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专题10 基因工程
1 大考点概览
考点01 基因工程的综合应用
1．（2026·四川广元·二模）科学家利用图示的RNA 干扰技术流程，设计了一种针对某害虫关键基因M
的生物防治策略。他们将靶向基因M 的双链RNA（dsRNA）导入害虫体内，最终导致基因M“沉默”。
下列叙述正确的是（ ）
A．图中Dicer 是一种限制性内切核酸酶，负责将双链RNA 切割成小片段核酸
B．将dsRNA 导入害虫体内后，基因M 的mRNA 会与小核酸在核糖体上发生结合
C．图中dsRNA 中的一条链与基因M 的mRNA 序列互补
D．基因M 沉默后，害虫细胞内所有基因的转录过程都会受到抑制
【答案】C
【详解】A、限制性内切核酸酶（限制酶）的底物是双链 DNA，作用是识别特定的 DNA 序列并切割
DNA；而 Dicer 酶的底物是双链 RNA（dsRNA），属于 RNA 酶，不是限制酶，A 错误；
B、siRNA（小核酸）与 mRNA 的结合，发生在细胞质基质中（RISC 复合体中），目的是阻断
mRNA 与核糖体的结合，抑制翻译过程；核糖体是翻译的场所，mRNA 若与核糖体结合，会正常翻译，
与 RNA 干扰的机制矛盾，B 错误；
C、RNA 干扰的核心原理是：siRNA（来自 dsRNA 的一条链）与靶基因 M 的 mRNA 碱基互补配对，
从而引导 RISC 降解 mRNA 或阻断翻译；因此 dsRNA 中必然有一条链的序列，与基因 M 的
mRNA 完全互补，才能实现靶向结合，C 正确；
D、RNA 干扰是基因特异性的，仅靶向基因 M 的 mRNA，只抑制基因 M 的翻译过程，不会影响其
他基因的转录和翻译；转录的抑制通常由转录因子、表观修饰等调控，与 RNA 干扰无关，D 错误。
考点1
基因工程的综合应用
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2．（2026·四川成都·二模）某科研团队在培育铁皮石斛新品种并提取石斛多糖时，分别采用了以下方法：
①将铁皮石斛(二倍体，2n=38)与抗寒的细茎石斛(二倍体，2n=38)体细胞杂交获得杂种植株；②利用铁
皮石斛愈伤组织进行液体悬浮培养规模化提取石斛多糖；③通过农杆菌转化法将冷响应基因导入铁皮
石斛愈伤组织获得转基因植株。下列叙述错误的是（ ）
A．方法①获得的杂种植株含76 条染色体，可通过减数分裂产生正常配子
B．方法②需控制培养基中的激素比例，以利于愈伤组织增殖和多糖合成
C．方法③需筛选含目的基因的愈伤组织，经再分化获得抗寒转基因植株
D．三种方法均依赖植物细胞的全能性，为铁皮石斛品种改良提供新方案
【答案】D
【详解】A、方法①为植物体细胞杂交，两种二倍体石斛的体细胞融合后，杂种植株体细胞染色体总数
为38+38=76 条，属于异源四倍体，细胞内存在同源染色体，减数分裂时可正常联会，产生正常配子，
A 正确；
B、方法②为愈伤组织悬浮培养，培养基中生长素和细胞分裂素的比例可调控细胞分裂和代谢过程，控
制适宜激素比例有利于愈伤组织增殖和多糖合成，B 正确；
C、方法③为转基因技术，目的基因导入愈伤组织后仅部分细胞成功整合目的基因，需先筛选出含目的
基因的愈伤组织，再经再分化过程发育为完整的抗寒转基因植株，C 正确；
D、植物细胞全能性是指已分化的细胞发育为完整个体或分化为其他各种细胞的潜能，方法②仅培养愈
伤组织增殖以提取代谢产物，未培育为完整个体，不依赖植物细胞全能性，D 错误。
3．（2026·四川乐山·二模）通过动物细胞工程技术，可以利用患者自身细胞在体外诱导发育成特定的组织
器官，然后再移植回患者体内以达到治疗目的。图1 和图2 表示利用患者自身细胞进行器官移植的两种
方法。下列说法正确的是（ ）
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A．两种方法都需要运用动物细胞培养技术，需要将细胞置于含有95%O2和5%CO2的混合气体的培养
箱中
B．利用两种方法所获得的组织器官的遗传物质均与患者完全相同，因此移植后不会发生免疫排斥反应
C．可利用Ca2＋处理法或显微注射法将Oct3/4 基因、Sox 基因、c-Myc 基因和KIf 基因导入成纤维细胞
D．图2 中供体细胞可不用去除细胞质，将整个供体细胞注入去核的卵母细胞中
【答案】D
【详解】A、动物细胞培养的气体环境是95%空气和5% CO₂，而非95%O₂，A 错误；
B、图2 方法中，重构胚的细胞质来自卵母细胞，因此所获得的组织器官的遗传物质并非与患者完全相
同，B 错误；
C、将目的基因导入动物细胞的常用方法是显微注射法，Ca²⁺处理法用于将目的基因导入微生物细胞，
不能用于动物细胞，C 错误；
D、图2 为体细胞核移植技术，实际操作中可不用去除供体细胞的细胞质，直接将整个供体细胞注入去
核的卵母细胞中，D 正确。
4．（2026·四川乐山·二模）据报道，近期武汉科技大学顾朝江团队研发了全球首创的“EMT-Cas12a”疗法：
利用名为“外泌体”的纳米级囊泡搭载基因剪刀“Cas12a”找到被病毒感染的细胞并将病毒基因组剪碎，
从根本上清除病毒。下列说法正确的是（ ）
A．“外泌体”的产生体现了生物膜具选择透过性
B．“外泌体”能精准识别被病毒感染的细胞，依赖的是细胞膜上的磷脂分子
C．“Cas12a”是一种限制性内切核酸酶，不具备特异性
D．可用差速离心法初步分离提纯“外泌体”
【答案】D
【详解】A、外泌体是细胞分泌的囊泡，其产生过程涉及膜的凹陷、包裹、释放，体现了生物膜具有一
定的流动性的结构特点，并未体现选择透过性的功能特点，A 错误；
B、细胞的识别功能依赖细胞膜上的糖蛋白（受体），磷脂分子是细胞膜的基本支架，不具备识别功能，
B 错误；
C、Cas12a 作为“基因剪刀”属于限制性内切核酸酶，能够识别特定的核苷酸序列并在特定位点切割核
酸，具有特异性，C 错误；
D、差速离心法可通过逐步提高离心速率分离不同大小、密度的颗粒，外泌体是纳米级囊泡，与其他细
胞组分的密度、大小存在差异，可用差速离心法初步分离提纯，D 正确。
5．（2026·四川德阳·二模）某科研团队利用基因工程技术改造里氏木霉（工业上生产纤维素酶的重要菌
株），用于生产人源溶酶体酶，流程如图所示。下列相关叙述正确的是（ ）
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A．敲除内源纤维素酶基因的目的是避免发酵产物被降解
B．配制转基因里氏木霉的培养基时应用纤维素作为碳源
C．改造里氏木霉蛋白质分泌途径可以提高目标产物的分泌效率
D．用大肠杆菌代替里氏木霉获得的目标产物分子结构完全相同
【答案】C
【详解】A、纤维素酶的底物是纤维素，不会降解作为蛋白质的目的产物（人源溶酶体酶）。敲除内源
纤维素酶基因的目的是减少无关内源蛋白的表达，节省表达资源、避免纤维素酶作为杂质干扰目的产
物提纯，A 错误；
B、该菌株已经敲除纤维素酶基因，无法合成纤维素酶分解利用纤维素，因此培养基不能用纤维素作为
碳源，B 错误；
C、改造里氏木霉的蛋白质分泌途径，可以使细胞合成的目的蛋白更高效地分泌到细胞外，提高目标产
物的分泌效率，便于后续分离提取，C 正确；
D、大肠杆菌是原核生物，没有内质网、高尔基体等细胞器，无法对人源溶酶体酶（真核蛋白）进行正
确的折叠、加工，得到的产物空间结构和里氏木霉（真核菌株）合成的不同，D 错误。
6．（2026·四川广安·二模）嵌合抗原受体T 细胞（CAR-T）疗法是一种治疗癌症的新技术。传统方法需从
患者体内分离T 细胞，在体外进行基因改造和扩增后再输回体内。而新方法通过静脉注射靶向脂质纳
米颗粒，将CAR 基因的mRNA 直接送入患者体内的T 细胞，使其转化为CAR-T 细胞。下列叙述正确
的是（ ）
A．传统疗法中T 细胞体外扩增的原理是细胞全能性
B．体内疗法的研发过程不需要动物细胞培养技术支持
C．体内疗法中mRNA 需进入细胞核并整合到染色体DNA 上
D．体内疗法可避免分离T 细胞、体外基因修饰和扩增等流程
【答案】D
【详解】A、T 细胞体外扩增的原理是细胞通过有丝分裂进行增殖，细胞全能性是指已分化的细胞具有
发育成完整个体的潜能，该过程仅获得更多T 细胞，未体现全能性，A 错误；
B、动物细胞培养是动物细胞工程的基础技术，体内疗法的研发过程需要借助动物细胞培养技术进行递
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送效果验证、安全性测试等，B 错误；
C、mRNA 是翻译的模板，进入细胞质后与核糖体结合即可合成CAR 蛋白，无需进入细胞核，也不会
整合到染色体DNA 上，C 错误；
D、由题干信息可知，体内疗法直接将携带CAR 基因mRNA 的靶向脂质纳米颗粒注射入患者体内，直
接改造体内的T 细胞，可避免分离T 细胞、体外基因修饰和扩增等传统流程，D 正确。
故选D。
7．（2026·四川内江·二模）非特异性过氧合酶（UPO）是一种能催化多种氧化反应的真菌胞外酶。我国科
研人员通过蛋白质工程等技术，将天然UPO 活性中心的一个赖氨酸改造为亮氨酸，以大肠杆菌为受体
细胞，获得了对特定底物的催化效率提升13 倍的UPO。下列有关叙述正确的是（ ）
A．UPO 基本组成单位为核糖核苷酸
B．该研究未涉及UPO 基因结构的改变
C．需依赖受体细胞的内质网等加工UPO
D．通过改变氨基酸序列实现UPO 功能改变
【答案】D
【详解】A、UPO 是胞外酶，化学本质为蛋白质，基本组成单位是氨基酸，A 错误；
B、蛋白质工程的操作对象是基因，将赖氨酸改造为亮氨酸的本质是定向改造UPO 基因的结构，实现
氨基酸替换，该研究涉及UPO 基因结构的改变，B 错误；
C、受体细胞为大肠杆菌，属于原核生物，细胞内只含有核糖体一种细胞器，没有内质网等细胞器，C
错误；
D、蛋白质的结构决定功能，氨基酸的种类、排列顺序等会影响蛋白质结构，题干中改变了UPO 的一
个氨基酸种类，即改变了氨基酸序列，进而改变UPO 的结构，最终实现其催化功能的提升，D 正确。
8．（2026·四川广安·二模）我国科学家利用基因工程技术，在烟草中构建“人工叶绿体工厂”，成功合成
治疗糖尿病的多肽药物GLP-1。研究团队将GLP-1 基因与叶绿体特异性启动子连接，构建表达载体，
通过基因枪法导入烟草叶绿体基因组，获得转基因烟草植株。表达载体的结构如图。下列叙述正确的
是（ ）
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A．叶绿体特异性启动子应来源于烟草细胞核基因组，以保证在叶绿体中高效转录
B．将目的基因整合到叶绿体基因组中可以降低基因通过花粉向环境扩散
C．该转基因烟草自交后代的所有植株均含有目的基因
D．在含壮观霉素的培养基上筛选得到的植株，其叶片细胞中一定能检测到GLP-1 蛋白
【答案】B
【详解】A、叶绿体特异性启动子应来源于烟草细胞的细胞质基因组，以保证在叶绿体中高效转录，A
错误；
B、将目的基因整合到叶绿体基因组中可以降低基因通过花粉向环境扩散，因为细胞质基因几乎不进入
到精子中，B 正确；
C、不是所有叶绿体都转入了目的基因，细胞分裂时可能分配过去的叶绿体未转入目的基因。，C 错误；
D、在含壮观霉素的培养基上筛选得到的植株，其叶片细胞中不一定能检测到GLP-1 蛋白，因为导入空
质粒的植株也具有壮观霉素抗性，D 错误。
9．（2026·四川凉山·二模）某病毒对动物养殖业危害十分严重，我国学者拟以该病毒外壳蛋白A 为抗原来
制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒。图1 为获得转基因工程菌所示的重组质粒（部分结构），图2
为单克隆抗体制备流程。下列分析错误的是（ ）
A．用P1、P3 进行PCR 扩增可确定工程菌构建是否成功
B．加入PEG 诱导融合形成的②，其中也有未融合细胞
C．③需用选择培养基去除不能产生特异性抗体的细胞
