白的纯化——凝胶色谱法
②样品加入与洗脱
二、血红蛋白的提取
4、纯度鉴定
SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳法.
二、血红蛋白的提取
4、纯度鉴定
SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳法.
三、乳酸脱氢同工酶的提取
乳酸脱氢酶（LDH）是动物组织中广泛存在的酶，在氧化型
辅酶NAD+存在下，它使乳酸脱氢产生丙酮酸。
1、乳酸脱氢同工酶概况
8
三、乳酸脱氢同工酶的提取
乳酸脱氢酶有许多同工酶。同工酶是指能催化
同一化学反应，但其酶蛋白的分子组成不同的一组
酶。
LDH是2种亚基L和M以不同比例组成的四聚体，即H4、H3M
、H2M2、HM3和M4共5种同工酶。在动物细胞分化及胚胎发育过
程中，其各种同工酶比例不同。
1、乳酸脱氢同工酶概况
三、乳酸脱氢同工酶的提取
本实验使用聚丙烯酰氨凝胶电泳法分离LDH的同工酶，用活
性染色法呈显同工酶区带。染色的原理是：在LDH的作用下，
NAD+被还原为NADH，将电子和H+传递给甲硫吩嗪（PMS），
还原的甲硫吩嗪再将电子和H+传递给氯化氮蓝四唑（NBT），还
原氮蓝四唑呈蓝色，展现在电泳凝胶上。
1、乳酸脱氢同工酶概况
三、乳酸脱氢同工酶的提取
①制备电泳凝胶板
2、提取过程
组装电泳槽，依对应配方制
备5ml分离胶倒入槽中。在胶的
上端轻轻加入少量水，以防止生
成胶的弯月面。待胶凝固后，小
心倒出蒸馏水，再用滤纸吸净残
留的水。
三、乳酸脱氢同工酶的提取
①制备电泳凝胶板
2、提取过程
将2ml浓缩胶倒入，插入梳
子，再加入少量水，待胶凝固后
，小心倒出蒸馏水，再用滤纸吸
净残留的水，拔出梳子。凝胶一
定要在倒入前配制。
9
三、乳酸脱氢同工酶的提取
①制备电泳凝胶板
2、提取过程
分离胶与浓缩胶配方
三、乳酸脱氢同工酶的提取
②加样
2、提取过程
取10μL血清，加入等体积40%蔗糖
溶液（内含少许溴酚蓝），在离心管中
混匀后，用移液器吸取15μL样品，小
心加到凹槽中，每组一槽，组间进行比
较。也可取胎牛、小牛、老牛的血清比
较同工酶相对百分含量的差别。
三、乳酸脱氢同工酶的提取
③电泳
2、提取过程
电泳装置如图，打开
电泳将电流调至10mA，
待样品进入分离胶时，改
为20-25mA，当溴酚蓝前
沿距下框1-2cm时，将电
流调至0，关闭电源。
三、乳酸脱氢同工酶的提取
④染色
2、提取过程
电泳后，取出凝胶板，放在盛有染色液的培养皿中，在37℃
水浴上保温20-30min，可看出LDH同工酶呈现蓝紫色区带。
10
三、乳酸脱氢同工酶的提取
④染色
2、提取过程
三、乳酸脱氢同工酶的提取
④染色
2、提取过程
【例1】★★
下列有关利用哺乳动物红细胞进行实验的叙述，正确的是（
）
A．可用同位素标记法追踪血红蛋白的合成和分泌过程来证明生物膜之
间的协调配合
B．可利用血红蛋白的颜色来监测凝胶色谱法分离血红蛋白的情况
C．不可用成熟的红细胞来制备纯净的细胞膜
D．可用成熟的红细胞来提取DNA
点对点练习
【例2】★★
通常用哺乳动物的血液来提取和分离血红蛋白，下列叙述中不正确的
是（
）
A．实验时向新鲜的血液中加入柠檬酸钠的目的是防止血液凝固
B．洗涤红细胞的目的是避免细胞粘连在一起
C．通过SDS﹣聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定血红蛋白
D．分离后血红蛋白还要通过凝胶色谱法将样品进一步纯化
点对点练习
11
【例3】★★
（多选）在蛋白质的提取和分离中，下列关于样品的处理，分析不正
确的是（
）
A．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖和无机盐
B．洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的
效果
C．洗涤红细胞选用0.1%的生理盐水
D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较大的杂质
点对点练习
【例4】★★
将处理破裂后的红细胞混合液以2000r/min 的速度离心10min 后，离心
管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是（
）
A．血红蛋白、甲苯层、脂质物质层、细胞破碎物沉淀层
B．甲苯层、细胞破碎物沉淀层、血红蛋白、脂质物质层
C．脂质物质层、血红蛋白、甲苯层、细胞破碎物沉淀层
D．甲苯层、脂质物质层、血红蛋白、细胞破碎物沉淀层
点对点练习
【例5】★★
已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，分子大小、
电荷的性质和数量情况如图所示，下列有关蛋白质分离的叙述正确的
是（
）
A．若将样品以2000 r/min 的速度离心10 min，分子戊在沉淀中，则
丙也一定在沉淀中
B．若用凝胶色谱法分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快
C．将样品装入透析袋中透析12h，若分子丙保留在袋内，则乙也一
定保留在袋内
D．若用SDS﹣聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分
子甲和分子丁形成的电泳带相距最远
【例6】★★★
蛋白质是生物体内重要的化合物，实验室提取、分离蛋白质对于蛋白
质的研究，应用具有重要意义，请分析回答：
（1）从红细胞中提取和分离血红蛋白的程序可分为四步：样品处理
、
、
和纯度鉴定．
其中样品处理包括：红细胞的洗涤、
、分离血红蛋白溶液；样品处
理的前两个步骤中使用的液体分别是、．纯度鉴定常采用的方法是
．
12
【例6】★★★
（2）图中所示装置中，C溶液是
．用乙装置分离蛋白质的方法叫
．为使凝胶装填紧密，应在约cm 高的操作压下向色谱柱内注入缓冲
液，当色谱柱内待
接近色谱柱底端时，开始用试管收集流出液，每5mL收集一管，连
续收集，在分离过程中，当观察到
时，说明色谱柱制作成功.
【例6】★★★
（3）装填凝胶柱时，不得有气泡存在，原因是
．
【例7】★★★
红细胞含有大量血红蛋白，血红蛋白的主要功能是携带O2 和CO2
．我们可以选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液进行实验，来提
取和分离血红蛋白．根据材料回答问题：
（1）实验前取新鲜血液，要在采血器中预先加入柠檬酸钠，目的
是
．
（2）提取和分离血红蛋白的程序是：样品处理、粗分离、纯化、
纯度鉴定．①在样品处理步骤中，洗涤红细胞的目的是，用
溶
液洗涤，洗涤后离心分离的速度和时间要求是
，离心后的上清
液没有
就说明红细胞已洗涤干净．
②图1表示
过程，该操作目的是去除样品中分子量（大或小）
的
杂质．原理是
．
③图2，往色谱柱中加样的正确操作顺序是
（用序号表示）．在进
行④操作前，应该等样品
，且要（填“打开”或“关闭”）下端
出口．
13
④图3 是利用样品分离得到的结果，则图3中蛋白质分子量最小
的是
．
⑤纯度鉴定步骤，利用琼脂糖凝胶电泳技术，将得到的蛋白质进
行分离，在电泳过程中，影响蛋白质迁移速度的因素包括蛋白质
分子的
、
以及分子的形状等．而加入SDS后，使得蛋白质的
迁移率只取决于
．
14
