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专题12 基因工程
一、选择题
1．（2026·黑龙江省双鸭山市第一中学·一模） 关于“琼脂糖凝胶电泳”实验，下列叙述错误的是
（ ）
A. 根据待分离DNA 片段的大小，需用缓冲液配制0.8%～1.2%的琼脂糖溶液
B. 向琼脂糖溶液中加入适量的核酸染料后，需在沸水浴内加热至琼脂糖熔化
C. 将PCR 产物和载样缓冲液混合后，需用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔
D. 待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，需及时断电并取出凝胶置于紫外灯下观察
2．（2026·内蒙古呼和浩特市·一模）叶绿体发育与BG 基因、GK 基因的表达有关、GK 功能缺失突变体
的叶绿素含量会显著降低。研究者将一定浓度的GK 蛋白与系列浓度BG 蛋白混合后，再加入GK 蛋白靶
基因CAO 的启动子DNA 片段，反应一段时间后，经琼脂糖凝胶电泳检测结果如下图。以下分析正确的
是（ ）
A. BG 蛋白通过抑制GK 蛋白的功能影响叶绿体发育
B. GK 蛋白结合靶基因CAO 导致叶绿素的含量下降
C. 条带中的“游离DNA 片段”来自BG 基因
D. 随BG 蛋白浓度增加CAO 的启动子功能增强
3．（2026·内蒙古呼和浩特市·一模）T4 噬菌体基因编码的T4DNA 连接酶，可连接具有黏性末端和平末
端的DNA 分子，下列有关T4DNA 连接酶的叙述正确的是（ ）
A. 组成元素为C、H、O、N、P
B. 在T4 噬菌体的核糖体上合成
C. 能连接黏性末端和平末端，不具有专一性
D. 可降低DNA 分子间形成磷酸二酯键所需的活化能
4. （2026·吉林省长春市·一模）利用PCR 既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关
PCR 的叙述错误的是（ ）
A. PCR 用的 DNA 聚合酶是一种耐高温酶
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B. 变性过程中双链DNA 的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA 聚合酶、ATP 和4 种核糖核苷酸
5.（2026·黑龙江省齐齐哈尔市·一模）冠瘿是植物被农杆菌感染后根部长出的肿瘤（如图1 所示），冠瘿
的形成与天然农杆菌的Ti 质粒（如图2 所示）有关，其中Vir 基因编码的产物可激活T-DNA 转移。下列
相关叙述正确的是（ ）
A. 长出冠瘿的植物根部某些植物激素水平较高
B. T-DNA 区域的基因可在植物细胞的细胞质基质中复制、转录、翻译
C. 若用Ti 质粒作为基因的载体，可将目的基因插入Vir 基因的内部
D. 若利用农杆菌进行基因工程转化，需将其Ti 质粒上的所有基因去掉
二、非选择题
1．（2026·黑龙江省哈尔滨市南岗区第三中学·一模） 白桦是我国东北地区重要的绿化树种，土壤盐渍化
严重制约其生长，而BpMYB5 基因是调控白桦耐盐性的关键基因。为验证该基因的耐盐功能，研究人员
利用无缝克隆技术，将BpMYB5 基因与绿色荧光蛋白（eGFP）基因融合，构建了pBI121-BpMYB5-eGFP
过表达载体，开展相关实验研究。
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注：kanR 为卡那霉素抗性基因，TetR 为四环素抗性基因。
（1）①过程是利用PCR 技术将质粒线性化，进行PCR 扩增质粒时，需要质粒、引物、_____、含Mg2+的
缓冲液和耐高温的DNA 聚合酶；该过程中引物应选择_____；耐高温的DNA 聚合酶在PCR 的_____步骤
中起作用。
（2）为确保BpMYB5 基因与eGFP 基因融合后能成功构建融合基因，并表达出完整的融合蛋白，在引物
设计时，应去除_____（单选）。
A. BpMYB5 基因中编码起始密码子的序列
B. BpMYB5 基因中编码终止密码子的序列
C. eGFP 基因中编码起始密码子的序列
D. eGFP 基因中编码终止密码子的序列
（3）已知相关基因的编码链（与模板链互补的DNA 链）的部分序列如下表（AUG 为起始密码子，
UAG、UAA、UGA 为终止密码子）。为实现二者的无缝克隆且保证融合蛋白的正常表达，图中引物R1
的设计至关重要，该引物的碱基序列应为5'-_____-3'。
BpMYB5 基因序列
