文档文本内容
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
专题13 基因工程
（基础题+提升题+创新题 三位一体）
1．下列实例与所利用的技术或原理不相符合的是（ ）
A．转基因抗虫棉和单倍体的培育都需要利用植物组织培养技术
B．植物体细胞杂交和动物细胞培养依据的原理都是细胞具有全能性
C．植物原生质体融合和动物细胞融合都利用了细胞膜具有一定的流动性
D．植物愈伤组织的形成和杂交瘤细胞的培养都离不开细胞的有丝分裂
【答案】B
【详解】A、转基因抗虫棉的培育过程：①在棉花的植株上提取叶肉细胞②在苏云金杆菌上提取相应基因
③将提取基因导入植物叶肉细胞的DNA（利用基因重组技术）④通过培养既培养出愈伤组织，进行再分化
⑤最后通过组织培养技术，得到含抗虫基因的棉花植株，单倍体的培育要用花粉离体培养成单倍体幼苗
（借助于植物组织培养），然后再秋水仙素处理幼苗，形成正常纯合体，A 正确；
B、植物组织培养过程依据的原理是植物细胞具有全能性，动物细胞培养依据的原理是细胞的增殖，B 错
误；
C、原生质体融合和动物细胞融合的原理是细胞膜的流动性，C 正确；
D、植物愈伤组织的形成是经过脱分化产生，与细胞有丝分裂有关，杂交瘤细胞的培养是细胞本身增多的
过程，也与细胞有丝分裂有关，D 正确。
故选B。
2．（2024·天津·一模）研究发现，水稻蜡质基因（Wx）编码直链淀粉合成酶。若Wx 基因中第226 位碱基
是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含量最高，基因型记做GG；若该位点
突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx 基因该位
点碱基是G 或T，研究人员以待测水稻叶片总DNA 为材料，以Wx 基因片段设计引物如图所示，对PCR
扩增产物经AccⅠ酶切后电泳。已知引物1 为5＇-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3＇，两引物之间无另外的
AccI 酶的识别位点。下列叙述正确的是（ ）
A．组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸的种类不同，数目相同
B．GT 杂合型水稻品种酶切电泳结果为2 条条带
C．若酶切产物只能观察到大约460bp 的DNA 条带，则表明该水稻品种为TT 型
D．该实验中需设计的引物2 为5＇-TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3＇
1
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
【答案】C
【分析】用PCR 扩增DNA 片段的过程中，脱氧核苷酸只能加在引物3'端，子链延长方向是5'→3'，引物的
碱基序列应与每条模板链3'端的一段核苷酸链的碱基序列互补。
【详解】A、由题意可知，若Wx 基因中第226 位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，若
该位点突变成T，则不能被正常剪接，由于内含子不能被剪切后会导致用于翻译的mRNA 比内含子被正常
剪切后的mRNA 变长，因此翻译形成的上述两种淀粉合成酶的氨基酸的数目不相同，A 错误；
B、若Wx 基因中第226 位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含最高，
基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记
做TT，故GT 杂合型水稻品种的G 能被酶切成两段，而T 不能被酶切，故酶切电泳结果为3 条条带，B 错
误；
C、PCR 产物从71bp 开始，到530bp 为止，共460bp。若PCR 产物不被酶切，电泳后只有一条460bp 左右
的条带，则基因型为TT，C 正确；
D、分析题图可知，引物的延伸方向为5'→3'，故图示所给引物1 设计区碱基序列所在的DNA 链为非模板
链，故引物1 的碱基序列与非模板链的碱基序列相同，而引物2 要以引物2 设计区碱基序列所在的DNA 链
