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专题12 基因工程
一、选择题
1．（2026·黑龙江省双鸭山市第一中学·一模） 关于“琼脂糖凝胶电泳”实验，下列叙述错误的是
（ ）
A. 根据待分离DNA 片段的大小，需用缓冲液配制0.8%～1.2%的琼脂糖溶液
B. 向琼脂糖溶液中加入适量的核酸染料后，需在沸水浴内加热至琼脂糖熔化
C. 将PCR 产物和载样缓冲液混合后，需用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔
D. 待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，需及时断电并取出凝胶置于紫外灯下观察
【答案】B
【解析】A、琼脂糖凝胶的浓度决定凝胶孔径大小，需根据待分离DNA 片段的大小配制对应浓度的琼脂
糖溶液，0.8%～1.2%为分离常规大小DNA 片段的常用浓度范围，A 正确；
B、先将琼脂糖溶液沸水浴加热熔化，待冷却至50~60℃左右再加入核酸染料，避免高温破坏染料结构使
其失效，B 错误；
C、载样缓冲液可增加样品密度，使样品能沉入加样孔，同时含有指示剂可指示电泳进度，因此PCR 产
物需与载样缓冲液混合后，用微量移液器缓慢注入加样孔，C 正确；
D、指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时需及时断电，避免待分离DNA 片段跑出凝胶，结合了核酸染料的
DNA 在紫外灯下可发出荧光，便于观察条带，D 正确。
2．（2026·内蒙古呼和浩特市·一模）叶绿体发育与BG 基因、GK 基因的表达有关、GK 功能缺失突变体
的叶绿素含量会显著降低。研究者将一定浓度的GK 蛋白与系列浓度BG 蛋白混合后，再加入GK 蛋白靶
基因CAO 的启动子DNA 片段，反应一段时间后，经琼脂糖凝胶电泳检测结果如下图。以下分析正确的
是（ ）
A. BG 蛋白通过抑制GK 蛋白的功能影响叶绿体发育
B. GK 蛋白结合靶基因CAO 导致叶绿素的含量下降
C. 条带中的“游离DNA 片段”来自BG 基因
D. 随BG 蛋白浓度增加CAO 的启动子功能增强
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【答案】A
【解析】A、结合题意及题图可知，BG 蛋白浓度越高，GK 结合靶启动子的能力越弱，说明BG 通过抑制
GK 的功能，影响叶绿体发育，A 正确；
B、分析题意可知，GK 可结合其靶基因CAO 的启动子DNA，GK 功能缺失会导致叶绿素含量显著降低，
说明正常功能的GK 可维持叶绿素正常合成，与叶绿体发育相关GK 功能缺失才会导致叶绿素含量下降，
说明GK 结合靶基因CAO 会促进叶绿素合成，而非导致含量下降，B 错误；
C、本实验中加入的DNA 是CAO 的启动子片段，游离DNA 是未结合GK 的CAO 启动子片段，不是BG
基因，C 错误；
D、电泳结果显示：随着BG 蛋白浓度升高，与GK 结合的CAO 启动子DNA 逐渐减少，游离的CAO 启
动子DNA 逐渐增多，说明BG 会抑制GK 与CAO 启动子的结合，CAO 启动子无法正常发挥启动转录的
功能，功能逐渐减弱，D 错误。
3．（2026·内蒙古呼和浩特市·一模）T4 噬菌体基因编码的T4DNA 连接酶，可连接具有黏性末端和平末
端的DNA 分子，下列有关T4DNA 连接酶的叙述正确的是（ ）
A. 组成元素为C、H、O、N、P
B. 在T4 噬菌体的核糖体上合成
C. 能连接黏性末端和平末端，不具有专一性
D. 可降低DNA 分子间形成磷酸二酯键所需的活化能
【答案】D
【解析】A、T4DNA 连接酶的本质为蛋白质，蛋白质的基本组成元素是C、H、O、N，多数不含P 元素，
A 错误；
B、T4 噬菌体属于病毒，无细胞结构，不含有核糖体，B 错误；
C、酶的专一性指一种酶可催化一种或一类化学反应，T4DNA 连接酶只能催化DNA 片段间磷酸二酯键的
形成，虽然可连接两类末端，仍具有专一性，C 错误；
D、酶的作用机理是降低化学反应所需的活化能，DNA 连接酶的功能是催化DNA 片段间形成磷酸二酯键，
因此可降低该反应的活化能，D 正确。
4. （2026·吉林省长春市·一模）利用PCR 既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关
PCR 的叙述错误的是（ ）
A. PCR 用的 DNA 聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA 的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA 聚合酶、ATP 和4 种核糖核苷酸
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【答案】D
【解析】A、PCR 使用的DNA 聚合酶（如Taq 酶）需耐受高温，因为变性步骤需高温处理，A 正确；
B、PCR 变性通过高温（约95℃）使双链DNA 解开，无需解旋酶参与，B 正确；
C、复性时引物与模板链通过碱基互补配对结合（如A-T、C-G），C 正确；
D、延伸阶段合成的是DNA 链，所需原料为4 种脱氧核苷酸（dNTP），而非核糖核苷酸，D 错误。
