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专题06 基因工程类（大题30 道）
1．研究人员对大肠杆菌的营养代谢途径进行改造，使改造后的大肠杆菌工程菌能表达甲酰胺酶与亚磷酸
脱氢酶融合蛋白，该融合蛋白能分解甲酰胺产生氨作为氮源，分解亚磷酸盐成为磷酸盐作为磷源。下图为
构建表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的大肠杆菌的过程。回答下列问题：
(1)PCR 体系①和PCR 体系②必须分开进行，其原因是 。将PCR 体系①的产物与体系②的产物混合后，
继续进行下一次PCR 反应。在该PCR 反应体系中经过高温变性后，当温度下降到 ℃左右时，能够互
补配对的DNA 链相互结合，理论上有 种结合的可能，其中能进行进一步延伸的有 种。
(2)用限制酶 酶切PGEX-2T 表达质粒，再将酶切得到的融合基因．for-Linker-ptx 放到切口处，在DNA
连接酶的作用下构建pGEX-2T-for-Linker-ptx 重组质粒。转化大肠杆菌DH5α 后，可在添加 的培养基中，
挑选DH5α 转化阳性的表达重组菌株。
(3)从重组大肠杆菌DH5α 中提取重组质粒pGEX-for-Linker-ptx，并将重组质粒导入大肠杆菌表达菌株BL21
中，得到重组表达菌株BL21，收集菌体并加入到含有 的培养基中，继续培养得到重组大肠杆菌。此
种方法培养大肠杆菌可以有效抑制杂菌的生长，其原理是 。
【答案】(1) 引物b 和引物c 存在碱基互补配对片段，置于同一反应体系会导致引物失效 50
4 1
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(2) BamHⅠ和EcoRⅠ 氨苄青霉素
(3) 甲酰胺和亚磷酸盐 添加甲酰胺和亚磷酸盐，重组大肠杆菌对其具有分解功能，获得充足的营
养成分而成为优势菌；而杂菌不具备分解功能，会因缺乏氮源和磷源而受到抑制
【分析】PCR 原理：在高温条件作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷
酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从
子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主
要原因是DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。
基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工
合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、花粉管通道法等；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基
因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法（感受态细胞法）。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因
PCR 技术；②检测目的基因是否转录出PCR 技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。
个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）PCR 体系①和PCR 体系②必须分开进行的原因是引物b 和引物c 存在碱基互补配对片段，
置于同一反应体系会导致引物失效。将PCR 体系①的产物与体系②的产物混合后，继续进行下一次PCR
反应。因为PCR 体系①得到ab 片段（引物a、引物b 延伸后得到等长的片段）、PCR 体系②得到cd 片段，
继续进行下一次PCR 反应时，该PCR 反应体系经过高温变性后，会形成四种单链（a、b、c、d），当温
度下降到50℃左右时，能够互补配对的DNA 链相互结合，即a 与b、a 与d、c 与d、c 与b 结合，即理论
上有4 种结合的可能，但由于子链延伸的方向只能是5'→3'，因此只有a 和d 互补后可继续延伸子链形成最
终改造后的基因，即能进行进一步延伸的有1 种。
（2）用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ酶切pGEX-2T 表达质粒，再将酶切得到的融合基因for-Linker-ptx 放到切口
处，在DNA 连接酶的作用下构建pGEX-2T-for-Linker-ptx 重组质粒。可在添加氨苄青霉素的培养基中转化
大肠杆菌DH5α，挑选DH5α 转化阳性表达重组菌株。
（3）从重组大肠杆菌DH5α 中提取重组质粒pGEX-for-Linker-ptx，并将重组质粒转化入大肠杆菌表达菌株
BL21 中，得到重组表达菌株BL21，收集菌体并加入到含有甲酰胺和亚磷酸盐的培养基中，继续培养得到
2
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重组大肠杆菌。此种方法培养大肠杆菌可以有效抑制杂菌的生长，其原理是添加甲酰胺和亚磷酸盐，重组
大肠杆菌对其具有分解功能，获得充足的营养成分而成为优势菌，而杂菌不具备分解功能，会因缺乏氮源
和磷源而受到抑制。
2．在植物基因工程中外源基因表达量不足是目前利用转基因植物生产植物疫苗时存在的问题之一。研究
表明，启动子的串联能增强外源基因的表达，研究人员拟构建含有两个35s 启动子（35s 启动子是花椰菜花
叶病毒的一种强启动子）串联的转基因苜蓿。一个35s 启动子包括1 个A 区和2 个B 区。图甲表示35s 启
动子及其附近区域分布的限制酶识别位点，已知不同限制酶切割后得到的黏性末端各不相同。图乙表示待
转入第二个35s 启动子的重组质粒的构成组件及其上的限制酶识别位点。
(1)利用PCR 技术可以扩增35s 启动子，PCR 技术的原理是 ，此技术设计引物很关键，引物是 。利用
此技术扩增的35s 启动子可以在PCR 扩增仪中自动完成，完成以后，常采用 来鉴定PCR 的产物。
(2)根据限制酶识别位点，为了让第二个35s 启动子准确串联在待转入的重组质粒上，应选择 限制酶切
割图甲的DNA 片段。
(3)为了筛选出正确串联了两个35s 启动子的新重组质粒菌落，研究人员用含有不同抗生素的平板进行筛选，
平板类型丙和丁加入的抗生素分别是 、 ，得到①②③三类菌落，其生长状况如下表（+代表生长，-
表示不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是 （填“①”“②”或“③”）类。若新获得的转
基因苜蓿中目的基因的表达量大幅增加，可以说明串联两个35s 启动子能 。
平板类型
①
②
③
甲：无抗生
素
+
+
+
乙：卡那霉
素
-
-
+
丙：？
-
+
+
丁：？
-
-
+
3
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【答案】(1) DNA 半保留复制（和DNA 的热变性） 一 小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补
配对的短单链核酸 琼脂糖凝胶电泳
(2)Xba I 和Hind III
(3) 氨苄青霉素 卡那霉素和氨苄青霉素 ② 增强外源基因（目的基因）的表达
【分析】1、基因工程主要利用到三个工具：准确切割DNA 分子的“分子手术刀”——限制酶、将DNA
片段再连接起来的“分子缝合针”——DNA 连接酶、将体外重组好的DNA 分子导入受体细胞的“分子运
输车”——载体。基因工程主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基
因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
2、农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子
叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti 质粒上的T-DNA（可转
移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA 上。根据农杆菌的这种特点，如
果将目的基因插入Ti 质粒的T-DNA 中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。
【详解】（1）PCR 技术是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA 复制的各种组分与反
应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术；PCR 利用了DNA 的热变性原理，通过调节温度
来控制DNA 双链的解聚与结合。PCR 过程需要引物使DNA 聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，
引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。PCR 扩增完成以后，常采用琼脂糖
凝胶电泳来鉴定PCR 的产物。
（2）构建表达载体时，应将35s 启动子插入质粒的T-DNA 区域，这样才能将目的基因随T-DNA 转移到被
侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA 上，所以不能选择Sal I 限制酶；限制酶不能破坏35s
启动子的完整性，所以不能选择BamH I；为了防止限制酶切割后35s 启动子和质粒自身环化及反应连接，
常选用两种不同的限制酶同时切割35s 启动子和质粒，所以不选EcoR I。综上：为了让第二个35s 启动子
准确串联在待转入的重组质粒上，应选用Xba I 和Hind III 两种限制酶切割图甲的DNA 片段。
（3）构建表达载体的成功率达不到100%，所以得到的质粒有些是含有35s 启动子的重组质粒，有些是不
含35s 启动子的质粒，在将目的基因导入受体细胞时，可能得到三种类型的细胞：未导入质粒的农杆菌、
导入了不含35s 启动子的质粒的农杆菌、导入了含有35s 启动子的重组质粒的农杆菌。未导入质粒的农杆
菌不能在含有抗生素的培养基上生长；导入了不含35s 启动子的质粒的农杆菌能在含有卡那霉素和氨苄青
霉素的培养基上生长；导入了含有35s 启动子的重组质粒的农杆菌由于质粒上的卡那霉素抗性基因被限制
酶Xba I 切割后破坏，能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，不能在含有卡那霉素的培养基上生长。为了
筛选出正确串联了两个35s 启动子的新重组质粒菌落，平板类型丙和丁加入的抗生素分别是氨苄青霉素、
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卡那霉素和氨苄青霉素。①只能在不含抗生素的培养基上生长，是未导入质粒的农杆菌；②能在含有氨苄
青霉素的培养基上生长且不能在含有卡那霉素的培养基上生长，是导入了含有35s 启动子的重组质粒的农
杆菌；③在不含抗生素和含氨苄青霉素、卡那霉素的培养基中都能存活，为导入了不含35s 启动子的质粒
的农杆菌，所以应选择的菌落是②。若新获得的转基因苜蓿中目的基因的表达量大幅增加，可以说明串联
两个35s 启动子能增强外源基因（目的基因）的表达。
3．叶用莴苣（如生菜）是大众喜爱蔬菜，夏季高温极易引起先期抽苔造成减产，泛素连接酶（LsE3）是
研究人员在莴苣高温抽苔植株中筛选得到的。LsE3 基因受温度调控，影响莴苣抽苔，但是LsE3 基因作用
机制尚不清楚。研究人员用无缝克隆技术构建莴苣LsE3 基因的表达载体用于研究其分子机理。无缝克隆
技术是构建表达载体的一种技术如图2。
(1)目的基因获取，在 条件下，提取先期抽苔莴苣细胞中 ，经 获得cDNA，再以cDNA 为
模板，利用PCR 技术扩增LsE3 基因。PCR 扩增除了图1 标出的物质以外，还需加入 （至少写两种）。
LsE3 基因两端序列如图1 所示，PCR 中需要两种引物F（左侧）、R（右侧）选用 （选项中为引物部
分序列，方向为5'→3'）。
A．GATTAG------TGTTGGB．CCAACA------CTAATCC． TAGGTG------AGACCT D．AGGTCT------
CACCTA
(2)表达载体构建，近年来新一代无缝克隆技术发展迅猛，基于T4 DNA 聚合酶和T5 核酸外切酶成为目前
研究的热点。早在1990 年，Aslanidis 等便提出基于T4 DNA 聚合酶( LIC)技术（如图2）。 T4 DNA 聚合
酶在反应体系中没有添加dNTP 情况下具有 3'→5'外切酶活性；在反应体系中添加dNTP 情况下具有
5'→3'聚合酶活性；在反应体系中仅添加某种特定的dNTP 原料（如dATP），T4 DNA 聚合酶也具有
3'→5'外切酶活性，且外切到dATP 时，外切酶活性和聚合酶活性同时发挥作用，从而竞争性终止反应，产
生指定长度的单链黏性末端。请结合图1 和图2 回答下列问题：
①LIC 技术构建表达载体，图1 中利用PCR 扩增LsE3 基因，反应液中加入T4 DNA 聚合酶和 处理。
用EcoRⅤ酶（GAT↓ATC）切割图1 所示质粒获得 末端，后加T4 DNA 聚合酶和 处理质粒。处
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理后将两者混合、退火并导入细胞内完成重组克隆。
②LIC 技术依赖特定同源序列，2007 年Li 等建立了不依赖特定序列的克隆( SLIC) 技术，后经过多次改进，
Qi 等建立了RQ-SLIC 技术，用EcoRⅤ酶切割质粒后与LsE3 基因混合，加入T4 DNA 聚合酶处理适当时间，
将混合物加热到72℃，目的是 ，缓慢降温（退火）后移入细胞内转化修复形成完整重组质粒，细胞
内转化修复过程中用到 酶。
(3)导入受体细胞，取叶用莴苣幼芽经 （过程）形成愈伤组织备用，用 处理农杆菌后导入重组质
粒，再感染叶用莴苣愈伤组织，将感染后的愈伤组织置于加入 植物组织培养基中培养，筛选出成功
导入质粒的植物细胞。
【答案】(1) 高温 总RNA（或“总mRNA”或“RNA”） 逆转录 Taq 酶、缓冲液、
dNTP、Mg2+ AC
(2) dGTP 平 dCTP 终止T4 DNA 聚合酶活性 DNA 聚合酶和DNA 连接
(3) 脱分化 氯化钙（或Ca2+） 潮霉素
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记
基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方
