第 23 章 基因工程
第 1 节 重组 DNA 技术的基本工具和 DNA 的粗提取
一、重组 DNA技术的基本工具
来源 主要是原核生物
具体作用 识别并切割双链 分子的特定核苷酸序列
DNA
“分子手 作用化学键 磷酸二酯键
术刀”——— 限制酶切割 分子产生的末端通常有两种形式 如图所示
DNA ( ):
限制性内 作
切核酸酶 用
作用结果
(限制酶)
作用 将双链 片段 缝合 起来 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键
“分子缝 DNA “ ” ,
Ec.oli 来自大肠杆菌 连接互补的黏性末端和平末端 但连接具有平末端的 片段的效
合针”——— DNA , , DNA
分 连接酶 率远低于 连接酶
T4DNA
DNA 类
连接酶 T4DNA 来自 噬菌体 连接互补的黏性末端和平末端
连接酶 T4 ,
作用 将目的基因导入受体细胞
裸露的 不与组蛋白结合 结构简单 独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核
“分子运输 质粒 定义 ( )、 、 DNA
之外 并具有自我复制能力的环状双链 分子
车”——— 种 最 , DNA
( 结构 具有复制原点 在细胞中能够自我复制 标记基因 便于重组 分子的筛选 一
基因载体 类 常用 ( )、 ( DNA )、
) 特点 个至多个限制酶切割位点 供目的基因插入
( )
其他载体 噬菌体 动植物病毒等
、
易混易错 连接酶和 聚合酶都是催化磷酸二酯键形成,但 连接酶连接两个 片段, 聚
DNA DNA DNA DNA DNA
合酶是将单个核苷酸加到已有核酸片段 端。
3'
二、DNA的粗提取与鉴定
不溶于酒精 但某些蛋白质溶于酒精 利用这一原理 可以初步分离 与蛋白质
实验 (1)DNA , , , DNA ;
在不同浓度的 溶液中溶解度不同 它能溶于 的 溶液
原理 (2)DNA NaCl , 2mol/L NaCl ;
沸水浴
二苯胺试剂 蓝色
(3)DNA+ →
-. / 3H"9U-U-IUN--."U-.
K$" $ 3U-."D$& U 04I ,-."
+ B .0USNJO.NJO U #"
实验
#"0/+M+/+F1#"UL4_NJOU*() !
步骤
%/" UB''U*$3 L+!<#" .0USNJO
+ .NJOU#"U0+!"' 1 +%/" >
%/" ''!"'*NPM-+/B$M#"#?U& 86AU# 4!!&NJOU
+G >M7
200 5年高考 3年模拟 A版 高考生物学知识归纳 粗提取与鉴定中的注意事项
DNA
()本实验的研磨液中含 (可使蛋白质变性与 分离)、 (为 酶抑制剂,可防止细胞破碎后 酶
1 SDS DNA EDTA DNA DNA
降解 )、 (提供缓冲体系,使 呈稳定状态)。实验中若遇到实验试剂缺乏的情况,可以用家用洗洁精(含
DNA Tris DNA
)或质量分数为 的洗衣粉水溶液(含有蛋白酶和表面活性剂,可用温水溶解洗衣粉)替代研磨液,也能达到裂
SDS 10%
解细胞膜、让蛋白质变性的目的。
()在 进一步提纯时,选用冷却的体积分数为 的酒精的作用是溶解蛋白质杂质和析出 。
2 DNA 95% DNA
()鉴定过程需要沸水浴加热,且二苯胺试剂可用于鉴定 ,但无法检测溶液中是否含蛋白质杂质。
3 DNA
学生用书 P179
从真题到教材 磷酸二酯键
T4DNA
1限制性内切核酸酶 简称 限制酶 可以识别 2 粗提取与鉴定
. ( : ) .DNA
双链 分子特定的 并且使 实验中涉及的主要试剂及作用
DNA , (1)
每一条链中特定部位的 断开 产 试剂 作用
,
生 末端或 末端 连接酶主 体积分数为 的冷酒
。DNA
精溶液
95% 溶解蛋白质
,
提取
DNA
要有两类 Ec.oli 连接酶和 连
: DNA 的 溶液 溶解
接酶 这两类酶都能将双链 片段 缝合 2mol/L NaCl
, DNA “ ” 二苯胺试剂 鉴定
DNA
起来 恢复 但Ec.oli 连
, , DNA 在 条件下 遇 呈
接酶连接具有平末端的 片段的效率要 (2) ,DNA
DNA 现蓝色(人教版选必 — )( 江苏,)
远远低于 连接酶( 重庆, ) 3P74 75 2023 9
T4DNA 2023 12 ( 广东, )
( 新课标,) 2023 11 。
2023 6 。 2答案 沸水浴 二苯胺试剂
1答案 核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性 平 . (1)DNA (2)
.