5'-AATGCCTAGT……GTGTTTTAGCAT-3'
eGFP 基因序列
5'-CATGTCCAGC……AACCCATAACCA-3'
（4）实验人员将重组的pBI121-BpMYB5-eGFP 载体（Ti 质粒）通过_____法侵染经消毒后的白桦种子，
为筛选出成功导入重组质粒的白桦种子，培养基上需要添加_____。
（5）将筛选得到的转基因种子经培养可获得转基因白桦植株，通过观察_____以了解BpMYB5 基因的表
达水平和表达部位。
（6）若将pBI121-BpMYB5-eGFP 过表达载体导入白桦细胞后，培育出的转基因白桦植株耐盐性未明显增
强，请结合题干实验情景，分析可能的原因_____（答出一点即可）。
2．（2026·黑龙江省双鸭山市第一中学·一模）地衣芽孢杆菌产生的胞外多糖（EPS）通过促进大粒径土壤
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团聚体形成以改良土壤。研究者利用EPS 合成酶基因（H 基因）和含木糖诱导型启动子的p 质粒（二者
结构如图1 所示）构建重组载体，以改造地衣芽孢杆菌并获取高产菌株。
（1）图1 中H 基因以a 链为转录模板链，由此可以推测H 基因的转录是从其______（填“左侧”或“右
侧”）开始的。H 基因上的一段序列为：5´-ATCTCGAGCGGG-3´中包含 Xho 识别序列（含有6 个核苷
酸），则这 6 个核苷酸序列是______。构建重组质粒时，为保证 H 基因与p 质粒正确连接，p 质粒位点
1 和2 的所对应的酶分别是______，酶切后加入______酶使它们形成重组质粒。
（2）将构建好的重组质粒转入经______处理后的地衣芽孢杆菌，经筛选获得到转基因地衣芽孢杆菌。对
其进行工业培养时，添加木糖获取更多EPS 的机理是______。
（3）质粒在细菌细胞中遗传不稳定，易丢失，研究者尝试将重组质粒进行改造，利用同源区段互换的方
法将H 基因插入地衣芽孢杆菌的拟核DNA 中，得到整合型地衣芽孢杆菌F。若将三种地衣芽孢杆菌进行
培养，结果如图3。其中D 菌为不含有 H 基因的地衣芽孢杆菌，E 菌含有 H 基因，但 H 基因没有整合到
地衣芽孢杆菌的拟核DNA 中。据图判断______最适宜改良土壤生产胞外多糖（EPS），请阐明理由
______。
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3．（2026·内蒙古鄂尔多斯市·一模）细菌治疗肿瘤是将特定细菌注入机体后，细菌趋向并聚集于肿瘤组
织，通过刺激机体产生特异性免疫反应，进而实现清除肿瘤组织的治疗方法。科研人员欲构建一种在激
光照射下，可将光能高效转化为热能，诱导Noxa 基因表达的工程菌。其中Noxa 是一种具有强烈诱导细
胞凋亡能力的蛋白质，ClyA 是可以展示在细胞膜表面的蛋白质，图为相关基因表达载体的构建过程。回
答下列问题。
注：Tcl 为温控基因，其控制合成的蛋白质在37℃时能抑制温度诱导型启动子的活性，在42℃时该蛋白
质失活。
（1）PCR 扩增目的基因：PCR 技术中，引物的作用是使DNA 聚合酶能从引物的________端开始连接脱
氧核苷酸。若2 链和4 链为基因转录的模板链，则引物________有互补区段，重叠产物1 中的两条链是
________（从“1 链”“2 链”“3 链”“4 链”中选填），其延伸过程不需要引物的原因是
____________________________。
（2）制备温度响应型细菌：用EcoRⅠ和SalⅠ对pBV220 载体和ClyA-Noxa 融合基因片段分别进行双酶
切，用________将酶切后的载体和融合基因片段连接，将基因表达载体导入大肠杆菌，并涂布于含
________的全营养LB 固体培养基中筛选。
（3）目的基因的检测与鉴定：挑取上述培养基中的单菌落，接种后分别置于温度为________的培养箱中
培养，一段时间后检测，若________，且表达产物既能展示在细胞表面且具有强促凋亡活性，则温度响
应型细菌构建成功。
（4）温度诱导型启动子是该工程菌的重要元件，若其持续活跃，可能带来的风险是__________________。
4．（2026·内蒙古呼和浩特市·一模）腺相关病毒（AAV）是一种单链DNA 缺陷型非包膜病毒，是临床基
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因治疗广泛使用的载体。Otof 基因（6kb）编码R 蛋白，突变可导致常见先天性耳聋。中外科研人员利用
AAV 双载体系统递送人源正常Otof 基因，通过基因工程技术治疗先天性耳聋取得显著疗效。请分析回答：