法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将
目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定：
（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②检
测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。
（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）目的基因获取，在高温条件下，提取先期抽苔莴苣细胞中总RNA，经逆转录获得cDNA，
再以cDNA 为模板，利用PCR 技术扩增LsE3 基因。PCR 扩增的条件有模板、引物、Taq 酶、dNTP、能量
等，除了图1 标出的物质以外，还需加入Taq 酶、缓冲液、dNTP、Mg2+。LsE3 基因两端序列如图1 所示，
PCR 中引物需要结合在模板链的3'，子链的延伸方向是沿引物的5'进行，结合图1 和碱基互补配对原则，
引物F（左侧）选用A、R（右侧）选用C。
（2）①由题干信息可知，在反应体系中仅添加某种特定的dNTP 原料（如dATP），T4 DNA 聚合酶也具
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有 3'→5'外切酶活性，且外切到dATP 时，外切酶活性和聚合酶活性同时发挥作用，从而竞争性终止反应，
产生指定长度的单链黏性末端，所以图1 中利用PCR 扩增LsE3 基因，反应液中加入T4 DNA 聚合酶和
dGTP 处理。用EcoR Ⅴ酶（GAT↓ATC）切割图1 所示质粒获得平末端，后加T4 DNA 聚合酶和dCTP 处理
质粒。
②LIC 技术依赖特定同源序列，2007 年Li 等建立了不依赖特定序列的克隆( SLIC) 技术，后经过多次改进，
Qi 等建立了RQ-SLIC 技术，用EcoR Ⅴ酶切割质粒后与LsE3 基因混合，加入T4 DNA 聚合酶处理适当时
间，将混合物加热到72℃，目的是终止T4 DNA 聚合酶活性，缓慢降温（退火）后移入细胞内转化修复形
成完整重组质粒，细胞内转化修复过程中用到DNA 聚合酶和DNA 连接酶。
（3）导入受体细胞，取叶用莴苣幼芽经脱分化形成愈伤组织备用，用氯化钙（或Ca2+）处理农杆菌后导
入重组质粒，再感染叶用莴苣愈伤组织，将感染后的愈伤组织置于加入潮霉素植物组织培养基中培养，原
因是重组质粒中含有潮霉素抗性基因，然后筛选出成功导入质粒的植物细胞。
4．在未断奶的小牛胃中存在一种凝乳酶，被广泛应用于奶酪和酸奶的生产。科学家将编码牛凝乳酶的基
因（长度1.5kb）导入大肠杆菌获得工程菌，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。
(1)提取小牛胃黏膜组织中的mRNA，经逆转录得到cDNA，选择合适的引物进行PCR 扩增，PCR 引物碱基
数一般在20～30 个之间，过短则导致 。
(2)如表为操作过程中可能用到的限制酶，图1 为获得的目的基因及末端（除黏性末端序列外，其他碱基序
列省略），图2 为要使用的质粒，其中的Tetr、Ampr分别为四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。对质
粒进行切割时，选用的两种限制酶为 。目的基因和质粒能连接成重组质粒的原因是 ，导入的目的
基因在受体细胞中能成功表达的理论基础是 。
限制酶
BamHⅠ
BclⅠ
SmaⅠ
Sau3AⅠ
识别位点及切割位点
—G↓GATCC—
—T↓GATCG—
—CCC↓GGG—
—↓GATC—
(3)将转化后的大肠杆菌接种在
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含 的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用
的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如下图， 号菌落的质粒很可能是含目的基因的重
组质粒。
注：M 为指示分子大小的标准参照物；小于0.2kb 的DNA 分子条带未出现在图中
(4)已知凝乳酶第20、24 位氨基酸变成半胱氨酸，其活性可显著提高。科研人员希望运用蛋白质工程技术
获得活性更强的凝乳酶，请选用合适的措施编号并排序： 。（用箭头表示）
①重组DNA 分子导入大肠杆菌
②随机改变凝乳酶基因的序列
③分析突变蛋白功能，设计结构
④改变凝乳酶基因的特定序列
⑤培养细胞后提纯突变蛋白
⑥将改变后的凝乳酶基因与质粒重组
【答案】(1)特异性降低
(2) BclⅠ和SmaⅠ 有相同的黏性末端可发生碱基互补配对 遗传信息的传递都遵循中心法则或
生物界共用一套遗传密码
(3) 四环素 2
(4)③→④→⑥→①→⑤
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）引物与模板之间遵循碱基互补配对原则，若引物太短则特异性降低。
（2）基因表达载体构建时，需要将目的基因和运载体切出相同的黏性末端，图示BamHⅠ会破坏目的基因，
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故对质粒进行切割时，选用的两种酶为BclⅠ和SmaⅠ。目的基因和质粒能连接成重组质粒的原因是有相同的
黏性末端可发生碱基互补配对，导入的目的基因在受体细胞中能成功表达的理论基础是遗传信息的传递都
遵循中心法则或生物界共用一套遗传密码。
（3）图中构建目的基因表达载体时，氨苄青霉素抗性基因被限制酶破坏，故将转化后的大肠杆菌接种在
四环素的培养基上进行培养及筛选；如果用BclⅠ和SmaⅠ两种酶切割重组质粒，电泳后将获得分别含有质
粒和目的基因的两条条带，2、3 含有两条条带，2 中其中一条条带为1.5kb，3 中其中一条条带为1kb，由
于牛凝乳酶的基因大小为1.5kb，所以对应电泳图是菌落2 很可能是含目的基因的重组质粒。
（4）蛋白质工程的过程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应
的脱氧核苷酸序列（基因），其前提是基因工程，故运用蛋白质工程技术从大肠杆菌中获得活性更强的凝
乳酶，具体过程为：③分析突变蛋白功能，设计结构→④改变凝乳酶基因的特定序列→⑥将改变后的凝乳
酶基因与质粒重组→①重组DNA 分子导入大肠杆菌→⑤培养细胞后提纯突变蛋白。
5．猕猴桃溃疡病是一种严重影响猕猴桃产量的细菌性病害。为获得抗猕猴桃溃疡病的转基因猕猴桃，科
研人员以猕猴桃的愈伤组织（对卡那霉素敏感）为转基因受体，通过农杆菌转化法将抗菌肽基因导入猕猴
桃。图1 表示抗菌肽基因和卡那霉素抗性基因（nptⅡ基因）及其上限制酶酶切位点的分布情况，图2 表示
Ti 质粒及其上限制酶酶切位点的分布情况。回答下列问题：
(1)限制酶能识别双链DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的 断
裂。限制酶主要来源于原核生物，但不会切割原核生物自身的DNA 分子，推测原因是 。目的基因
可随T-DNA 整合到目的细胞的染色体DNA 上，这体现了 的生物学变异原理。
(2)若只用EcoRI 切割目的基因和Ti 质粒，会产生多种连接产物。为筛选出含有目的基因正向连接的重组Ti
质粒的菌株，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到了①②③三类菌落，其生长情况如下表，“+”表
示生长，“-”表示不生长。根据表中结果判断，应选择的菌落是 （填表中序号），菌落②的导入情况
是 。
项目
①
②
③
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无抗生素
+
+
+
卡那霉素
-
-
+
氨苄青霉素
-
+
+
卡那霉素+氨苄青霉素
-
-
+
(3)若既要避免上述多种连接情况的发生，又要使目的基因最终能整合到猕猴桃愈伤组织细胞的染色体
DNA 上，最好选择限制酶 对目的基因和Ti 质粒进行切割。
【答案】(1) 磷酸二酯键 原核生物的DNA 分子上没有该限制酶的识别序列(或识别序列被修饰，
使限制酶不能将其切开) 基因重组
(2) ③ 导入不含目的基因的Ti 质粒(自身环化的Ti 质粒)(或导入目的基因反向连接的重组Ti 质粒)
(3)KpnI 和PstI
【分析】 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA 重组和转基因技术，赋予生物
以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品．基因工程是在DNA 分子水平上进
行设计和施工的，又叫做DNA 重组技术。
【详解】（1）限制酶能识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核
苷酸之间的磷酸二酯键断开。由于限制酶来源于原核生物，可能 原核生物的DNA 分子上没有该限制酶的
识别序列(或识别序列被修饰，使限制酶不能将其切开)，所以限制酶不能将原核生物的DNA 切开。目的基
因可随T-DNA 整合到目的细胞的染色体DNA 上，这属于基因重组。
（2）从图1 和图2 看出，用EcoRI 切割目的基因和Ti 质粒，目的基因上有卡那霉素抗性基因，质粒上有
氨苄青霉素抗性基因，二者重组后，对氨苄青霉素和卡拉霉素都有抗性，所以应该选择③，菌落②对卡拉
霉素不具抗性，但抗氨苄青霉素，应该导入不含目的基因的Ti 质粒。
（3）为避免质粒或目的基因自身连接，根据质粒和目的基因的限制酶分布情况，可以选择KpnI 和PstI
（二者形成的粘性末端不同，且在质粒和目的基因上都有该酶的酶切位点）。
6．CRISPR-Cas12a 系统是第二类用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR-Cas 系统，该系统主要包含crRNA 和
Cas12a 蛋白两部分，crRNA 能特异性识别并结合特定的DNA 序列，从而引导Cas12a 蛋白到相应位置剪切
DNA。某科研团队基于CRISPR-Cas12a 系统对宫颈癌细胞中的KIFC1 基因进行敲除，来探讨KIFCI 基因
在宫颈癌细胞中的功能及对宫颈癌HeLa 细胞增殖的影响。
(1)在CRISPR-Cas12a 系统中，crRNA 的序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含
种核苷酸；细菌细胞中的 也能起到类似Cas12a 蛋白的作用。若要将KIFCI 基因从目标DNA 上
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剪切下来，需要设计 种crRNA。
(2)为保证目的基因与PX458 质粒正确连接，在扩增目的基因时，应在引物端加入相应的限制酶序列，其中
P1 的碱基序列为5′ 3′（写出前9 个碱基）。采用PCR 技术对一个DNA 进行扩增时，第n 次循
环共需要引物 个。
(3)
在目的基因
与PX458 质粒连接时，可用 （填“E.coliDNA 连接酶”或“T4DNA 连接酶”）进行连接。
(4)将crRNA-Cas12a 重组载体成功转染至HeLa 细胞，与对照组相比，实验组中KIFCl 蛋白表达量如图2 所
示，细胞数目的变化如图3 所示，由此可得出的结论是 ，判断依据是 。
【答案】(1) 8/八 限制酶（限制性内切核酸酶） 2/二/两
(2) CAGCTGCTC 2n
(3)T4DNA 连接酶
(4) KIFC1 基因可以促进HeLa 细胞的增殖 敲除细胞株中KIFC1 蛋白表达量明显下降，证明HeLa
细胞KIFC1 基因敲除成功：KIFCl 敲除组细胞数目显著低于对照组，表明KIFC1 敲除可使HeLa 细胞增殖
能力下降
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选和获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR
技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、
启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一
样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细
胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检
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测与鉴定：分子水平上的检测：个体水平上的鉴定。
【详解】（1）在CRISPR-Cas12a 系统中，crRNA 的序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域既
有DNA 也有RNA，故最多有种核苷酸（4 种脱氧核苷酸和4 种核糖核苷酸）；Cas12a 蛋白可以到相应位
置剪切DNA，其作用相当于限制酶；若要将KIFCI 基因从目标DNA 上剪切下来，需要有两个切口，而
crRNA 的识别具有特异性，故需要2 种crRNA。
（2）扩增目的基因时，应在引物端加入相应的限制酶序列，引物需要与模板链的3'端结合，按照碱基互补
配对原则保证子链从5'向3'延伸，结合图示可知，P1 的碱基序列为5′CAGCTGCTC3′；一个DNA 分子有两
条链，第n 次复制形成2n 个DNA，相当于新合成2n-1 个DNA 分子，合成一个DNA 分子需要两个引物，
因此需要的引物数目为2n-1×2=2n 个。
（3）T4DNA 连接酶可连接黏性末端和平末端，故在目的基因与PX458 质粒连接时，可用T4DNA 连接酶
连接。
（4）结合图示可知，敲除细胞株中KIFC1 蛋白表达量明显下降，证明HeLa 细胞KIFC1 基因敲除成功：
KIFCl 敲除组细胞数目显著低于对照组，表明KIFC1 敲除可使HeLa 细胞增殖能力下降，据此可知，KIFC1
基因可以促进HeLa 细胞的增殖。
7．人体白细胞中的干扰素基因能特异性表达产生干扰素，干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，
在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病，对治疗乳腺癌、淋巴癌、多发骨髓瘤和某些白血病等也有一定
的疗效。干扰素基因两端的碱基序列如下图所示，表中为常见的几种限制酶及碱基识别序列。请回答下列
问题：
限制
酶
识别序列