故选D。
5.（2026·黑龙江省齐齐哈尔市·一模）冠瘿是植物被农杆菌感染后根部长出的肿瘤（如图1 所示），冠瘿
的形成与天然农杆菌的Ti 质粒（如图2 所示）有关，其中Vir 基因编码的产物可激活T-DNA 转移。下列
相关叙述正确的是（ ）
A. 长出冠瘿的植物根部某些植物激素水平较高
B. T-DNA 区域的基因可在植物细胞的细胞质基质中复制、转录、翻译
C. 若用Ti 质粒作为基因的载体，可将目的基因插入Vir 基因的内部
D. 若利用农杆菌进行基因工程转化，需将其Ti 质粒上的所有基因去掉
【答案】A
【解析】A、冠瘿是植物被农杆菌感染后根部长出的肿瘤，冠瘿的形成与天然农杆菌的Ti 质粒，该质粒
可将T-DNA 转移到受体细胞的染色体DNA 上，T-DNA 中含有生长素合成酶基因和细胞分裂素合成酶基
因，这些基因表达会使植物细胞中生长素和细胞分裂素含量升高，而生长素和细胞分裂素能促进植物组
织异常增殖形成肿瘤（冠瘿） ，因而推测，长出冠瘿的植物根部某些植物激素水平较高，A 正确；
B、T-DNA 区域的基因会转移到受体细胞的染色体DNA 上，因而在植物细胞的细胞核中复制、转录，但
翻译过程发生在细胞质基质中的核糖体上，B 错误；
C、Vir 基因编码的产物可激活T−DNA 转移，若将目的基因插入Vir 基因内部，会破坏Vir 基因的结构，
使其不能编码激活T−DNA 转移的产物，导致T−DNA 无法转移，所以目的基因不能插入Vir 基因内部，
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而应插入T−DNA 区域 ，C 错误；
D、若利用农杆菌进行基因工程转化，不需要将其Ti 质粒上的所有基因去掉，只需要去除Ti 质粒上的T -
DNA 区域中的致瘤基因（生长素合成酶基因和细胞分裂素合成酶基因等），保留T - DNA 的边界序列以
及Vir 基因等必要元件，以便将目的基因插入T - DNA 区域并借助Vir 基因激活T - DNA 转移，D 错误。
二、非选择题
1．（2026·黑龙江省哈尔滨市南岗区第三中学·一模） 白桦是我国东北地区重要的绿化树种，土壤盐渍化
严重制约其生长，而BpMYB5 基因是调控白桦耐盐性的关键基因。为验证该基因的耐盐功能，研究人员
利用无缝克隆技术，将BpMYB5 基因与绿色荧光蛋白（eGFP）基因融合，构建了pBI121-BpMYB5-eGFP
过表达载体，开展相关实验研究。
注：kanR 为卡那霉素抗性基因，TetR 为四环素抗性基因。
（1）①过程是利用PCR 技术将质粒线性化，进行PCR 扩增质粒时，需要质粒、引物、_____、含Mg2+的
缓冲液和耐高温的DNA 聚合酶；该过程中引物应选择_____；耐高温的DNA 聚合酶在PCR 的_____步骤
中起作用。
（2）为确保BpMYB5 基因与eGFP 基因融合后能成功构建融合基因，并表达出完整的融合蛋白，在引物
设计时，应去除_____（单选）。
A. BpMYB5 基因中编码起始密码子的序列
B. BpMYB5 基因中编码终止密码子的序列
C. eGFP 基因中编码起始密码子的序列
D. eGFP 基因中编码终止密码子的序列
（3）已知相关基因的编码链（与模板链互补的DNA 链）的部分序列如下表（AUG 为起始密码子，
UAG、UAA、UGA 为终止密码子）。为实现二者的无缝克隆且保证融合蛋白的正常表达，图中引物R1
的设计至关重要，该引物的碱基序列应为5'-_____-3'。
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BpMYB5 基因序列
5'-AATGCCTAGT……GTGTTTTAGCAT-3'
eGFP 基因序列
5'-CATGTCCAGC……AACCCATAACCA-3'
（4）实验人员将重组的pBI121-BpMYB5-eGFP 载体（Ti 质粒）通过_____法侵染经消毒后的白桦种子，
为筛选出成功导入重组质粒的白桦种子，培养基上需要添加_____。
（5）将筛选得到的转基因种子经培养可获得转基因白桦植株，通过观察_____以了解BpMYB5 基因的表
达水平和表达部位。
（6）若将pBI121-BpMYB5-eGFP 过表达载体导入白桦细胞后，培育出的转基因白桦植株耐盐性未明显增
强，请结合题干实验情景，分析可能的原因_____（答出一点即可）。
【答案】（1） ①. 四种脱氧核苷酸（四种dNTP） ②. 引物2 和引物3 ③. 延伸 （2）B
（3）GCTGGACATAAACAC
（4） ①. 农杆菌转化 ②. 卡那霉素
（5）绿色荧光强度和分布
（6）①BpMYB5 基因未成功整合到白桦细胞的染色体DNA 上，导致该基因无法稳定转录和表达，无法
发挥调控耐盐性的功能
②融合基因（BpMYB5-eGFP）在转录过程中出现异常，如启动子未被正常识别、转录产物被降解，导致
基因表达产物（融合蛋白）合成不足
③BpMYB5 基因表达产物（蛋白质）未正确折叠或定位异常，无法正常调控与耐盐相关基因的表达，进
而无法增强白桦的耐盐性
④无缝克隆过程中出现碱基错配，导致BpMYB5 基因功能异常，无法正常发挥调控作用（或其他合理答
案）
【解析】
【小问1 详解】
PCR 扩增的原料为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP，统称四种dNTP），此外还需要模板