第 23章 基因工程 201
第 2 节 PCR 和电泳
PCR和琼脂糖凝胶电泳
原理 半保留复制和 的热变性
DNA DNA
模板 含有待扩增序列的基因组 或从 逆转录来的
DNA mRNA cDNA
原料 四种游离的脱氧核苷酸或脱氧核苷三磷酸
(dNTP)
一般为根据目的基因两端序列设计的能与之互补配对的短单链核酸 一般需要选择 种引
条件 引物 ( 2
物分别扩增两条模板链
)
酶 耐高温的 聚合酶 如Taq 聚合酶
DNA ( DNA )
缓冲液 需含有 以激活 聚合酶
2+
PCR
Mg , DNA
步骤和
结果续表
电泳的 分子具有可解离的基团 在一定的 下 这些基团可以带上正电荷或负电荷 在电场的作用
琼脂 DNA , pH , 。
定义 下 这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动
糖凝 ,
胶电
检测 在凝胶中 分子的迁移速率与凝胶的浓度 分子的大小和构象等有关 凝胶中的 分子
泳 DNA 、DNA 。 DNA
原理 通过染色 可以在波长为 的紫外灯下被检测出来
, 300nm
知识拓展 扩增后进行电泳结果异常分析
PCR
未出现扩增条带 模板 含有杂蛋白或Taq 聚合酶的抑制剂;Taq 聚合酶失活;引物出现质量问
DNA DNA DNA
的可能原因 题;引物浓度不合适; 浓度过低;变性温度过低;变性时间过短等
2+
Mg
出现非特异性扩增 模板 出现污染;Taq 聚合酶出现质量问题;引物特异性不强(如与非目的序列有同
DNA DNA
条带的可能原因 源性)或形成引物二聚体; 浓度过高;复性时的温度过低; 循环次数过多等
2+
Mg PCR
小表达 技术操作中为什么需要用 种不同的引物? 。
PCR 2
答案: 分子由两条反向平行的脱氧核苷酸链构成, 扩增时只能从各自模板链的 端开始,故需碱基序列不
DNA PCR 3'
同的 种引物
2
学生用书 P180
真题选改判 双链 利用 催化合成
,
1( 河北, )利用添加核酸染料的凝胶对 子链 同时要加入一对引物 引物的作
.2024 13 DNA , ,
产物进行电泳后 在紫外灯下观察结果 用是
PCR , 。
( 江苏, )( 山东, )(
( ) 2022 24 2022 25 2022
1答案 辽宁, )
. √ 12 。
2( 湖南, )电泳时产物的片段越小 迁移 4答案 种脱氧核苷酸 加热 耐高温的
.2024 15 , . 4
速率越慢 聚合酶 Taq 聚合酶 使
。 ( ) DNA ( DNA ) DNA
2答案 聚合酶能够从引物的 端开始连接脱氧核
. ✕ 3'
3( 黑、吉、辽,)采用琼脂糖凝胶电泳鉴定 苷酸
.2024 7
产物的实验中 琼脂糖凝胶浓度的选择 5 产物一般通过 来鉴
PCR , .PCR
需考虑待分离 片段的大小 定 在凝胶中 分子的 与凝胶
DNA 。 ( ) , DNA
3答案 的浓度 分子大小和构象等有关 凝胶中
. √
、DNA ,
的 通过染色后 可在 的
从真题到教材 DNA , 300nm
下被检测出来( 河北, )( 黑、吉、辽,)
4利用 获取目的基因 需要 2024 13 2024 7。
. PCR : 5答案 琼脂糖凝胶电泳 迁移速率 紫外灯
作为原料 通过 方式打开 .