Apal
5'GGGCC'C3'
BamHl
5'G`GATCC 3'
Hindlll
5'A`AGCTT3'
Sacl
5'GAGCT'C3'
EcoRl
5'G'AATTC3'
xhol
5'C'TCGAG3'
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(1)干扰素除了对乳腺癌、淋巴癌、多发骨髓瘤和某些白血病等有一定的疗效，还可用于治疗慢性乙型肝炎、
慢性丙型肝炎，其理论依据是 。
(2)传统生产干扰素往往是从人体的 细胞内提取，但产量很低。1993 年，我国批准并以侯云德院士为
首的研究人员，成功研制出我国第一个基因工程药物——重组人干扰素 α-1b，该基因工程操作中，需要用
相同的限制酶切割干扰素基因和质粒，表中合适的限制酶是 ，选择的理由是 。
(3)干扰素在体外保存相当困难，如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸（密码子：UGU、UGC）变成丝氨酸
（密码子: UCU、UCC、UCA、UCG），可在-70℃的条件下保存半年。请依据蛋白质工程的基本原理，设
计最为简单的方案，获取能在体外保持的干扰素，写出简要的设计思路 。
【答案】(1)慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎都是病毒引起，而干扰素能够干扰病毒复制，控制肝炎病毒在细
胞内的扩增
(2) 白 BamHl、 EcoRl 上表所给酶中只有 BamHl、EcoRl 的碱基识别序列与干扰素基因端
部的碱基序列相同，用这两种酶才能切割出完整的干扰素基因，同时在质粒上切出相同的粘性末端便于与
干扰素基因结合
(3)将干扰素基因编码半胱氨酸相应位点的碱基对 G//C 替换为 C//G，然后让修饰过的基因转录获得
mRNA，进一步翻译获得多肽链，最后空间折叠获取能够在体外保存的干扰素
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最
有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与
鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②
检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技
术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）干扰素还可用于治疗慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎，原因是慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎
都是病毒引起，而干扰素能够干扰病毒复制，控制肝炎病毒在细胞内的扩增。
（2）传统生产干扰素往往是从人体的白细胞内提取，但产量很低。基因工程操作中，需要用相同的限制
酶切割干扰素基因和质粒，表中合适的限制酶是BamHl、 EcoRl，理由是上表所给酶中只有 BamHl、
EcoRl 的碱基识别序列与干扰素基因端部的碱基序列相同，用这两种酶才能切割出完整的干扰素基因，同
时在质粒上切出相同的粘性末端便于与干扰素基因结合。
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（3）依据蛋白质工程的基本原理，获取能在体外保持的干扰素，设计思路为将干扰素基因编码半胱氨酸
相应位点的碱基对 G//C 替换为 C//G，然后让修饰过的基因转录获得 mRNA，进一步翻译获得多肽链，
最后空间折叠获取能够在体外保存的干扰素。
8．过度饮酒可能会导致人体的健康问题，据此科研人员展开了相应的研究。
(1)肝脏是酒精的主要代谢场所，酒精的代谢途径如图所示：
在缺少糖原的条件下， 菌也可发生上图的代谢过程。服用头孢类药物后饮酒会造成乙醛中毒，推测
这是因为头孢类分子可抑制 活性。
(2)最近研究人员构建了一种含hADH1B 基因(乙醇脱氢酶基因)的工程益生菌，服用益生菌可加速肠道内的
酒精分解。该基因工程益生菌构建过程如图甲：
限制酶名称
识别序列和切割位点
BamH Ⅰ
G↓GATCC
EcoR Ⅰ
C↓AATTC
Sma Ⅰ
CCC↓GGG
①分析表、图
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甲，应选用 酶切割质粒和hADH1B 基因片段。
②依据图乙中的原理，用碱性磷酸单酯酶处理酶切后的质粒(使
﹣P 变成
﹣OH)，这样可防止质粒的
。
③若将上述处理后的质粒与酶切后的hADH1B 基因片段连接，由于
﹣OH 与
﹣OH 不能连接而形成2 个
切口的重组DNA。设计合理的引物进行PCR，至少扩增 轮后，再通过DNA 连接酶处理可获得无切
口的环状重组DNA(基因表达载体)。
④但上述实验不能避免目的基因的反向连接，请补充下面的实验方案，确定出目的基因的连接方向。
实验方案：先将基因表达载体进行EcoR Ⅰ的单酶切，然后通过 电泳分离鉴定。
预期结果：若出现 bp 的条带和 bp 的条带，则目的基因反向连接；若出现 bp 的条带和
bp 的条带，则目的基因连接正确。
【答案】(1) 醋酸 乙醛脱氢酶
(2) SmaⅠ 自身环化 2 琼脂糖凝胶 220 1700 420 1500
【分析】基因表达载体是载体的一种，包括目的基因、标记基因、启动子和终止子。
【详解】（1）在缺少糖原的条件下，醋酸菌也可代谢产乙酸。据图所示，当乙醛脱氢酶活性受到抑制时，
会造成乙醛中毒，所以可推测头孢类分子抑制了乙醛脱氢酶的活性。
（2）①BamHⅠ会切割质粒的标记基因，EcoRⅠ会切割目的基因，故使用SmaⅠ切割。
②碱性磷酸单酯酶处理酶切后的质粒的末端5′−OH 与正常存在的3′−OH 不能连接，故可以防止质粒自身环
化。
③当PCR 进行2 轮后，可得到双链都为5′−P 的双链DNA，通过DNA 连接酶处理可获得无切口的环状重组
DNA。
④通过图甲可推导出，正向连接会酶切出420bp 和1500bp 大小的条带，反向连接会酶切出220bp 和1700bp
大小的条带，所以若将。基因表达载体进行EcoR Ⅰ的单酶切，然后通过琼脂糖凝胶电泳电泳，若出现
420bp 和1500bp 大小的条带，则为正向连接，反之，若出现220bp 和1700bp 大小的条带，则为反向连接。
9．日常生活中产生的厨余垃圾含有大量有机物，极易腐败发酸发臭、滋生有害生物，若收集转运过程中
发生泄漏则会污染空气、土壤及水源。科研人员从绿色木霉中获得了纤维素内切葡聚糖酶基因EGⅢ，并
将其导入毕赤酵母中，构建出了基因工程菌（流程如图所示），实现了高效降解厨余垃圾中纤维素的目的。
请据图回答下列问题：
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注：图中BamHⅠ、EcoRⅠ、SalⅠ为限制酶
(1)为了构建基因表达载体，应该选择 （填限制酶）切割目的基因和质粒DNA，基因表达载体中含有
启动子和终止子等成分，启动子的作用是 。将重组质粒导入大肠杆菌中的方法是 。
(2)图中步骤1 将重组质粒导入大肠杆菌的目的是 ，不直接利用大肠杆菌生产纤维素内切葡聚糖酶的
原因可能是 。
(3)为确认转化是否成功，将转化毕赤酵母接种在含 的培养基中培养，一段时间后获得的单菌落即为
含有EGⅢ基因的基因工程菌。
(4)堆肥法是厨余垃圾资源化利用常用的方法之一，与传统堆肥法（利用自然环境存在的微生物分解有机
物）相比，加入以上基因工程菌的堆肥方法有哪些优点： （写出两点即可）。
【答案】(1) BamHI、SalI RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 钙离子
处理法
(2) 大量扩增含目的基因的重组质粒 目的基因是真核生物基因，需要在真核生物体内表达
(3)纤维素
(4)高效率的降解纤维素，实现对废物的重新利用，减小环境污染
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导
入受体细胞；目的基因的检测与表达。
【详解】（1）为避免自身环化和反向连接，在构建基因表达载体时，最好选择两种酶，图中EcoRI 会破
坏目的基因，BamHI、SalI 刚好可以切目的基因两端，且载体的上也有这两个限制酶的切割位点，故应该
用BamHI、SalI 切割。基因表达载体中含有启动子和终止子等成分，启动子的作用是RNA 聚合酶识别和
结合的部位，驱动基因转录出mRNA。将重组质粒导入大肠杆菌中的方法是钙离子处理法。
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（2）图中步骤1 将重组质粒导入大肠杆菌后，就会在大场杆菌体内复制，产生大量重组质粒，即大量扩增
重组质粒。由于目的基因是真核生物基因，需要在真核生物体内表达，而大肠杆菌是原核生物，所以还需
要转化到酵母菌细胞内。
（3）确认目的基因是否转化成功，就是检验一下毕赤酵母能不能表达出能够降解纤维素的物质，即将其
接种在含有纤维素的培养基上培养。
（4）和普通的微生物相比，基因工程菌能高效率的降解纤维素，实现对废物的重新利用，减小环境污染。
10．土壤盐渍化会影响水稻生长发育，研究人员将水稻耐盐碱基因OsMYB56 导入不耐盐碱水稻品种吉粳
88 中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图所示，其中TetR为四环素抗性基因，
AmpR为氨苄青霉素抗性基因，①~⑤表示操作过程。回答下列问题：
限制酶
BanHI
BclI
SmaI
Sau3AI
识别位点及切割位点
－G↓GATCC－
－T↓GATCA－
－CCC↓GGG－
－↓GATC
－
(1)为了防止质粒自身环化，保证OsMYB56 基因和酶切后的质粒定向连接，在目的基因复制前，设计PCR
引物时最好在引物的 端添加含有限制酶 的识别序列。根据上图信息可知，设计的引物序列
一种是5'－CCCGGGTCTGTTGAAT－3'，另一种是 （共写出16 个碱基的序列）。
(2)过程②中需要先用 处理根瘤农杆菌，使根瘤农杆菌处于 的状态，以便将基因表达载体导
入细胞。
(3)过程③中利用了质粒中的T－DNA 的特点；过程④中，从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素
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主要有生长素和 ，该过程还需要光照，其作用是 （答出1 点）。
【答案】(1) 5' BclI 和SmaI 5'－TGATCACTTGGATGAT－3'
(2) Ca2＋（或CaCl2） 能吸收周围环境中的DNA 分子
(3) 可转移至受体细胞，并将其整合到受体细胞的染色体DNA 上 细胞分裂素 诱导叶绿素的
形成，满足叶绿体利用光能制造有机物的需要
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最
有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与
鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因－DNA 分子杂交技术；②
检测目的基因是否转录出了mRNA－分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原－抗体杂交
技术。
【详解】（1）在设计PCR 引物时最好在引物的5'端添加含有限制酶的识别序列；据图可知，质粒中的两
个标记基因TetR 和AmpR 中都含有限制酶BamHI 的识别序列，如果用限制酶BamHI，会破坏质粒中的两
个标记基因，为防止质粒自身环化，保证OsMYB56 基因和酶切后的质粒定向连接，需要用两种酶，因此
过程①可以选择限制酶BclI 和SmaI；DNA 分子由2 条链构成，每一条链都有3'端与5'端，羟基端为3'端，
磷酸基团的末端为5'端，因此OsMYB56 基因游离的磷酸基团侧为5'端，羟基端为3'端。根据图中
OsMYB56 基因两端序列可知，设计的引物序列是5'－CCCGGGTCTGTTGAAT－3'和5'－
TGATCACTTGGATGAT－3'。
（2）过程②中需要先用Ca2+处理根瘤农杆菌，使根瘤农杆菌处于能吸收周围环境中的DNA 分子的状态，
以便将基因表达载体导入细胞。
（3）T－DNA 具有可转移至受体细胞，并将其整合到受体细胞的染色体DNA 上的特点，③中利用了质粒
中的T－DNA 的特点，愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素主要有生长素和细胞分裂素。光照能诱导叶
绿素的形成，满足叶绿体利用光能制造有机物的需要，该过程中还需要光照条件。
11．为研究干旱胁迫基因LEA 和VOC 对甘蓝型油菜油脂的积累机制，科研人员构建了两个基因表达载体。
其中基因LEA 与荧光素酶基因（Luc）构建成基因表载体甲，基因VOC 和标记基因构建成基因表达载体乙，
相关序列及酶切位点如图所示。
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(1)利用PCR 扩增LEA 基因时，需要在反应体系中添加的有机物质有引物、模板、4 种脱氧核苷酸、 ，
还需要在引物的 （填“3'端”或“5'端”）添加限制酶识别序列，添加序列对应的限制酶是 。
(2)为了构建基因表达载体甲，依据图中已知碱基序列，在PCR 扩增仪中加入的引物的碱基序列为 ，
扩增 代后会得到等长的8 条DNA 片段。
(3)农杆菌转化甘蓝型油菜细胞时，T—DNA 的作用是 ，该过程发生的变异类型为 。
(4)乙酰-CoA 羧化酶基因（AC）是油脂合成过程的关键酶基因，甘油三酯酯酶基因（ATGL）是油脂分解
过程的关键酶基因。将基因表达载体甲、乙分别导入植物细胞培养成转基因植物A、B，在干旱胁迫的环
境下培养两种转基因植物和正常植物，分别检测植物体内AC 和ATGL 基因的表达水平，结果如下图。
正常植株
转基因A 植株
转基因B 植株
AC 酶
ATGL 酶
①在分子水平上，用 方法检测AC 酶和ATGL 酶的含量可得到上述结果。
②基于以上研究，干旱胁迫基因LEA 和VOC 在甘蓝型油菜油脂积累中的机制是 。
【答案】(1) 耐高温的DNA 聚合酶 5'端 EcoRV 和XbaⅠ
(2) 5'—GATATCATGGGC—3'和5'—TCTAGACTAGTG—3' 4/四
(3) 携带目的基因进入受体细胞并将其整合到受体细胞的染色体DNA 上 基因重组
(4) 抗原—抗体杂交 在干旱胁迫的环境下，LEA 通过促进AC 的表达使植物油脂增加；VOC 通过
抑制ATGL 的表达减弱油脂的降低