（质粒）、引物、含Mg ²+的缓冲液和耐高温的DNA 聚合酶（Taq 酶）；①过程为质粒的线性化，需要
扩增质粒上启动子到终止子的片段，结合图示引物位置，引物2 和引物3 可与质粒的互补链结合，沿
5'→3'方向扩增出目标线性化质粒，引物1 和4 则用于扩增目的基因，因此该过程选引物2 和3；耐高温的
DNA 聚合酶的作用是催化脱氧核苷酸连接形成子链，仅在PCR 的延伸步骤（温度约72℃）发挥作用，变
性（解旋）和退火（引物结合）步骤无需DNA 聚合酶参与。
【小问2 详解】
要使BpMYB5 基因与eGFP 基因融合后表达出完整的融合蛋白，需保证两个基因的编码序列连续翻译，
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无提前终止的情况：
A、融合蛋白的翻译从BpMYB5 基因的起始密码子开始，因此需保留BpMYB5 的起始密码子序列，A 错
误；
B、若保留BpMYB5 基因的终止密码子，翻译会在BpMYB5 基因末端提前终止，无法合成包含eGFP 的
完整融合蛋白，因此需去除该序列，B 正确；
C、 eGFP 基因作为融合的下游基因，其起始密码子无需保留（翻译从上游BpMYB5 的起始密码子开
始），但这是基因融合的天然结果，并非引物设计时需主动去除的序列，C 错误；
D、融合基因的翻译需在eGFP 基因的终止密码子处结束，因此需保留eGFP 的终止密码子序列，D 错误。
故选B。
【小问3 详解】
无缝克隆的核心是让目的基因与线性化载体的末端存在互补序列，实现无酶连接；同时需保证融合基因
翻译连续，结合题干序列分析： 题中BpMYB5 基因的3'端TAG 对应终止密码子UAG，那前一位密码子
应该是TTT 所对应的UUU，按照融合蛋白能够正常表达的思路，下一个密码子应该是eGFP 基因5'端的
ATG 所对应的起始密码子AUG。 eGFP 基因的5'端序列为CATGTCCAGC，在设计引物时，去掉eGFP
基因5'端的C，该序列需与BpMYB5 的3'端互补衔接，作为无缝克隆的同源序列； 引物R1 为BpMYB5
基因的下游引物，需包含eGFP 的5'端同源序列和BpMYB5 的3'端互补序列，最终序列为5'-
GCTGGACATAAACAC-3'。
【小问4 详解】
题干中明确将重组质粒导入农杆菌，再通过农杆菌转化法侵染白桦种子（植物受体细胞），该方法是植
物基因工程中最常用的转化方法，利用农杆菌的Ti 质粒将T-DNA 上的目的基因整合到植物细胞的染色体
DNA 上； 重组质粒上的kanR（卡那霉素抗性基因）为标记基因，四环素抗性基因（TetR）未被整合到
重组质粒的T-DNA 上，因此为筛选出成功导入重组质粒的白桦种子，需在培养基中添加卡那霉素，未导
入重组质粒的细胞无卡那霉素抗性，会被抑制生长，仅有导入的细胞能存活。
【小问5 详解】
实验中将BpMYB5 基因与eGFP（绿色荧光蛋白）基因融合构建表达载体，绿色荧光蛋白可作为报告基因：
绿色荧光的强度与融合蛋白的合成量正相关，反映BpMYB5 基因的表达水平（荧光越强，基因表达量越
高）；绿色荧光的分布对应融合蛋白的分布位置，反映BpMYB5 基因的表达部位（如根、茎、叶的荧光
分布，说明基因在该部位表达）。
【小问6 详解】
转基因植株目的基因功能未实现，可从基因整合、转录、翻译、蛋白功能及实验操作等环节分析，核心
逻辑为“基因未正常表达/表达产物无正常功能→无法调控耐盐相关通路→耐盐性未增强”：
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基因整合环节：农杆菌转化后，目的基因可能未整合到植物染色体DNA 上，仅存在于细胞质中，无法随
细胞分裂稳定遗传和表达；转录环节：重组质粒的启动子可能未被植物细胞的转录因子识别，或转录出
的mRNA 被细胞内的核酸酶降解，导致无有效转录产物；
翻译/蛋白功能环节：融合蛋白可能因折叠错误形成无活性的空间结构，或定位错误（如未到达细胞膜 /
细胞核的作用位点），无法激活耐盐相关基因的表达；
实验操作环节：无缝克隆时若出现碱基错配、缺失，会导致BpMYB5 基因的编码序列突变，表达出的蛋
白失去原有调控功能。
2．（2026·黑龙江省双鸭山市第一中学·一模）地衣芽孢杆菌产生的胞外多糖（EPS）通过促进大粒径土壤
团聚体形成以改良土壤。研究者利用EPS 合成酶基因（H 基因）和含木糖诱导型启动子的p 质粒（二者
结构如图1 所示）构建重组载体，以改造地衣芽孢杆菌并获取高产菌株。
（1）图1 中H 基因以a 链为转录模板链，由此可以推测H 基因的转录是从其______（填“左侧”或“右
侧”）开始的。H 基因上的一段序列为：5´-ATCTCGAGCGGG-3´中包含 Xho 识别序列（含有6 个核苷
酸），则这 6 个核苷酸序列是______。构建重组质粒时，为保证 H 基因与p 质粒正确连接，p 质粒位点
1 和2 的所对应的酶分别是______，酶切后加入______酶使它们形成重组质粒。
（2）将构建好的重组质粒转入经______处理后的地衣芽孢杆菌，经筛选获得到转基因地衣芽孢杆菌。对
其进行工业培养时，添加木糖获取更多EPS 的机理是______。
（3）质粒在细菌细胞中遗传不稳定，易丢失，研究者尝试将重组质粒进行改造，利用同源区段互换的方