, DNA
202 5年高考 3年模拟 A版 高考生物学
学生用书 P180
PCR引物的设计原则、选择及结果分析
1.PCR 引物的设计原则、选择
引物是一段短单链核酸 且能与 母链的一段碱基序列互补配对
(1) , DNA ;
引物的 引物的 端可以被修饰 而 端一般需与 模板链严格互补配对 不可被修饰 端常见的修
(2) 5' , 3' DNA , 。5'
设计原则 饰 加酶切位点 加荧光标记 引入突变位点等
: 、 、 ;
过程中 引物一般成对存在且成对的引物不能碱基互补配对
(3)PCR ,
判断引物的 端 端 引物与 模板链的 端互补 方向 B *
(1) 3' 、5' : DNA 3' ,
判断引物 相反 ,+ 3
;
的方向 (2)DNA 复制 : 子链沿引物的 5'→3' 方向延伸 ; C
由此可知 甲 乙 丙 丁四个引物的扩增方向如图 所示 图
(3) , 、 、 、 1 1
若扩增目的基因序列 则应选择图 中的引物乙 丙 B
根据扩增 (1) , 1 、 ;
若要检验目的基因是否以正确方向插入质粒相应位点 应设计一 ,+ 3
目的选择 (2) ,
个引物与目的基因外部序列 即质粒序列 碱基互补配对 另一个引 C
引物 ( ) ,
物与目的基因内部序列碱基互补配对 如图 所示的引物 图
, 2 1、2 2
2.结果分析
分子数分析 以 个 分子为例
(1)DNA ( 1 DNA )
复制次数 次 次 次 n次
1 2 3
分子数 n
DNA 2 4 8 2
含引物的 分子数 n
DNA 2 4 8 2
含引物 或 的 分子数 n
1 2 3
A( B) DNA 1=2-1 3=2-1 7=2-1 2-1
同时含引物 的 分子数 n
1 2 3
A、B DNA 0=2-2 2=2-2 6=2-2 2-2
共消耗的引物 和 数量 n
2 3 4 +1
(A B) 2=2-2 6=2-2 14=2-2 2 -2
两条单链等长的 分子数
DNA 1 2 3 n n
个引物均与模板链内部碱基互补配对 0=2-2 0=2-4 2=2-6 2-2
(2 )
电泳图像分析
(2)
泳道 为 由一些分子大小已知的 片段组成
根据条 ① 1 Marker, DNA ,
可以作为电泳结果中的参考系 以反映出待测片段的分子大
带位置 ,
小 如泳道 中的 片段在
判断 。 4 DNA 3000bp~5000bp。
当 构象相同 电泳条件基本一致时 相对分子质量大
② DNA 、 ,
DNA 的 分子迁移速率较小 相对分子质量小的 分子迁
分子 DNA , DNA
移速率较大 故泳道 的片段 的相对分子质量 片段 的
大小 , 3 ① > ②
相对分子质量
根据电
泳道 和泳道 为同一个质粒经不同限制酶处理得到的结果
泳条带 2 3 。
泳道 只有 条条带 说明质粒含 或 个相应限制酶切割位
判断限 2 1 , 0 1
点 泳道 含 条条带 说明质粒含 个相应限制酶切割位
制酶酶 。 3 2 , 2
点 假设泳道 中 分子为 则泳道 中 分
切位点 。 2 DNA 4800bp, 3 DNA
子的大小分别为 片段 和 片段
数量 3000bp( ①) 1800bp( ②)
第 23章 基因工程 203典例 1 ( 届南京、盐城一模, )稻米胚乳直
2024 14
链淀粉含量高会导致食用品质差 研究发现
。 ,
水稻蜡质基因 Wx 编码直链淀粉合成酶 若
( ) 。
Wx基因中第 位碱基是正常的 该位点所
226 G,
在内含子能被正常剪切 胚乳中直链淀粉含量
,
最高 基因型记作 若该位点突变成 则不
, GG; T,
能被正常剪切 胚乳中直链淀粉合成水平会降
,
低 基因型记作 为检测Wx基因该位点碱
, TT。 呈环状结构
A.