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：目的基因的获取，基因表达载体的构建，将目的基因导
入受体细胞，目的基因的检测与表达。
【详解】（1）利用PCR 扩增LEA 基因时，需要在反应体系中添加的有机物质有引物、模板、4 种脱氧核
苷酸和耐高温的DNA 聚合酶。耐高温的DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3'端延伸
DNA 链，因此PCR 扩增需要引物。引物与目的基因所在DNA 分子遵循碱基互补配对原则，所以扩增LEA
基因时，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。由于Luc 中存在BamH I 识别序列，BamH I 会将Luc
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切断，一种酶切会导致载体、LEA 自身环化及LEA 反向连接等，因此选择的限制酶是EcoR V 和Xba I。
（2）根据已知序列，由于引物只能引导子链从5'→3'延伸，根据碱基互补配对原则，用PCR 扩增时的两个
引物对应的序列为:5'-GATATCATGGGC-3'和5'-TCTAGACTAGTG-3'。PCR 要得到等长的片段至少需要进行
3 轮循环，等长片段的数量为2n-2n，要得到等长的8 条DNA 片段，则2n-2n=8，n=4，故应该扩增4 次。
（3）农杆菌转化甘蓝型油菜细胞时，T-DNA 的作用是携带目的基因进入受体细胞并将其整合到受体细胞
的染色体DNA 上，该过程发生的变异类型为基因重组。
（4）①检测酶(蛋白质)分子水平上采用抗原-抗体杂交技术进行检测。②根据检测结果，转基因A 植株的
AC 酶变高了，B 的ATGL 酶变低了，可以推测在干旱胁迫的环境下，LEA 通过促进AC 的表达使植物油脂
增加；VOC 通过抑制ATGL 的表达减弱油脂的降低。
12．基因工程是花卉培养中的一种重要技术手段，这能够培养出不少新品种的花卉。如图为利用矮牵牛花
中编码3，5－羟氧化酶的基因（HE）改造玫瑰，培育能够产生蓝色花冠玫瑰的新品种的技术流程图。图
中TetR、AmpR、NPTⅡ分别表示四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、氨基糖苷类－3－磷酸转移酶基
因。请分析回答下列问题：
(1)基因工程的核心步骤是 。
(2)从矮牵牛花细胞中获得目的基因后，对其扩增的技术叫 ，这种技术手段需要用到的一种特
殊工具酶是 。若初始加入1 个目的基因，则历经4 次PCR 循环需要消耗引物数量为
个。
(3)根据图示分析，为了便于后期筛选成功导入大分子A 的农杆菌，选择的限制酶的种类是 ，
农杆菌侵染玫瑰茎尖愈伤组织细胞后在转化过程中表现出的特点是 。
(4)构建基因表达载体时，一般将目的基因插在启动子和终止子之间，其中启动子的作用是作为
酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类所需蛋白质。
(5)成功导入大分子A 的农杆菌在含四环素培养基、含氨苄青霉素培养基、同时含两种抗生素的培养基上的
生存状况应是 。
(6)检测HE 是否成功插入到染色体DNA 上，检测方法是采用 。
【答案】(1)基因表达载体的构建
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(2) PCR Taq DNA 聚合酶（或耐高温的DNA 聚合酶） 30
(3) Sal Ⅰ、EcoR Ⅰ 能将Ti 质粒上的T-DNA 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色
体DNA 上
(4)RNA 聚合
(5)能在含氨苄青霉素的培养基上生存，但是不能在含四环素培养基和同时含两种抗生素的培养基上生存
(6)PCR 技术
【分析】基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→基因表达载体的构建（基因工程的核心）→将目的
基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符
合人们需要的新的生物类型和生物产品。在转基因操作过程中，其核心步骤是基因表达载体的构建。
（2）对目的基因进行扩增的技术叫PCR，中文名称是聚合酶链式反应。因为该技术在较高的温度下进行，
因此需要用到一种特殊的工具酶，即耐高温的DNA 聚合酶，即Taq DNA 聚合酶。若初始加入1 个目的基
因，则历经4 次PCR 循环可形成16 个DNA 分子，其中原有2 条母链的没有引物，其余子链都有引物，故
需要消耗引物数量为15×2 = 30 个。
（3）为了防止破坏目的基因，不能选择BamH I，则适合的酶切位点为EcoR Ⅰ、Sal I 或Pst Ⅰ、Sal I，如果
以Pst Ⅰ、Sal I 作为酶切位点，则TetR 和AmpR 都会被破坏，若以EcoR Ⅰ、Sal I 为酶切位点，破坏了
TetR，但保留了AmpR 抗性基因，所以选择EcoR Ⅰ、Sal I 为酶切位点。农杆菌细胞内含有Ti 质粒，当它侵
染植物细胞后，能将 Ti 质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞
的染色体DNA 上。
（4）启动子是一段有特殊序列结构的DNA 片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA 聚
合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
（5）由于在该过程中四环素抗性基因被破坏，而氨苄青霉素抗性基因正常，故成功导入大分子A 的农杆
菌在含四环素培养基、含氨苄青霉素培养基、同时含两种抗生素的培养基上生存状况应该是能在含氨苄青
霉素的培养基上生存，但是不能在含四环素培养基和同时含两种抗生素的培养基上生存。
（6）目的基因是否成功插入到宿主细胞的染色体DNA 上，可采用PCR 技术进行检测。
13．抗除草剂转基因作物的推广可有效减轻除草劳动强度、提高农业生产效率。图1 为抗除草剂转基因玉
米的技术流程，报告基因GUS 只能在导入真核细胞后正确表达，在农杆菌中不能正确表达。报告基因
GUS(含有内含子)，表达产物能催化无色物质K 呈现蓝色。
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(1)基因工程的原理是 ，基本操作步骤有 。
(2)科研人员研发了新的DNA 重组方法——无缝克隆In-Fusion 技术，如图2 所示。In-Fusion 酶能够识别任
何具有相同15bp 末端序列的线性DNA 分子并使其形成黏性末端，据此实现目的基因和载体的连接。和传
统方法比，无缝克隆In-Fusion 技术的优点是 。
(3)农杆菌转化愈伤组织时，常用含除草剂的选择培养基筛选转化的愈伤组织。由于愈伤组织表面常残留农
杆菌，导致未成功转化的愈伤组织也可能在选择培养基上生长。针对上述现象，可以在选择培养基中同时
加 进行筛选，其中周围的培养基 （“显”或“不显”）蓝色的愈伤组织是转化成功的，原因是
。
【答案】(1) 基因重组 目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞，
目的基因的检测与鉴定
(2)插入位点不受限制酶识别序列限制，实现了目的基因在载体任意位点上的插入
(3) 无色物质K 显 转化成功的愈伤组织中，GUS 基因能正确表达，表达产物能催化培养基
中的无色物质K 呈现蓝色；农杆菌中的GUS 基因不能正确表达，不能催化培养基中的无色物质K 呈现蓝
色
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
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（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符
合人们需要的新的生物类型和生物产品，其基本原理是基因重组，基本操作步骤有目的基因的筛选与获取、
基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。
（2）分析题意可知，无缝克隆In-Fusion 技术的插入位点不受限制酶识别序列限制，实现了目的基因在载
体任意位点上的插入，因此和传统方法比，无缝克隆In-Fusion 技术更具优势。
（3）已知报告基因GUS 表达产物能催化无色物质K 呈现蓝色，转化成功的愈伤组织中，GUS 基因正确表
达，表达产物能催化培养基中的无色物质K 呈现蓝色；农杆菌中的GUS 由于含有内含子转录序列不能切
除，不能正确表达，不能催化培养基中的无色物质K 呈现蓝色，故未转化愈伤组织可能在选择培养基上生
长，但不能催化无色物质K 呈现蓝色，可以用无色物质K 处理愈伤组织，呈现蓝色的就是转化成功的愈伤
组织。
14．党的二十大对保障粮食安全提出了更高要求，马铃薯块茎富含淀粉，而且其中的维生素是所有粮食中
最全的，因此我国科学家对马铃薯这种重要粮食作物开展了大量研究。马铃薯因为自交不亲和，所以只能
进行无性繁殖，我国科学家用CRISPR/Cas9 基因编辑技术定点敲除二倍体马铃薯的自交不亲和基因获得了
二倍体自交系的马铃薯。如图所示：
(1)该技术利用一段与靶序列互补的向导RNA 引导Cas9 蛋白对特异靶向DNA 进行识别和定点敲除自交不
亲和基因，其中的Cas9 蛋白相当于 酶，若要将自交不亲和基因从目标DNA 上切除下来，需要设计
种不同的向导RNA。若靶序列为5'-AGCAT……GTACCT-3'，则设计的向导RNA 中相应的序列应为 。
(2)MAP30 蛋白是一种能使I 型核酸核糖体失活的蛋白质，实验表明MAP30 蛋白具有抗pvx 病毒功能，为
培育高效表达该基因的马铃薯新品种，科研团队利用农杆菌转化法将MAP30 基因导入马铃薯细胞内，如
图所示：
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①选择Ti 质粒做载体的原因是 ，构建基因表达载体时为避免反向拼接应选择 识别切割质粒，再用
连接。
②个体水平上，可通过 的方法检测转基因马铃薯是否具有抗病毒的特性，具体做法是 。
【答案】(1) 限制 2 3'-UCGUA……CAUGGA-5'
(2) Ti 质粒上的T-DNA 可转移到受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 上 Xbal 和Hindlll
DNA 连接酶 接种感染 向转基因马铃薯植株和非转基因马铃薯植株接种pvx 病毒，观察并对比它
们的感染情况
【分析】1、由图可知，CRISPR/Cas9 基因编辑技术可以定点敲除目标基因。向导RNA 是一条单链RNA，
能够引导Cas9 蛋白到一个特定的基因位点进行切割。2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：
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构建基因文库获取目的基因、利用PCR 技术扩增和人工合成法。（2）基因表达载体的构建：是基因工程
的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细
胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、和花粉
管通道法。农杆菌细胞内含有Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti 质粒上的T-DNA（可转移的DNA）
转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA 上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基
因插入Ti 质粒的T-DNA 中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。将目的基因导入
动物细胞最有效的方法是显微注射法，将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基
因的检测与鉴定： 分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。
【详解】（1）识图分析可知，向导RNA 引导Cas9 蛋白对特异靶向DNA 进行识别和定点敲除自交不亲和
基因，Cas9 蛋白能够切割DNA，断裂的是磷酸二酯键，因而Cas9 蛋白具有类似限制酶的作用。根据题图
及题干信息，向导RNA 的识别序列是单链RNA 序列，能够利用碱基互补配对原则，进行特异性识别目标
DNA 的作用，因而必须根据靶（目标）基因的序列（自交不亲和基因序列）来设计2 种不同的向导
RNA。若靶序列为5'-AGCAT……GTACCT-3'，则根据碱基互补配对原则，设计的向导RNA 中相应的序列
应为3'-UCGUA……CAUGGA-5'。
（2）①利用农杆菌转化法可以将目的基因导入马铃薯细胞内，农杆菌中含有Ti 质粒，在Ti 质粒中含有T-
DNA，即可转移的DNA，选择Ti 质粒做载体可以将目的基因插入到T-DNA 中，Ti 质粒上的T-DNA 可转
移到受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA 上。构建基因表达载体时需要将目的基因插入到Ti 质
粒的T-DNA 中，为避免目的基因与质粒的反向拼接，同时为了避免破坏目的基因并将其插入启动子和终止
子之间，应选择XbaI 和HindIII 两种限制酶，再用DNA 连接酶连接。②检测转基因马铃薯是否具有抗病毒
的特性，在个体水平上可以用接种感染法。向转基因马铃薯植株和非转基因马铃薯植株接种pvx 病毒，观
察并对比它们的感染情况，如果转基因表达成功，那么病毒对转基因马铃薯几乎没有影响。
15．自然条件下，受伤的植物组织会释放一些酚类物质，使农杆菌趋化性地集中并吸附在受伤组织表面，
酚类物质可激活并诱导农杆菌中Ti 质粒上的Vir 基因表达。下图1 为根癌农杆菌中野生型Ti 质粒结构示意
图，图2 为农杆菌介导的转基因抗除草剂植物生产一般流程。农杆菌感染植物细胞时，仅质粒上的T-DNA
（含结合的基因）转移到了植物细胞中，只有整合在T-DNA 区域外的基因，才可以在农杆菌中表达，T-
DNA 的基因只有在插入植物基因组后才能激活表达，回答下列问题。
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(1)用野生型Ti 质粒进行转化实验时，获得转化成功的植物愈伤组织，植物细胞快速生长和分裂，产生冠瘿