为模板，故引物2 的碱基序列应与所给序列碱基互补配对，该实验中需设计的引物2 为5'－
ATGATTTAACGAGAGTTGAA－3'，D 错误。
故选C。
3．（2024·辽宁·一模）下列有关“DNA 粗提取与鉴定”、“PCR 扩增”、“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙
述中，正确的是（ ）
A．DNA 的粗提取与鉴定实验中可利用DNA 在酒精中溶解度较大的特点来提取DNA
B．将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后，溶液即可变为蓝色
C．PCR 反应体系中需加入耐高温的DNA 聚合酶，该酶在延伸过程中起作用
D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA 分子结合，便于在紫外灯下观察
【答案】C
【分析】本题考查基因工程中的相关实验。DNA 不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精；鉴定DNA 时，需
要先将DNA 溶解在NaCl 溶液中，再与二苯胺溶液混合，并在水浴加热条件下呈现蓝色；耐高温的DNA
聚合酶在延伸环节时进行子链的合成。
【详解】A、DNA 的粗提取与鉴定实验中利用DNA 不溶于酒精、但某些蛋白质溶于酒精的原理，可以初
步分离DNA 与蛋白质，A 错误；
B、将丝状物溶于2mol/L 的5mL 的NaCl 溶液中，然后向试管中加入4mL 的二苯胺试剂，沸水浴加热
5min，试管冷却后溶液呈现蓝色，B 错误；
C、PCR 反应体系中需加入耐高温的DNA 聚合酶，该酶在延伸过程中根据碱基互补配对原则合成新的
DNA 链，C 正确；
D、用电泳缓冲液配制的琼脂糖溶液中加入的核酸染料能与DNA 分子结合，可以在波长为300nm 的紫外
灯下被检测出来，D 错误。
故选C。
4．（2024·辽宁葫芦岛·一模）人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有
2
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
效方法。下图为“乙肝基因工程疫苗”生产过程图解，质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。
质粒中 lacZ 基因编码产生的酶可以分解培养基中的 X—gal，产生蓝色物质， 使菌落呈现蓝色， 否则菌
落为白色。
(1)图中过程①中有两种选择限制酶的方案，它们分别是 或 。过程②需要先将大肠杆菌用 处理。
(2)PCR 过程每次循环分为3 步，其中发生引物与单链DNA 结合的步骤称为 ，得到的产物一般通过
的方法来鉴定。在 PCR 反应体系中一般需要加入Mg2+，原因是 。
(3)据图可知，该目的基因的具体功能是 。为了使重组质粒中目的基因正常表达， 还需要插入的序列
有 。
(4)为了筛选含目的基因的重组质粒的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入 和 培养一
段时间挑选出 色的菌落进一步培养获得大量目的菌。
【答案】(1) 只用 BamHI 同时用 EcoRI 和 BamHI Ca2+
(2) 复性 琼脂糖凝胶电泳 耐高温的 DNA 聚合酶需要Mg2+激活
(3) 指导乙肝病毒蛋白质外壳的合成 启动子和终止子
(4) 青霉素 X-gal 白
【分析】基因工程基本操作程序：
1、目的基因的获取：方法有PCR、人工合成、从基因文库中获取;
2、基因表达载体的构建：基因表达载体的组成有目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点;
3、将目的基因导入受体细胞：导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法、基因枪法；导入动
物细胞的方法是显微注射法；导入微生物的方法是Ca2+处理法；
4、目的基因的检测与鉴定：首先是分子水平的检测，包括通过PCR 等技术受体细胞中是否成功导入目的
基因或检测目的基因基因是否转录出了mRNA；用相应的抗体进行抗原一抗体杂交，检测目的基因是否翻
