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3区4.5分!多组学发文模板|TCGA公共数据库挖掘+靶向代谢组+RNA‑seq,层层筛选,解锁肠道代谢物抑制三阴性乳腺癌的分子密码!
马尿酸如何抑制三阴性乳腺癌？这篇研究通过靶向代谢组学发现，高脂饮食条件下马尿酸显著下调，而体外实验证实马尿酸能选择性抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，对非三阴性细胞影响甚微。更精彩的是，作者通过转录组测序锁定EGFL8为关键下游靶点，并揭示了EGFL8-Notch信号轴在这一过程中的核心作用，为代谢干预三阴性乳腺癌提供了全新视角。
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新鲜出炉！今天给大家深度剖析一篇2026年6月发表在《Biomedicines》上的文章，题目为：马尿酸通过EGFL8-Notch信号轴抑制三阴性乳腺癌
Hippuric Acid Suppresses Triple-Negative Breast Cancer via the EGFL8-Notch Signaling Axis.
本研究通过靶向代谢组学分析高脂饮食诱导的MMTV-PyMT自发乳腺癌小鼠血清，发现马尿酸是显著下调的代谢物；功能实验表明马尿酸选择性抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭；转录组测序鉴定EGFL8为下游靶点，并证实马尿酸通过EGFL8-Notch信号轴发挥抗肿瘤作用。
影响因子：4.5
发表期刊：Biomedicines
团队成员合影（位于上海陆家嘴中心，可随时预约参观）
代谢组学与转录组学整合分析： 通过对高脂饮食诱导的MMTV-PyMT自发乳腺癌小鼠模型进行靶向血清代谢组学分析，结合三阴性乳腺癌细胞的转录组测序，系统筛选并鉴定了马尿酸及其下游靶点EGFL8。
马尿酸对三阴性乳腺癌的选择性抑制作用： 马尿酸显著抑制三阴性乳腺癌细胞（4T1和MDA-MB-231）的增殖、迁移和侵袭，而对正常乳腺上皮细胞（MCF10A）和管腔A型乳腺癌细胞（MCF7）影响甚微，显示出对三阴性乳腺癌的选择性。
EGFL8作为新型肿瘤抑制因子： 首次在乳腺癌中系统研究EGFL8的功能，发现其过表达抑制三阴性乳腺癌细胞的恶性表型，敲低则促进肿瘤进展，确立EGFL8在三阴性乳腺癌中的肿瘤抑制角色。
揭示EGFL8-Notch信号轴的调控机制： 发现EGFL8负向调控Notch信号通路，马尿酸通过上调EGFL8进而抑制Notch1、Jag1及其下游靶基因Hes1和Hey1的表达。
临床相关性验证： 基于TCGA数据库分析发现，EGFL8在乳腺癌组织中表达显著降低，在三阴性乳腺癌中尤为明显，且其表达随肿瘤分期进展而下降，与T、N、M分期显著相关。
首次揭示马尿酸对三阴性乳腺癌的直接抗肿瘤作用： 以往研究多将马尿酸视为代谢生物标志物，本研究首次证明其作为生物活性代谢调节因子直接抑制三阴性乳腺癌进展，拓展了对其功能的认识。
鉴定EGFL8为马尿酸下游关键介质： 通过RNA测序筛选出EGFL8为马尿酸处理后最显著且一致上调的差异表达基因，并通过功能获得和缺失实验及回复实验证实EGFL8是马尿酸抗肿瘤作用的关键介质。
阐明EGFL8-Notch信号轴的分子机制： 揭示EGFL8通过负向调控Notch信号通路发挥肿瘤抑制作用，马尿酸通过上调EGFL8进而抑制Notch通路活性，为三阴性乳腺癌的代谢干预提供了新的分子靶点。
建立肠道微生物-代谢物-肿瘤信号轴： 将肠道微生物来源代谢物马尿酸与三阴性乳腺癌的调控机制相联系，提出了一条新的肠道微生物-代谢物-肿瘤信号轴。
多维度研究方法的整合： 整合靶向代谢组学、转录组测序、公共数据库分析、功能获得与缺失实验以及回复实验，系统验证了从代谢物发现到分子机制的全链条。