瘤，但无法分化出植物幼苗，因此农杆菌在用于植物转化时需要对野生型Ti 质粒进行改造，需要敲除野生
型Ti 质粒上的 基因，并添加抗生素抗性基因A、B，这些过程需要用到的工具酶有 。构建
基因表达载体时，用双酶法（两种不同的限制酶）分别切割目的基因和Ti 质粒，目的是 。
(2)植物选择标记基因和细菌选择标记基因在设计时都可以选用抗生素抗性基因，由于选择的对象细胞不同，
抗生素选择培养基中的抗生素类型及其选择机理也有所不同，如下表所示：
选择对象
细胞
抗生素筛选体系
选择机理
农杆菌
卡那霉素
抑制农杆菌的细胞壁的合成，导致不含抗生素抗性基因的农杆菌在培养
基上不能增殖
植物细胞
G418（氨基糖苷类
抗生素）
抑制蛋白质在叶绿体和线粒体中的合成，使植物的光合作用和能量代谢
受到干扰，从而引起植物细胞死亡
根据题干信息分析，图2 中的抗性基因A 和抗性基因B 分别是 、 抗性基因。
(3)转化成功的植物细胞在植物组织培养前还需要在培养基中添加 （填“卡那霉素”“G418”或
“四环素”）进行脱菌处理，消除后续实验中农杆菌带来的影响，经组织培养得到植物幼苗需用
处理进行鉴定筛选出转基因植株。
【答案】(1) 生长素基因和细胞分裂素 限制酶和DNA 连接酶 防止目的基因或质粒的自身环
化及目的基因和质粒的反向连接
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(2) G418（氨基糖苷类抗生素）抗性基因 卡那霉素
(3) 四环素 除草剂
【分析】基因工程基本操作程序：目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的
基因的检测与鉴定。
【详解】（1）T-DNA 转移至植物细胞可使植物产生冠瘿瘤，植物的冠瘿瘤实际上是植物愈伤组织组织的
生长与分裂造成，促进植物组织生长与分裂有关的激素包括生长素与细胞分裂素等，因此农杆菌在用于植
物转化时需要对野生型Ti 质粒进行改造，需要敲除野生型Ti 质粒上的生长素基因和细胞分裂素基因。敲
除基因和添加基因需要限制酶和DNA 连接酶。构建基因表达载体时，用双酶法（两种不同的限制酶）分
别切割目的基因和Ti 质粒，目的是防止目的基因或质粒的自身环化及目的基因和质粒的反向连接。
（2）据图2 可知，抗性基因A 位于T-DNA 中，抗性基因B 位于T-DNA 外，农杆菌体内质粒上的T-DNA
片段具有可转移性，即能够从农杆菌中转移至植物细胞内，并整合到植物细胞的染色体DNA 上，因此植
物细胞的筛选需要抗性基因A，农杆菌的筛选可用抗性基因B，即抗性基因A 是G418（氨基糖苷类抗生
素）基因，抗性基因B 是卡那霉素基因。
（3）据题意可知，农杆菌的质粒上含有G418（氨基糖苷类抗生素）基因和卡那霉素基因，因此能在含
G418（氨基糖苷类抗生素）和卡那霉素培养基中生存，要想消除后续实验中农杆菌带来的影响，转化成功
的植物细胞在植物组织培养前还需要在培养基中添加四环素进行脱菌处理。据题意可知，经组织培养得到
植物幼苗是具有抗除草剂功能，因此需用除草剂处理进行鉴定筛选出转基因植株。
16．虾青素可由β-胡萝卜素在β-胡萝卜素酮化酶（BKT）和β-胡萝卜素羟化酶（CRTR-B）的作用下转化
而来，具有抗衰老、增强免疫、保护心血管等功能，杜氏盐藻是单细胞浮游植物，生长快，易培养，能大
量合成β-胡萝卜素，科研人员将BKT 基因和CRTR-B 基因导入杜氏盐藻，构建杜氏盐藻细胞工厂高效生
产虾青素。
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(1)获取目的基因：雨生红球藻是天然虾青素重要来源，提取雨生红球藻的总 DNA 为 ， 设计特异性
引物扩增 BKT 基因和CRTR-B 基因，此过程需要 酶的催化。
(2)构建转化载体：“无缝克隆法”是构建重组质粒的新方法，指利用同源重组酶将末端具有 一致同源序
列的线性化载体和目的基因连接形成重组质粒，图1 表示利用“无缝克隆法”向质粒中插入抗除草剂基因
的基本过程。
I．PCR 获取抗除草剂基因过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在引物的 端添加对应的同
源序列 。若要确保抗除草剂基因能够从重组质粒中切除，还 需要在基因两侧加入限制酶识别序列，则所
需引物（5，一3，）的序列应为： 。
A．同源序列十特异性扩增引物序列十限制酶识别序列
B．同源序列十限制酶识别序列十特异性扩增引物序列
C．特异性扩增引物序列十限制酶识别序列十同源序列
Ⅱ．科研人员利用“无缝克隆法" 同时将 BKT 基因和CRTR-B 基因插入质粒，形成的重 组质粒对应部位
如图2 所示，推测此过程扩增 BKT 基因所用的引物为 ； 扩 增CRTR-B 基因所用的引物为 ；
Ⅲ．最终形成的重组质粒如图3 所示，其中atpA 启动子和 psbA 启动子均为杜氏盐藻叶 绿体启动子，选
用内源性启动子的目的是 ；
Ⅳ．与传统的酶切法构建重组质粒相比，“无缝克隆法"具备的优势有 。
(3)准备受体细胞：选取初始杜氏盐藻涂布到杜氏盐藻固体培养基进行培养，一段时间后，挑取生长状态良
好的单藻落到杜氏盐藻液体培养基中继续培养，期间可取藻液滴入 ，在显微镜下进行计数，两次培
养的目的分别为 、 。
(4)目的基因导入及相关检测：采用基因枪法将重组质粒导入杜氏盐藻叶绿体，一段时间后，用含 的
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培养基筛选已转化的杜氏盐藻，通过相关技术检测是否成功表达 。
(5)叶绿体转化是植物基因工程的新热点，叶绿体的诸多特点为叶绿体转化提供优势，如叶 绿体基因组小，
功能清晰，使基因操作方便；叶绿体细胞具有自我复制功能，一个植物细 胞可含有多个叶绿体，每个叶
绿体中含有多个基因组，可大大提高 ；另外，叶绿体基因位于细胞质中，可有效避免 。
【答案】(1) 模板 Taq DNA 聚合酶
(2) 5， B ①③/③① ⑥⑧/⑧⑥ 防止基因沉默 ， 确保目的基因能表达 可同
时导入多个外源基因；不受限制酶识别序列的限制 ， 可在载体的任意位点插入目的基因
(3) 血细胞计数板 纯化杜氏盐藻 扩大培养杜氏盐藻
(4) 除草剂 β-胡萝卜素酮化酶和 β-胡萝卜素羟化酶
(5) 目的基因的表达量 基因污染
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）因雨生红球藻是天然虾青素重要来源，是目的基因的来源，故可提取雨生红球藻的总 DNA
为模板，设计特异性引物扩增其 DNA 中的 BKT 基因和CRTR-B 基因，此过程需要 Taq DNA 聚合酶的催
化。
（2）根据题意，“无缝克隆法”是指利用同源重组酶将末端具有一致同源序列的线性化载体和目的基因
连接形成重组质粒。
I 根据 PCR 扩增的原理，在 PCR 过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在5’ 端添加对应的同
源序列；根据题意，若要确保抗除草剂基因能够从重组质粒中切除，则所需引物（5’一 3’）的序列应为
“同源序列十限制酶识别序列十特异性扩增引物序列”。
故选B。
Ⅱ 根据图2 所示，要通过“无缝克隆法”同时将 BKT 基因和CRTR-B 基因插入质粒，则要保证BKT
基因一侧有一致同源序列，另一侧能带上CRTR-B 基因，因此扩增 BKT 基因所用的引物为①③ ； 同理，
扩增CRTR-B 基因所用的引物为⑥⑧。
Ⅲ 启动子是转录的起始信号，选用内源性启动子的目的是防止基因沉默，确保目的基因能表达。
Ⅳ 根据题意，与传统的酶切法构建重组质粒相比，“无缝克隆法”具备的优势是“可同时导入多个外
源基因”“不受限制酶识别序列的限制”“可在载体的任意位点插入目的基因”等。
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（3）因杜氏盐藻是单细胞浮游植物，因此可用血细胞计数板进行显微观察计数；选取初始杜氏盐藻涂布
到杜氏盐藻固体培养基进行培养的目的是纯化杜氏盐藻，挑取生长状态良好的单藻落到杜氏盐藻液体培养
基中继续培养的目的是扩大培养杜氏盐藻。
（4）筛选已转化的杜氏盐藻的培养基是选择培养基，其中含除草剂；再通过抗原—抗体杂交实验检测是
否成功表达 β-胡萝卜素酮化酶和 β-胡萝卜素羟化酶。
（5）因每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高目的基因的表达量；且叶绿体基因位于细胞质中，一
般不能稳定遗传，因此可避免基因污染。
17．研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌，将其添加于饲料中，以提高家禽养殖效率。枯草芽孢杆菌能
分泌一种可降解纤维素的酶，这种酶由W 基因编码。为在乳酸杆菌中表达W 基因，需使用图1 中质粒为
载体，图2 为含W 基因的DNA 片段。
(1)采用 技术可以快速、大量获得W 基因。
(2)启动子是 识别和结合的部位。很多启动子具有物种特异性，在图1 质粒中插入W 基因，其上游启动
子应选择 （填写字母）。
A．枯草芽孢杆菌启动子 B．乳酸杆菌启动子 C．农杆菌启动子
(3)根据图1 和图2，应使用限制酶 切割图2 中含W 基因的DNA 片段，导入质粒以获得能正确表达W
基因的重组质粒。所得重组质粒转化乳酸杆菌后，使用含 的培养基筛选，以得到转入W 基因的乳酸杆
菌。
(4)目的基因导入受体细胞后，常用 技术检测目的基因是否翻译出降解纤维素的酶。
【答案】(1)PCR
(2) RNA 聚合酶 B
(3) EcoR I、Hind Ⅲ 氨苄青霉素
(4)抗原-抗体杂交
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【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动
子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法
是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子
水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②检测目的基
因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水
平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）采用PCR 技术可以快速、大量获得目的基因。
（2）启动子是RNA 聚合酶识别和结合的部位。该基因工程是将枯草芽孢杆菌的W 基因导入乳酸杆菌，想
让W 基因在乳酸杆菌中成功表达，所以应当选择乳酸杆菌启动子，B 正确。
（3）选择限制酶时应当注意：不能破坏目的基因；目的基因首尾都要有切点；质粒要确保至少含有一个
完整的标记基因；质粒上的切点要位于启动子之后、终止子之前；据图分析，Mfe I 会破坏目的基因，
BamH I 会破坏质粒中的启动子，故使用限制酶EcoR I、Hind Ⅲ切割含W 基因的DNA 片段，以获得能正
确表达W 基因的重组质粒。因为构建的基因表达载体只含有标记基因氨苄青霉素抗性基因，所以应使用含
氨苄青霉素的培养基进行筛选。
（4）目的基因导入受体细胞后，由于纤维素酶的化学本质是蛋白质，因此为了检测目的基因是否翻译出
降解纤维素的酶，常用抗原-抗体杂交技术检测。
18．土壤盐渍化会影响水稻生长发育，研究人员将水稻耐盐碱基因OsMYB56 导入不耐盐碱水稻品种吉粳
88 中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图所示，其中TetR为四环素抗性基因，
AmpR中为氨苄青霉素抗性基因，①～⑤表示操作过程。回答下列问题：
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限制酶
BamHⅠ
BclⅠ
SmaⅠ
Sau3AⅠ
识别位点及切割位点
-G↓GATCC-
-T↓GATCA-
-CCC↓GGG
-↓GATC-
(1)在构建基因表达载体时，为防止目的基因和质粒的自身环化，最好使用 （填“1 种”或“2 种”）
限制酶，由图表可知，使用的限制酶是 。
(2)过程②中需要先用 处理根瘤农杆菌，使根瘤农杆菌处于 （填生理状态），以便将基因表达载体
导入细胞。
(3)过程③中利用了质粒中的T-DNA 的特点过程④中，从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素主要有
生长素和 ，该过程还需要光照，其作用是 （答出1 点）。
【答案】(1) 2 种 BclⅠ和SmaⅠ
(2) Ca2+（或CaCl2） 感受态（或能吸收周围环境中的DNA 分子的状态）
(3) 可转移至受体细胞，并将其整合到受体细胞的染色体DNA 上 细胞分裂素 诱导叶绿素的
形成，满足叶绿体利用光能制造有机物的需要
【分析】基因工程基本操作程序：目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的
基因的检测与鉴定。
【详解】（1）据图可知，质粒中的两个标记基因TetR 和AmpR 中都含有限制酶BamHⅠ的识别序列，如果
用限制酶BamHⅠ，会破坏质粒中的两个标记基因，为防止质粒自身环化，保证OsMYB56 基因和酶切后的
质粒定向连接，需要用两种酶，因此过程①可以选择限制酶BclⅠ和SmaⅠ。
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（2）过程②中需要先用Ca2+处理根瘤农杆菌，使根瘤农杆菌处于能吸收周围环境中的DNA 分子的状态，
以便将基因表达载体导入细胞。
（3）农杆茵细胞内含有Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti 质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被
侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA 上，因此质粒中的T-DNA 具有可转移至受体细胞，并
将其整合到受体细胞的染色体DNA 上的特点。根据农杆菌的这种特点，如果将目过程④中，从愈伤组织
到幼苗的培养过程需要的激素主要有生长素和细胞分裂素。光照能诱导叶绿素的形成，满足叶绿体利用光
能制造有机物的需要，该过程中还需要光照条件。
19．二苯乙烯苷是我国传统药材何首乌特有的药效成分，具有抗氧化、清除自由基等功效。合成二苯乙烯
苷的关键酶是芪合酶（STS），为获得大量的STS，研究人员利用质粒（如图2）将STS 基因（如图1）转
化到大肠杆菌细胞内进行表达。回答下列问题：