基是 或 研究人员以待测水稻叶片总
G T, DNA 分子质量大小为
B. 10kb
为材料 以Wx基因片段设计引物如图所示 对
, , 有一个Not 和两个Eco 切点
C. Ⅰ RⅠ
PCR
扩增产物经Acc
Ⅰ
酶切后电泳
。
已知引物
其Not 切点与Eco 切点的最短距离为
D. Ⅰ RⅠ
为 两
1 5'-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3',
2kb
引物之间无另外的Acc 的识别位点 下列说 答案 D
Ⅰ 。
法正确的是 变式 同考法不同考查角度 引物判断、酶切结
( )
($55$"$55$5$5($55(5( 55$""$5$5$(55"""5$"5
'@@ '@@ 果综合 ( 山东, , 分)科研人员构建了可
2023 2510
"DD
(( (5"5"$ 表达 融合蛋白的重组质粒并进行了检测
J-V5 ,
55 5 该质粒的部分结构如图甲所示 其中V5编码
。
P,J"1 F (( 0,J"1 序列表达标签短肽
V5。
F 55 !/ .<B F%/"
该 实 验 中 需 设 计 的 引 物 为
A. 2
5'-TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3'
若酶切产物只能观察到 的 条
B. 460bp DNA
图甲
带 则表明该水稻品种为 型
, GG
杂合型水稻品种酶切电泳结果为 条
C.GT 3
条带
组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸种类不
D.
图乙
同 数目相同
,
与图甲中启动子结合的酶是 除
答案 C (1) 。
图甲中标出的结构外 作为载体 质粒还需具备
典例 2 ( 届淮安六校联盟学情调研, )一种 , ,
2024 13 的结构有 答出 个结
双链 分子被三种不同的限制酶切割 切割 ( 2
DNA , 构即可
)。
产物通过电泳分离 用大小已知的 片段的
, DNA 构建重组质粒后 为了确定J基因连接到质粒
(2) ,
电泳结果作为分子量标记 图中左边一列 关
( )。 中且插入方向正确 需进行 检测 若仅用一对
, PCR ,
于该双链 下列说法错误的是
DNA, ( )
引物
,
应选择图甲中的引物
。
已知J基
因转录的模板链位于 链 由此可知引物 与
b , F1
图甲中J基因的 填 链 或 链
( “a ” “b ”)
204 5年高考 3年模拟 A版 高考生物学
相应部分的序列相同 所检出的蛋白 填 是 或 不是 由重
。 ( “ ” “ ”)
重组质粒在受体细胞内正确表达后 用抗 组质粒上的J基因表达的
(3) , J 。
蛋白抗体和抗 抗体分别检测相应蛋白是否表 答案 聚合酶 标记基因 复制原点
V5 (1)RNA 、
达以及表达水平 结果如图乙所示 其中 出现 或限制性酶切位点 和 或 和
, 。 , ( ) (2)F2 R1( “F1
条带 证明细胞内表达了 条带 链 融合蛋白 不是
1 , 2 R2”) a (3)J-V5
第 23章 基因工程 205
第 3 节 基因工程的基本操作程序和蛋白质工程
一、基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因 主要是指编码蛋白质的基因
目的基因 ,
也可能是基因调控序列等
( )
较为有效的筛选方法 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
目的基因的获取方法 人工合成法 基因文库法等
PCR、 、
苏教速览
()从基因组文库中筛选某目的基因,一般采用核酸探针杂交的方法,将某基因的已知片段作为筛选的探针,在基因
1
组文库中筛选含有目的基因的菌落,进行扩增、分离、回收而获得目的基因。
() 文库的构建:构建 文库主要包括从组织细胞中提取 ,逆转录成 ,与适当载体连接后转化
2cDNA cDNA mRNA cDNA
宿主,这种包含细胞全部 信息的 克隆集合称为该组织细胞的 文库。
mRNA cDNA cDNA
2.基因表达载体的构建（基因工程的核心步骤）
让目的基因在受体细胞中稳定存在 并且遗传给下一代
构建目的 (1) , ;
使目的基因能够表达和发挥作用
(2)
基因表达
载体的
组成 组成型启动子 在多数或全部组织中保持持续的驱动转录活性
启动子的 诱导型启动子 受外界化学或物理信号调控驱动下游基因转录 如乳糖操纵子
,
分类
具有组织特异性 在特定的组织或器官中驱动下游基因转录 或者发育时