D．④需用克隆化培养和抗体检测，获得检测呈阳性的细胞
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【答案】C
【详解】A、用P1、P3进行PCR 扩增可扩增出目的基因及其以外的序列，即包含了原来质粒的序列，
因而可确定工程菌构建是否成功，A 正确；
B、由于细胞融合是随机的，且融合过程需要诱导，因而推测，加入PEG 诱导融合形成的②，其中也
有未融合细胞，同时还有同型细胞融合的情况，B 正确；
C、③需用选择培养基去除没有融合的细胞和同型细胞自身融合形成的融合细胞，进而将杂交瘤细胞筛
选出来，C 错误；
D、④需用克隆化培养和抗体检测，获得能产生目标抗体的杂交瘤细胞，即获得抗体检测呈阳性的细胞，
D 正确。
10．（2026·四川广安·二模）某研究团队为提升谷氨酸棒杆菌生产L-缬氨酸的效率，通过基因敲除技术去
除了乳酸脱氢酶基因（ldh）和丙酮酸氧化酶基因（poxB）以减少副产物，优化菌株糖转运系统，最
终在发酵罐中实现L-缬氨酸高效积累。下列叙述正确的是（ ）
A．基因敲除ldh 和poxB 时，必须使用的工具酶包括限制酶、DNA 连接酶和Taq 酶
B．将改造后的菌株接种到液体培养基中进行扩大培养，用血细胞计数板进行活菌计数
C．该发酵过程中，需维持罐内温度、pH 和溶氧等条件稳定，不必对发酵罐进行灭菌
D．该研究成果表明，基因工程改造菌株并优化发酵工艺，可提高目标产物的产量
【答案】D
【详解】A、基因敲除属于基因工程操作，必需的工具酶为限制酶和DNA 连接酶，Taq 酶是PCR 技术
扩增DNA 片段的专用酶，并非基因敲除的必需工具酶，A 错误；
B、血细胞计数板计数时无法区分死菌和活菌，统计结果包含死菌，不能用于活菌计数，活菌计数通
常采用稀释涂布平板法，B 错误；
C、发酵前必须对发酵罐进行严格灭菌，若不灭菌会造成杂菌污染，杂菌会与目的菌株竞争营养，或
产生有害代谢产物，C 错误；
D、通过基因敲除改造菌株、优化糖转运系统等操作，最终实现了L-缬氨酸的高效积累，说明基因工
程改造菌株并优化发酵工艺可提高目标产物的产量，D 正确。
11．（2026·四川宜宾·二模）在高中生物学实验中，同一种试剂或溶液往往因浓度、使用时机或搭配方法
不同而发挥不同的作用。下列有关实验试剂的叙述正确的是（ ）
A．在“检测生物组织中的脂肪”实验中，体积分数为50%的酒精可增强染液对脂肪的附着力
B．在“绿叶中色素的提取和分离”实验中，利用不同色素在无水乙醇中溶解度不同进行分离
C．在“低温诱导植物细胞染色体数目的变化”实验中，需用体积分数95%的酒精洗去卡诺氏液
D．在“DNA 的粗提取与鉴定”实验中，加入体积分数95%的酒精，目的是溶解DNA 获得更多丝状
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物
【答案】C
【详解】A、“检测生物组织中的脂肪”实验中，体积分数为50%的酒精的作用是洗去苏丹Ⅲ（或苏
丹Ⅳ）染液的浮色，A 错误；
B、“绿叶中色素的提取和分离”实验中，无水乙醇的作用是提取色素，分离色素的原理是不同色素
在层析液中的溶解度不同，B 错误；
C、“低温诱导植物细胞染色体数目的变化”实验中，卡诺氏液用于固定细胞形态，之后需用体积分
数95%的酒精冲洗以洗去卡诺氏液，C 正确；
D、“DNA 的粗提取与鉴定”实验中，DNA 不溶于体积分数95%的冷酒精，加入该酒精的目的是使
DNA 析出，D 错误。
12．（2026·四川内江·二模）研究人员将新型冠状病毒表面刺突蛋白的受体结合域（RBD）基因导入水稻
愈伤组织，培育获得多个稳定表达RBD 的转基因水稻株系。下列叙述错误的是（ ）
A．可通过农杆菌转化法将RBD 基因导入水稻愈伤组织
B．转化后的愈伤组织需经脱分化和再分化才能获得植株
C．培育过程中需调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例
D．转入的RBD 基因可能因插入位置不同影响内源基因功能
【答案】B
【详解】A、农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法，可通过该方法将RBD 基因导入水
稻愈伤组织，A 正确；
B、愈伤组织是外植体经脱分化后形成的结构，转化后的愈伤组织仅需经过再分化过程即可发育为完
整植株，B 错误；
C、植物组织培养过程中，生长素与细胞分裂素的比例会调控分化方向：比例较高时利于根的分化，
比例较低时利于芽的分化，因此培育过程中需调整二者的比例，C 正确；
D、外源基因插入宿主细胞基因组的位置是随机的，若插入到内源基因的编码区或调控区域，就可能
影响内源基因的正常功能，D 正确。
13．（2026·四川成都·二模）生物兴趣小组成员对高中生物学教材中的实验进行探究，下列关于实验的叙
述正确的是（ ）
A．调查遗传病时，选群体中发病率较高的单基因遗传病更容易推断其遗传方式
B．用高倍显微镜观察叶肉细胞，可以观察到叶绿体的形态、分布和双层膜结构
C．进行DNA 粗提取时，采用冷酒精作为DNA 的溶剂可初步分离DNA 与蛋白质
D．探究NAA 促进月季插条生根的最适浓度，进行预实验不需要设置清水对照组
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【答案】A
【详解】A、调查遗传病遗传方式时，单基因遗传病的遗传规律符合孟德尔遗传定律，选择群体中发
病率较高的单基因遗传病更易获得足够的家系样本，进而推断遗传方式，A 正确；
B、高倍光学显微镜仅能观察到叶绿体的形态和分布，叶绿体的双层膜属于亚显微结构，需要借助电
子显微镜才能观察到，B 错误；
C、DNA 不溶于酒精，蛋白质可溶于酒精，DNA 粗提取时加冷酒精的目的是析出DNA，冷酒精不是
DNA 的溶剂，C 错误；
D、预实验需要设置清水组作为空白对照，才能判断不同浓度NAA 对生根的作用是促进还是抑制，进
而缩小后续实验的浓度探究范围，D 错误。
14．（2026·四川成都·二模）2015 年，屠呦呦因发现青蒿素治疗疟疾的新疗法获得了诺贝尔奖。工业上青
蒿素一般从青蒿植株中提取，产量低，价格高。科研人员利用基因工程改造酵母菌，使其高效生产青
蒿酸（青蒿素前体），再通过优化代谢途径、发酵条件，极大地提高青蒿酸产量，最终再经化学转化
即可合成青蒿素，这一技术将青蒿素生产成本降低80%。下列叙述正确的是（ ）
A．需要利用花粉管通道法将青蒿酸合成基因导入酵母菌
B．青蒿素属于酵母菌代谢过程中产生的次生代谢物
C．发酵结束后，可通过过滤、沉淀等手段从发酵液中获得青蒿酸
D．与上述方法相比，利用青蒿细胞工厂化生产获得青蒿素的周期更长
【答案】D
【详解】A、花粉管通道法是将目的基因导入植物细胞的方法，而酵母菌是真菌，A 错误；
B、青蒿素原本是青蒿细胞的次生代谢物，而酵母菌原本不能合成青蒿酸（青蒿素前体），是通过基
因工程导入相关基因后才合成的，不属于酵母菌自身代谢产生的次生代谢物，B 错误；
C、青蒿酸是在酵母菌细胞内合成的，发酵结束后，需要用提取、分离和纯化的方法获得，而过滤、
沉淀得到的是菌体，C 错误；
D、利用青蒿细胞工厂化生产青蒿素，需要经历细胞的脱分化、再分化等过程，而基因工程改造的酵
母菌发酵生产的周期相对较短，因此，青蒿细胞工厂化生产的周期更长，D 正确。
15．（2026·四川内江·二模）我国育种工作者利用普通小麦（AABBDD，6n=42）与黑麦（RR，2n=14）培
育抗白粉病、抗秆锈病的优质小麦品系，过程如图1。黑麦1 号染色体上紧密连锁着抗白粉病基因
（P）和抗秆锈病基因（S），同时携带的L 基因会降低面粉品质；育种过程中利用如图2 的分子标记
a（与两抗病基因紧密绑定）、b（在两抗病基因下游）、c（位于L 基因内）进行筛选。下列叙述错
误的是（ ）
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A．乙的染色体组成为AABBDDRR，其减数分裂过程中可形成28 个四分体
B．γ 射线处理使黑麦1 号染色体片段插入普通小麦中的变异属于基因重组
C．在丁中检测到标记a 而无b、c 的株系，优于同时检测到a、b 而无c 的株系
D．育种过程中可利用白粉病、秆锈病病菌在个体水平对小麦抗病性进行鉴定
【答案】B
【详解】A、普通小麦（6n=42，说明一个染色体组含7 条染色体）产生的配子含21 条染色体（染色
体组ABD），黑麦（2n=14）产生的配子含7 条染色体（染色体组R），杂交得到的甲染色体组成为
ABDR；秋水仙素诱导染色体加倍后，乙的染色体组成为AABBDDRR，共含28 对同源染色体；减数
分裂时1 对同源染色体形成1 个四分体，因此可形成28 个四分体，A 正确；
B、γ 射线使黑麦染色体断裂，其片段插入普通小麦的染色体上，属于染色体结构变异（易位），B 错
误；
C、根据标记位置：标记a 与抗病基因P、S 紧密连锁，标记c 位于降品质的L 基因内。若检测到a、
无b 和c，说明仅插入了含抗病基因的片段，不携带不良基因L，且插入的无用片段最短；若检测到
a、b、无c，虽然也不含L，但插入的多余片段更长，对小麦原有优良性状影响更大，因此前者更优，
C 正确；
D、育种过程中，可在个体水平通过接种白粉病、秆锈病病菌，观察小麦发病情况，直接鉴定抗病性，
D 正确。
16．（2026·四川绵阳·二模）基因PCR 定点突变是蛋白质工程的重要技术，该技术需要设计含有非特异性
配对碱基的引物，再通过PCR 将突变位点引入到产物中。重叠延伸PCR 是发展最早的定点突变技术，
其操作流程如下图所示。下列分析错误的是（ ）
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A．蛋白质工程可以创造新的、自然界中不存在的蛋白质
B．应将引物1、2 与引物3、4 置于两个独立的反应体系中
C．步骤④使用DNA 聚合酶可对杂交分子甲和乙进行延伸
D．步骤⑤中如果完成6 轮循环一共需要消耗63 个引物1
【答案】C
【详解】A、蛋白质工程是通过改造基因来设计具有新功能的蛋白质，能够创造自然界中原本不存在
的蛋白质，A 正确；
B、引物1、2 用于扩增含突变位点的上游片段，引物3、4 用于扩增含突变位点的下游片段。若将四
组引物置于同一反应体系，会导致引物交叉结合、干扰PCR 产物的特异性，因此需在两个独立的反应
体系中分别扩增上下游片段，B 正确；
C、步骤④使用DNA 聚合酶可对分子乙进行延伸，甲不可延伸，C 错误；
D、PCR 过程中，引物的消耗数量为2n+1－2（n 为循环数），初始模板不消耗引物。6 轮循环后，总产
物数为27－2=126，因此消耗的引物1 数量为126÷2=63，D 正确。
故选C。
17．（2026·四川泸州·二模）研究发现，过敏性哮喘患者体内IgE 浓度显著高于正常范围，下图是生产一
种用于治疗该病的单克隆抗体的流程图。下列叙述错误的是（ ）
A．构建的表达载体含有抗IgE 抗体的基因
B．转化并培养大肠杆菌可获得大量的表达载体
C．该生产流程运用了动物细胞融合技术
D．该单克隆抗体进入患者体内后不会作为抗原被清除
【答案】C
【详解】A、图示目的是生产抗IgE 单克隆抗体，因此构建的表达载体含有抗IgE 抗体的基因，从而
可以在CHO 细胞株中稳定高效的表达，A 正确；
B、通过大肠杆菌的增殖，使得表达载体在大肠杆菌内扩增，从而获得大量的表达载体，B 正确；
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C、该实验是将质粒导入单克隆CHO 细胞株中稳定高效表达抗IgE 单克隆抗体，没有涉及动物细胞融
合技术，C 错误；
D、该单克隆抗体是由人源化抗IgE 抗体的cDNA 表达产生的，因此进入患者体内后不会作为抗原被
清除，D 正确。
故选C。
18．（2026·四川绵阳·二模）ε-聚赖氨酸（ε-PL）是一种主要由小白链霉菌生产的聚阳离子多肽。它对细菌、
酵母菌、霉菌和病毒都具有抑制作用，常作为食品抗菌防腐剂。通过连续发酵生产ε-PL 的流程为：①