法将H 基因插入地衣芽孢杆菌的拟核DNA 中，得到整合型地衣芽孢杆菌F。若将三种地衣芽孢杆菌进行
培养，结果如图3。其中D 菌为不含有 H 基因的地衣芽孢杆菌，E 菌含有 H 基因，但 H 基因没有整合到
地衣芽孢杆菌的拟核DNA 中。据图判断______最适宜改良土壤生产胞外多糖（EPS），请阐明理由
______。
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【答案】（1） ①. 右侧 ②. 5´-CTCGAG-3´ ③. Xho、BsaI(顺序不可颠倒) ④. DNA 连
接
（2） ①. Ca2+ ②. p 质粒上是木糖诱导型启动子，在培养基中需要添加木糖，才能诱导H 基因
表达出胞外多糖合成酶
（3） ①. F 菌 ②. D 菌不能产生胞外多糖（EPS），F 菌比E 菌生长迅速，胞外多糖（EPS）产量
高，H 基因整合到细菌DNA 上，不易丢失
【解析】
【小问1 详解】
转录是从DNA 链的3'端开始，mRNA 自身的延伸方向为5'→3'，由此可以推测H 基因的转录是从其右侧
开始的。限制酶切割DNA ，须两条链都有识别位点（即识别片段两条链序列成倒序），选5'-
CTCGAG-3'片段，则另一条链为3'-GAGCTC-5'，两条链都有识别位点，故推测该序列进行剪切的Xho 识
别的核苷酸序列（6 个核苷酸）最可能为5'-CTCGAG-3'。
H 基因以a 链为转录模板链，转录时mRNA 自身的延伸方向为5′→3′，即转录是从DNA 链的3′开始，
启动子是RNA 聚合酶识别和结合部位，能够驱动基因的转录，再结合质粒中启动子的方向可知，图1 中
p 质粒位点1 和2 所对应的酶分别是Xho 酶和Bsa Ⅰ酶。DNA 连接酶连接的是DNA 片段，DNA 聚合酶主
要就是将单个脱氧核糖核苷酸按照顺序连接到DNA 链上，所以酶切后加入DNA 连接酶使它们形成重组
质粒。
【小问2 详解】
目的基因导人微生物细胞常用Ca2+处理法，Ca2+处理受体细胞，可使其处于一种能吸收周围环境中
DNA 分子生理状态，这种细胞叫感受态细胞。
经筛选获得到转基因地衣芽孢杆菌，对其进行工业培养时，添加木糖获取更多EPS 的机理是：p 质粒上是
木糖诱导型启动子，在培养基中需要添加木糖，才能诱导H 基因表达出胞外多糖合成酶。
【小问3 详解】
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由图3 可知，F 菌最适宜改良土壤生产胞外多糖（EPS）原因是：D 菌不能产生胞外多糖（EPS），F 菌比
E 菌生长迅速，胞外多糖（EPS）产量高，H 基因整合到细菌DNA 上，不易丢失。
3．（2026·内蒙古鄂尔多斯市·一模）细菌治疗肿瘤是将特定细菌注入机体后，细菌趋向并聚集于肿瘤组
织，通过刺激机体产生特异性免疫反应，进而实现清除肿瘤组织的治疗方法。科研人员欲构建一种在激
光照射下，可将光能高效转化为热能，诱导Noxa 基因表达的工程菌。其中Noxa 是一种具有强烈诱导细
胞凋亡能力的蛋白质，ClyA 是可以展示在细胞膜表面的蛋白质，图为相关基因表达载体的构建过程。回
答下列问题。
注：Tcl 为温控基因，其控制合成的蛋白质在37℃时能抑制温度诱导型启动子的活性，在42℃时该蛋白
质失活。
（1）PCR 扩增目的基因：PCR 技术中，引物的作用是使DNA 聚合酶能从引物的________端开始连接脱
氧核苷酸。若2 链和4 链为基因转录的模板链，则引物________有互补区段，重叠产物1 中的两条链是
________（从“1 链”“2 链”“3 链”“4 链”中选填），其延伸过程不需要引物的原因是
____________________________。
（2）制备温度响应型细菌：用EcoRⅠ和SalⅠ对pBV220 载体和ClyA-Noxa 融合基因片段分别进行双酶
切，用________将酶切后的载体和融合基因片段连接，将基因表达载体导入大肠杆菌，并涂布于含
________的全营养LB 固体培养基中筛选。
（3）目的基因的检测与鉴定：挑取上述培养基中的单菌落，接种后分别置于温度为________的培养箱中
培养，一段时间后检测，若________，且表达产物既能展示在细胞表面且具有强促凋亡活性，则温度响
应型细菌构建成功。
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（4）温度诱导型启动子是该工程菌的重要元件，若其持续活跃，可能带来的风险是__________________。
【答案】（1） ①. 3' ②. F2 和R1 ③. 1 链和4 链 ④. 互为引物
（2） ①. DNA 连接酶 ②. 氨苄青霉素
（3） ①. 37℃和 42℃ ②. 37℃条件下未检测Cly-Noxa 融合蛋白，42℃能检测到（只有42℃能
检测到Cly-Noxa 融合蛋白）
（4）正常细胞凋亡（细菌在未到达肿瘤前就被免疫系统清除，降低疗效）
【解析】
【小问1 详解】
PCR 中，DNA 聚合酶只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。若2 链和4 链为转录模板链（即
3'→5'），则引物需与模板链互补，故引物F2 和R1 有互补区段。重叠产物1 中的两条链是1 链和4 链（1