(1)利用PCR 扩增STS 基因时应选择的引物是 ，为使STS 基因与质粒正确连接，在设计PCR
引物时需在所选引物的 （填“3′”或“5′”）端分别增加相应限制酶的酶切位点，同时选用两种限
制酶 切割质粒。
(2)将重组质粒导入大肠杆菌细胞内进行表达，需将大肠杆菌用 处理，以增大细胞壁的通透性，
使 容易进入受体细胞。
(3)可将转化后的大肠杆菌接种到含 的培养基上进行筛选。能在该培养基上形成菌落的大肠杆菌
是否一定含有STS 基因？请判断并说明理由： 。除用选择培养基外，检测转基因是否成功的生物
技术还有 （答2 种）。
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【答案】(1) 引物2 和引物3 5' XhoI 和NdeI
(2) Ca2+ 含有STS 基因的重组质粒（或周围环境中的DNA）
(3) 氨苄青霉素 不一定，含氨苄青霉素抗性基因的未重组载体（空白质粒）也可导入大肠杆菌，
使大肠杆菌在培养基上形成菌落 PCR 技术（电泳）、抗原一抗体杂交技术、分子杂交技术
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩
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子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．
将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最
有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与
鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因--DNA 分子杂交技术；②
检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技
术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）根据引物由5'→3'方向延伸，可知扩增目的基因需使用引物2 和引物3。为使STS 基因与质
粒正确连接，在设计PCR 引物时需在所选引物的5′端分别增加相应限制酶的酶切位点，以确保目的基因两
侧与质粒有相同的酶切位点。质粒中存在三种限制酶切位点，其中限制酶SacⅠ会破坏抗生素标记基因，因
此切割质粒可用限制酶XhoI 和NdeI 切割。
（2）将目的基因导入大肠杆菌中，常用Ca2+处理，使其处于一种容易吸收周围DNA 的状态，使含有STS
基因的重组质粒容易进入受体细胞。
（3）质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，可将转化后的大肠杆菌接种到含氨苄青霉素的培养基上进行筛选。
能在此培养基上形成的菌落可能是含氨苄青霉素抗性基因的未重组载体导入大肠杆菌，使大肠杆菌在培养
基上形成菌落。检测目的基因是否成功导入受体细胞并成功表达，可采用PCR 技术、抗原—抗体杂交技术
和核酸分子杂交技术。
20．凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶，它能水解多肽链中苯丙氨酸和甲硫氨酸之间的肽键以促使牛奶凝结
来生产奶酪；提取凝乳酶的传统方法是从未断奶小牛的胃黏膜里提取．此方法产量低且昂贵。如今科学家
运用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中，实现了牛凝乳酶的批量生产。图1 和图2
表示质粒和凝乳酶基因的结构示意图，如表为不同限制酶识别的碱基序列及切割位点。回答下列相关问题：
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限制酶
PvitⅡ
K pnⅠ
EcoRⅠ
PstⅠ
Bam HⅠ
Sau3AⅠ
识别序列
CAG↓CTG
G↓GTACC
G↓AATTC
CTGC↓AG
G↓GATCC
↓GATC
(1)获取小牛胃黏膜的单细胞需要将剪碎的小牛胃黏膜用 处理；对获得的单细胞进行培养时需要定期更
换培养液，目的是 。从培养的牛胃黏膜细胞中提取 ，再逆转录形成DNA，再以此DNA 为模板利
用PCR 技术获得凝乳酶基因。
(2)将图2 中的凝乳酶基因与图1 质粒构建基因表达载体时，最好选择 切割目的基因和质粒，并利用
（只写1 种）连接酶进行连接。若将该基因表达载体导入受体细胞后，凝乳酶基因能稳定存在但不能表达，
原因可能是 。
(3)可用非转基因牛凝乳酶作为对照检验由酵母菌发酵工程生产的凝乳酶的活性。已知凝乳酶能催化乳汁凝
固，将一定量的凝乳酶与一定量的乳汁混合，控制 （写出2 点）等条件适宜，观察凝乳需要的时间越
（填“长”或“短”），说明凝乳酶的活性越高。
【答案】(1) 胰蛋白酶（或胶原蛋白酶） 去除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成
伤害 总mRNA
(2) PvitⅡ T4DNA 连接酶 没有启动子,没有拼接到受体细胞的DNA 上
(3) 温度、pH 短
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术
扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启
动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定；
2、动物细胞悬液的制备方法：取动物胚胎或幼龄动物器官、组织，将材料剪碎，并用胰蛋白酶或用胶原
蛋白酶处理，形成分散的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。
【详解】（1）要获得小牛胃黏膜的单细胞需要将剪碎的小牛胃黏膜组织用胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)处理；
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对获得的单细胞进行培养时需要定期更换培养液，目的是去除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自
身造成伤害；从培养的牛胃黏膜细胞中提取总mRNA 再逆转录形成DNA，再以此DNA 为模板利用PCR
技术获得凝乳酶基因；
（2）由图1 和图2 可知，质粒和含目的基因的DNA 分子中都有限制酶PvitⅡ的酶切位点，因此将图2 中的
凝乳酶基因与图1 质粒构建基因表达载体时，最好选择限制酶PvitⅡ切割目的基因和质粒，以产生相同的
黏性末端，且为平末端，所以用T4DNA 连接酶进行连接；若将该基因表达载体导入受体细胞后，凝乳酶
基因能稳定存在但不能表达，原因可能是没有启动子，没有拼接到受体细胞的DNA 分子上，导致该基因
无法表达；
（3）检验由酵母菌发酵工程生产的凝乳酶的活性时，将一定量的凝乳酶与一定量的乳汁混合，要控制温
度、pH 等影响酶活性的条件；如果凝乳酶的活性越高，则凝乳需要的时间就越短。
21．水稻胚乳可作为生物反应器用于开发功能性产品。从猪瘟病毒抗原蛋白的预期功能出发，研究小组设
计其预期的结构，推测应有的氨基酸序列，合成新的基因X。利用PCR 技术对其进行扩增并连接启动子
1，形成Z 片段。把Z 片段插入Ti 质粒的T-DNA 中，将构建好的基因表达载体导入水稻细胞完成转化，在
胚乳中获得相应蛋白，最终将蛋白进一步加工为植物源猪瘟疫苗。相关信息如图所示。
回答下列问题。
(1)研究小组通过PCR 扩增Z 片段，延伸过程中，4 种脱氧核苷酸在 催化作用下合成新的DNA 链。酶切
时，限制酶识别序列的重叠会降低切割效率。为构建基因表达载体，选择限制酶HindⅢ和 进行切割，
可使Z 片段插入T-DNA 的效率最高。为使基因能够正常表达，质粒上的N 和J 应都为 。
(2)为获得含蛋白X 的水稻材料，首先诱导水稻种子脱分化形成 ，然后通过 的侵染，使目的基因进入
水稻细胞并完成转化，再将其转接到含特定激素的培养基上，诱导其 形成具有根、茎、叶的完整植株。
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(3)为验证水稻中目的基因X 是否表达（转录和翻译），分子水平上的检测方法有 （答出2 点即可）。
(4)从猪瘟病毒抗原蛋白的预期功能出发，合成基因X，进而得到猪瘟疫苗的过程属于 工程的范畴。
【答案】(1) 耐高温的DNA 聚合酶（Taq DNA 聚合酶） EcoR Ⅰ 终止子
(2) 愈伤组织 农杆菌 再分化
(3)通过PCR 技术检测水稻细胞中目的基因X 是否转录出了mRNA；从转基因水稻中提取蛋白质，用相应
的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出了蛋白质
(4)蛋白质
【分析】1、基因工程是一项体外DNA 重组技术，需要借助限制酶、 DNA 连接酶和载体等工具才能进行。
它的基本操作程序包括：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的
基因的检测与鉴定。
2、PCR 是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA 半保留复制的原理，在体外提供参与DNA 复制的
各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
3、蛋白质工程是基因工程的延伸，是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过
改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
【详解】（1） PCR 是根据DNA 半保留复制的原理在体外进行DNA 复制的技术，其过程为：变性-复性-
延伸，在子链延伸过程中，4 种脱氧核苷酸要在耐高温的DNA 聚合酶催化下合成新的子代DNA 链。依题
意，酶切时，限制酶识别序列的重叠会降低切割效率。Xba Ⅰ与Hind Ⅲ识别序列有重叠，不符合题目要求。
EcoR Ⅴ所切末端为平末端，连接效率低，不符合题目要求。EcoR Ⅰ识别序列与Hind Ⅲ识别序列无重叠，
产生的切口是黏性末端，连接效率相对平末端高。为使基因能够正常表达，基因结构的上游和下游各有启
动子和终止子，因此，N 和J 应都为终止子。
（2）为获得含蛋白X 的水稻材料，首先诱导水稻种子脱分化形成愈伤组织，然后通过农杆菌的侵染，使
目的基因进入水稻细胞并完成转化，再将其转接到含特定激素的培养基上，诱导其再分化形成具有根、茎、
叶的完整植株。
（3） 为验证水稻中目的基因X 是否表达（转录和翻译），可通过PCR 技术检测水稻细胞中目的基因X
是否转录出了mRNA；可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出
了蛋白质。
（4）蛋白质工程是基因工程的延伸，是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通
过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。因此，
从猪瘟病毒抗原蛋白的预期功能出发，合成基因X，进而得到猪瘟疫苗的过程属于蛋白质工程的范畴。
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22．In-Fusion 技术是一项新型的无缝克隆技术。技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同
的DNA 序列（即同源序列，通常为15~20bp），然后用In—Fusion 酶（能识别双链线性化DNA 片段
5'→3'末端16 个碱基，并使其降解）处理即可实现无缝连接。它的操作步骤（如图）大致为：①利用PCR
技术将质粒线性化；②PCR 扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性化质粒同源
区域在In—Fusion 酶作用下形成重组质粒；④将重组质粒导入受体细胞。回答下列问题：
(1)过程①需要用到的酶是 ，质粒线性化前后所含有的游离磷酸基团的个数分别为 个。
(2)过程③中，同源序列1、2 中的碱基序列不同，这样设计的好处是 。
(3)过程④中，用 处理大肠杆菌，以便重组质粒导入受体细胞。重组质粒利用大肠杆菌细胞中的
DNA 聚合酶和 酶，实现完全环化。
(4)通过检测大肠杆菌的致死率可反映其转化后的抗性效果。在含 的液体培养基中培养一段时间，
然后分别用显微镜计数法和稀释涂布平板法进行计数，计数结果分别是M、N，则致死率可用
×100%表示，此结果较真实值偏高。
【答案】(1) 耐高温的DNA 聚合酶（或TaqDNA 聚合酶） 0、2
(2)防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因自身环化
(3) Ca2+ DNA 连接酶
(4) 氨苄青霉素 （M-N）/M
【分析】分析题图：①是将质粒线性化；②使PCR 扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③使目
的基因与线性化质粒同源区域在In-Fusion 酶作用下形成重组质粒；④是将重组质粒导入受体细胞。
【详解】（1）过程①是利用两种引物进行的质粒线性化过程，该过程属于PCR 技术的应用，故需要
TaqDNA 聚合酶；环状质粒无游离磷酸基团，一条DNA 链含有一个游离的磷酸基团；线性化DNA 是双链，
则含有2 个游离的磷酸基团，故质粒线性化前后所含有的游离磷酸基团的个数分别0 和2。
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（2）过程③是基因表达载体的构建过程，该过程中，同源序列1、2 中的碱基排序不同，这样设计的好处
是防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因的自身环化，以保证目的基因能够正确连接并表达。
（3）Ca2+能促进细菌摄取外源的DNA，常使用CaCl2 溶液制备感受态细胞，进而转入外源DNA，故过程
④中，用Ca2+处理大肠杆菌，以便重组质粒导入受体细胞。DNA 连接酶能将DNA 片段连接成一个重组
DNA 分子，故重组质粒利用大肠杆菌细胞中的DNA 聚合酶和DNA 连接酶，实现完全环化。
（4）在含氨苄青霉素的液体培养基中培养一段时间，然后分别用显微镜计数法（死菌和活菌均被计数）
和稀释涂布平板法（用于活菌计数）进行计数。由于在用稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细胞连在