选育高产抗病毒菌株并扩大培养→②发酵启动（初始pH 为6.8）→③补料发酵→④诱导合成ε-PL
（pH 降至4.0 左右）→⑤提取精制。下列叙述错误的是（ ）
A．食品中添加的ε-PL 可以被人体消化利用
B．可用基因工程或放射线诱变定向改造菌种
C．改变pH 可切换菌体代谢途径从而合成ε-PL
D．被杂菌污染或病毒侵染均可导致发酵失败
【答案】B
【详解】A、ε-PL 作为聚阳离子多肽，可被人体蛋白酶水解为赖氨酸吸收利用，符合食品添加剂特性，
A 正确；
B、基因工程可定向改造菌种，但放射线诱变属于诱变育种，具有不定向性，无法确保“定向改造”，
B 错误；
C、流程中pH 从6.8 降至4.0 诱导ε-PL 合成，说明环境条件（pH）可调节微生物代谢途径，C 正确；
D、杂菌污染会竞争营养、改变发酵条件；病毒侵染可破坏生产菌株，二者均会导致发酵失败，D 正
确。
故选B。
19．（2026·四川绵阳·二模）人类的每条5 号染色体上有2 个SMN1 或其等位基因。SMN1 有基因内长序
列缺失和微小突变（基因中一个或几个核苷酸发生变化）两种变异类型，其中长序列缺失的突变基因
不能通过现有引物进行PCR 扩增。无正常SMN1 基因的个体患脊髓性肌萎缩症（SMA），不考虑其
他变异，下列说法正确的是（ ）
A．SMN1 基因的长序列缺失属于染色体变异，微小突变属于基因突变
B．SMA 患者的基因型有5 种
C．通过PCR 扩增后电泳，有条带的个体均不患SMA
D．正常夫妇生下患病后代属于基因重组
【答案】B
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【详解】A、SMN1 基因的长序列缺失属于基因内部碱基序列缺失，属于基因突变，微小突变（基因
中一个或几个核苷酸发生变化）属于基因突变，A 错误；
B、根据题意可以设控制该病的基因型为A、a1、a2，a1、a2为两种突变产生的等位基因，因为每条5
号染色体上有2 个SMN1 或其等位基因，患者的基因型有a1a1a1a1，a2a2a2a2，a1a1a1a2，a1a1a2a2，
a1a2a2a2，5 种，B 正确；
C、仅发生长序列缺失的SMN1 基因不能通过PCR 扩增，因此通过PCR 扩增后电泳，有条带的个体也
可能因不含正常SMN1 基因而患SMA，C 错误；
D、患病基因是通过基因突变形成的等位基因，正常夫妇生下患病后代的原因是等位基因分离，等位
基因不发生基因重组，D 错误。
故选B。
20．（2026·四川绵阳·二模）下列关于实验选材或操作的叙述正确的是（ ）
A．洋葱鳞片叶外表皮细胞和黑藻成熟叶肉细胞均可用来观察质壁分离现象
B．应选择含叶绿体大且多的植物材料来观察叶绿体
C．低温诱导染色体数目加倍实验中，两次使用酒精的目的相同
D．用洋葱粗提取 DNA 实验中，研磨液经离心或低温静置后取沉淀物置于酒精中
【答案】A
【详解】A、洋葱鳞片叶外表皮细胞具有紫色液泡，黑藻成熟叶肉细胞含大液泡和叶绿体便于观察，
二者均可发生明显的质壁分离现象，A 正确；
B、观察叶绿体应选择叶绿体大但数量较少的材料（如藓类小叶），叶绿体过多会重叠影响观察，B
错误；
C、低温诱导实验中，第一次酒精（卡诺氏液）用于固定细胞，第二次酒精（解离液）用于解离组织，
目的不同，C 错误；
D、DNA 粗提取时，研磨液离心或静置后，DNA 溶于上清液，需取上清液加入冷酒精析出DNA，而
非取沉淀物，D 错误。
故选A。
21．（2026·四川绵阳·二模）泰番3 号是通过CRISPR/Cas9 技术精准编辑的番茄新品种，果实的产量和品
质显著提升，部分培育过程如图所示。下列说法正确的是（ ）
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A．该实验的目的基因Spr9 只能从番茄果实中获取
B．sgRNA 与靶DNA 特定碱基序列结合，结合区域最多含8 种核苷酸
C．步骤④中Cas9 蛋白的功能类似于限制酶，步骤⑤连接DNA 片段使用DNA 聚合酶
D．诱导生根的植物组织培养基中细胞分裂素/生长素的比例较高
【答案】B
【详解】A、番茄植株由受精卵发育而来，体细胞中含有的基因相同，故目的基因可以从多种细胞中
获取，A 错误；
B、sgRNA 与靶DNA 特定碱基序列结合，结合区域中sgRNA 为RNA（含A、U、G、C 四种核糖核苷
酸），靶DNA 为DNA（含A、T、G、C 四种脱氧核糖核苷酸），共涉及8 种核苷酸，B 正确；
C、步骤④中Cas9 蛋白通过催化磷酸二酯键水解将DNA 切断，功能类似于基因工程中的限制性内切
核酸酶，步骤⑤修复过程是将两个DNA 片段连接在一起，应该使用DNA 连接酶，C 错误；
D、生长素可诱导侧根和不定根的形成，因此诱导生根的植物组织培养基中细胞分裂素/生长素的比例
较低，D 错误。
故选B。
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二、解答题
22．（2026·四川凉山·二模）玉米的叶肉细胞能通过PEPC 酶将低浓度的CO2固定成C4，C4转运到维管束
鞘细胞后释放CO2，提高了维管束鞘细胞中CO2的浓度，再进行卡尔文循环，过程如图所示。卡尔文
循环的Rubisco 酶是CO2固定的关键酶，Rubisco 活化酶（RCA）可以调节Rubisco 酶的活化状态，玉
米RCA 基因的表达水平影响其光合速率。研究者以正常植株W 为参照，构建了RCA 基因表达显著增
加的植株R，实验结果如下表。回答下列问题：
植株
净光合速率
（μmol·m-2·s-1）
胞间CO2浓度
（ppm）
气孔导度
（mol·m-2·s-1）
W
29．4
47．5
174．7
R
33．6
30．7
175．1
(1)玉米中的PEPC 酶和Rubisco 酶都能固定CO2，与CO2的亲和力更强的是_____酶。据图所示生理过
程推测，维管束鞘细胞和叶肉细胞中的叶绿体有哪些方面的不同（答出1 点即可）：_____。
(2)图中由C5转变为PEP 的过程属于_____（填“吸能”或“放能”）反应，该过程产生的AMP 是由
ATP 脱离了两个磷酸基团形成的腺苷一磷酸，可以作为_____合成的基本单位。
(3)通过基因工程在玉米RCA 基因的启动子前连接具有组织特异性的增强子，可显著驱动RCA 基因的
表达，下列关于增强子的理解，正确的是_____（多选）。
①增强子是不具有遗传效应的DNA 片段 ②增强子由4 种脱氧核苷酸单体连接而成
③增强子单链上相邻碱基以氢键相连接 ④脱氧核糖与磷酸交替连接构成基本骨架
(4)用携带改造后的RCA 基因的农杆菌侵染玉米愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA 进入愈伤组织细
胞，将RCA 基因整合到_____上，将成功转化的愈伤组织诱导形成再生植株的过程称为_____。
(5)与植株W 相比，植株R 的气孔导度几乎没有变化，但净光合速率显著增加，原因是_____。
【答案】(1) PEPC 酶的种类不同（成分不同、结构不同）
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(2) 吸能 RNA/核糖核酸
(3)②④
(4) 染色体（DNA） 再分化
(5)Rubisco 活化酶（RCA）含量增加，提高了Rubisco 酶的活性，CO2固定速率增加，光合作用增强
【详解】（1）玉米中的PEPC 酶和Rubisco 酶都能固定CO2，其中与CO2的亲和力更强的是PEPC 酶，
正因为如此，玉米能利用较低浓度的二氧化碳。图中显示，维管束鞘细胞中能进行卡尔文循环，而叶
肉细胞中不能，因而可推测，维管束鞘细胞和叶肉细胞的叶绿体中酶的种类不同（成分不同、结构不
同）。
（2）图中由C5转变为PEP 的过程中消耗了ATP，因而属于“吸能”反应，该过程产生的AMP 是由
ATP 脱离了两个磷酸基团形成的腺苷一磷酸，为腺嘌呤核糖核苷酸，可以作为合成RNA（核糖核酸）
的原料。
（3）①增强子具有驱动基因表达的作用，因而是基因的结构，具有遗传效应，①错误；
②增强子可以连接到玉米RCA 基因的启动子前，说明其由4 种脱氧核苷酸单体连接而成的，②正确；
③增强子单链上相邻碱基以脱氧核糖-磷酸-脱氧核糖相连接，③错误；
④增强子也是DNA 片段，其基本骨架是由脱氧核糖与磷酸交替连接构成的长链组成，④正确。
（4）用携带改造后的RCA 基因的农杆菌侵染玉米愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA 进入愈伤组织
细胞，将RCA 基因整合到染色体DNA 上，将成功转化的愈伤组织诱导经过脱分化过程形成再生植株，
该过程属于植物组织培养过程。
（5）与植株W 相比，植株R 的气孔导度几乎没有变化，但净光合速率显著增加，这是因为Rubisco
活化酶（RCA）含量增加，提高了Rubisco 酶的活性，CO2固定速率增加，暗反应速率加快，因而光
合作用增强。
23．（2026·四川广元·二模）甘油三酯脂肪酶（LIP）在高温条件下易失活，限制了其工业应用。研究人员
从嗜热菌中分离得到一种热稳定蛋白HEAT，该蛋白具有耐高温特性。欲将HEAT 蛋白与LIP 融合，
获得耐高温的重组脂肪酶，部分实验流程如图所示。
（注：AUG 是起始密码子，UGA 是终止密码子。Hind Ⅲ、BamHⅠ和EcoRⅠ均表示限制酶）
(1)图中所示过程需将HEAT 基因和LIP 基因用_______（填工具酶）连接成融合基因，并成功表达出
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融合蛋白。在连接前必须对HEAT 基因的_______处（填序号）序列进行改造，其目的是
_______________。
(2)构建重组质粒时，应选用图中________限制酶对融合基因和质粒进行双酶切。
(3)获得HEAT-LIP 融合蛋白后，为检测其酶活性及热稳定性，设计了如下实验：
组别
处理条件
相对酶活性（%）
甲组
天然LIP，37℃处理
30min
100
乙组
天然LIP，70℃处理
30min
15
丙组
HEAT-LIP 融合蛋白，
70℃处理30min
82
分析实验结果，得出的结论是___________________________。
(4)研究人员希望将LIP 基因改造为LIP-M 基因，使LIP 第三位氨基酸由谷氨酸（Glu）变为天冬氨酸
（Asp），以进一步提高其催化效率。
脂肪酶
部分氨基酸序列
LIP
……Val-Glu-Leu-Gly-Phe-Arg……
LIP-M
……Val-Asp-Leu-Gly-Phe-Arg
通过设计引物并利用PCR 扩增技术将LIP 基因改造成LIP-M 基因，请写出基因的改造思路：
________________________。
【答案】(1) DNA 连接酶 ② 防止翻译在HEAT 蛋白合成后提前终止，导致无法继续翻
译LIP 蛋白（或防止翻译会在②处序列对应mRNA 上的终止密码子处停止，不会得到融合蛋白）
(2)Hind Ⅲ和BamH Ⅰ
(3)说明HEAT 蛋白能提高LIP 的热稳定性
(4)根据LIP—M 第三位氨基酸的差异，设计一条含有突变碱基的引物。用该突变引物和另一端的普通
引物，以LIP 基因为模板进行PCR 扩增，即可获得LIP—M 基因
【详解】（1）DNA 连接酶能将两个DNA 片段连接起来，形成磷酸二酯键，故HEAT 基因和LIP 基因
可通过DNA 连接酶连接起来。基因②处序列对应mRNA 上的终止密码子，为防止翻译在HEAT 蛋白
合成后提前终止，导致无法继续翻译LIP 蛋白，故需要对HEAT 基因②处的序列进行改造。
（2）目的基因需要插在启动子和终止子之间，同时为确保目的基因与载体定向拼接，需要用Hind Ⅲ
和BamH I 处理目的基因和质粒。
（3）对比甲组（天然LIP 在37℃处理，相对酶活性100%）和乙组（天然LIP 在70℃处理，相对酶活