链的3'端与4 链的5'端存在互补序列）。延伸过程不需要引物的原因是：两条单链的末端存在互补序列，
变性后可互为引物，在DNA 聚合酶作用下延伸。
【小问2 详解】
用DNA 连接酶（T4DNA 连接酶）将酶切后的载体和融合基因片段连接。涂布于含氨苄青霉素的全营养
LB 固体培养基中筛选（因为质粒上含有氨苄青霉素抗性基因）。
【小问3 详解】
根据题注可知，Tcl 为温控基因，其控制合成的蛋白质在37℃时能抑制温度诱导型启动子的活性，在42℃
时该蛋白质失活，所以要分别置于温度为37℃和42℃的培养箱中培养。若37℃条件下未检测Cly-Noxa
融合蛋白，42℃能检测到（只有42℃能检测到Cly-Noxa 融合蛋白），说明温度响应型细菌构建成功。
【小问4 详解】
若启动子持续活跃，会导致Noxa 基因持续表达，使工程菌正常细胞凋亡（细菌在未到达肿瘤前就被免疫
系统清除，降低疗效）。
4．（2026·内蒙古呼和浩特市·一模）腺相关病毒（AAV）是一种单链DNA 缺陷型非包膜病毒，是临床基
因治疗广泛使用的载体。Otof 基因（6kb）编码R 蛋白，突变可导致常见先天性耳聋。中外科研人员利用
AAV 双载体系统递送人源正常Otof 基因，通过基因工程技术治疗先天性耳聋取得显著疗效。请分析回答：
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（1）体外可利用________技术扩增Otof 基因，通过大容量载体将此目的基因导入受体细胞的缺点是感染
率和成活率低。
（2）Otof 基因和AAV 基因组如图1、图2 所示，单个AAV 能运载的最大目的基因仅为4.7kb．若“↓”为可
选择的酶切位点，则图1 需要将Otof 基因拆分为大小分别为________的5′-Otof 和Otof-3′片段，分别装入
AAV 载体形成AAV 重组载体1 和2（图3）。此外，为确保两段基因在细胞内表达，重组载体中需包括
启动子和________等序列。
（3）重组载体1 和2 共感染同一受体细胞后复制形成双链，随后重组载体2 表达Cre 酶切割重组载体1
和2 中的lox 位点，产生黏性末端，实现两段DNA 精准对接。若重组载体1 中lox 序列如图4，则重组载
体2 的lox 序列可否为图5 所示序列，请说明理由________。
（4）为了使R 蛋白基因只在特定细胞中表达，重组载体1 应选择________（填器官名称）部细胞中特异
性表达基因的启动子。为减少Cre 酶对受体细胞的其他影响，重组载体2 的启动子应选择________（填
“强”或者“弱）启动子。
（5）若要从个体水平检测Otof 基因是否表达并发挥作用，临床上通常先通过动物进行实验，可选取Otof
基因敲除小鼠模型，实验组静脉注射AAV 双载体，对________（答出一种即可）进行检测，以确定Otof
基因在受体细胞中重组并表达。
【答案】（1）PCR （2） ①. 3.5kb 和2.5kb（顺序可以互换） ②. 终止子
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（3）否，因为经Cre 酶切后5’-Otof 的片段与含3’-Otof 片段的黏性末端没有碱基互补配对，无法连接
（能够与含5’-Otof 片段黏性末端连接的不是含3’-Otof 的片段；能够与含3’-Otof 片段黏性末端连接
的不是含5’-Otof 的片段）
（4） ①. 耳 ②. 弱
（5）听觉功能（听力）
【解析】
[小问1 详解】
体外可利用PCR 技术扩增Otof 基因，通过大容量载体将此目的基因导入受体细胞的缺点是感染率和成活
率低，因而需要改进相应的方法。
【小问2 详解】
Otof 基因和AAV 基因组如图1、图2 所示，单个AAV 能运载的最大目的基因仅为4.7kb．若“↓”为可
选择的酶切位点，则图1 需要将Otof 基因拆分为大小分别为3.5kb 和2.5kb 的5′-Otof 和Otof-3′片段，
分别装入AAV 载体形成AAV 重组载体1 和2（图3）。此外，为确保两段基因在细胞内表达，重组载体
中需包括启动子和终止子等序列，保证目的基因的顺利表达。
【小问3 详解】
重组载体1 和2 共感染同一受体细胞后复制形成双链，随后重组载体2 表达Cre 酶切割重组载体1 和2 中
的lox 位点，产生黏性末端，实现两段DNA 精准对接。若重组载体1 中lox 序列如图4，则重组载体2 的
lox 序列不能为图5 所示序列，因为经Cre 酶切后<5’-Otof 的片段与含3’-Otof 片段的黏性末端没有碱基
互补配对，无法连接。
【小问4 详解】
为了使R 蛋白基因只在特定细胞中表达，重组载体1 应选择耳部细胞中特异性表达基因的启动子，该操
作可以保证目的基因在特定部位的表达。为减少Cre 酶对受体细胞的其他影响，重组载体2 的启动子应选
择弱启动子，避免对受体细胞其他部位的基因产生切割。
【小问5 详解】
若要从个体水平检测Otof 基因是否表达并发挥作用，临床上通常先通过动物进行实验，可选取Otof 基因
敲除小鼠模型，实验组静脉注射AAV 双载体，对听觉功能（听力）进行检测，进而检测Otof 基因在受体
细胞中是否进行重组并表达。
5．（2026·辽宁省沈阳市·一模）抗PD-L1 的单克隆抗体可用于癌症的免疫治疗。某研究者利用PiggyBac