一起时，在平板上观察到的是一个菌落，故若计数结果分别是M、N，致死率可用（M-N）/M×100％表示，
会导致N 偏小，进而导致此结果较真实值偏大。
23．研究人员利用一种从某生物体内分离出的抗盐碱基因，通过基因工程、植物细胞工程等现代生物技术，
培育出了抗盐碱大豆，使大豆能在盐碱地中正常生长，提高了大豆的产量。下图为培育流程，其中①~⑥
为不同过程，其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因，AluⅠ、SmaⅠ、HindⅢ和PstⅠ为限制酶。根据所学知识，
回答下列问题：
(1)不用限制酶AluⅠ切割抗盐碱基因的原因是 。用限制酶切割抗盐碱基因和质粒时，选择SmaⅠ和PstⅠ
比只选择PstⅠ的优点是 （答出两点）。
(2)研究人员用AluⅠ切割原质粒得到7.7kb 的DNA 片段，切割重组质粒得到3.0kb、4.8kb 的DNA 片段；
SmaⅠ和PstⅠ切割原质粒得到2.3kb、5.4kb 的DNA 片段（注意：DNA 片段大小与图中所画比例一致），则
抗盐碱基因的长度为 。
(3)利用PCR 技术可获取大量目的基因，PCR 反应体系中有两种引物，在复性时引物会结合到互补DNA 链
上，对两种引物的设计要求之一是 ；除引物外，PCR 反应体系中还需要加入 （答出两点）。
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(4)将目的基因导入植物细胞时，常采用农杆菌转化法，将目的基因插入Ti 质粒中。利用Ti 质粒，通过农
杆菌转化法可将抗盐碱基因导入大豆愈伤组织细胞的理论依据是 。
(5)为了筛选出成功导入重组质粒的农杆菌，1 号培养基中需要加入的物质是 。诱导组织细胞脱分化的
是 号培养基。图中④⑤⑥过程，所利用的生物技术的理论基础是 。
【答案】(1) 限制酶AluⅠ切割会破坏抗盐碱基因 防止目的基因和质粒反向连接；防止目的基因、
质粒自身环化
(2)2.4kb
(3) 两种引物之间不能碱基互补配对 模板、dNTP、Taq DNA 聚合酶、PCR 缓冲液等
(4)农杆菌中Ti 质粒上的T-DNA 能转移并整合至植物细胞染色体DNA 上
(5) 氨苄青霉素 3 植物细胞具有全能性
【分析】据图分析，图示为利用基因工程和细胞工程培育出抗盐碱大豆的过程，其中①表示构建基因表达
载体；②表示将目的基因导入农杆菌细胞；③表示筛选含有目的基因的农杆菌；④表示脱分化形成愈伤组
织的过程；⑤⑥表示幼苗培育成成体的过程。
【详解】（1）据图可知，抗盐碱基因中包含了AluⅠ限制酶识别序列，若用限制酶AluⅠ切割则会破坏抗盐
碱基因；选择Sma I 和Pst I 两种限制酶分别切割抗盐碱基因和质粒，抗盐碱基因与质粒各自能形成不能互
补配对的两个黏性末端，同时抗盐碱基因与质粒之间的黏性末端又能互补配对，相比只选择PstⅠ一种酶进
行切割的优点是可防止目的基因和质粒反向连接、防止目的基因、质粒自身环化。
（2）研究人员用AluⅠ切割原质粒得到7.7kb 的DNA 片段，可知原质粒的长度为7.7kb，切割重组质粒得到
3.0kb、4.8kb 的DNA 片段，可知重组质粒的长度为7.8kb，重组质粒是用SmaⅠ和PstⅠ酶切后构建而来，且
DNA 片段大小与图中所画比例一致，已知SmaⅠ和PstⅠ切割原质粒得到2.3kb、5.4kb 的DNA 片段，故抗盐
碱基因替换了原质粒中2.3kb 的DNA 片段，故抗盐碱基因的长度为7.8-5.4=2.4kb。
（3）利用PCR 技术可获取大量目的基因，PCR 反应体系中有两种引物，在复性时引物会结合到互补DNA
链上，对两种引物的设计要求之一是两种引物之间不能碱基互补配对，以防止引物之间结合形成双链，降
低引物与DNA 模板链结合的效率；PCR 反应体系中除引物外，还包括模板、dNTP、Taq DNA 聚合酶、
PCR 缓冲液等。
（4）Ti 质粒上的T-DNA 具有可转移的特性，当农杆菌侵染大豆愈伤组织细胞时，农杆菌中Ti 质粒上的T-
DNA 包括插入其中的目的基因可转移并整合至受体细胞染色体DNA 上。
（5）据图分析，质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，故含重组质粒的农杆菌具有抗氨苄青霉素的特性，所
以为了筛检成功导入重组质粒的农杆菌，1 号培养基需要加入氨苄青霉素；外植体经脱分化可形成愈伤组
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织，据图分析，3 号培养基可诱导组织细胞脱分化形成愈伤组织；图中④⑤⑥过程，为植物的组织培养技
术，所利用的理论基础是植物细胞具有全能性。
24．某真菌的W 基因可编码一种可高效降解纤维素的酶，已知图乙中W 基因转录方向是从左往右。为使
放线菌产生该酶，以图甲中质粒为载体，进行重组DNA 技术的相关操作。回答下列问题：
限制酶
BamHⅠ
EcoRⅠ
MfeⅠ
KpnⅠ
HindⅢ
识别序列及切割位点（5′-3′）
G↓GATTC
G↓AATTC
C↓AATTG
GGTAC↓C
A↓AGCTT
(1)若要从土壤中筛选出纤维素分解菌，需要配制以为 唯一碳源的固体培养基并进行灭菌处
理。为便于筛选可在培养基中加入 染料。
(2)限制酶主要是从 （填“真核生物”或“原核生物”）中分离纯化出来的。结合上述
图表分析应使用限制酶 切割图甲中质粒，使用限制酶切割 图乙中含W 基因的DNA 片段，
以获得能正确表达W 基因的重组质粒。
(3)与质粒中启动子结合的酶是 。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入W 基因，其
上游启动子应选择 （填生物类型）启动子，有利于W 基因在目的菌中的表达产生高效降解纤
维素的酶。
(4)W 基因转录的模板链是 （填“甲链”或“乙链”）。利用PCR 技术对W 基因进行扩增时子
链延伸的方向是 。
【答案】(1) 纤维素 刚果红
(2) 原核生物 MfeI、HindⅢ EcoRI、HindⅢ
(3) RNA 聚合酶 放线菌
(4) 乙链 5'→3'
【分析】一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子是一
段有特殊序列结构的DNA 片段，位于基因的上游紧挨转录的起始位点，它是RNA 聚合酶识别和结合的部
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位。有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
【详解】（1）纤维素分解菌能分解纤维素为葡萄糖作为碳源，其他微生物不能分解纤维素，可以用纤维
素为唯一碳源的培养基筛选纤维素分解菌。筛选纤维素分解菌可用刚果红染料，刚果红可与纤维素反应形
成红色复合物。
（2）限制酶主要是从原核生物分离纯化出来的。根据题图信息“图中W 基因转录方向是从左往右”、
“质粒启动子到终止子方向为顺时针”，故重组质粒的启动子应在W 基因左侧，终止子应在W 基因右侧，
W 基因右侧只能用HindⅢ切割，W 基因左侧有BamHI、KpnI、EcoRI 三种酶切位点，结合质粒情况及切
割位点识别序列，应使用限制酶MfeI、HindⅢ切割图中质粒，使用限制酶EcoRI、HindⅢ切割图中含W
基因的DNA 片段，以获得能正确表达W 基因的重组质粒，因为限制酶MfeI 和限制酶EcoRI 切割露出相同
的粘性末端。
（3）启动子启动基因的转录，故与质粒中启动子结合的酶是RNA 聚合酶；根据题干信息“启动子通常具
有物种特异性”，目标是使放线菌产生高效降解纤维素的酶，故应选择放线菌的质粒，在质粒中插入W 基
因，其上游启动子应选择放线菌启动子。
（4）W 基因转录方向是从左向右，mRNA 链的合成方向为5'→3'，与乙链从左向右3'→5'互补，故W 基因
转录的模板链是乙链。利用PCR 技术扩增目的基因的原理是DNA 半保留复制，子链延伸方向为5'→3'。
25．类胡萝卜素因众多营养保健功能而具有很高的商业价值与应用前景。现研究人员通过构建含有β-胡萝
卜素酮化酶基因bkt 的表达载体，转化莱茵衣藻（一种真核绿藻）以提高其类胡萝卜素产量。请回答下列
问题：
(1)为了同时保留衣藻内源性启动子H-R 及终止子RBCS2，应选用限制酶 对质粒pUCBKT-P 和pH105
进行酶切，原因是 。再利用DNA 连接酶将酶切下的基因片段连接成表达载体。
(2)可利用 （填技术）大量扩增bkt 基因，该技术需要在添加 离子的缓冲液中扩增基因。若产物中
除了目的基因外有其他DNA 片段存在，从引物角度考虑，原因可能是 。
(3)用含奇霉素的抗性培养基对转化后的莱茵衣藻进行筛选，因不同种类的绿藻对抗生素敏感浓度不同，所
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以要设计 的奇霉素进行实验，观察并确定 。
(4)以下是利用某两种限制酶进一步对提取的莱茵衣藻DNA 进行单酶切和双酶切后的电泳结果。据此推测，
提取的DNA 总长度是 bp，两种限制酶切割位点之间的最短距离是 bp。
【答案】(1) Pamc Ⅰ和Xba Ⅰ 双酶切在保证目的基因的插入时还能避免目的基因自身环化和随意
连接
(2) PCR 镁 引物较小，特异性较低，同时扩增出目的基因和其他DNA 片段
(3) 不同浓度 菌落大小及透明圈大小
(4) 800 200
【分析】基因工程的基本工具包括限制酶、DNA 连接酶和分子运输车。选择限制酶应不破坏目的基因和标
记基因，尽可能保证目的基因正向插入，提高成功率。
【详解】（1）由图可知，为了同时保留衣藻内源性启动子H-R 及终止子RBCS2，选择的限制酶切割位点
应在启动子和终止子之间，同时双酶切在保证目的基因的插入时还能避免目的基因自身环化和随意连接，
故限制酶选择为Pamc Ⅰ和Xba Ⅰ。
（2）可利用PCR 大量扩增bkt 基因，该技术需要在缓冲液中添加镁离子。若产物中除了目的基因外有其
他DNA 片段存在，从引物角度考虑，原因可能是引物较小，特异性较低，同时扩增出目的基因和其他
DNA 片段。
（3）用含奇霉素的抗性培养基对转化后的莱茵衣藻进行筛选，因不同种类的绿藻对抗生素敏感浓度不同，
需要设计不同浓度的奇霉素进行实验，观察并确定菌落大小及透明圈大小，以筛选出抗奇霉素的绿藻。
（4）用不同酶对DNA 进行单酶切时，得到一条DNA 片段，说明原DNA 是环状DNA，且总长度为
800bp，用酶Ⅰ和酶Ⅱ联合切割时，获得的DNA 片段长度分别为600bp 和200bp，故两种限制酶切割位点
之间的最短距离是200bp。
26．甜菜是我国重要的糖料作物之一。为提高甜菜的光合效率和产量，科研人员构建了携带SBPase 基因
（编码卡尔文循环的关键酶）的表达载体（图1），通过基因工程对甜菜进行遗传改造。回答下列问题：
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(1)构建表达载体并导入农杆菌：获取目的基因后利用PCR 技术进行扩增，经凝胶电泳鉴定后，回收其中
包含目的基因的DNA 片段。然后使用限制性核酸内切酶切割 ，将带有黏性末端的酶切产物纯
化回收后，用 连接。图1 基因表达载体中没有标注出来的基因结构是 （填一
个即可）。经过一系列步骤后，将测序正确的重组质粒导入农杆菌。
(2)获取抗性植株：将含有重组质粒的农杆菌与甜菜叶柄共培养一段时间后，先将外植体放在含有羧苄霉素
和头孢霉素的培养基中初步培养，目的是 ，再转入含有 的筛选培养基中获
得抗性植株。此过程中使用抗生素时需要注意的事项是 。
(3)为从分子水平上检测抗性植株是否含有目的基因，对抗性植株进行PCR 后检测，检测结果如图2。
CK+组是选用含 的质粒作为阳性对照。
(4)取阳性无菌苗叶片提取总RNA，将RNA 逆转录成cDNA，再以cDNA 为模板，利用目的基因引物进行
PCR 以检测 。
【答案】(1) 质粒和目的基因（包含目的基因的DNA 片段） DNA 连接酶 复制原点（启动
子、终止子）
(2) 杀灭农杆菌（抑制农杆菌生长、抑制农杆菌、抑菌） 卡那霉素 注意抗生素的种类、剂
量及作用时间等
(3)目的基因
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(4)目的基因的表达情况（目的基因是否转录成功、目的基因是否转录出mRNA）
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的
基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）使用限制性核酸内切酶切割质粒和目的基因，使其产生相同的粘性末端；将带有黏性末端
的酶切产物使用DNA 连接酶连接，催化磷酸二酯键的形成；图1 中为表达载体，需要酶切位点、标记基
因、复制原点（启动子、终止子）等，图中未标出的为复制原点（启动子、终止子）。
（2）将外植体放在含有羧苄霉素和头孢霉素的培养基中初步培养，是为了杀灭农杆菌；再转入含有卡那
霉素的筛选培养基中，由于重组质粒含有抗性基因，因此能获得重组细胞，进而获得抗性植株；抗生素起
到筛选重组质粒的作用，使用时需注意抗生素的种类、剂量及作用时间等。
（3）CK+组为阳性质粒，与1-8 转基因植株的条带一致，含有目的基因，故CK+组是选用含目的基因的质
粒作为阳性对照。
（4）利用目的基因引物进行PCR 以检测目的基因是否转录出mRNA，若转录成功，则能逆转录成
cDNA，能结合目的基因相应的引物扩增出相应的条带。
27．反刍动物的瘤胃中含有分解纤维素的微生物，科研小组从瘤胃中分离培养分解纤维素的微生物的流程
如图所示。
回答下列问题：
(1)以纤维素为 的选择培养基进行I 过程，培养基常用的灭菌方法是 。
(2)将I 过程得到的菌液接种到充满N2的密闭试管中进行Ⅱ过程，培养一段时间后可在试管壁的薄层培养基
上获得单菌落。与Ⅰ相比，Ⅱ所用培养基中还需要添加的物质是 。培养瘤胃微生物时，除考虑营养
物质外，还要考虑 、 和渗透压等条件。
(3)分离出某真菌的W 基因可编码一种可高效降解纤维素的酶，已知图中W 基因转录方向是从左向右，启
动子通常具有物种特异性，为使大肠细菌产生该酶，在质粒中插入W 基因，其上游启动子应选择 的启动
子，以图中质粒为载体，进行转基因操作。不同限制酶的识别序列及切割位点如表所示。
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限制酶
BamHI
EcoRI
MfeI
KpnI
HindIII
识别序列和切割位点
G↓GATTC
G↓AATTC
C↓AATTG
GGTAC↓C
A↓AGCTT
①W 基因转录的模板链是 。利用PCR 技术对W 基因进行扩增时子链延伸的方向是 。
②与质粒中启动子结合的酶是 。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入W 基因，其上游