译成相关蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。
【详解】（1）构建基因表达载体时应注意选用相同的限制酶切割目的基因和载体，保证载体和目的基因
有相同的黏性末端；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，避免破坏目的基因，如EcoR Ⅴ；切
割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA 的
鉴定和筛选；为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的
3
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
基因所在片段和质粒(双酶切)。综上所述，图中过程①中有两种选择限制酶的方案，它们分别是只用
BamHI 和同时用EcoRI 和BamHI；将重组质粒导入大肠杆菌中，使用钙离子(Ca2+)处理，目的是将大肠杆
菌变成感受态细胞，处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态，促进感受态细胞吸收DNA 分子，
完成转化。
（2） PCR 过程每次循环分为3 步,变性、复性、延伸,其中发生引物与单链DNA 结合的步骤称为复性，得
到的产物般通过琼脂糖凝胶电泳的方法来鉴定；真核细胞和细菌的DNA 聚合酶都需要Mg2+激活。因此，
PCR 反应缓冲溶液中一般要添加Mg+。
（3）根据图中③目的基因最终产生乙肝病毒外壳，说明该目的基因的具体功能是指导乙肝病毒蛋白质外
壳的合成；为了使重组质粒中目的基因正常表达，还需要插入的序列有启动子和终止子，两者分别调控基
因转录的开始和结束，保证转录 正常进行。
（4）据图可知，用限制酶BamHI 切割时破坏了lacZ 基因，但没有破坏青霉素抗性基因，因此为了筛选含
目的基因的重组质粒的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入青霉素和X-gal，根据题干信息
“质粒中 lacZ 基因编码产生的酶可以分解培养基中的 X—gal，产生蓝色物质， 使菌落呈现蓝色， 否则
菌落为白色。”可知，培养一段时间挑选出白色的菌落进一步培养获得大量目的菌。
5．（2024·天津·一模）为构建肝特异性CD36 基因敲除小鼠模型。研究人员利用Crt-1oxP 系统开展实验。
Cre 可识别DNA 分子中特定的loxP 序列，并将两个loxP 序列之间的DNA 序列剪除，切口连接形成的环化
产物被降解，从而达到敲除特定基因的目的，如图1 所示。
(1)Cre 的作用类似于基因工程中的 ，DNA 切口环化连接的过程需要 。
(2)图2 显示两类工具鼠，其中A 鼠成对的CD36 基因两侧分别引入一个同向loxP 序列（基因型表示为
L+L+，野生型为L-L-），B 鼠中含一个外源导入的Cre 编码序列（基因型表示为C+C-，野生型为C-C-），
Alb 表示肝脏组织特异性启动子。利用A、B 两类工具鼠作为亲本，选用合适的杂交策略，即可获得肝特
异性CD36 基因敲除目标小鼠。
①目标小队的基因型应为 。
A．
B．
C．
D．
4
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
②选择合适的杂交策略，目标小鼠最早可出现在子 代。
(3)取鼠尾细胞通过琼脂糖凝胶电泳鉴定子代1～8 号小鼠的基因型，结果如图3。已知A 鼠、B 鼠的基因型
检测结果分别与图3 中子代6 号、1 号小鼠相同，则图3 中代表目标小鼠的是 号。
(4)对目标小鼠不同组织细胞基因检测，请将预期结果填在下面的表格中。（＋表示存在，－表示缺失）
细胞类型
Cre 编码序列
CD36 基因
肝脏细胞
心肌细胞
【答案】(1) 限制酶 DNA 连接
(2) A 二
(3)8
(4) + － － +
【分析】基因工程的基本步骤：（1）获取目的基因（从基因组文库中获取或、利用PCR 技术扩增目的基
因）；（2）基因表达载体的构建（这也是基因工程的核心）；（3）将目的基因导入受体细胞（植物、动