性仅15%）的结果，可以看出天然LIP 在高温（70℃）条件下酶活性显著下降，热稳定性较差。而丙
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组中，HEAT-LIP 融合蛋白在70℃处理30 分钟后，相对酶活性仍能达到82%，远高于相同高温条件下
天然LIP 的15%，这表明融合了HEAT 蛋白后，重组脂肪酶在高温环境下仍能保持较高的酶活性，即
HEAT 蛋白的融合有效提高了LIP 的热稳定性。
（4）要实现LIP 基因第三位氨基酸由谷氨酸（Glu）变为天冬氨酸（Asp），首先需要明确两种氨基
酸对应的密码子，然后可根据LIP—M 第三位氨基酸的差异，设计一条含有突变碱基的引物，使用该
突变引物和另一端的普通引物，以LIP 基因为模板进行PCR 扩增，即可获得LIP—M 基因。
24．（2026·四川达州·二模）科研团队为培育出能发荧光的转基因小鼠（性别决定为XY 型），将水母绿
色荧光基因（GFP）插入质粒中，构建基因表达载体。下图为GFP 基因结构（黑色为编码氨基酸的区
域）、质粒结构和几种限制酶的识别序列及切割位点。回答下列问题。
(1)为确保GFP 能正确连接到质粒中，应使用限制酶________（填名称）切割质粒。若用所选限制酶
切割质粒时，发现质粒完全没有被切开，其原因可能是________。
①限制酶已失活 ②质粒DNA 突变导致限制酶识别位点缺失
③限制酶用量少 ④酶切位点被甲基化修饰而不能被限制酶识别
(2)为获得大量用于转基因操作的GFP，应选用的引物组合是________（从P1～P5中选择）。GFP 编码
的前两个氨基酸分别是甲硫氨酸（密码子为AUG）、色氨酸（密码子为UGG），为了既能保证GFP
准确复制又便于限制酶识别和切割，则选用的左侧引物的碱基序列为5′-________-3′（写出前12 个即
可）。
(3)GFP 可突变成黄色荧光基因（YFP）。将导入1 个GFP 的雄鼠与导入1 个YFP 的雌鼠进行多次杂交，
子代中黄色荧光雌鼠∶无荧光雌鼠∶黄绿荧光雄鼠∶绿色荧光雄鼠＝1 1 1 1
∶∶∶。根据杂交实验结果，分
别写出GFP 和YFP 所在的染色体情况________________。
(4)GFP 常作为报告基因，其编码的蛋白质在紫外光激发下能发出稳定的绿色荧光；GFP 常连接在目的
蛋白基因的末端而形成融合基因，表达生成的荧光蛋白与目的蛋白连接在一起，但并不影响各自的功
能。下列分析正确的有________。
A．GFP 在受体细胞中是否表达，最简单的检测方法是DNA 分子杂交
B．GFP 的表达产物可用于检测被研究蛋白基因在受体细胞内的表达量
C．GFP 的表达产物可用于检测被研究蛋白在受体细胞内的加工和运输途径
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D．GFP 与染色体蛋白基因形成融合基因，可用于研究细胞分裂中染色体的变化
【答案】(1) MfeⅠ、HindⅢ ①②④
(2) P2和P4 GAATTCATGTGG
(3)GFP 位于Y 染色体上，YFP 位于常染色体上或X 染色体上
(4)BCD
【详解】（1）要保证GFP 完整、正确插入质粒的启动子和终止子之间，需要双酶切避免质粒自连和
反向连接：GFP 编码区完整片段左侧可被BamHⅠ或EcoRⅠ切割，右侧可被HindⅢ切割，而质粒上
BamHⅠ切割位点在启动子上不能使用，且如果用EcoRⅠ和HindⅢ切割质粒会把终止子切除所以不能
用，而MfeⅠ切割产生的黏性末端和EcoRⅠ的黏性末端相同，所以可以用MfeⅠ和HindⅢ这两种酶切割
质粒，同时用EcoRⅠ和HindⅢ这两种酶切割目的基因。限制酶切割失败的可能原因包括：限制酶失活
无法切割、质粒突变导致识别位点丢失、酶切位点被甲基化修饰后无法被限制酶识别；而限制酶用量
不足只能切割效率低而不是完全没有切开，①②④符合题意，③不符合题意。
（2）PCR 扩增目的基因时，两个引物需要分别结合目的基因两端，延伸方向朝向目的基因内部：P4
在编码区左侧，延伸方向向右（朝向编码区），P2在编码区右侧，延伸方向向左（朝向编码区），因
此选P2和P4。题目要求便于限制酶切割，因此引物5'端需要添加限制酶识别序列（据图可知左侧用
EcoRⅠ，识别序列为GAATTC，共6 个碱基）；据图可知左侧引物P4与模板链互补扩增链为编码链，
前两个氨基酸密码子为AUG、UGG，对应编码链DNA 序列为ATGTGG（共6 个碱基），因此前12
个碱基为GAATTCATGTGG。
（3）根据子代性状分离比：所有雄鼠都携带GFP，所有雌鼠都不携带GFP，说明GFP 随Y 染色体遗
传，即GFP 位于Y 染色体；亲代雌鼠有一个YFP，雄鼠没有YFP，而子代雌雄鼠都一半携带YFP，
一半不携带，所以YFP 既可能在X 染色体上也可能位于常染色体上。
（4）A、GFP 表达后的产物可直接在紫外激发下发出荧光，因此检测GFP 是否表达最简单的方法是
直接观察荧光，DNA 分子杂交用于检测受体细胞中是否插入目的基因，不是检测表达的最简单方法，
A 错误；
B、GFP 荧光强度与GFP 的量正相关，融合蛋白中目的蛋白与GFP 量一致，因此可以通过荧光强度检
测目的基因的表达量，B 正确；
C、融合蛋白中GFP 不影响目的蛋白的功能，随目的蛋白加工运输，因此可以通过观察荧光位置，检
测目的蛋白的加工和运输途径，C 正确；
D、GFP 与染色体蛋白融合后，染色体可显示荧光，便于观察细胞分裂中染色体的行为变化，D 正确。
25．（2026·四川成都·二模）蚊子传播疟疾等疾病，每年影响全球超20 亿人。传统化学杀虫剂因蚊虫产生
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广泛抗性而效果下降，急需开发新型环保防控手段。昆虫病原真菌对蚊虫致病力强、环境较安全，但
自然传播效率低。为此，科研人员通过在昆虫病原真菌中表达吸引蚊虫的长叶烯基因（L），构建了
传播能力更强的基因工程菌。请回答下列问题：
(1)基因工程菌是_________。L 基因可通过人工合成也可以通过____________（写出两种方法）获取。
(2)构建重组DNA 分子时，图中质粒还缺少的必备元件是_____。为使基因L 能正确连接到图中质粒，
应选用限制酶___________来处理质粒。
(3)获得转基因真菌的关键步骤为__________，此后将其导入野生真菌中以获得转基因真菌，并应在
______的培养基上筛选工程菌。通过PCR 鉴定是否成功导入目的基因时，若模板DNA 分子上两个引
物结合区之间有一个与引物识别序列高度相似的序列，则电泳结果除目的基因所在条带外，还出现一
个与加样孔距离更_____（填“远”或“近”）的条带。
(4)利用真菌消灭蚊虫属于_____防治。为进一步提升工程菌的防控效果，科学家准备将继续改造真菌
使其能定殖于蚊虫滋生地（如水体边缘），持续释放吸引物质。请分析其可能带来的潜在风险：
______。
【答案】(1) 用基因工程方法，使外源基因得到高效表达的菌类 构建基因文库、PCR 扩增
(2) 复制原点 BamHⅠ、EcoRⅠ
(3) 构建长叶烯基因表达载体 缺少尿嘧啶 远
(4) 生物 基因工程菌在环境中持续存活和扩散，可能对局部生态系统产生未知影响；存在基
因向环境中其他微生物发生水平转移的潜在风险，造成基因污染
【详解】（1）基因工程菌是指用基因工程方法，使外源基因得到高效表达的菌类；L 基因可通过人工
合成，也可以通过构建基因文库、利用PCR 扩增获取。
（2）构建重组DNA 分子时，质粒有启动子、终止子，质粒还缺少的必备元件是复制原点；由于模板
链两端具有BglII 和EcoRI 酶切位点，而BglII 会切掉启动子，因此选择与BglII 具有相同酶切末端的
BamHⅠ，质粒上具有BamHⅠ和EcoRⅠ，选择限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ，基因L 能正确连接，因此应选用
限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ处理质粒。
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（3）获得转基因真菌的关键步骤构建长叶烯基因表达载体；由于质粒上含有URY3，是真菌筛选标记
基因，缺失该基因真菌无法合成尿嘧啶，因此转入该质粒的真菌能合成尿嘧啶，因此应在缺少尿嘧啶
的培养基上筛选；通过PCR 鉴定是否成功导入目的基因时，若模板DNA 分子上两个引物结合区之间
有一个与引物识别序列高度相似的序列，则可能有部分引物与该高度相似的序列结合，扩增出比模板
DNA 更短的一系列DNA 分子，则电泳结果除目的基因所在条带外，还出现一个与加样孔距离更远的
条带。
（4）生物防治包括利用生物之间的种间关系达到防治的目的，因此利用真菌消灭蚊虫属于生物防治；
该方法可能带来的潜在风险：基因工程菌在环境中持续存活和扩散，可能对局部生态系统产生未知影
响；存在基因向环境中其他微生物发生水平转移的潜在风险，造成基因污染。
26．（2026·四川南充·二模）乳糖不耐受症是由于人体小肠中乳糖酶缺乏，导致无法消化乳糖而引起的胃
肠不适。利用基因工程菌生产乳糖酶，进而制备低乳糖乳制品，是解决该问题的重要途径。科研人员
将乳酸克鲁维酵母的LacZ 基因（编码乳糖酶）导入大肠杆菌构建工程菌，LacZ 基因和质粒的结构如
图甲所示。回答下列问题。
注：1．AmpR为氨苄青霉素抗性基因；2．限制酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ的识别序列分别为5′-G↓GATCC-3′和5′-
G↓AATTC-3′。3．甘氨酸的密码子为GGU、GGA，丝氨酸密码子为UCC、UCG。
(1)获取并快速扩增LacZ 基因的常用方法是______。
(2)构建重组质粒是构建工程菌的核心工作。
①若用单酶切法（仅用一种限制酶）构建重组质粒，应选择限制酶_______；在快速扩增LacZ 基因时，
需在2 个引物的5′端添加_______（填碱基序列）。
②若用双酶切法（EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ）构建重组质粒，需要利用基因编辑技术将LacZ 基因中BamH Ⅰ
识别序列（该序列编码甘氨酸和丝氨酸）替换为_______。
(3)已知乳糖酶可以分解无色物质X-gal 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色。将重组质粒导入大肠杆菌后，
检测大肠杆菌工程菌构建成功的思路是_______。
(4)为便于分离纯化，研究人员将纤维素结合结构域（CBD）基因与LacZ 基因融合，构建了新的表达
载体（如图乙）。
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注：1．F1、F2、R1、R2 为引物；2．CBD 基因编码的蛋白结构域能可逆地吸附在纤维素材料表面。
①构建新的重组质粒后，为了确定CBD 基因连接到质粒中且插入方向和位置正确需要PCR 后电泳检
测，若仅用一对引物，应选择图乙中的引物是_______。
②经检测，融合蛋白成功表达。请简述利用该融合蛋白的特性，分离获得纯净乳糖酶的基本思路
_______。
(5)若希望将该工程菌用于大规模工业化生产乳糖酶，在完成上述实验室构建和验证后，还需在哪些方
面进行深入研究？（答出2 点即可）______。
【答案】(1)PCR（或聚合酶链式反应）
(2) EcoR Ⅰ 5′-GAATTC-3′ 5′-GGTTCC-3′、5′-GGATCG-3′、5′-GGTTCG-3′
(3)将工程菌涂布在含氨苄青霉素和X-gal 的固体培养基上，培养后筛选蓝色菌落
(4) F2 和R1 利用CBD 与纤维素的亲和性获取融合蛋白，再切除CBD 获得纯净乳糖酶