特异型启动子 ( )
期特异性 在特定发育时期驱动下游基因转录 如水稻胚乳细胞启动子
( ),
构建基因
表达载体
过程
示意图易混易错 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
位置
DNA DNA mRNA mRNA
聚合酶识别和结合 翻译的起始信号(编码氨 翻译的结束信号(一般不编码氨
作用 RNA 使转录停止
的部位,驱动基因的转录 基酸:甲硫氨酸) 基酸)
知识拓展 ()标记基因的常见类型及相应筛选方法
1
标记基因常见类型 筛选方法
基因表达载体上携带的抗生素抗性基因进入受体细胞并表达后,可以使受体细胞表现出对相
标记基因为抗生素
应抗生素的抗性,在受体细胞的培养体系中加入致死浓度的相应抗生素后,存活的便是转化成
的抗性基因
功的细胞
标记基因为必需营 基因表达载体上携带某种必需营养物质的合成基因,而受体细胞本身不能合成这一营养组分。
养物质合成基因 将细胞在不含有此营养组分的培养基中培养,存活的便是转化成功的细胞
标记基因为报告基
基因表达载体上携带的GFP基因表达的绿色荧光蛋白,在一定条件下可发出绿色荧光。将携
因[如绿色荧光蛋
带该标记基因的重组质粒导入细胞后,若细胞可发出绿色荧光,则说明转化成功
白(GFP)基因]
()对空质粒的筛选———蓝白斑筛选法:载体上携带有抗生素抗性基因及LacZ基因。LacZ基因表达产物可分解
2
产生蓝色物质,使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。该载体上仅在LacZ基因中存在目的基因插入位点,若目的
X-gal
基因插入LacZ基因,则LacZ基因失去相应功能。在大肠杆菌的培养基中加入相应抗生素和 后,未导入质粒
X-gal
的菌株不能生长,白色的菌落便是成功导入目的基因的大肠杆菌,呈现蓝色的菌落则是转入空质粒的大肠杆菌。
3.将目的基因导入受体细胞
我国科学家独创 可以用微量注射器将含目的基因的 溶液直接注入
花粉管 。 DNA
子房中 也可以在植物受粉后的一定时间内 剪去柱头 将 溶液滴加
通道法 。 , , DNA
在花柱切面上 使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
,
农杆菌细胞内含 质粒 当农杆菌侵染植物细胞后 能将 质粒上的
植物细胞 Ti 。 , Ti
受体细胞 可转移的 转移到被侵染的细胞 并将其整合到该细胞的染
农杆菌 T-DNA( DNA) ,
的种类及 色体 上 将目的基因插入 质粒的 中 不会因目的
转化法 DNA 。 Ti T-DNA (T-DNA
方法 基因的插入而丧失转移功能 通过农杆菌的转化作用 就可以使目的基因
), ,
进入植物细胞
动物细胞 显微注射法 利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中
微生物 先用 处理大肠杆菌细胞 使细胞处于一种能吸收周围环境中 分
2+
处理法 Ca , DNA
2+
细胞 Ca 子的生理状态 然后再将重组的基因表达载体导入其中
,
知识拓展 农杆菌转化法示意图
()两次重组
1
第一次重组:目的基因与 质粒构建重组载体。
① Ti
第二次重组:重组 质粒上的 插入染色体 。
② Ti T-DNA DNA
206 5年高考 3年模拟 A版 高考生物学()两次导入
2
第一次导入:将重组 质粒导入经 处理的农杆菌细胞。
2+
① Ti Ca
第二次导入:将 导入植物细胞染色体 上。
② T-DNA DNA
4.目的基因的检测与鉴定
操作方法 设计目的基因特异性引物 提取受体细胞内的基因组 进
: , DNA
检测目的 行 扩增 如果能够扩增出目的基因片段 说明该基因已经导入受体
PCR PCR , ,
基因是否 细胞
导入受体 操作方法 把目的基因片段用放射性同位素 生物素或荧光进行标记 与
: 、 ,
细胞 DNA 受体细胞的基因组 进行杂交 如果目的基因已经导入受体细胞 那
分子杂交 DNA , ,
么标记的基因片段就会与其结合 通过特殊的仪器就能够检测出来
,
分子水平
逆转录 操作方法 提取受体细胞内的总 进行逆转录 得到 以获得的
的检测 -PCR : RNA , cDNA,
检测目的
为模板 设计待测目的基因特异性引物进行
(RT-PCR) cDNA , PCR
基因是否
核酸分子 操作方法 从待测转基因生物细胞中提取 分子 用已标记的目的
转录
: mRNA ,
杂交 基因片段作为探针与 杂交
mRNA