转座系统将PD-L1 抗体的重链和轻链基因重组到CHO 细胞（源于中国仓鼠的卵巢）中，最终筛选出稳定
高效表达外源基因的细胞株。回答下列问题。
（1）PiggyBac 转座系统的核心组分是转座子质粒和辅助质粒（携带转座酶基因）。转座酶可识别转座子
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质粒中两个末端重复序列（TR），并将两者间的转座片段切割下来，而后将其插入受体细胞基因组中。
由此可知，利用该转座系统时，应将目的基因插入______中。
（2）转座子质粒（图1）中EGFP 基因会影响抗体基因的表达，故研究者应选用图中的限制酶______处
理该质粒，而后对未处理和处理的质粒进行电泳，结果如图2。电泳后应回收图2 中条带______位置的
DNA 作为后续使用。
（3）
当目的基
（4）因末端和载体末端有相同的同源臂序列时，ExnaseⅡ酶可识别该序列，并从DNA 的5'端开始去掉
部分核苷酸形成“黏性末端”，“黏性末端”可碱基互补配对的片段，经进一步处理形成重组DNA。研
究者欲利用该原理构建重组质粒，那么PCR 获取重链基因时，应在图3 中引物对______的______端分别
添加序列为______。（注：轻链基因重复以上操作）
A.5'-GACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTT-3'
B.5'-AAGCTTGGGTCTCCCTATAGTGAGTC-3'
C.5'-GCGGCCGCGACTCTAGAGGGCCCTATTC-3'
D.5'-GAATAGGGCCCTCTAGAGTCGCGGCCGC-3'
（4）利用PiggyBac 转座系统转化时，需将重组质粒和______用脂质体包裹并添加到含CHO 细胞的培养
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基中，该培养基中应含有______便于筛选成功转化的CHO 细胞。成功转化的CHO 细胞增殖到一定数量
后，对培养皿中的所有组分进行离心，收集______（填“上清液”或“沉淀物”）分离抗体并鉴定，最
终成功获得所需的细胞株。
【答案】（1）转座片段（“两个特定序列”、“TR 之间”）
（2） ①. Hind Ⅲ和Not Ⅰ ②. ①
（3） ①. ②、③ ②. 5' ③. AD
（4） ① 辅助质粒 ②. G418 ③. 上清液
【解析】
【小问1 详解】
转座酶可识别转座子质粒中两个末端重复序列（TR），并将两者间的转座片段切割下来插入受体细胞基
因组。因此，应将目的基因插入转座片段（或两个特定序列或TR 之间），这样才能随转座片段一起被插
入受体细胞基因组。
【小问2 详解】
为去除影响抗体基因表达的EGFP 基因，需用切割EGFP 基因的限制酶。图1 显示EGFP 基因两侧有
Not Ⅰ和Hind Ⅲ的酶切位点，因此选用Not Ⅰ和 Hind Ⅲ处理质粒。未处理的质粒长度为7077bp，经限
制酶处理后会线性化，长度不变，电泳时未处理的质粒条带相对分子质量大，迁移距离短，处理后的质
粒条带相对分子质量小，迁移距离长。从图2 来看，条带①位置的DNA 是处理后的质粒DNA，所以电泳
后应回收图2 中条带①位置的DNA 作为后续使用。
【小问3 详解】
为使目的基因末端和载体末端有相同的同源序列，PCR 引物需添加与载体末端互补的序列。且引物是沿
5'向3'延伸的，由题意可知，图 1 中转座子质粒的多克隆位点两端序列的上游为5'-
GACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTT-3'（选项 A） 下游为5'-
GAATAGGGCCCTCTAGAGTCGCGGCCGC-3'（选项D），因此应在引物②（结合转录模板链的 3' 端）
的5'端添加序列A； 对引物③（结合转录模板链的 5' 端）的5'端添加序列D，即在引物②和③的5'端分
别添加序列A 和D。
【小问4 详解】
PiggyBac 转座系统需要转座子质粒（含目的基因）和辅助质粒（携带转座酶基因）共同作用，因此需将
重组质粒和辅助质粒用脂质体包裹。转座子质粒携带新霉素抗性基因（Neo ），该基因表达使细胞对
⁺
G418 有抗性，因此培养基中应含有G418，便于筛选成功转化的CHO 细胞。抗体是分泌蛋白，成功转化
的CHO 细胞会将抗体分泌到培养液中，因此离心后收集上清液分离抗体。
6．（2026·黑龙江省齐齐哈尔市·一模）利用Golden Gate 构建基因表达载体的原理是利用TypeⅡs 型限制
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酶（如BsaⅠ）的酶切位点在识别序列之外的特性，使重组DNA 分子上不会留下使用的酶切位点，这样
就可以在同一反应体系中进行酶切和片段连接，且可以通过设计自定义序列（NNNNN）同时进行多片段
的有序连接。镉是水体污染中常见的重金属元素，为治理水体中的镉污染，研究人员将镉离子结合蛋白
基因CADR、黄色荧光蛋白基因YFP 利用Golden Gate 法融合并接入质粒，转入莱茵衣藻细胞后利用含镉
培养液进行培养。质粒构建过程如图所示（RFP 表示红色荧光蛋白基因），请回答下列问题。
（1）重组质粒上除目的基因、启动子、终止子之外，还应具有______（写出一项）。利用BsaⅠ切割时