(5)发酵工程中培养基配方和发酵条件；乳糖酶的最适条件和热稳定性等
【详解】（1）获取并快速扩增LacZ 基因的常用方法是PCR（或聚合酶链式反应）。
（2）① 单酶切时，LacZ 基因内部已经存在BamHⅠ的识别位点，使用BamHⅠ切割会破坏目的基因，
因此只能选择EcoRⅠ；需要在引物的5′端添加EcoRⅠ的识别序列GAATTC，方便后续酶切构建重组质粒。
② 原BamHⅠ识别序列5′−GGATCC−3′正好对应编码甘氨酸（密码子GGA）和丝氨酸（密码子
UCC），替换后需要保留两个氨基酸的编码，同时去除BamHⅠ识别序列，改为5′-GGTTCC-3′、5′-
GGATCG-3′、5′-GGTTCG-3′都符合要求。
（3）氨苄青霉素抗性基因可筛选出成功导入质粒的大肠杆菌，而成功构建的工程菌会表达乳糖酶，
分解
X−gal 使菌落变蓝，因此可通过将工程菌涂布在含氨苄青霉素和X-gal 的固体培养基上，
培养后筛选蓝色菌落。
（4）①PCR 验证插入方向时，引物需要分别结合在插入片段CBD 的上游、下游目的序列LacZ 的下
游，只有F2（CBD 上游正向引物）和R1（LacZ 下游反向引物）符合，若能扩增出对应长度的片段，
说明插入方向和位置正确。
② 利用CBD 与纤维素的亲和性获取融合蛋白，再切除CBD 获得纯净乳糖酶得到融合蛋白（乳糖
酶）。
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（5）若希望将该工程菌用于大规模工业化生产乳糖酶，在完成上述实验室构建和验证后，还需在发
酵工程中培养基配方和发酵条件；乳糖酶的最适条件和热稳定性等方面进行深入研究。
27．（2026·四川成都·二模）我国科学家于2026 年1 月首次提出长基因递送治疗性策略AAVLINK，该方
法先将长基因分成Ⅰ、Ⅱ两段，分别装进两个腺相关病毒(AAV)中，一个AAV 携带基因Ⅰ片段和
LoxP 位点，另一个AAV 除携带基因Ⅱ片段、LoxP 位点外，还携带Cre 重组酶基因及调控该基因表达
的Poly(A)。两个装载着长基因片段的AAV 载体进入细胞后，Cre 重组酶会精准识别并切割LoxP 位点，
并再将拆分的两个基因片段实现精准重组(如图甲)。图乙为LoxP 序列的结构示意图。回答下列问题：
(1)该技术中的Cre 酶，其功能兼有DNA 重组技术中两种常见工具的作用，这两种工具是___________。
Cre 酶切开一个LoxP 的间隔序列后形成的末端形式是___________末端。LoxP 位点具有方向性，推测
其方向性是由图乙中的___________序列决定的。
(2)根据图示信息，按照从左往右的顺序，依次写出图甲中第二步重组完成后问号区域DNA 片段的组
成：___________。重组发生后，Cre 重组酶基因的表达会被迅速关闭，以免破坏已拼接好的长基因。
从AAV 载体的相关结构分析，Cre 重组酶基因表达关闭的原因可能是___________。
(3)Cre-LoxP 是一种广泛应用的基因编辑工具。研究者想要敲除某个目的基因，需要在目的基因两端分
别插入LoxP 位点，如图丙所示，方式1 在目的基因两端插入同向的LoxP 位点，方式2 在目的基因两
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端插入反向的LoxP 位点。
其中方式___________(填“1”或“2”)才能实现目的基因的敲除；若选择另一种方式，Cre 酶切割下来
的目的基因能翻转180°再连接回去，原因是___________。
【答案】(1) 限制酶、DNA 连接酶 黏性 间隔
(2) 启动子-cre-LoxP 位点 没有Poly（A），Cre 基因无法表达（或Cre 基因的启动子为诱导
型启动子）
(3) 1 目的基因两端反向LoxP 位点经Cre 酶切割后，形成的黏性末端相同
【详解】（1）Cre 酶能精准识别并切割LoxP 位点，这类似于限制酶切割特定DNA 序列的功能；同时
它还能将拆分的两个基因片段实现精准重组，这又类似于DNA 连接酶连接DNA 片段的功能，因此两
种工具是限制酶和DNA 连接酶。分析题图乙可知，Cre 酶切开一个LoxP 的间隔序列后形成黏性末端。
图乙中两侧的反向重复序列碱基排列顺序一致，无法确定方向，则能决定方向的只有中间的间隔序列。
（2）两个AAV 载体经Cre 重组后，发生片段交换：AAV1 的LoxP 位点下游连接上Ⅱ片段和Poly(A)
（即图中第二步上方的产物），AAV2 原来位于LoxP 下游的Ⅱ-Poly(A)交换出去后，剩余片段从左到
右为启动子-Cre-LoxP 位点。原本Cre 重组酶基因下游带有Poly(A)，重组后Poly(A)随Ⅱ片段转移到另
一个重组DNA 上，Cre 基因因缺少Poly(A)无法表达（或Cre 基因的启动子为诱导型启动子）。
（3）当两个LoxP 位点同向时（方式1），Cre 酶切割后会切除两个位点之间的目的基因，实现目的
基因敲除。当两个LoxP 反向时（方式2），由于DNA 双链反向平行，目的基因被切下后翻转180°，
形成的黏性末端相同，两端的末端仍然可以互补配对，因此会翻转后重新连接回原位置。
28．（2026·四川成都·二模）雄性不育是指雄蕊发育不正常，但雌蕊正常，水稻（2n=24）的雄蕊是否可育
由细胞核基因和细胞质基因共同决定。袁隆平在1987 年曾指出，杂交水稻的育种可以分为三系法、
二系法和一系法三个战略发展阶段。三系法是通过培育雄性不育系、保持系和恢复系三个纯合品系来
培养杂交水稻，培育过程如图1 所示；二系法利用了水稻细胞核中的光温敏基因，光温敏水稻在特定
的光周期与温度组合条件下表现为雄性不育，杂交水稻的培育过程如图2 所示。回答下列问题：
(1)水稻基因组计划需测定______条染色体上的DNA 序列。
(2)水稻细胞质中存在正常可育基因（N）和雄性不育基因（S），细胞核中存在可育恢复基因（R）和
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非恢复基因（r），且R 对r 显性。三系法中雄性不育系基因型可表示为S（rr），只能作____（“父
本”或“母本”），理论上雄性可育水稻的基因型有____种。为了持续获得雄性不育系水稻，应使用
雄性不育系与保持系进行杂交，保持系的基因型为_____。雄性不育系与恢复系杂交得到的杂交水稻
连续自交两代，F2中雄性不育个体所占的比例为____。
(3)二系法中光温敏水稻在不同条件下育性不同的根本原因是______，这说明生物性状由______调控。
(4)已知水稻细胞核中雄性不育基因ms 对雄性可育基因Ms 为隐性。为简化育种流程，科研人员设计
了含有三大功能基因模块的表达载体，并将其导入隐性核雄性不育水稻中，最终筛选出单一位点插入
T-DNA 的水稻植株作为SPT 保持系，以实现保持系自交即可同时得到不育系和保持系。已知表达载体
的T-DNA 片段如图3 所示，在农杆菌侵染植物细胞时T-DNA 会整体转移到植物细胞的染色体DNA 上。
调查统计发现SPT 保持系花粉中，可育花粉与不育花粉的比例约为1:1，据此推测，基因A 的作用是
______。利用SPT 保持系获得并筛选雄性不育水稻种子的最简单的方案是_____。
【答案】(1)12
(2) 母本 5 N（rr） 1/6
(3) 基因的选择性表达 基因和环境
(4) 使含基因A 的花粉失活 用SPT 保持系自交获得种子，选出不能发出红色荧光的种子
【分析】分析题干信息可知：雄性的育性由细胞核基因和细胞质基因共同控制，基因型包括：N
（RR）、N（Rr）、N（rr）、S（RR）、S（Rr）、S（rr）。其中R 和N 为可育基因，r 和S 为不育
基因；只有当核、质中均为不育基因时才表现为不育，故只有S（rr）表现雄性不育，其他均为可育，
即只要存在可育基因，就表现为可育。
【详解】（1）水稻2n=24，是雌雄同株植物，没有性染色体（X、Y）之分。基因组测序只需测一个
染色体组的染色体，即24÷2=12 条。
（2）雄性不育，雄蕊异常，不能产生可育花粉，但雌蕊正常，只能接受花粉，作母本。细胞质基因：
N（可育）、S（不育），细胞核基因：R（可育恢复，显性）、r（非恢复，隐性），因此育性判断：
① 细胞质为N：无论核基因如何，全部可育②细胞质为S：核基因RR/Rr 可育，核基因rr 不育，雄性
可育水稻基因型种类，细胞质 N：N(RR)、N(Rr)、N(rr) 共3 种，细胞质 S：S(RR)、S(Rr) 共2 种，
理论上雄性可育水稻的基因型有5 种；细胞质：母本 S，子代细胞质一定为 S，细胞核：母本 rr ×
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父本，子代必须全为 rr，父本核基因型必须为rr，细胞质必须为N（自身可育）即保持系基因型：
N(rr)； 雄性不育系与恢复系杂交得到的杂交水稻连续自交两代，不育系S(rr)× 恢复系S(RR)，杂交
水稻基因型：S(Rr)，S(Rr) →S(RR):S(Rr):S(rr)=1:2:1
⊗
，不育个体S(rr)不再自交，因此，只有S(Rr)自
交才会产生S(rr)，S(Rr)占2/3，自交后代1/4 为S(rr)，因此不育比例为2/3×1/4=1/6。
（3）光温敏水稻基因未改变，但在不同光照、温度下育性不同。根本原因：基因的选择性表达（相
同基因在不同环境下表达情况不同），性状由：基因（基因型）和环境共同调控。
（4）SPT 保持系基因型：隐性核不育msms+转入T-DNA（含 Ms、A、标记基因），正常：msms 雄
性不育，转入 Ms 后：核可育基因恢复，理论上花粉都可育但实际花粉可育∶不育 = 1 1∶， 说明基因
A 会让含该转基因的花粉不育（致死），只有不含转基因的花粉可育。由于SPT 保持系的利用了SPT
的T-DNA，其上含有的pLTP2 为种子特异性启动子，其可以合成红色荧光蛋白编码的基因，因此种子
能发出红色荧光的植株含有SPT 的T-DNA，具有育性，因此获得并筛选雄性不育水稻种子的最简单的
方案是用SPT 保持系自交获得种子，选出不能发出红色荧光的种子。
29．（2026·四川宜宾·二模）传统的CRISPR/Cas9 系统原理如图1、2 所示，科学家通过突变得到一个没有
核酸酶活性的Cas9 蛋白，使其失去切割DNA 的功能，但与sgRNA 结合等功能不变，这样的Cas9 称
之为dCas9，目前CRISPR/dCas9 系统常用于基因组转录调控。研究者设计了一套CRISPR/dCas9 系统
Y，将其导入某大肠杆菌菌株中，可以实现对多个基因的同步激活与抑制，以提高该菌抗肿瘤化合物
Z 的产量。
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(1)系统Y 中可以含有多种序列不同的sgRNA，sgRNA 依据_________原则与目标序列特异性结合，引
导dCas9 结合到DNA 上。
(2)图2 是sgRNA 构建过程示意图，过程甲对特征序列和重复序列扩增需在不同的PCR 体系中进行，
原因是_________________。最早在经历_________个循环后出现产物A．过程乙可分两个环节，第一
个环节，过程甲的产物A、B 在高温下解旋形成单链，复性后延伸，得到重组DNA 片段，该环节
_________（填“需要”或“不需要”）引物，原因是______。
(3)研究者检测了系统Y 对基因的激活效果，当sgRNA 靶向结合R 基因的上游区域时，Z 产量提升约
2.9 倍。系统Y 中dCas9 蛋白和转录激活因子P 蛋白相连，sgRNA 可以与dCas9 自动组装到一起。推
测当sgRNA 与R 基因的上游区域结合，P 蛋白可募集_________酶启动R 基因转录，有利于Z 的合成。
(4)研究者检测了系统Y 对基因的抑制效果，设计了能靶向结合F 基因（与细胞分裂相关）不同区域
Q1 和Q2 的sgRNA1、sgRNA2，分别转入不同的大肠杆菌中，细胞数量相对值如图3.