（1）体外可利用________技术扩增Otof 基因，通过大容量载体将此目的基因导入受体细胞的缺点是感染
率和成活率低。
（2）Otof 基因和AAV 基因组如图1、图2 所示，单个AAV 能运载的最大目的基因仅为4.7kb．若“↓”为可
选择的酶切位点，则图1 需要将Otof 基因拆分为大小分别为________的5′-Otof 和Otof-3′片段，分别装入
AAV 载体形成AAV 重组载体1 和2（图3）。此外，为确保两段基因在细胞内表达，重组载体中需包括
启动子和________等序列。
（3）重组载体1 和2 共感染同一受体细胞后复制形成双链，随后重组载体2 表达Cre 酶切割重组载体1
和2 中的lox 位点，产生黏性末端，实现两段DNA 精准对接。若重组载体1 中lox 序列如图4，则重组载
体2 的lox 序列可否为图5 所示序列，请说明理由________。
（4）为了使R 蛋白基因只在特定细胞中表达，重组载体1 应选择________（填器官名称）部细胞中特异
性表达基因的启动子。为减少Cre 酶对受体细胞的其他影响，重组载体2 的启动子应选择________（填
“强”或者“弱）启动子。
（5）若要从个体水平检测Otof 基因是否表达并发挥作用，临床上通常先通过动物进行实验，可选取Otof
基因敲除小鼠模型，实验组静脉注射AAV 双载体，对________（答出一种即可）进行检测，以确定Otof
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基因在受体细胞中重组并表达。
5．（2026·辽宁省沈阳市·一模）抗PD-L1 的单克隆抗体可用于癌症的免疫治疗。某研究者利用PiggyBac
转座系统将PD-L1 抗体的重链和轻链基因重组到CHO 细胞（源于中国仓鼠的卵巢）中，最终筛选出稳定
高效表达外源基因的细胞株。回答下列问题。
（1）PiggyBac 转座系统的核心组分是转座子质粒和辅助质粒（携带转座酶基因）。转座酶可识别转座子
质粒中两个末端重复序列（TR），并将两者间的转座片段切割下来，而后将其插入受体细胞基因组中。
由此可知，利用该转座系统时，应将目的基因插入______中。
（2）转座子质粒（图1）中EGFP 基因会影响抗体基因的表达，故研究者应选用图中的限制酶______处
理该质粒，而后对未处理和处理的质粒进行电泳，结果如图2。电泳后应回收图2 中条带______位置的
DNA 作为后续使用。
（3）
当目的基
（4）因末端和载体末端有相同的同源臂序列时，ExnaseⅡ酶可识别该序列，并从DNA 的5'端开始去掉
部分核苷酸形成“黏性末端”，“黏性末端”可碱基互补配对的片段，经进一步处理形成重组DNA。研
究者欲利用该原理构建重组质粒，那么PCR 获取重链基因时，应在图3 中引物对______的______端分别
添加序列为______。（注：轻链基因重复以上操作）
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A.5'-GACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTT-3'
B.5'-AAGCTTGGGTCTCCCTATAGTGAGTC-3'
C.5'-GCGGCCGCGACTCTAGAGGGCCCTATTC-3'
D.5'-GAATAGGGCCCTCTAGAGTCGCGGCCGC-3'
（4）利用PiggyBac 转座系统转化时，需将重组质粒和______用脂质体包裹并添加到含CHO 细胞的培养
基中，该培养基中应含有______便于筛选成功转化的CHO 细胞。成功转化的CHO 细胞增殖到一定数量
后，对培养皿中的所有组分进行离心，收集______（填“上清液”或“沉淀物”）分离抗体并鉴定，最
终成功获得所需的细胞株。
6．（2026·黑龙江省齐齐哈尔市·一模）利用Golden Gate 构建基因表达载体的原理是利用TypeⅡs 型限制
酶（如BsaⅠ）的酶切位点在识别序列之外的特性，使重组DNA 分子上不会留下使用的酶切位点，这样
就可以在同一反应体系中进行酶切和片段连接，且可以通过设计自定义序列（NNNNN）同时进行多片段
的有序连接。镉是水体污染中常见的重金属元素，为治理水体中的镉污染，研究人员将镉离子结合蛋白
基因CADR、黄色荧光蛋白基因YFP 利用Golden Gate 法融合并接入质粒，转入莱茵衣藻细胞后利用含镉
培养液进行培养。质粒构建过程如图所示（RFP 表示红色荧光蛋白基因），请回答下列问题。
（1）重组质粒上除目的基因、启动子、终止子之外，还应具有______（写出一项）。利用BsaⅠ切割时