三阴性乳腺癌因缺乏雌激素受体、孕激素受体和HER2的表达，对内分泌治疗和HER2靶向治疗均不敏感，化疗、放疗和手术是主要治疗手段，亟需探索新的分子机制和治疗靶点。饮食诱导的肥胖通过慢性炎症、激素失调和代谢重编程等机制促进肿瘤进展，但介导肥胖与三阴性乳腺癌进展之间关联的具体循环代谢物尚不明确。马尿酸作为一种肠道微生物与宿主共同产生的代谢物，具有抗炎和抗氧化特性，在多种恶性肿瘤中水平降低，但其在乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌中的作用尚未被探索。EGFL8属于表皮生长因子样蛋白家族，在细胞黏附、血管生成和侵袭转移中发挥作用，但其在三阴性乳腺癌中的功能和调控机制尚未被系统研究。
动物模型与血清采集： 使用FVB/N背景的MMTV-PyMT自发乳腺癌小鼠，分为高脂饮食组和正常饮食组，采集血清进行靶向代谢组学分析。
代谢组学分析： 对血清样本进行靶向代谢组学检测，通过主成分分析评估组间代谢差异，依据fold change≥2、p<0.05、VIP>1的标准筛选差异代谢物，并进行KEGG通路富集分析。
细胞功能实验： 使用马尿酸处理三阴性乳腺癌细胞（4T1、MDA-MB-231）及对照细胞（MCF10A、MCF7），通过CCK8实验、Transwell实验和克隆形成实验评估其对增殖、迁移和侵袭的影响。
转录组测序与靶点筛选： 对马尿酸处理的4T1细胞进行RNA测序，筛选差异表达基因，结合公共数据库分析，通过qPCR验证候选基因。
功能验证与机制研究： 通过过表达和敲低EGFL8，结合回复实验，验证EGFL8在马尿酸抗肿瘤作用中的介导角色；检测Notch通路相关基因的表达变化，阐明EGFL8-Notch信号轴的调控机制。
临床相关性分析： 利用TCGA-BRCA数据库分析EGFL8在乳腺癌中的表达特征及其与病理分期和TNM分期的相关性。
代谢组学鉴定马尿酸为关键代谢物： 主成分分析显示高脂饮食组与正常饮食组血清代谢谱明显分离。在检测到的395种代谢物中，23种显著改变，其中马尿酸在正常饮食组中显著富集（fold change=8.49，p=0.019），被选为后续功能研究对象。
马尿酸选择性抑制三阴性乳腺癌细胞恶性表型： CCK8实验显示马尿酸剂量依赖性抑制4T1和MDA-MB-231细胞增殖，增殖标志物Ki67和Pcna表达降低。Transwell实验表明马尿酸显著抑制迁移和侵袭。分子水平上，马尿酸下调间充质标志物（Cdh2、Vim、Fn1）和侵袭相关酶Mmp9，上调上皮标志物Tjp1，提示抑制上皮-间充质转化。而马尿酸对MCF10A和MCF7细胞的增殖、迁移和侵袭无显著影响。
EGFL8被鉴定为马尿酸下游介质： RNA测序鉴定出54个差异表达基因，包括31个上调和23个下调基因。结合公共数据库分析，9个候选基因经qPCR验证，其中EGFL8在4T1和MDA-MB-231细胞中上调最为显著且一致。
EGFL8抑制三阴性乳腺癌细胞恶性表型： EGFL8过表达显著降低克隆形成和增殖能力，下调增殖相关基因，抑制迁移和侵袭，伴随上皮-间充质转化相关基因改变。相反，EGFL8敲低促进克隆形成、增殖、迁移和侵袭，伴随上皮-间充质转化激活。
EGFL8介导马尿酸的抗肿瘤效应： 回复实验显示，EGFL8敲低显著减弱马尿酸对克隆形成、增殖及增殖相关基因表达的抑制作用，部分逆转马尿酸对迁移、侵袭和上皮-间充质转化相关基因表达的抑制效果。
EGFL8/Notch信号轴参与马尿酸介导的三阴性乳腺癌抑制： EGFL8敲低显著增加Notch1、Jag1及下游靶基因Hes1和Hey1的表达，而过表达产生相反效果。马尿酸单独处理降低4T1和MDA-MB-231细胞中Notch通路组分的表达，并减弱EGFL8敲低引起的这些基因上调，提示EGFL8负向调控Notch相关分子。