实验表明：____________。
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【答案】(1)碱基互补配对
(2) R1和F2部分序列互补，会导致PCR 失败 3 不需要 此时两条DNA 的同源部分
即可作为其延伸的引物
(3)RNA 聚合
(4)系统Y 能抑制基因表达（两种靶向结合区域均能抑制基因表达）；靶向Q1 时效果更好；P 蛋白不
影响系统Y 的抑制功能
【详解】（1）系统Y 中可以含有多种序列不同的sgRNA，sgRNA 依据碱基互补配对原则与目标序列
特异性结合，引导dCas 结合到DNA 上。
（2）由图2 可知，R1和F2部分序列互补，会导致PCR 失败，故甲对特征序列和重复序列扩增需在不
同的PCR 体系中进行。PCR 中，第1 个循环形成2 条DNA 链，第2 个循环形成4 条DNA 链，第3 个
循环才能得到与目标序列长度一致的产物，所以经历3 个循环后出现产物A。过程乙可分两个环节，
第一个环节，过程甲的产物A、B 在高温下解旋形成单链，复性后延伸，得到重组DNA 片段，不需要
引物，是因为产物A 和B 的单链之间存在互补序列，复性时可以互补结合，延伸时DNA 聚合酶可以
以此为模板进行延伸。
（3）P 蛋白是转录激活因子，可募集RNA 聚合酶启动R 基因转录，从而有利于Z 的合成。
（4）对照组不含sgRNA（无靶向结合），细胞数量相对值为1；实验组转入sgRNA1 或sgRNA2，均
含dCas9，部分组含P 蛋白。 结果分析：与对照组相比，靶向Q1 和Q2 的实验组细胞数量均低于1，
说明dCas9 结合到F 基因（细胞分裂相关基因）后，抑制了F 基因的表达。靶向Q1 的实验组细胞数
量比靶向Q2 的更低，说明靶向F 基因的Q1 区域时，抑制效果更显著，含P 蛋白与不含P 蛋白的组细
胞数量无明显差异，说明P 蛋白不影响系统Y 的抑制功能。
30．（2026·四川内江·二模）全球气候变暖对植物生长发育构成严峻挑战。高温胁迫下，植物细胞中的光
系统Ⅱ（PSⅡ，主要由色素—蛋白复合体组成）对光能的吸收、传递和转化功能受阻，进而影响光合
速率。为培育耐高温的芍药品种，某研究团队以芍药为材料，探究褪黑素（可增强植物的高温抗性）
合成途径中的关键基因PITDC 调控芍药响应高温胁迫的机制。回答下列问题：
(1)PSⅡ位于叶绿体的_____上，其色素主要吸收_____光。
(2)研究人员对PITDC 基因沉默（不表达）及野生型芍药植株进行高温胁迫处理，测得相关指标如图
1。
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注：SOD 为超氧化物歧化酶，可清除活性氧（活性氧会攻击脂质、蛋白质等）；Fv/Fm 反映PSⅡ的光
能转化效率，其数值越大，效率越高；Gs 为气孔导度。
据图推测，高温胁迫下，PITDC 基因沉默植株的光合速率_____（填“低于”、“等于”或“高
于”）野生型植株，理由是_____。
(3)为提高芍药植株中PITDC 基因的表达，研究人员筛选出PITOE3 蛋白。为探究该蛋白能否与PITDC
基因启动子结合，研究人员依据PITDC 基因启动子特异性序列制备了荧光标记的DNA 探针和未标记
的同源探针；同时依据PITDC 基因启动子的突变序列，制备了未标记的突变探针，进行了相关实验，
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结果如图2（仅标记探针可产生可见条带）。
注：“+”表示加入，“-”表示未加入；“10×”、“50×”表示加入量为标记DNA 探针的倍数；“？”处
结果未展示。
①第5 组中加入的物质从上到下依次应为_____（用“+”“-”表示）。
②当第4 组条带1“？”处的结果比第3 组_____（填“更宽”或“更窄”）时，可判断PITOE3 蛋白能
与PITDC 基因启动子特异性结合。
(4)为进一步研究PITOE3 蛋白与PITDC 基因启动子之间的调控关系，研究人员构建了对照组基因表达
载体，结构为
，
则实验组的基因表达载体需在对照组基础上，在CaMV5S 与终止子2 之间添加_____。若实验组的荧
光强度_____（填“高于”、“低于”或“等于”）对照组，表明PITOE3 蛋白能激活PITDC 基因启
动子。
(5)根据上述研究结果，请从基因工程的角度为培育耐高温的芍药品种提出一条可行思路：_____。
【答案】(1) 类囊体薄膜 红光和蓝紫光
(2) 低于 高温胁迫下，PITDC 基因沉默植株的SOD 活性、Fv/Fm 和Gs 均低于野生型，因而
叶绿体膜受到损伤，色素光能转化效率低且吸收二氧化碳少，因而光合速率低。
(3) +、+、-、+ 更窄
(4) PITOE3 基因 高于
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(5)将PITOE3 基因导入芍药，使其过表达，增强PITDC 基因的转录，从而提高植株在高温胁迫下的光
合效率与抗氧化能力
【详解】（1）PSⅡ为色素-蛋白复合体，位于叶绿体的类囊体薄膜上，其色素主要吸收红光和蓝紫光。
（2）据图推测，高温胁迫下，PITDC 基因沉默植株的SOD 活性较低，清除活性氧能力弱，且Fv/Fm
下降明显，说明PSⅡ的光能转化效率低，受损严重，同时PITDC 基因沉默植株的气孔导度较低，因
而吸收二氧化碳较少，可见PITDC 基因沉默植株的光合速率“低于”野生型植株。
（3）为探究PITOE3 蛋白能否与PITDC 基因启动子结合，研究人员依据PITDC 基因启动子特异性序
列制备了荧光标记的DNA 探针和未标记的同源探针；同时依据PITDC 基因启动子的突变序列，制备
了未标记的突变探针，进行了相关实验，组1 作为对照，加入标记的DNA 探针后没有产物出现，说
明该标记的探针与启动子结合，抑制了该基因的表达，而组5 有相应蛋白质表达，其作为对照，说明
该体系中可表达相关蛋白质，其中相应需要添加的物质是标记的DNA 探针、蛋白PITOE3 和未标记的
突变探针，其他均不需要加入；组2 中加入蛋白PITOE3 后，其与标记的DNA 探针结合，进而使相关
基因表达。组3 中由于加入了未标记的同源探针，其与相应的启动子结合后抑制了相关基因表达，因
而表达产物减少，据此推测，组4 中加入了更多的未标记的同源探针，因而会使相应的基因表达更少，
即当第4 组条带1“？”处的结果比第3 组更窄时，可判断PITOE3 蛋白能与PITDC 基因启动子特异性
结合。
（4）为进一步研究PITOE3 蛋白与PITDC 基因启动子之间的调控关系，研究人员构建了对照组基因
表达载体，结构为
，
则实验组的基因表达载体需在对照组基础上，在CaMV5S 与终止子2 之间添加PITOE3 基因。若实验
组的荧光强度“高于”对照组，表明PITOE3 蛋白产生后与相应的启动子结合进而激活了PITDC 基因
启动子。
（5）根据上述研究结果，为培育耐高温的芍药品种可设法将PITOE3 基因导入芍药，使其过表达，增
强PITDC 基因的转录，从而提高植株在高温胁迫下的光合效率与抗氧化能力，获得耐高温品种。
31．（2026·四川内江·二模）乙型肝炎病毒（HBV）包膜上存在S 和PreS1 抗原蛋白，HBV 通过PreS1 抗
原蛋白与肝细胞表面受体特异性结合而入侵。病毒入侵肝细胞后产生的cccDNA（共价闭合环状
DNA）可在细胞内长期留存，并持续指导新病毒的合成，这是慢性乙型肝炎难以根治的重要原因。科
研人员研发了一种含PreS1-S 融合基因的DNA 疫苗（结构如图），以期联合药物实现“功能性治愈”。
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回答下列问题：
注：F1、F2、F3 为引物；CMV 启动子是真核细胞的启动子；识别并结合T7 启动子的RNA 聚合酶由
T7 噬菌体基因编码。
(1)人工合成PreS1-S 融合基因时，需先根据_____的氨基酸序列推测脱氧核苷酸序列，再通过化学方法
合成。
(2)构建重组质粒时，为确定PreS1-S 融合基因是否已正确连接到质粒上，应选择图中的一对引物_____
对待测质粒进行PCR 扩增。
(3)构建重组菌时，将正确连接的重组质粒导入大肠杆菌后，需接种在含_____的固体培养基上进行初
步筛选。融合基因不能在重组菌中表达，原因是_____。
(4)为确保DNA 疫苗能在人体细胞内正常表达，在对测序正确的重组菌扩大培养生产疫苗之前，通常
需要在体外检测该基因能否正常表达。此时，需向反应体系中加入能与T7 启动子特异性结合的_____，
以确保转录过程的启动。
(5)对模型动物皮内注射该DNA 疫苗并结合电穿孔处理（增大细胞膜通透性）后，疫苗可进入细胞内
表达出融合抗原。该抗原经加工后呈递在细胞表面，可被B 细胞和T 细胞识别引发_____。与传统仅
含S 抗原的预防型疫苗相比，该DNA 疫苗治疗慢性乙型肝炎的优势是_____。
【答案】(1)S 和PreS1 抗原蛋白
(2)F1和F3
(3) 卡那霉素 融合基因的首端是CMV 启动子，该启动子是真核细胞的启动子，其只能在真
核细胞驱动转录，且大肠杆菌中没有与T7 启动子结合的RNA 聚合酶。
(4)RNA 聚合酶
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(5) 体液免疫和细胞免疫 该疫苗含PreS1-S 融合基因，可表达两种抗原，诱导产生S 抗体和
PreS1 抗体，PreS1 抗体可以阻断HBV 入侵肝细胞，更有效清除病毒，且该疫苗DNA 与受体细胞整合
在一起，因而可以持久起作用。
【详解】（1）人工合成PreS1-S 融合基因时，需先根据S 和PreS1 抗原蛋白的氨基酸序列推测脱氧核
苷酸序列，再通过化学方法合成相关的基因，进而获得目的基因。
（2）构建重组质粒时，为确定PreS1-S 融合基因是否已正确连接到质粒上，根据扩增过程中子链延伸
的方向可确定，应选择图中的一对引物F1和F3对待测质粒进行PCR 扩增，若存在扩增产物，则说明
融合基因已正确连接，反之则没有连接。
（3）构建重组菌时，将正确连接的重组质粒导入大肠杆菌后，需接种在含卡那霉素的固体培养基上
进行初步筛选，能够生长的大肠杆菌是带有重组质粒的。融合基因不能在重组菌中表达，因为融合基
因的首端是CMV 启动子，该启动子是真核细胞的启动子，其只能在真核细胞驱动相关基因的表达，
因而融合基因在大肠杆菌中不能表达，且大肠杆菌中没有与T7 启动子结合的RNA 聚合酶。
（4）为确保DNA 疫苗能在人体细胞内正常表达，在对测序正确的重组菌扩大培养生产疫苗之前，通
常需要在体外检测该基因能否正常表达。此时，需向反应体系中加入能与T7 启动子特异性结合的
RNA 聚合酶，以确保转录过程的启动。
（5）对模型动物皮内注射该DNA 疫苗并结合电穿孔处理（增大细胞膜通透性）后，疫苗可进入细胞
内表达出融合抗原。该抗原经加工后呈递在细胞表面，可被B 细胞和T 细胞识别引发体液免疫和细胞
免疫。与传统仅含S 抗原的预防型疫苗相比，传统疫苗仅含S 抗原，该疫苗含PreS1-S 融合基因，可
表达两种抗原，既能诱导产生S 抗体，还能产生PreS1 抗体，而HBV 需要通过PreS1 结合肝细胞入侵，
因此PreS1 抗体可以阻断HBV 入侵肝细胞，更有效清除病毒，相比传统疫苗更适合治疗慢性乙肝，且
该疫苗DNA 与受体细胞整合在一起，因而可以持久起作用。
32．（2026·四川德阳·二模）天然橡胶（NR）是全球重要战略资源，但热带橡胶树供给受限。橡胶草可以
在温带地区生长，其根部能合成NR。但细胞内的蔗糖会同时用于合成NR 和菊粉。基因编辑技术为
NR 的高效供给提供了全新路径：研究人员利用CRISPR/Cas9 技术敲除橡胶草中菊粉合成关键酶基因
Tk1-SST 和Tk1-FFT，使NR 积累量翻倍。
结合材料及所学知识回答下列问题：
(1)CRISPR/Cas9 系统中，负责特异性识别并结合靶基因的向导分子是_________，该向导分子与靶基
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因结合区域最多含有_________种核苷酸。
(2)敲除Tk1-SST 和Tk1-FFT 双基因后，橡胶草NR 产量提升的代谢机制为：
敲除Tk1-SST 和
Tk1-FFT 基因
→
______________
→
NR 积累量显
著增加
(3)为验证Tk1-SST 基因敲除效果，科研人员提取橡胶草根部细胞DNA，用位于待敲除区域两侧的引
物进行PCR 扩增，电泳结果如下图所示。已知野生型扩增产物长度为1200bp，敲除成功后产物长度
约为400bp。
据图判断，株系3 最可能为______（填“纯合敲除”“野生型”或“嵌合体”），依据是_________。
若将该株系单独培养几代后，发现400bp 条带逐渐增强而1200bp 条带逐渐减弱，最可能的原因是
_________。
(4)与传统的将外源NR 合成酶基因导入橡胶草基因组的技术相比，利用CRISPR/Cas9 技术敲除内源菊
粉合成基因以增产NR 的优势在于_________（答1 点即可）。
【答案】(1) sgRNA 8
(2)其编码的酶无法合成，导致菊粉合成途径受阻，原本用于菊粉合成的蔗糖便更多流向天然橡胶的合
成路径
(3) 嵌合体 电泳结果同时出现1200bp（野生型）和400bp（敲除型）两种条带 成功敲
除的细胞在培养过程中逐渐占据优势（或未敲除的细胞生长缓慢，被逐渐淘汰）
(4)仅对橡胶草自身基因进行精准编辑，不引入外源基因，生物安全性更高（或改造后的橡胶草不属于
转基因生物，更易通过安全审批；或从源头阻断竞争通路，增产效果更直接高效）
【详解】（1）CRISPR/Cas9 系统中，依靠sgRNA（向导RNA）通过碱基互补配对特异性识别结合靶
基因；向导RNA 的基本单位是4 种核糖核苷酸，靶基因基本组成单位是4 种脱氧核苷酸，所以结合区
域最多含有8 种不同的核糖核苷酸。
（2）根据题干信息，橡胶草细胞内的蔗糖同时用于合成NR 和菊粉。敲除菊粉合成关键基因后，无法
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合成菊粉合成关键酶，菊粉合成被阻断，原本用于合成菊粉的蔗糖可转向用于NR 合成，因此NR 积
累量升高。
（3）野生型只含正常基因，仅能扩增出1200bp 条带；纯合敲除只含敲除后的基因，仅能扩增出
400bp 条带；株系3 同时出现两种条带，说明同一个体中同时存在未敲除和敲除成功的细胞，符合嵌
合体的特点；成功敲除的细胞在培养过程中逐渐占据优势（或未敲除的细胞生长缓慢，被逐渐淘汰），
因此嵌合体培养多代后，400bp 条带逐渐增强、1200bp 条带逐渐减弱。
（4）导入外源基因的技术需要将外源DNA 插入橡胶草基因组，可能引发生物安全问题、或插入位置
干扰其他基因功能，而本方法是敲除自身内源基因，不需要引入外源基因，安全性更高，性状更稳定。
（或改造后的橡胶草不属于转基因生物，更易通过安全审批；或从源头阻断竞争通路，增产效果更直