DNA 分子的______键发生断裂，形成黏性末端；理论上利用BsaⅠ切割后最多可以产生______种黏性末
端。若要在同一反应体系中完成载体构建，除BsaⅠ酶外，还需要在反应体系中加入______。
（2）为保证目的基因与载体正确连接且重组质粒上不保留酶切位点，研究人员需要设计不同的BsaⅠ切
割位点，若上图中载体启动子侧插入位点某单链部分序列为5'-CCATGGAGACC-3'，则CADR 基因左侧
切割后形成的黏性末端序列为5'-______-3'（写出同一单链碱基）。
（3）构建重组质粒需要使用DNA 连接酶。下列属于DNA 连接酶作用底物的是______。
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（4）为筛选构建成功的重组载体，用酶切并连接处理后的DNA 分子转化靶细胞，培养一段时间后在荧
光显微镜下观察，观察到部分发红色荧光的细胞，原因是__________________________。若通过培养，
观察到某细胞株系发出黄色荧光，______（填“能”或“不能”）确定该株系适合用于镉污染治理。
7．（2026·吉林省G35 联合体·一模）马铃薯在整个生育期都易遭受虫害，受到害虫危害的马铃薯品质及
产量会受到严重影响。研究发现，蛋白酶抑制剂可与害虫肠道内的蛋白酶作用形成稳定的复合物，从而
影响蛋白消化酶活性；同时该复合物可作为负反馈信号影响昆虫进食。科研人员采用基因工程技术培育
出了抗虫马铃薯，目的基因及Ti 质粒上的限制酶切位点如图所示。回答下列问题:
（1）蛋白酶抑制剂基因的化学本质是____。使用PCR 技术对蛋白酶抑制剂基因进行扩增时，需在扩增体
系中加入____酶；缓冲溶液中加入Mg²⁺的作用是____。
（2）切割蛋白酶抑制剂基因和Ti 质粒时选择EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ两种限制酶同时处理比只选择EcoR Ⅰ一种限
制酶处理的优点是____。不用限制酶BamH Ⅰ切割Ti 质粒的原因是____。
（3）构建蛋白酶抑制剂基因的表达载体时，需将蛋白酶抑制剂基因插入____，才可以将其带入受体细胞
并____。
（4）检验转基因马铃薯的抗虫性状，常用方法是____。种植转基因抗虫马铃薯能减少____的使用，以减
轻环境污染。
8．（2026·吉黑龙江省哈尔滨市第九中学·一模）单个B 细胞抗体制备技术是近年来发展的快速制备单克
隆抗体的新技术。该技术利用“一个B 细胞只含有一个功能性重链可变区DNA 序列和一个轻链可变区
DNA 序列，且只产生一种特异性抗体”的特点，从免疫动物脾组织或外周血中分离出抗原特异性B 细胞，
可通过单细胞PCR 技术从单个B 细胞中扩增IgG 重链和轻链可变区基因，再将其导入哺乳动物细胞中表
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达，最终获得具有生物活性的单克隆抗体。兔单抗以其高亲和力和多样性在基础研究和药物研发中颇受
青睐。请结合下图回答问题：
（1）对兔多次使用同种抗原进行刺激的目的是_______。
（2）抗原特异性B 细胞磁场分离技术核心步骤是：制备混合细胞悬液，目标抗原直接偶联磁珠，再放入
磁场，利用抗原与B 细胞表面_________特异性结合的原理分离目标细胞，实现目标细胞富集。然后利用
动物细胞培养技术对单B 细胞进行_________，通过_______进行筛选。
（3）借助融合PCR 技术整合抗体轻链和重链基因，图2 过程设计的P2 和P3 引物的添加序列必须能够发
生_______。融合PCR 步骤1 中，至少进行_________次循环才能获得基因重链基因的PCR 产物。若要对
重链、轻链融合基因继续进行PCR 扩增，则图2 中的M、N 处位置所需要的引物分别是_________。
（4）图3 中电泳图中_________号条带最可能表示融合后片段，若PCR 没有扩增出任何产物，则可能的
原因是________（至少两点）。
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（5）由图1 和图4 判断，构建重组基因表达载体，为保证目的基因的插入部位位于EF1A 启动子与SV40
late pA 之间的表达框内（在Kozak 序列之后），切割质粒时不宜使用的限制酶是________。此外，不宜
同时选用酶SpeI 和XbaI，原因是__________。
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