EGFL8在乳腺癌中的临床相关性： 公共数据库分析显示，EGFL8在乳腺癌组织中表达显著低于正常组织，在三阴性乳腺癌中尤为降低，且随肿瘤分期进展而下降，与T、N、M分期显著相关。
结论：本研究证明马尿酸通过上调EGFL8并抑制Notch信号通路来抑制三阴性乳腺癌进展。马尿酸选择性抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，对非三阴性细胞影响甚微。EGFL8过表达重现马尿酸的抗肿瘤效果，而敲低则减弱这些效果，建立了马尿酸与EGFL8之间的功能联系。EGFL8负向调控Notch信号通路，为观察到的表型提供了机制基础。这些发现揭示了一条新的肠道微生物-代谢物-肿瘤信号轴，提示马尿酸作为治疗候选物的潜力。
讨论：马尿酸是肠道微生物来源的苯甲酸与宿主甘氨酸代谢结合形成的典型肠道微生物-宿主共代谢物。既往研究报道马尿酸参与氧化应激调节、炎症和免疫反应调节等生物学过程，但其在癌症中的直接作用研究较少。本研究首次证明马尿酸作为生物活性代谢调节因子直接抑制三阴性乳腺癌进展，将其角色从代谢生物标志物拓展到具有药理潜力的功能分子。EGFL8属于表皮生长因子样结构域蛋白家族，在细胞黏附、迁移和组织发育中发挥重要作用，但其在癌症中的角色鲜有报道。本研究鉴定EGFL8为三阴性乳腺癌中的新型肿瘤抑制因子，并将其与Notch信号通路相联系。Notch信号通路是高度保守的细胞间通讯系统，促进肿瘤细胞增殖、存活、抗凋亡以及上皮-间充质转化、侵袭和转移。本研究中Notch通路关键组分在EGFL8调控和马尿酸处理下表现出一致的变化，提示EGFL8/Notch信号轴参与马尿酸介导的三阴性乳腺癌抑制。值得注意的是，马尿酸在三阴性乳腺癌细胞系中比MCF7细胞表现出更强的抗肿瘤效果，提示其生物学效应可能受EGFL8表达之外的亚型特异性分子背景影响。与pan-Notch通路抑制剂（如γ-分泌酶抑制剂）相比，马尿酸作为内源性代谢物在实验条件下表现出抗肿瘤活性且无明显细胞毒性效应。本研究存在若干局限性：仍需在三阴性乳腺癌模型中进行马尿酸体内验证；马尿酸调控EGFL8表达的上游机制尚不清楚；需要进一步的蛋白质和功能水平验证以完全确立Notch通路的参与；马尿酸水平是否与人类乳腺癌风险或预后相关，以及EGFL8/Notch轴在人类三阴性乳腺癌中是否发挥类似作用，均需进一步研究。
基于我们此前的发现，即高脂饮食促进MMTV-PyMT自发性乳腺癌小鼠模型中的肿瘤转移[25]，我们进一步研究了循环代谢改变，以鉴定与肿瘤进展相关的关键代谢物。对来自同一小鼠队列的血清样本进行了靶向代谢组学分析（图1A）。主成分分析（PCA）显示DIO组与正常对照组之间存在明显分离，表明高脂喂养诱导了显著的代谢转变（图1B）。在检测到的395种代谢物中，主要类别包括氨基酸和肽类、脂肪酸、有机酸、碳水化合物、胆汁酸和芳香族化合物（图1C）。KEGG通路富集分析显示，这些代谢物主要参与氨基酸代谢、碳水化合物代谢、核苷酸代谢、脂质代谢以及外源生物降解与代谢（图1D）。基于预定义的筛选标准，23种代谢物被鉴定为显著改变，包括14种上调和9种下调代谢物（图1E）。显著改变代谢物的完整列表见表A2。值得注意的是，马尿酸在正常饮食组中显著富集。作为一种由肠道微生物群和宿主共同产生的内源性代谢物，马尿酸已知具有抗炎和抗氧化特性。既往研究报道多种癌症中马尿酸水平降低，提示其潜在的抑瘤作用[17–20]。因此，选择马尿酸进行后续的功能和机制研究。