检测目的基 抗原 抗体 操作方法 从受体细胞中提取蛋白质后 进行电泳分离 然后利用目的蛋
— : , ,
因是否翻译 杂交 白的抗体进行检测
个体生物
检测目标性状的有无等 如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定抗虫基因是否赋予了棉花抗虫
学水平的 ,
特性以及抗性的程度
鉴定
二、基因工程的应用
D ; ' * E+*'
D * '
'
8 '36*8' 6*' U8*;+ 6
* '=D+ + 0AF
D K8 ' M 'F*8' 3 BUED"+"
/
7 '+ B L + + '+ 1U*E 15+
+
P'+*JE( * * / + D ' K E! U
* ED!! *L>+8'
N
* + B *N *F
L
! F 4*20
+*
三、蛋白质工程
设计基础 以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础
目的 改造现有蛋白质 或制造一种新的蛋白质
,
由于基因决定蛋白质 因此要对蛋白质的结构进行设计改造 最终还必须通过改造或合
简介 改造方法 , ,
成基因来完成
从预期的蛋白质功能出发 设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 找到并
基本思路 → → →
改变相对应的脱氧核苷酸序列 基因 或合成新的基因 获得所需要的蛋白质
( ) →
应用 速效胰岛素类似物的研发 延长干扰素的体外保存时间 枯草杆菌蛋白酶的改进等
、 、
小表达 蛋白质工程中为什么通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造?
。
答案:蛋白质一般具有十分复杂的空间结构,基因的结构相对简单,容易改造;改造后的基因可以遗传给下一代,而直
接改造的蛋白质无法遗传
第 23章 基因工程 207
学生用书 P186
真题选改判 上游 聚合酶识别和结合的部位 驱
RNA ,
1( 北京, )转基因抗虫棉能杀死害虫就一 动基因的转录 当诱导物存在时 可以激活
.2021 14
,
定对人有毒 或抑制目的基因的表达
。 ( )
1答案 4将目的基因导入受体细胞 植物常采用农杆
. ✕ . :
2( 辽宁, )利用蛋白质工程技术在 的 菌转化法 需将目的基因插入 质粒的
.2021 14 N0 , Ti
和 亚基之间加入一段连接肽 可获得热稳 中( 海南, )( 广东, ) 动
α β , 2023 20 2023 20 。
定的融合型腈水合酶 加入连接肽需要 物常采用显微注射技术将目的基因导入
(N1),
通过改造基因实现 将目的基因导入大肠杆菌时需先用
。 ( ) ;
2答案 处理 使之处于一种能吸收周围环
. √
,
境中 分子的生理状态 ( 江苏, )
从真题到教材 DNA 。2024 23 。
4答案 受精卵
2+
3基因表达载体的构建 基因表达载体由目的 . T-DNA Ca
. : 5目的基因的检测与鉴定 分子水平的检测 常
基因 复制原点 启动子 . : ,
、 、 、 、 采用 等技术检测 和 检测
等组成 启动子位于基因的 DNA RNA,
。 , 是否表达出相应的蛋白质常采用
作用是
。 最终还要进行
诱导型启动子的作用是 ;
水平的鉴定( 江苏, )( 江苏, )
( 黑、吉、 2022 24 2021 23 。
2024 5答案 抗原 抗体杂交技术 个体生
辽, )( 广东, )( 山东, ) . PCR —
25 2023 20 2023 25 。 物学
3答案 标记基因 终止子 以上两空可调换
. ( )
208 5年高考 3年模拟 A版 高考生物学
学生用书 P186
间 且能使目的基因按照正确的转录方向插入
一、限制酶选择的原则 , 。
为避免目的基因和质粒的自身环化和反向
1.同尾酶 (3)
连接 尽量选用不同的限制酶切割目的基因和
同尾酶是指识别 分子中不同核苷酸 ,
DNA 质粒 即双酶切
序列 但能切割产生相同末端的限制酶 如图 , 。
, , : 实例分析
(4)
由同尾酶产生的黏性末端 能够通过碱基
,
互补配对彼此连接 可用于基因表达载体的
,
构建
。
2.限制酶选择的原则 质粒
限制酶不能破坏目的基因的完整结构 也
(1) ,
不能破坏载体上的启动子 终止子 复制原点
、 、
等必要元件
。 含目的基因的片段
限制酶识别位点应位于启动子和终止子之
(2) 注 基因以乙链为转录模板链 Mfe 和
:①W ;② Ⅰ
Eco 为同尾酶 可切出相同的黏性末端
RⅠ ,