物、微生物）；（4）目的基因的检测与鉴定（DNA 分子杂交技术，分子杂交技术、抗原抗体杂交）。
【详解】（1）结合图示可知，Cre 能将双链DNA 在特定部位切割开，因此其类似于基因工程中的限制性
内切核酸酶，即④正确；经过Cre 切割后，形成的DNA 片段两端含有相同的黏性末端，因而该DNA 片段
能发生环化，在DNA 切口环化连接的过程中需要DNA 连接酶的作用。
（2）A、基因型为L+L+C +C -的目标鼠，其中含有的CD36 基因无法表达，相当于获得了肝特异性CD36
基因敲除目标小鼠，A 正确；
B、基因型为L+L+C-C-的目标鼠中不含有肝组织特异性，不符合要求，B 错误；
C、基因型为L-L-C+C+的目标鼠中CD36 基因会表达，不符合要求，C 错误；
D、基因型为L+L-C+C-的目标鼠中CD36 基因会表达，不符合要求，D 错误。
故选A。
图中A 鼠的基因型可表示为L+L+C -C -，B 鼠的基因可表示为L-L-C+C-，二者杂交获得的子一代的基因
型可表示为，L+L-C+C-和L+L-C-C-，而后让子一代中基因型为L+L-C+C-的小鼠与A 鼠进行杂交即可获得
5
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
基因型为L+L+C+C-的目标鼠，即最早可出现在子二代。
（3）已知A 鼠的基因型为L+L+C-C-，对应6 号，B 鼠的基因型为L-L-C+C-，对应1 号小鼠，而目标鼠的
基因型为L+L+C+C-，则经过比对可以发现图3 中代表目标小鼠的是8 号。
（4）目标小鼠的肝脏细胞中CD36 蛋白的表达量明显减少，而心肌细胞中的表达量正常，肝脏细胞中有
Cre 编码序列，且有相应的在肝脏细胞中表达的特定的启动子，进而表达出Cre，心肌细胞不能表达出
Cre，但有相应的CD36 基因，所以能正常表达。
6．（2024·辽宁·一模）目前科学家可利用基因工程改造的大肠杆菌生产人胰岛素，下图是利用基因工程生
产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。据图回答下列问题
(1)构建基因表达载体时，为了满足需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时可以激活或
抑制 。图中的质粒在构建基因表达载体时，除插入目的基因外还需具备的结构有 。
(2)为获得更多的目的基因，可利用PCR 技术进行扩增，该技术需要设计引物，引物与DNA 结合发生在
PCR 的 阶段；PCR 第四次循环时需要消耗 对引物。为保证目的基因与载体的正向连接，在设
计PCR 引物时，应在引物的 （填“3′”或“5′”）端添加限制酶 （填种类）的识别序列。根据
上述信息，写出上游引物的15 个碱基序列：5′- -3′。
(3)Ʋ-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gaⅠ产生蓝色物质。筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，在添加了氨苄青
霉素和X-gaⅠ的培养基上应选择白色的菌落，原因是 （答出2 点）。
【答案】(1) 目的基因的表达 终止子
(2) 复性 8 5' XhoI 和MunI 5'-CTCGAGATGCCAATC-3'
(3)①只有导入了质粒的大肠杆菌才能在添加了氨苄青霉素的培养基上生长②目的基因的插入破坏了lacZ 基
因的结构，使其不能正常表达产生β-半乳糖苷酶，底物X-gal 不会被分解
【分析】PCR 是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）
的扩增反应，是模拟体内DNA 复制过程，在体外特异性扩增DNA 片段的一种技术。
【详解】（1）启动子是RNA 聚合酶识别与结合的部位，可用于驱动基因转录，在载体中人工构建诱导型
6
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
启动子，当诱导物存在时可以激活或抑制目的基因的表达；启动子是RNA 聚合酶识别与结合的位点，可
用于驱动基因转录出mRNA；图示结构包括目的基因、启动子和标记基因、复制原点，除插入目的基因外，
质粒作为载体还需具备的结构是终止子。