鉴于TNBC的高度侵袭性，我们接下来评估了马尿酸对肿瘤细胞行为的功能影响。CCK-8实验表明，马尿酸以剂量依赖性方式显著抑制小鼠TNBC 4T1细胞的增殖（图2A）。一致地，增殖标志物Ki67和Pcna的表达显著降低（图2B）。在人TNBC细胞系MDA-MB-231中也观察到类似的抑制效果（图2C,D）。接下来，Transwell实验进一步揭示马尿酸显著抑制4T1细胞的迁移和侵袭能力（图2E）。在分子水平上，马尿酸下调间充质标志物（Cdh2、Vim、Fn1）和侵袭相关酶Mmp9，同时上调上皮标志物Tjp1（图2F），表明抑制了上皮-间充质转化（EMT）。在MDA-MB-231细胞中获得了可比的结果（图2G,H）。为进一步评估马尿酸的细胞类型特异性，我们评估了其对正常乳腺上皮细胞（MCF10A）和luminal A型乳腺癌细胞（MCF7）的作用。重要的是，马尿酸对非TNBC细胞表现出极小的影响。正常乳腺上皮细胞（MCF10A）或luminal A型乳腺癌细胞（MCF7）的增殖、迁移和侵袭能力均未发生显著改变（图2I–L）。综上所述，这些结果表明马尿酸选择性抑制TNBC细胞的恶性表型。
为阐明马尿酸抗肿瘤作用的分子机制，对4T1细胞（一种小鼠TNBC细胞系，选择以保持与小鼠来源的代谢组学和体内实验模型的一致性）在马尿酸处理后进行了RNA测序（RNA-seq）（图3A）。共鉴定出54个差异表达基因（DEGs），包括31个上调基因和23个下调基因。基于倍数变化和统计显著性，选择了前20个DEGs。结合公共数据库分析，通过qPCR进一步验证了9个候选基因，包括Akap6、Nsun7、Egfl8、Csf2、Nanp、Rnf223、Mmp10、Isoc2a和Aifm3（图3B）。其中，EGFL8在4T1和MDA-MB-231细胞中均显示出最显著且一致的上调，与RNA-seq结果一致（图3C）。鉴于既往报道提示EGFL8在肿瘤进展中的作用[22–24]，这些数据表明EGFL8可能作为介导马尿酸抑制TNBC进展的潜在下游靶点。
为确定EGFL8的功能作用，在MDA-MB-231细胞中进行了功能获得和功能缺失实验。EGFL8过表达和敲低的效率通过qRT-PCR确认（补充图S1）。EGFL8过表达显著降低了集落形成和增殖，并伴随增殖相关基因的下调（图4A–C）。此外，EGFL8过表达显著抑制迁移和侵袭，并伴随EMT相关基因的相应变化（图4D,E）。相反，EGFL8敲低促进了克隆形成和增殖（图4F–H），并促进迁移和侵袭，伴随EMT激活（图4I,J）。综上所述，这些结果确立了EGFL8作为TNBC中的抑癌因子，其效应与马尿酸诱导的效应高度一致。
为验证马尿酸与EGFL8之间的功能联系，进行了拯救实验。EGFL8敲低显著减弱了马尿酸对集落形成和增殖的抑制作用（图5A,B），以及对增殖相关基因表达的抑制（图5C）。类似地，马尿酸对迁移、侵袭和EMT相关基因表达的抑制效应在EGFL8沉默后被部分逆转（图5D,E）。总体而言，这些发现表明EGFL8是马尿酸抗肿瘤活性的关键介质。
基于既往研究报道EGFL8与Notch信号在癌症进展中的潜在调控关系，我们进一步研究了EGFL8是否调节该通路[26]。EGFL8敲低显著增加了Notch1、Jag1以及下游靶基因Hes1和Hey1的表达（图6A），而EGFL8过表达产生相反效果（图6B）。随后，我们进一步探究了马尿酸对Notch信号的影响。一致地，马尿酸单独处理降低了4T1和MDA-MB-231细胞中Notch1通路组分的表达（图6C,D）。此外，马尿酸处理减弱了EGFL8敲低诱导的这些基因上调（图6E），提示EGFL8可能负向调控Notch相关分子。这些结果表明马尿酸至少部分通过EGFL8-Notch信号通路抑制TNBC进展。
公共数据库分析显示，与正常组织相比，乳腺癌组织中EGFL8表达显著降低（图7A）。亚型分析进一步表明EGFL8在乳腺癌亚型之间存在差异表达，在TNBC中观察到显著降低的表达（图7B）。此外，EGFL8表达随肿瘤分期进展而降低（图7C），并与T、N和M分类显著相关（图7D–F），表明其与肿瘤进展和转移密切相关。
更多结果和补充图表:
PMID：42351828
DOI：10.3390/biomedicines14061400
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