续表 的基因整合于染色体中以实现表达 已知当甲
。
质粒中含 个Eco 识别位点 选用Eco 醇作为唯一碳源时 该酵母菌中AOX1基因受
① 2 RⅠ , RⅠ ,
会切去终止子 选用Bam 会破坏启动子 故
, HⅠ , 到诱导而表达 和 分别
可选用的限制酶有Mfe Hin Kpn ,5'AOX1 3'AOX1(TT)
Ⅰ、 dⅢ、 Ⅰ。
基因以乙链为转录模板链 聚合酶从
是基因AOX1 的启动子和终止子 请分析
分析 ②W ,RNA 。
模板链的 端开始转录 故 基因乙链的 端
回答
质粒 3' , W 3'
:
与启动子相连 端与终止子相连 为保证
,5' , W
基因与质粒正确连接 质粒的终止子一侧应选 4OB#"νS 55
,
用与 基因右侧相同的Hin 故切割质粒 4BD K=#
W dⅢ, #HM
可选的限制酶为Mfe Hin "09 55 5* %/"
Ⅰ、 dⅢ !7L "09
"09 EL 1$3
分析 选用Mfe
Ⅰ
会破坏
W
基因
,
故只能选择同尾酶 L
2
2
" #
目的 Eco RⅠ, 因此选用Eco RⅠ、 Hin dⅢ 切割含 W #HM )#T"H
基因 基因的 Q1*$,B1
DNA
典例 1 ( 全国甲, 节选)某同学采用基因 D
O O O
2024 38 F
工程技术在大肠杆菌中表达蛋白 回答下列 "09 "0936
E。 F3B1 5 8 F3%/"
问题
。
与大肠杆菌等原核生物相比 用巴斯德毕赤
质粒载体上有限制酶 的酶切位点 限 (1) ,
(2) a、b、c ,
酵母作为基因工程的受体细胞 其优点是
制酶的切割位点如图所示 构建重组质粒时 与 ,
。 ,
用酶 单酶切相比 用酶 和酶 双酶切的优点 。
a , a b
要获取HBsAg基因 可采取 技术进
体现在 (2) , PCR
行大量扩增 其前提是
答出 点即可 使用酶 单酶切构 ,
( 2 ); c
将HBsAg基因导入酵母菌
建重组质粒时宜选用的连接酶是 。
。
前需完成基因表达载体的构建获取重组质粒
,
一是因为HBsAg基因片段小 在细胞中容易
,
丢失 二是因为缺少
; ,
FB FC FD
HBsAg基因在细胞中不能复制
。
答案 避免载体自连 保证目的基因连接方 为实现HBsAg基因和 质粒重组
(2) , (3) pPIC9K ,
向正确 连接酶 应该选择 切割质粒 并
T4DNA ,
二、基因工程的操作程序分析 在HBsAg基因两侧的 和 位置接上
A B
典例 2 ( 届常州前黄高级中学学情检测, ) 确保定向连接
2025 24 , 。
如图是将乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg导 酶切获取HBsAg基因后 需用
(4) ,
入巴斯德毕赤酵母生产乙肝疫苗的过程图 巴 酶将其连接到 质粒上 形成重组质粒
。 pPIC9K , ,
斯德毕赤酵母是一种甲基营养型酵母 能将甲 并将其导入大肠杆菌以获取
, 。
醇作为其唯一碳源 该酵母菌体内无天然质 步骤 中应选用 酶来切割
。 (5) 3
粒 科学家改造出了图中所示的 质粒 重组质粒以获得重组 然后再将其导入巴
, pPIC9K DNA,
用作载体 其与目的基因形成的重组质粒经酶 斯德毕赤酵母细胞
, 。
切后可以与酵母菌染色体发生同源重组 将目 为了确认巴斯德毕赤酵母转化是否成功 在
, (6) ,
第 23章 基因工程 209
培养基中应该加入 以便筛选 若要 并电泳,若出现条带,则说明已成功导入目的
。 PCR
基因。
检测转化后的细胞中是否含有HBsAg基因转
变式 同考法不同情境 ( 黑、吉、辽, , 分)
录产物 可以用 方法进行检测 转化的 2024 2512
, 。
将天然 质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒
酵母菌在培养基上培养一段时间后 需要向其
Ti
,
辅助 转移 和不含有Vir基因 含有
中加入 以维持其生活 同时诱导HBsAg ( T-DNA ) 、
,
的穿梭质粒 共同转入农杆菌 可提高转
基因表达 T-DNA , ,
。
化效率 细菌和棉花对密码子偏好不同 为提高
答案 蛋白质合成后 酵母细胞可以在内质 。 ,
(1) ,
翻译效率 增强棉花抗病虫害能力 进行如下操
网和高尔基体中对其进行加工和修饰并分泌到 , ,
作 回答下列问题
细胞外 便于提取 有一段已知的HBsAg 。 。
, (2) 7F 8
基因的核苷酸序列来合成引物 复制原点
限制酶Sna 和Avr Sna Avr .