（2）引物与DNA 结合发生在PCR 的复性阶段；第四次循环是8 个DNA 分子进行复制，需要引物8 对；
由于图中有两个EcoRI 的酶切位点，不能选择，而SalI 和NheI 会破坏目的基因，都不能选择，而DNA 复
制时，子链的延伸是从引物的3′端开始的，结合图中转录方向可知，为保证目的基因与载体的正向连接，
在设计PCR 引物时，应在引物的5'端添加限制酶XhoI 和MunI 的识别序列；根据目的基因转录的方向和质
粒中限制酶的酶切位点可知，目的基因的上游应添加XhoI 的识别序列，故上游引物的15 个碱基序列为：
5'-CTCGAGATGCCAATC-3'。
（3）重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，只有导入了质粒的大肠杆菌才能在添加了氨苄青霉素的培养基
上生长，根据题干信息“β-半乳糖苷酶可以分解无色的Xga Ⅰ产生蓝色物质”，故目的基因的插入破坏了
lacZ 基因的结构，使其不能正常表达产生β-半乳糖苷酶，底物X-gal 不会被分解，故筛选导入重组质粒的
大肠杆菌时，在添加了氨苄青霉素和X-ga Ⅰ的培养基上应选择白色的菌落。
7．（2024·江苏泰州·一模）ThTC 指的是经基因编辑技术改造后失去成瘤能力，但能自主分泌干扰素β
（IFNβ）的一种新型治疗性肿瘤活疫苗，它能发挥阻断肿瘤生长且引起机体免疫反应等效用，其制备过程
及作用机理如下图。相关叙述正确的有（ ）
A．为避免ThTC 被自身分泌的干扰素β 攻击，需去除ThTC 的干扰素β 受体
B．ThTC 分泌的干扰素β 等细胞因子使肿瘤细胞坏死，从而阻断肿瘤生长
C．死亡的肿瘤细胞暴露抗原，可能被APC 呈递给T 细胞进而促进抗肿瘤免疫应答
D．可设置ThTC 自毁机制，使其在完成抗肿瘤使命后于特定激活条件下被清除
【答案】ACD
【分析】已知ThTC 指的是经基因编辑技术改造后失去成瘤能力，但能自主分泌干扰素β（IFNβ）的一种
新型治疗性肿瘤活疫苗，它能发挥阻断肿瘤生长且引起机体免疫反应等效用，可用来预防癌症发生。
【详解】A、干扰素需与受体结合才能发挥作用，因此为避免ThTC 被自身分泌的干扰素β 攻击，需去除
ThTC 的干扰素β 受体，A 正确；
7
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
B、据图可知，ThTC 分泌的干扰素β 等细胞因子使肿瘤细胞形成了凋亡小体，因此其死亡属于细胞凋亡，
B 错误；
C、死亡的肿瘤细胞暴露抗原，可能被APC 呈递给T 细胞进而促进抗肿瘤免疫应答，产生免疫记忆，C 正
确；
D、由于ThTC 细胞本身是肿瘤细胞，有可能在体内无限增殖，引发不良反应，因此可设置ThTC 自毁机制，
使其在完成抗肿瘤使命后于特定激活条件下被清除，D 正确。
故选ACD。
8．（2024·黑龙江·一模）石斛是具有重要的药用价值的兰科植物。利用分子生物学技术对石斛DNA 分子
进行鉴定，能更有效保证石斛的用药安全，而石斛DNA 的有效提取是成功开展分子鉴定的前提。某团队
利用3 种方法(M1、M2、M3)对铁皮、霍山两种石斛叶进行提取DNA 的实验，并检测DNA 提取样品液在
230、260、280nm 处的吸光度。A₂₆₀ 用于计算DNA 浓度，A₂₆₀/A₂₈₀(图1)反映DNA 提取液中蛋白质等杂质
的浓度，A₂₆₀/A₂₃₀(图2)反映DNA 提取液中无机盐等小分子杂质的浓度。A₂₆₀/A₂₈₀、A₂₆₀/A₂₃₀ 比值越大,DNA
越纯。下列有关叙述,错误的是（ ）
A．与蛋白质、无机盐等杂质相比，DNA 对260nm 光吸收值最大
B．用鲜叶提取DNA，两种石斛宜用M2 法
C．用霍山石斛冻叶提取DNA，最好用M3 法
D．可以用PCR 技术对提取的DNA 进行分子鉴定
【答案】C
【分析】PCR 原理：在高温作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链，以4 种游离脱氧核苷酸为
原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子链
的5'端自3'端延伸的。
【详解】A、A
用于计算
₂₆₀
DNA 浓度，A ₂₆₀/A ₂₈₀(图1)反映DNA 提取液中蛋白质等杂质的浓度，