DNA 分子的______键发生断裂，形成黏性末端；理论上利用BsaⅠ切割后最多可以产生______种黏性末
端。若要在同一反应体系中完成载体构建，除BsaⅠ酶外，还需要在反应体系中加入______。
（2）为保证目的基因与载体正确连接且重组质粒上不保留酶切位点，研究人员需要设计不同的BsaⅠ切
割位点，若上图中载体启动子侧插入位点某单链部分序列为5'-CCATGGAGACC-3'，则CADR 基因左侧
切割后形成的黏性末端序列为5'-______-3'（写出同一单链碱基）。
（3）构建重组质粒需要使用DNA 连接酶。下列属于DNA 连接酶作用底物的是______。
（4）为筛选构建成功的重组载体，用酶切并连接处理后的DNA 分子转化靶细胞，培养一段时间后在荧
光显微镜下观察，观察到部分发红色荧光的细胞，原因是__________________________。若通过培养，
观察到某细胞株系发出黄色荧光，______（填“能”或“不能”）确定该株系适合用于镉污染治理。
【答案】（1） ①. 标记基因 ②. 磷酸二酯 ③. 256 ④. DNA 连接酶
（2）5'-CCAT-3'
（3）D （4） ①. 未插入CADR/YFP 的目的基因的空载体，RFP 基因正常表达 ②. 能
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【解析】
【小问1 详解】
重组质粒上除目的基因、启动子、终止子之外，还应具有标记基因、复制原点。Bsa Ⅰ属于限制酶切割
DNA 分子，断裂DNA 分子磷酸二酯键。由于Bsa Ⅰ黏性末端含有4 个随机碱基（NNNN），每种位置有
4 种可能，故最多能产生44=256 种黏性末端。表达载体的构建需要使用DNA 连接酶、限制酶等工具酶。
【小问2 详解】
若上图中载体启动子侧插入位点某单链部分序列为5'-CCATGGAGACC-3'，Bsa Ⅰ切割产生的黏性末端是
3'-GGTA-5'，则CADR 基因左侧切割后形成的黏性末端序列为5'-CCAT-3'。
【小问3 详解】
脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，-OH 位于3'端，ABC 脱氧核苷酸两端的基团有误，DNA 连接酶是连接
两个相同的DNA 片段，即催化一条脱氧核苷酸链的3'端的-OH 与另一脱氧核苷酸链的5'端的磷酸基团形
成磷酸二酯键，故选D。
【小问4 详解】
部分细胞仅导入未插入CADR/YFP 的目的基因的空载体，RFP 基因正常表达，但CADR 和YFP 未插入，
故仅发红色荧光。若观察到黄色荧光，即CADR 与YFP 均正确插入并转录翻译，说明该体系具备镉抗性
及报告功能，能用于镉污染治理。
7．（2026·吉林省G35 联合体·一模）马铃薯在整个生育期都易遭受虫害，受到害虫危害的马铃薯品质及
产量会受到严重影响。研究发现，蛋白酶抑制剂可与害虫肠道内的蛋白酶作用形成稳定的复合物，从而
影响蛋白消化酶活性；同时该复合物可作为负反馈信号影响昆虫进食。科研人员采用基因工程技术培育
出了抗虫马铃薯，目的基因及Ti 质粒上的限制酶切位点如图所示。回答下列问题:
（1）蛋白酶抑制剂基因的化学本质是____。使用PCR 技术对蛋白酶抑制剂基因进行扩增时，需在扩增体
系中加入____酶；缓冲溶液中加入Mg²⁺的作用是____。
（2）切割蛋白酶抑制剂基因和Ti 质粒时选择EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ两种限制酶同时处理比只选择EcoR Ⅰ一种限
制酶处理的优点是____。不用限制酶BamH Ⅰ切割Ti 质粒的原因是____。
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（3）构建蛋白酶抑制剂基因的表达载体时，需将蛋白酶抑制剂基因插入____，才可以将其带入受体细胞
并____。
（4）检验转基因马铃薯的抗虫性状，常用方法是____。种植转基因抗虫马铃薯能减少____的使用，以减
轻环境污染。
【答案】（1） ①. DNA ②. 耐高温的DNA 聚合（Taq DNA 聚合） ③. 激活（耐高温的）
DNA 聚合酶（TaqDNA 聚合酶）
（2） ①. 可防止目的基因和质粒反向连接；防止目的基因、质粒的自身环化 ②. BamH Ⅰ切割
会破坏Ti 质粒上的启动子
（3） ①. Ti 质粒中的T-DNA 上 ②. 整合到受体细胞的染色体DNA 上
（4） ①. 投放害虫 ②. 农药
【解析】
【小问1 详解】
基因是具有遗传效应的DNA 片段，故蛋白酶抑制剂基因的化学本质是DNA。PCR 技术的所需条件为模板
DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、耐高温DNA 聚合酶（Taq DNA 酶）、Mg2+ 等，因此使用PCR 技
术对蛋白酶抑制剂基因进行扩增时，需在扩增体系中加入耐高温的DNA 聚合（Taq DNA 聚合）酶；缓
冲溶液中还需加入Mg2+能够激活耐高温的DNA 聚合酶。
【小问2 详解】
切割蛋白酶抑制剂基因和Ti 质粒时选择EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ两种限制酶同时处理比只选择EcoR Ⅰ一种限