启动子应选择 的启动子。
③限制酶主要是从 中分离纯化出来的。应使用限制酶 切割图中质粒，使用限制酶 切割
图中含W 基因的DNA 片段，以获得能正确表达W 基因的重组质粒。
【答案】(1) 唯一碳源 湿热灭菌
(2) 琼脂 温度 pH
(3) 乙链 5'→3' RNA 聚合酶 大肠杆菌 原核生物 MfeI、HindⅢ EcoRI、
HindⅢ
【分析】一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子是一
段有特殊序列结构的DNA 片段，位于基因的上游紧挨转录的起始位点，它是RNA 聚合酶识别和结合的部
位。有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
【详解】（1）据题意可知，上图是科研小组从瘤胃中分离培养分解纤维素的微生物的流程，因此得到瘤
胃提取物后，将其放入以纤维素为唯一碳源的选择培养基进行I 过程。灭菌是指用强烈的理化因素杀死物
体内外所有的微生物（包括芽孢和孢子），常用的方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌，培养基常用灭
菌方法是湿热灭菌。
（2）将I 得到的菌液接种到充满N2 的密闭试管II 中，培养一段时间后可在试管壁的薄层培养基上获得单
菌落。与I 相比，II 所用培养基为固体培养基，需要添加的物质是琼脂。微生物的培养条件有适宜的营养
物质(碳源、氮源、无机盐等)、温度、pH、渗透压(控制培养液的浓度)等，因此培养瘤胃微生物时，除考
虑营养物质外，还要考虑温度、pH 和渗透压等条件。
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（3）①W 基因转录方向是从左向右，mRNA 链的合成方向为5'→3'，与乙链从左向右3'→5'互补，故W 基
因转录的模板链是乙链。利用PCR 技术扩增目的基因的原理是DNA 半保留复制，子链延伸方向为5'→3'。
②启动子启动基因的转录，故与质粒中启动子结合的酶是RNA 聚合酶；根据题干信息“启动子通常具有
物种特异性”，目标是使大肠杆菌产生高效降解纤维素的酶，故应选择大肠杆菌的质粒，在质粒中插入W
基因，其上游启动子应选择大肠杆菌启动子。
③限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的；根据题图信息“图中W 基因转录方向是从左往右”、“放
线菌质粒启动子到终止子方向为顺时针”，故重组质粒的启动子应在W 基因左侧，终止子应在W 基因右
侧，W 基因右侧只能用HindⅢ切割，W 基因左侧有BamHI、KpnI、EcoRI 三种酶切位点，结合质粒情况
及切割位点识别序列，应使用限制酶MfeI、HindⅢ切割图中质粒，使用限制酶EcoRI、HindⅢ切割图中含
W 基因的DNA 片段，以获得能正确表达W 基因的重组质粒。
28．研究人员利用水稻细胞培育能产生人 HIV 抗体2G12 的水稻胚乳细胞生物反应器，其基本流程包括
表达载体的构建、农杆菌转化、水稻细胞转化、转基因植株的筛选等。
(1)为成功构建表达载体，需在人工合成的人 HIV 抗体2G12 基因首端添加启动子，你的选择是 （填字
母），依据是 。
A．人 B 细胞启动子
B．HIV 启动子
C．水稻胚乳细胞启动子
D．农杆菌启动子
(2)潮霉素对原核细胞和真核细胞的生长都有抑制作用。据此分析，下图所示重组T-DNA 片段中潮霉素抗
性基因为基因表达载体中的 ，其作用是 。
(3)目的基因插入染色体的具体位置通常具有不确定性，可采用反向PCR 技术检测。下图是利用这一技术
分析人 HIV 抗体2G12 基因插入染色体位置的流程图。
欲得到图中环状 DNA，过程Ⅰ酶切时 （填“能”或“不能”） 利用不同限制酶。由图中环状
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DNA 至少经过 轮循环才能得到图示链状产物。
(4)与其他工程技术相比，利用水稻生产人 HIV 抗体2G12 的优势有 （答两点即可）。
【答案】(1) C 水稻胚乳细胞启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA 聚合酶识别和结合而驱动转
录
(2) 标记基因 鉴别和筛选成功导入人HIV 抗体2G12 基因的农杆菌和水稻细胞
(3) 能 3
(4)产量高；成本低；不受性别限制；不需要专业培养设备
【分析】基因工程的操作步骤有：目的基因的获取、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的
基因的检测和鉴定。检测目的基因是否导入受体细胞可采用PCR 技术，检测目的基因是否表达可采用抗原
抗体杂交或个体水平检测。
【详解】（1）利用水稻细胞培育能产生人 HIV 抗体2G12 的水稻胚乳细胞生物反应器，水稻胚乳细胞启
动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA 聚合酶识别和结合而驱动转录，C 正确，ABD 错误。
故选C。
（2）潮霉素抗性基因可用于鉴别和筛选成功导入人HIV 抗体2G12 基因的农杆菌和水稻细胞，潮霉素抗
性基因为基因表达载体中的标记基因。
（3）有些限制酶切割形成的黏性末端相同，故能利用不同限制酶切割，环状DNA 的两条链为母链，根据
DNA 半保留复制的特点，PCR 过程一般需要经过3 轮循环才能得到图示链状产物。
（4）利用水稻细胞培育能产生人 HIV 抗体2G12 的水稻胚乳细胞生物反应器，具有产量高；成本低；不
受性别限制；不需要专业培养设备等优点。
29．大肠杆菌能进入实体瘤核心并保持较强活性，科研人员期望利用大肠杆菌构建一种基因表达可控的工
程菌，期望用于人体特定部位实体瘤的免疫治疗。
(1)科研人员利用温度敏感型转录调控蛋白构建温控表达的质粒系统，如下图。
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①利用来自λ 噬菌体的温度敏感型转录抑制因子Tcl42 作为“开关”构建温控抑制元件，在 （选填
“λ 噬菌体”、“大肠杆菌”或“人”）中具强活性的启动子pLac 可以使Tcl42 持续性表达，抑制启动子
pRL；当控温至42℃时才开启特定基因的表达。
②Tcl42 开关仅在加热时瞬时激活特定基因，而免疫疗法需要数周才能见效，所以设计了“基因电路”
——一次短暂的温度激活后可维持长期的基因表达。其核心基因包括重组酶Bxb1 基因、分泌型αPD-L1 蛋
白基因（该蛋白可用免疫治疗）等。
请选择相关选项完善该“基因电路”的技术路线： 及质粒，获基因电路 → 受体菌37℃时，蛋白
Tcl42 抑制启动子pRL → → 免疫元件无功能（不表达αPD-L1） → → 解除蛋白Tcl42 对启动子
pRL 的抑制→ → →细菌合成GFP，并分泌大量αPD-L1。
A、重组酶Bxb1 基因不表达 B、菌体升温至42℃时
C、用不同的限制酶、DNA 连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件
D、启动子p7 启动荧光蛋白GFP 基因、αPD-L1 基因的转录
E、重组酶Bxb1 基因表达，进而引起启动子p7 两侧发生重组
(2)科研人员用 处理大肠杆菌，使其处于感受态，从而将“基因电路”质粒导入菌体内，经过培养、
涂布后，筛选 （选项），由此成功构建用于免疫治疗的温控工程菌（EcT）。
A、含有四环素的培养基上形成的菌落 B、具有绿色荧光的菌落
C、同时具有A 和B 特征的菌落 D、具有A 或B 特征的菌落均可
(3)使用聚焦超声（FUS）装置，可以使动物特定范围的组织快速升温至42℃，从而实现体内微生物治疗的
温度控制。为验证上述温控工程菌的治疗肿瘤效果，选取若干组生理状态相近的小鼠，经过7 天的成瘤建
模后，分别进行如下处理，并检测记录小鼠体内肿瘤体积。
第1 组：注射生理盐水，2 天后FUS 处理；
第2 组：注射温控工程菌，2 天后FUS 处理。请评价并完善实验方案 。
最终证明温控工程菌可被FUS 处理局部激活，并具有持续性肿瘤免疫治疗效果。
(4)若期望将上述温控工程菌用于临床实验，还需利用小鼠开展 方面的研究。
【答案】(1) 大肠杆菌 C A B E D
(2) Ca2+ A
(3)该实验方案无法排除改造后的温控工程菌在未热激活状态对肿瘤生长的影响，应增设温控工程菌在未热
激活状态的对照组
(4)温控工程菌或温控工程菌 +FUS 对哺乳动物重要脏器（肝、肾、神经系统等）的影响；与现行临床药物
相比，效果是否具有优势；温控工程菌在非FUS 处理部位是否有非特异性激活
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【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因——DNA 分子杂交技术；②检测
目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技
术。
个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）①“基因电路”的技术路线实验的目的是利用温度敏感型转录调控蛋白构建温控表达的大
肠杆菌质粒系统，因此，使Tcl42 持续性表达的具强活性的启动子pLac 应该来自大肠杆菌。
②“基因电路”的技术路线要起作用，第一步要构建“基因电路”，因此要先用不同的限制酶、DNA 连接
酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，使这些元件能够连接成“基因电路”；依题意，
当温度不到42℃时具强活性的启动子pLac 可以使Tcl42 持续性表达，抑制启动子pRL，则与其构成一个表
达单位的重组酶Bxb1 基因不表达 。重组酶的作用位点在免疫元件中，重组酶Bxb1 基因不表达，则αPD-
L1 不表达，免疫元件无功能；当控温至42℃时解除蛋白Tcl42 对启动子pRL 的抑制，重组酶Bxb1 基因表
达，进而引起启动子p7 两侧发生重组，启动子p7 启动荧光蛋白GFP 基因、αPD-L1 基因的转录。从而使
细菌合成GFP，并分泌大量αPD-L1。综合以上分析，“基因电路”的技术路线是：C、用不同的限制酶、
DNA 连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，获基因电路 → 受体菌37℃时，蛋白
Tcl42 抑制启动子pRL →A、重组酶Bxb1 基因不表达→ 免疫元件无功能（不表达αPD-L1） →B、菌体升
温至42℃时→ 解除蛋白Tcl42 对启动子pRL 的抑制→E、重组酶Bxb1 基因表达，进而引起启动子p7 两侧
发生重组→D、启动子p7 启动荧光蛋白GFP 基因、αPD-L1 基因的转录→细菌合成GFP，并分泌大量αPD-
L1。
（2）在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。研究人员一般先
用Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，然后将“基因电
路”质粒导入菌体内。依题意，重组的质粒中带有抗四环素的抗性基因，因此，可含有四环素的培养基来
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筛选含重组质粒的受体细胞，能在该培养基上形成的菌落就是成功构建用于免疫治疗的温控工程菌菌落，
A 符合题意，BCD 不符合题意。
故选A。
（3）依题意，该实验的目的是验证上述温控工程菌的治疗肿瘤效果，但若按照题意实验，则无法排除改
造后的温控工程菌在未热激活状态对肿瘤生长的影响，因此，应增设一组温控工程菌在未热激活状态的对
照组。
（4）若期望将上述温控工程菌用于临床实验，则还要检验工程菌的优势、作用效果、安全性等方面的影
响实验。因此，还需利用小鼠开展温控工程菌或温控工程菌 +FUS 对哺乳动物重要脏器（肝、肾、神经系
统等）的影响；与现行临床药物相比，效果是否具有优势；温控工程菌在非FUS 处理部位是否有非特异性
激活方面的研究。
30．猴病毒40（SV-40）AgT 基因表达的抗原AgT 可以阻断小鼠抑癌基因的信号通路，诱导小鼠发生前列
腺癌。科学家利用生物技术手段制备了前列腺癌转基因小鼠动物模型，为前列腺癌的发生、发展规律和防
治研究提供了重要的平台。回答下列问题：
(1)下图为SV-40DNA 分子的部分结构，利用PCR 技术扩增AgT 基因，应选择引物1 和 ，将该DNA 分
子加入到PCR 扩增仪中，要获得8 个等长的AgT 基因片段，至少要经历 次循环。
(2)构建基因表达载体时，通常需要将目的基因与人工构建的诱导型启动子结合，其目的是 。
(3)若需大量制备前列腺癌转基因小鼠，可以利用胚胎移植技术。通常导入了目的基因的小鼠受精卵细胞在
体外发育至 时期才能用于胚胎移植，移植前应对供体小鼠和受体小鼠做 处理，目的是 。
【答案】(1) 引物4 4/四
(2)当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达
(3) 桑葚胚或囊胚 同期发情 使供体和受体生殖器官的生理变化同步，为供体的胚胎移入受
体提供相同的生理环境
【分析】目的基因的获取和构建基因表达载体一般要同种限制酶。培育转基因动物时，往往采用受精卵作
为受体细胞，因为受精卵的全能性最高。因为自然界所有生物共用一套遗传密码子，所以一种生物的基因
能在另一种生物体内表达。
【详解】（1）利用PCR 技术扩增AgT 基因，应选择引物1 和引物4，因为子链的延伸是沿着引物的5’向
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3‘端延伸的，等长的目的基因片段数目＝2n—2n（n 为循环次数），故该DNA 分子加入到PCR 扩增仪中，
要获得8 个等长的AgT 基因片段，至少要经历4 次循环，经过4 次循环后得到的等长的引物之间的序列的
数目为24-2×4＝8 个。
（2）构建基因表达载体时，通常需要将目的基因与人工构建的诱导型启动子结合，这是因为，当诱导物
存在时，可以激活或抑制目的基因的表达，进而实现转基因的目标。
（3）若需大量制备前列腺癌转基因小鼠，可以利用胚胎移植技术。通常将导入了目的基因的小鼠受精卵
细胞在体外发育至桑葚胚或囊胚时期才能用于胚胎移植，也可进行胚胎分割，而后再进行移植，移植前应
对供体小鼠和受体小鼠做同期发情处理，这样可以保证供体和受体生殖器官的生理变化同步，为供体的胚
胎移入受体提供相同的生理环境，提高胚胎移植的成功率。
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