接高效）
33．（2026·四川成都·二模）植物蔗糖转运蛋白（SUT）主要负责植物体内蔗糖的长距离运输，影响植物
的生长和发育，决定作物的产量和品质。SUT 基因家族中的StSUT2 基因主要在花和老叶中表达，科
学家借助Gateway 克隆技术通过构建StSUT2 植物超表达载体，为初探其功能提供基础。Gateway 克隆
技术包括TOPO 反应和LR 反应（如图1、图2 所示），ccdB 基因编码毒性蛋白，会导致细胞死亡。
回答下列问题：
(1)从植物的花或老叶细胞中提取总mRNA，经过______过程获得cDNA，根据______设计引物进行
PCR 扩增，即可获得大量的StSUT2 基因。
(2)利用图1 中的TOPO 反应可以将目的基因PCR 产物连入入门载体，该载体上的相应序列可被拓扑异
构酶（TOPO）识别并在相应位点断开______，形成一端为平末端，一端为黏性末端的载体，并将其
与拓扑异构酶酶切后的StSUT2 基因进行连接。拓扑异构酶与基因工程的______酶功能相似。为确保
StSUT2 基因定向连接入门载体，在扩增StSUT2 基因时，可在引物中引入5'-______-3'序列。
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(3)图2 中LR 反应可借助入门载体上的attL 位点和目的载体上的attR 位点，将入门载体中的目的基因
与目的载体中的相应片段实现同源重组，得到含目的基因的目的载体。然后与大肠杆菌混合培养，在
培养基中添加适量______以促进目的基因转化。经上述处理培养后，可判断存活的大肠杆菌中导入的
是含目的基因的目的载体，而不是目的载体，原因是______。
(4)请结合图2 中的LR 反应过程，在图3 的方框中补全含StSUT2 基因的超表达载体的示意图______。
(5)通过比较含StSUT2 基因入门载体的转基因植物细胞、含StSUT2 基因超表达载体的转基因植物细
胞和非转基因植物细胞中的______，从而确定StSUT2 基因是否成功超量表达。
【答案】(1) 逆转录 StSUT2 基因两端的部分碱基序列
(2) 磷酸二酯键 限制酶和DNA 连接酶 CACC
(3)
目的载体中含有ccdB 基因，导入目的载体的大肠杆菌会死亡（或含目的基因的目
的载体中无ccdB 基因，导入含目的基因的目的载体的大肠杆菌不会死亡）
(4)
(5)StSUT2 转运蛋白含量
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子
和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细
胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微
注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
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（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基
因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技
术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）为获得大量StSUT2 基因，应首先从植物的花或老叶细胞中提取总mRNA，通过逆转录
过程获得cDNA，然后根据StSUT2 基因两端的序列设计两种引物进行PCR 扩增，进而获得大量的
StSUT2 基因。
（2）载体上的相应序列可被拓扑异构酶（TOPO）识别并在相应位点断开磷酸二酯键，形成一端为平
末端，一端为黏性末端的载体，并将其与拓扑异构酶酶切后的StSUT2 基因进行连接。因此拓扑异构
酶与基因工程的限制酶和 DNA 连接酶功能相似。由于目的基因左侧碱基序列为GTGG，因此在扩增
StSUT2 基因时，可在引物中引入5'—CACC—3'序列，以确保StSUT2 基因定向连接入门载体。
（3）用Ca2+处理后的大肠杆菌会处于能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，因此在培养基中添加
适量CaCl2 以促进目的基因转化。据题干信息可知，目的载体中含有ccdB 基因，ccdB 基因编码毒性
蛋白，会导致细胞死亡，因此若将大肠杆菌导入目的载体，大肠杆菌会死亡。
（4）因为LR 反应可借助入门载体上的attL 位点和超表达载体上的attR 位点，将入门载体中的目的基
因与超表达载体中的相应片段实现同源重组，因此StSUT2 基因的超表达载体为：
。
（5）为确定StSUT2 基因是否成功超量表达，可通过比较含StSUT2 基因入门载体的转基因植物细胞、
含StSUT2 基因超表达载体的转基因植物细胞和非转基因植物细胞中的StSUT2 转运蛋白含量。
34．（2026·四川泸州·二模）下图1 为某种沉默子调控目的基因表达的示意图。为确定图2 中S 序列是否
具有该种沉默子活性，科学家进行了相关研究。实验所用质粒和可能用到的限制酶如图3 所示。
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请分析回答：
(1)在构建重组质粒时，需使用限制酶和_______酶对图3 中质粒进行处理。为保证S 序列能准确插入
质粒，切割质粒时应选择图3 表中的_______限制酶。
(2)为获得大量的S 序列，需使用_______酶对其进行PCR 扩增。为实现S 序列的精准插入，需要在下
游引物的_______（填“5′端”或“3′端”）添加限制酶识别序列，该序列是5′-_______-3′。
(3)为检验重组质粒是否构建成功，研究人员选取合适的限制酶对重组质粒进行酶切，其产物电泳结果
如图。该结果显示重组质粒的构建_______（填“成功”或“不成功”），依据是_______。
(4)将重组质粒和图3 质粒分别导入小鼠细胞后，在荧光显微镜下进行观察，若_______，则表明S 序
列具有图1 沉默子活性。
【答案】(1) DNA 连接 EcoRⅠ和BamHⅠ
(2) 耐高温的DNA 聚合酶 5′端 AGATCT
(3) 成功 样品出现长度为5000 和680 的两条条带，与质粒和S 序列的长度相似
(4)导入重组质粒的细胞的荧光强度低于导入质粒的细胞的荧光强度
【分析】基因工程的基本操作程序：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入
受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）在构建重组质粒时，需使用限制酶和DNA 连接酶对图3 中质粒进行处理。结合图1、
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图2 和图3 呈现的信息可知：构建重组质粒时，需要将S 序列插入到质粒上的GFP（绿色荧光蛋白基
因）和终止子之间，再结合图2 所示的S 序列的转录方向是从左向右可推知：构建重组质粒时，应选
择图3 表中的EcoRⅠ和BamHⅠ限制酶对质粒进行切割，以保证S 序列的正确插入。
（2）欲利用PCR 技术对S 序列进行扩增，需使用耐高温的DNA 聚合酶。转录的方向是从mRNA 的
5'端到3'端，PCR 扩增时引物是从子链的5′端往3′方向延伸。由图3 可知：用BamHⅠ限制酶和BglⅡ限
制酶切割产生的黏性末端相同；由图2 可知：转录是从S 序列的左侧向右侧进行，且S 序列中存在
BamHⅠ限制酶的识别序列。为实现扩增出的S 序列的精准插入质粒中且S 序列不被BamHⅠ限制酶破坏，
需要在下游引物的5′端添加BglⅡ限制酶的识别序列，该序列是5′- AGATCT -3′。
（3）由图2 和图3 可知：S 序列的长度约为680bp，质粒的长度约为5000bp。选取合适的限制酶对重
组质粒进行酶切并对酶切产物进行电泳，其结果显示：样品出现长度为5000 和680 的两条条带，与质
粒和S 序列的长度相似，说明成功构建了重组质粒。
（4）沉默子是通过抑制启动子的功能来抑制目的基因的表达。若S 序列具有图1 沉默子活性，则将重
组质粒（含S 序列）和图3 质粒（不含S 序列）分别导入小鼠细胞后，导入重组质粒的细胞的荧光强
度应低于导入质粒的细胞的荧光强度。
35．（2026·四川绵阳·二模）食醋是生活中常用的调味品，其酸度是衡量醋酸菌发酵能力和食醋品质的重
要指标。为获得高产醋酸菌并提高生产效率，研究人员从传统工艺和现代生物技术两个角度开展研究，
回答下列问题：
(1)醋酸菌的新陈代谢类型为______，传统酿醋工艺中，常在发酵初期加入适量陈醋，目的是______。
(2)为探究发酵液中醋酸菌的数量，研究小组采用稀释涂布平板法进行计数，测得的结果通常比实际值
偏_______，原因是______。
(3)巴氏醋酸菌产醋酸能力强，但醋酸积累过多会导致发酵液pH 下降，抑制该菌生长。研究表明，在
醋酸菌中表达氨基酸解氨酶，能有效缓解pH 的变化。为此，科研小组计划通过基因工程将目的基因
X 导入巴氏醋酸菌，以维持其在产酸过程中pH 的相对稳定。请回答下列问题：
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①目的基因的筛选和获取：利用PCR 技术扩增X 基因时，需要在反应体系中添加模板、原料、引物、
_______、缓冲液等。
②构建基因表达载体：为使X 基因正向插入载体，扩增X 基因时应分别在引物1 和引物2 的5'端添加
_______限制酶的识别序列。
③目的基因导入受体细胞：为检测重组质粒是否成功导入巴氏醋酸菌，需要进行筛选，筛选时应在培
养基中添加_______。
【答案】(1) 异养需氧型 为发酵过程提供醋酸菌菌种，加速发酵过程
(2) 小 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
(3) 耐高温的DNA 聚合酶（TaqDNA 聚合酶） XbaI 和SalI（不能交换顺序） 卡那霉素
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技
术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基
因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方
法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）醋酸菌不能自己制造有机物，其新陈代谢类型为异养需氧型；传统发酵技术中常利用
前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵。酿醋时加入适量陈醋，可以增大发
酵液中醋酸菌的浓度，加快发酵速度。
（2）稀释涂布平板法是微生物培养常用的计数方法，由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观
察到的只是一个菌落，故研究小组采用稀释涂布平板法进行计数，测得的结果通常比实际值偏小。
（3）①PCR 是一项体外扩增DNA 的技术，在进行扩增时需要在反应体系中添加模板、原料、引物、
耐高温的DNA 聚合酶（TaqDNA 聚合酶）、缓冲液等。
②为使X 基因正向插入载体并正常表达，需用双酶切法分别处理质粒和目的基因。处理质粒时，选用
的限制酶不能破坏标记基因，所以排除BamHI，即用Xhol 和Xbal 切割质粒。处理目的基因时，若使
用Xhol 会破坏目的基因，所以只能选择Xhol 的同尾酶Sall。目的基因表达时以a 链作为模板链，为
了使转录方向正确，需要a 链的3’端靠近启动子，5’端靠近终止子，观察引物和目的基因的配对情况
可以发现，a 链的左侧为5’端，右侧为3’端。所以引物1 应该添加Xbal 酶切序列，使得重组后目的基
因a 链5’端靠近终止子，引物2 应该添加SalI 酶切序列，使得重组后a 链3’端靠近启动子。
③据图可知，重组质粒有卡那霉素抗性基因，可用作标记基因，故为检测重组质粒是否成功导入巴氏
醋酸菌，需要进行筛选，筛选时应在培养基中添加卡那霉素。
36．（2026·四川绵阳·二模）某研究团队利用工程技术对诱导多能干细胞（iPSC）进行基因编辑改造，使
其成为在细胞膜上表达CAR 分子（嵌合了靶细胞的抗原受体的跨膜复合蛋白）的多能干细胞（CAR-
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iPSC），进而诱导分化出相应免疫细胞，包括CAR 细胞毒性T 细胞（CAR-T）、CAR 巨噬细胞
（CAR-iMac）、CAR 自然杀伤细胞（CAR-NK），以治疗癌症。其基本流程如下图所示。回答下列
问题。
(1)从供血者采集到的PBMC______（填“需要”或“不需要”）用胰蛋白酶分散成单细胞。细胞扩增
培养过程中需要传代培养，原因是______（答出2 点即可）。
(2)PBMC 需经①重编程导入特定基因（OCT4，SOX2，KLF4 等），强制改变其基因表达模式，使其
回到类似______的多能状态（iPSC），再经②导入CAR 基因并成功表达，成为具有______功能的
CAR-iPSC。
(3)绝大多数B 细胞恶性肿瘤的标志物之一是CD19（一种膜蛋白）。将CAR 分子中嵌入______的
CAR-iPSC 诱导分化成CAR-T，经扩增后回输病人（自体CAR-T 治疗），可以显著增强______（免疫
类型），清除该类肿瘤细胞。
(4)用健康捐献者的细胞批量制备CAR-T 细胞，进行异体CAR-T 治疗时，因T 细胞表面的受体
（TCR）会识别异己细胞并进行攻击，因此需要预防______（选填编号：①移植物抗宿主病
（GVHD）②宿主抗移植物病（HvGR）），预防的解决方案是______。
【答案】(1) 不需要 细胞密度过大，有接触抑制；有害代谢物积累；营养物质缺乏等
(2) 胚胎干细胞 特异性识别靶细胞
(3) CD19 的受体 细胞免疫
(4)
①②
敲除供者细胞的相关基因
【分析】通过分析题意可知，从供血者体内分离得到PBMC，经过基因改造再经过体外动物细胞培养
后，将CAR-T 细胞再输到患者体内，这样T 细胞就可以特异性识别和攻击肿瘤细胞。
【详解】（1）PBMC 是悬浮的单细胞悬液，无需胰蛋白酶消化分散；贴壁生长的细胞会出现接触抑
制，细胞密度过大、营养物质不足和代谢废物积累会抑制细胞增殖，需分瓶传代以维持细胞增殖。
（2）PBMC 经过重编程导入OCT4、SOX2 等基因，可将体细胞诱导为诱导多能干细胞（iPSC），其
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多能性类似胚胎干细胞（可分化为多种细胞类型）；CAR 分子嵌合抗原受体后，能特异性结合靶细胞