制酶处理的优点是可防止目的基因和质粒反向连接；防止目的基因、质粒的自身环化，提高重组效率
（或确保目的基因定向插入）。不用限制酶BamH Ⅰ切割Ti 质粒的原因是BamH Ⅰ切点位于T-DNA 内
部，若使用BamH Ⅰ切割会破坏Ti 质粒上的启动子。
【小问3 详解】
构建蛋白酶抑制剂基因的表达载体时，需将蛋白酶抑制剂基因插入Ti 质粒中的T-DNA 上，才可以将其带
入受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA 上。
【小问4 详解】
检验转基因马铃薯的抗虫性状，常从个体水平上进行检测，方法是投放害虫，若害虫大量死亡，说明转
基因成功。种植转基因马铃薯能减少农药的使用，以减轻环境污染。
8．（2026·吉黑龙江省哈尔滨市第九中学·一模）单个B 细胞抗体制备技术是近年来发展的快速制备单克
隆抗体的新技术。该技术利用“一个B 细胞只含有一个功能性重链可变区DNA 序列和一个轻链可变区
DNA 序列，且只产生一种特异性抗体”的特点，从免疫动物脾组织或外周血中分离出抗原特异性B 细胞，
可通过单细胞PCR 技术从单个B 细胞中扩增IgG 重链和轻链可变区基因，再将其导入哺乳动物细胞中表
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达，最终获得具有生物活性的单克隆抗体。兔单抗以其高亲和力和多样性在基础研究和药物研发中颇受
青睐。请结合下图回答问题：
（1）对兔多次使用同种抗原进行刺激的目的是_______。
（2）抗原特异性B 细胞磁场分离技术核心步骤是：制备混合细胞悬液，目标抗原直接偶联磁珠，再放入
磁场，利用抗原与B 细胞表面_________特异性结合的原理分离目标细胞，实现目标细胞富集。然后利用
动物细胞培养技术对单B 细胞进行_________，通过_______进行筛选。
（3）借助融合PCR 技术整合抗体轻链和重链基因，图2 过程设计的P2 和P3 引物的添加序列必须能够发
生_______。融合PCR 步骤1 中，至少进行_________次循环才能获得基因重链基因的PCR 产物。若要对
重链、轻链融合基因继续进行PCR 扩增，则图2 中的M、N 处位置所需要的引物分别是_________。
（4）图3 中电泳图中_________号条带最可能表示融合后片段，若PCR 没有扩增出任何产物，则可能的
原因是________（至少两点）。
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（5）由图1 和图4 判断，构建重组基因表达载体，为保证目的基因的插入部位位于EF1A 启动子与SV40
late pA 之间的表达框内（在Kozak 序列之后），切割质粒时不宜使用的限制酶是________。此外，不宜
同时选用酶SpeI 和XbaI，原因是__________。
【答案】（1）获得能产生特定抗体的B 淋巴细胞
（2） ①. 受体 ②. 克隆化培养 ③. 抗体（阳性）检测
（3） ①. 碱基互补配对 ②. 2 ③. P1、P4
（4） ①. 4 ②. 复性温度太高；引物设计不合理无法与目的基因结合
（5） ①. EcoRI ②. 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定
向连接
【解析】
小问1 详解】
对兔多次使用同种抗原进行刺激的目的是促进B 细胞增殖、分化，产生更多的产生特定抗体的B 淋巴细
胞。因为多次抗原刺激可以使免疫系统对该抗原的记忆更深刻，激活更多的B 细胞，从而产生大量能分
泌特定抗体的B 细胞，为后续获取足够数量的抗原特异性B 细胞做准备。
小问2 详解】
抗原特异性B 细胞磁场分离技术是基于抗原与B 细胞表面的受体特异性结合的原理。单B 细胞数量较少，
需要克隆化培养进行体外扩增以获得足够数量用于后续实验，而抗原-抗体杂交技术（抗原阳性检测）可
以特异性地筛选出能产生目标抗体的细胞。
【小问3 详解】
P2 和P3 引物的添加序列能够碱基互补配对才能使轻链和重链基因在PCR 过程中连接起来。第一次循环
是以重链基因和轻链基因为模板分别合成部分融合链，第二次循环才能以新合成的链为模板合成完整的
重链基因PCR 产物，所以至少进行2 次循环才能获得基因重链基因的PCR 产物。据图可知，M 处要扩增
融合基因的上游需要P1 引物，N 处扩增下游需要P4 引物。
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【小问4 详解】
融合后的片段长度较长，在电泳图中迁移速度最慢，所以4 号条带最可能是融合后片段。引物设计不合
理可能导致引物与模板无法结合；模板质量差会影响扩增效率；反应体系不合适可能使反应无法正常进
行；退火温度不合适会影响引物与模板的特异性结合。
【小问5 详解】
从图4 可以看出EcoRI 的切割位点在Kozak 序列之前，不在EF1A 启动子与SV40 late pA 之间的表达框
内，所以不宜使用。SpeI 和XbaI 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载
体定向连接。
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