(3) BⅠ Ⅱ BⅠ、 Ⅱ #U 7
限制酶识别序列 连接 大量重组质
(4)DNA
#U 33
粒 限制酶Bgl 卡那霉素 分子杂
(5) Ⅱ (6) F 7 '
交 甲醇 ' ' 8 D
/PCR/RT-PCR
D
知识归纳 转基因“受体细胞”的筛选 ' 3 3 3 7JS
B1
()用含抗生素的培养基筛选 _
1
载体只有一种标记基因,如四环素抗性基因,需将完成 _ QT
①
转化后的受体细胞接种在含四环素的培养基中培养,能 ! F 5%/" Q - # T / &
生长的细胞为导入质粒(包括重组质粒和空质粒)的受体 B1 )ZH#3
F3 ,BO3 5%/"3#
细胞。 0SJ
载体有两种标记基因,如四环素抗性基因和氨苄青霉
注 表示引物 表示左边界
② :F1~F3,R1~R3 ;T-DNA-LB ;
素抗性基因。
表示右边界Ori表示复制原点 KanR 表示卡那
T-DNA-RB ; ;
,+
霉素抗性基因 HygBR 表示潮霉素 抗性基因
; B 。
(2
从苏云金杆菌提取 时 需加入蛋白酶
!7L (1) DNA , ,
L2 F3B1 其作用是 提取过程中加入
。
体积分数为 的预冷酒精 其目的是
B1
95% ,
。
本操作中获取目的基因的方法是 和
(2)
(2 !7LL 36
+ 2+
。
将转化后的受体细胞先接种在含氨苄青霉素的培养基
穿梭质粒中p35s为启动子 其作用是
(3) ,
上培养,能生长的是含重组质粒的细胞和含空质粒的细 驱动目
,
胞,如图中 、、、、 处,在 处位置上分别挑取细
12345 1~5
的基因转录 插入两个p35s启动子 其目的可
; ,
菌,置于含四环素的培养基上相应位置,标记出形成的
能是
菌落的位置,能在含氨苄青霉素的培养基上生长,且 。
不能在含四环素的培养基上生长的为含重组质粒的 根据图中穿梭质粒上的KanR 和HygBR 两
(4)
受体细胞,如图中 、 处细菌是含重组质粒的受体 个标记基因的位置 用 基因对应
15 ,
细胞。
的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织
()利用其他技术筛选目的基因:如提取受体细胞中 。
2 为检测棉花植株是否导入目的基因 提取棉
的质粒进行酶切并电泳,根据电泳条带进行判断,或提 (5) ,
取受体细胞中的质粒,依据目的基因序列设计引物进行 花植株染色体 作模板 进行 应选用
DNA , PCR,
210 5年高考 3年模拟 A版 高考生物学
的引物是 和 用 合成基因序列和 天
。 D. 1~1362 1363~1848
本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工 然基因序列获得改造的抗虫蛋白
(6)
程 理由是 单选 答案 使蛋白质水解 使蛋白质等溶解在
, ( )。 (1)
通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 酒精中 不溶于酒精而析出
A. ,DNA (2)PCR
将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 人工合成 聚合酶识别并结合的部位
B. (3)RNA
将 基因序列改变为棉花细胞偏好密 使目的基因在植物细胞中高效表达 保证目
C. 1~1362 (
码子的基因序列 的基因的高水平表达 潮霉素 抗性
) (4) B
(5)F3 R2 (6)D
第 23章 基因工程 211