（肿瘤细胞）的抗原，使CAR-iPSC 分化的免疫细胞具备特异性识别肿瘤的功能。
（3）CD19 是B 细胞恶性肿瘤的标志物，CAR 分子需嵌入能识别CD19 的受体，CAR-T 才能特异性
识别肿瘤细胞；CAR-T 细胞属于细胞毒性T 细胞,通过细胞免疫直接杀伤肿瘤细胞。
（4）异体CAR-T 细胞的TCR 会识别宿主细胞的异己抗原，引发移植物抗宿主病（GVHD），当异体
CAR-T 细胞输到患者体内时，宿主的免疫细胞（如T 细胞、巨噬细胞等）会识别CAR-T 细胞表面的
异己抗原，并启动免疫应答，最终导致CAR-T 细胞被清除，无法在体内存活和发挥抗肿瘤作用，引
发宿主抗移植物病（HvGR）；通过基因编辑敲除CAR-T 细胞的TCR 编码基因，使其失去识别宿主
异己抗原的能力,从而避免对宿主细胞的攻击，同时敲除CAR-T 细胞的 HLA-I 类或II 类基因，使其不
表达供者来源的HLA 分子，从而避免被宿主免疫细胞识别。
37．（2026·四川绵阳·二模）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应
用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。
回答下列问题：
(1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是_______。
(2)生物兴趣小组利用PCR 技术获得足够多的cg（CG 编码基因），欲利用基因工程构建携带cg 的大
肠杆菌表达载体工程菌。
①在PCR 扩增cg 操作时，设置了一组除cg 模板外其他成分均满足的反应体系，其作用是_______。
②基因工程的核心工作是________。
③兴趣小组构建大肠杆菌表达载体过程中，对cg 的PCR 扩增产物和质粒进行双酶切，随后用
E.coliDNA 连接酶连接（E.coliDNA 连接酶连接具有平末端的DNA 片段的效率非常低）。为保证连接
准确性和效率，在cg 转录模板链的5＇端最好含有__________酶切位点（如图）。作为符合条件的基
因表达载体，还应具有的组件_______。
(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是________，随后在
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含_______的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
【答案】(1)在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大
(2) 对照作用，排除反应体系中核酸被污染 基因表达载体的构建 BamH I 复制原点
(3) 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态 卡拉胶和四环素
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将
目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的
卡拉胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大，因此可选择
海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。
（2）①在PCR 扩增cg 操作时，设置了一组除cg 模板外其他成分均满足的反应体系，其作用是对照
作用，排除反应体系中核酸被污染。
②基因工程的核心工作是基因表达载体的构建，它能使目的基因在受体细胞中稳定存在、表达和遗传。
E.coli DNA
③
连接酶连接具有平末端的DNA 片段的效率非常低，因此切割质粒和目的基因时最好不
选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoR V 酶和Sma Ⅰ酶，而Spe Ⅰ酶与Xba Ⅰ酶切割后的黏性末
端相同，若选择Spe Ⅰ酶与Xba Ⅰ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连、甚至目的基因倒接，因此切
割质粒时Spe Ⅰ酶与Xba Ⅰ酶中只能选择一个，而Xba Ⅰ酶会破坏卡那霉素抗性基因，所以一端
（3'端）应选择Spe Ⅰ酶，而另一个限制酶需要选择BamH Ⅰ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止
子，且mRNA 形成的方向是5’→3’，且mRNA 与DNA 的模板链方向相反，因此基因模板链的3’应靠
近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg 转录模板链的5'端最好含有BamH I 酶切位点。一个完整
的基因表达载体需要包含：目的基因（cg 基因） 启动子、终止子、标记基因（如卡那霉素抗性基
因）、复制原点等，因此作为符合条件的基因表达载体，还应具有的组件复制原点。
（3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是使细胞处于一
种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，便于重组DNA 进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶
（CG）的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此
导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无
水解透明圈筛选目的菌株。
38．（2025·四川德阳·二模）为了培育既抗除草剂（草甘膦），又抗冻的烟草植株，科学家将抗草甘膦基
因（Aro 基因，存在EcoRI 酶切位点）和抗冻基因（Cor 基因，存在Bell 酶切位点）采用融合PCR 技
术（原理如下图所示）连接起来构建为Aro-Cor 融合基因并进行了扩增，再将融合基因导入烟草细胞
培育既抗除草剂又抗冻的转基因烟草，过程如下。请分析回答：
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(1)在将Aro 基因和Cor 基因融合的过程中，起到搭桥作用的引物2 和引物3 的碱基序列______（填
“相同”或“不相同”），变性后形成的杂交分子在补齐为双链等长的融合基因时的延伸过程，不需
要添加引物，其原因是______。为保证构建的Aro-Cor 融合基因能正确插入载体中，应该分别在引物
1 和引物4 侧连接______的限制酶识别序列。
(2)上述培育转基因烟草过程中将目的基因导入烟草细胞采用的方法是______，将农杆菌和烟草细胞按
比例充分混匀，3 天后转入含有潮霉素而不是四环素抗性基因的选择培养基筛选抗性愈伤组织，原因
是______。
(3)植物激素是植物体内产生，能从产生部位运送到作用部位，对植物的______的微量有机物。在培育
转基因烟草植株的过程中，培养基中添加的生长素和细胞分裂素会影响植物细胞的发育方向，据此分
析，在初次进行实验时，可以尝试调整生长素和细胞分裂素的______来观察其对细胞发育的影响。
【答案】(1) 不相同 两条母链均存在
端，使DNA 聚合酶能从母链的
端开始连接脱氧核
苷酸 BamHⅠ和MunⅠ
(2) 农杆菌转化法 潮霉素抗性基因随农杆菌的T-DNA 进入并整合到植物细胞的染色体DNA
上，所以只有选择潮霉素筛选抗性愈伤组织才能筛出成功导入目的基因的植物细胞
(3) 生长发育有显著影响 浓度和比例
【分析】PCR 原理：在高温作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷
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酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向
是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引
物，其主要原因是DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA 链。
【详解】（1）在将Aro 基因和Cor 基因融合的过程中，起到搭桥作用的引物2 和引物3 的碱基序列不
相同。因为引物2 要结合Aro 基因的特定序列，引物3 要结合Cor 基因的特定序列，它们的结合位点
不同，所以碱基序列不同。
变性后形成的杂交分子在补齐为双链等长的融合基因时的延伸过程，不需要添加引物，其原因是融合
基因的两端序列是已知的，可以根据已知序列合成与两端互补的引物，在第一次延伸反应后产生的新
的DNA 链两端就可以作为后续延伸反应的模板，不需要额外添加引物，即两条母链均存在
端，使
DNA 聚合酶能从母链的
端开始连接脱氧核苷酸
为保证构建的Aro-Cor 融合基因能正确插入载体中，由图可以看出，Aro-Cor 融合基因两端有EcoR
Bcl I,为保证构建的Aro-Cor 融合基因能正确插入载体中，应该分别在引物1 和引物4 侧连接,引物1 一
端应该链接BamHⅠ，引物4 一端应该链接MunⅠ。
（2）图中将目的基因导入烟草细胞采用的方法是农杆菌转化法，转入含有潮霉素而不是四环素抗性
基因的选择培养基筛选抗性愈伤组织，原因是潮霉素抗性基因随农杆菌的T-DNA 进入并整合到植物
细胞的染色体DNA 上，所以只有选择潮霉素筛选抗性愈伤组织才能筛出成功导入目的基因的植物细
胞
（3）植物激素是植物体内产生，能从产生部位运送到作用部位，对植物的生长发育有显著影响的微
量有机物。 在培育转基因烟草植株的过程中，培养基中添加的生长素和细胞分裂素会影响植物细胞
的发育方向，据此分析，在初次进行实验时，可以尝试调整生长素和细胞分裂素的浓度或比例来观察
其对细胞发育的影响。
39．（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR 来应对感染。麻
疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的
主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46 转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。
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回答下列问题：
(1)利用PCR 技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是______。
(2)将hCD46 接入质粒应选用的限制酶组合是______。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚
胎体内，应选用______限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。
(3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其______。将胚胎移植到小鼠c 的子宫中，应
选用桑葚胚的原因是______。
(4)利用PCR 技术对子代小鼠进行hCD46 基因检测，应设置不加DNA 模板的对照组，目的是______。
(5)若能进一步构建既表达hCD46 受体又敲除IFNAR 基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，
原因是______。
【答案】(1)两种引物分别与含hCD46 基因的两条模板链结合
(2) EcoRⅠ和NotI AgeⅠ和HindⅢ
(3) 超数排卵 桑葚胚易于在小鼠子宫着床
(4)排除PCR 体系中外源DNA 的污染
(5)该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR 以应对感染
【分析】PCR 是聚合酶链式反应的缩写。PCR 是一项在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。
通过这一技术，可以获取大量的目的基因。PCR 扩增反应需要两种引物、模板DNA、原料（4 种脱氧
核苷酸）、酶（耐高温的DNA 聚合酶）。PCR 反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】（1）利用PCR 技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的变化是两种引物分别与解开的
两条模板链进行碱基互补配对，为子链的延伸做准备，即表现为两种引物分别与含hCD46 基因的两条
模板链结合
（2）结合图示可知，质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoRⅠ和NotI 的识别序列，且这两个序
列位于启动子和终止子之间，因此，将hCD46 接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotI。为提高
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转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用AgeⅠ和HindⅢ限制酶组合将重组质粒变为线
性DNA，因为这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段。
（3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其超数排卵，为获取大量的供体胚胎做准备。
将胚胎移植到小鼠c 的子宫中，通常选用桑葚胚的原因是因为桑葚胚易于在小鼠子宫着床，进而可以
提高胚胎的存活率。
（4）利用PCR 技术对子代小鼠进行hCD46 基因检测，应设置不加DNA 模板的对照组作为空白对照，
这样可以排除PCR 体系中外源DNA 的污染，提高实验结果的可信度。
（5）若能进一步构建既表达hCD46 受体又敲除IFNAR 基因的小鼠，则该转基因小鼠能接受抗原刺激，
进而机体会分泌干扰素，但干扰素无法与相应的受体结合，因为转基因小鼠的受体IFNAR 无法表达，
因而干扰素无法起作用，因此，该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。
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