A ₂₆₀/A ₂₃₀(图2)反映DNA 提取液中无机盐等小分子杂质的浓度。A ₂₆₀/A
、
₂₈₀
A ₂₆₀/A
比值越大，
₂₃₀
DNA 越
纯，推测DNA 对260nm 光吸收值最大，A 正确；
B、据图可知，用鲜叶提取DNA，两种石斛均是M2 法的A ₂₆₀/A
、
₂₈₀
A ₂₆₀/A
最大，说明
₂₃₀
DNA 越纯，故
宜用M2 法，B 正确；
C、比较图1 和图2 可知，用霍山石斛冻叶提取DNA，最好用M1 法，因为此时A ₂₆₀/A
、
₂₈₀
A ₂₆₀/A
均相
₂₃₀
对最高，C 错误；
8
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
D、分析题意，本实验目的是利用分子生物学技术对石斛DNA 分子进行鉴定，而PCR 结合探针可特异性
鉴定DNA，故可以用PCR 技术对提取的DNA 进行分子鉴定，D 正确。
故选C。
9．（2024·黑龙江·一模）研究表明：γ-氨基丁酸(GABA)是人体大脑皮层主要的抑制性神经递质，在疾病治
疗方面具有重要的应用价值。谷氨酸脱羧酶(GadB)可以催化L-谷氨酸反应合成γ-氨基丁酸，但来源于野生
型的菌株的内源性GadB 的活力均较低。磷酸吡哆醛合酶基因SNO 1(675bp)和SNZ 1(894bp)的蛋白质产物
具有催化合成磷酸吡哆醛的能力。当SNO 1 和SNZ 1 同时表达时，能够形成复合物，从而提高GadB 活性，
单独表达时不能形成相应的复合物。某研究小组通过以下实验步骤，尝试实现γ-氨基丁酸的高效生产。回
答下列问题：
步骤1：利用原始质粒A 构建重组质粒B 和重组质粒C(图1)
注:NcoⅠ、KpnⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ为限制酶切位点
(1)已知Gad B 基因(1400bp)的α 链为转录的模板链，测得该链首端到末端的序列为5'-
ATCTACGCGCTCATCCG……CGCAGCAATGAGTAGCG-3'。利用PCR 获取目的基因时,PCR 反应体系需要
加入缓冲液、模板DNA、引物、 等物质。某同学设计了如下4 种PCR 引物，其中可选用的引
物是 (填序号)。
5'-CGGATGAGCGCGTAGAT-3'
5'-ATCTACGCGCTCATCCG-3'
①
②
5'-CGCAGCAATGAGTAGCG-3'
5'-CGCTACTCATTGCTGCG-3'
③
④
(2)据图1 分析，利用PCR 扩增目的基因时，设计Gad B 的引物时，需要在引物 (填序号)的5'端
添加限制酶 识别序列，在引物 (填序号)的5'端添加限制酶 识别序列，
从而可以更好的构建重组质粒B，并确保Gad B 基因的正确连接。
步骤2：利用单酶切法结合凝胶电泳初步鉴定重组质粒是否构建成功
9
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(3)利用NcoⅠ切割3 种质粒后，琼脂糖凝胶电泳结果如图2 所示。据图2 结果分析，图示中泳道3 是质粒
(填“A”“B”或“C”)的单酶切结果。
步骤3：4 个菌株发酵产γ-氨基丁酸能力的比较
实验中所用到的菌株如下：R1(原始菌株)，R2(某些特定基因敲除菌株)，R3(将重组质粒B 导入R2 的重组
菌株)，R4(将重组质粒C 导入R2 的重组菌株)。
(4)通过高效液相色谱法检测4 个菌株发酵液中γ-氨基丁酸含量，数据显示基因敲除菌(R2)的发酵液中γ-氨
基丁酸的含量相对于原始菌株R1 提高了4.2 倍。据此推测，敲除的基因的功能是 。
(5)结果显示4 个菌株中产γ-氨基丁酸能力最强的是菌株R3，菌株R4 发酵液中γ-氨基丁酸的含量低于菌株
R3，从物质和能量分配的角度推测可能的原因是：虽然SNO 1 和SNZ 1 的表达能够提高磷酸吡哆醛的含量，
进而提高谷氨酸脱羧酶GadB 的活性，但是 ，导致γ-氨基丁酸生产能力下降。
【答案】(1) 4 种脱氧核苷酸、DNA 聚合酶 ②④
(2) ② Nco Ⅰ ④ Kpn Ⅰ
(3)C
(4)抑制谷氨酸脱羧酶的活性
(5)SNO 1 和SNZ 1 的表达需消耗更多的物质与能量，不利于后续γ-氨基丁酸的合成
【分析】基因工程技术的基本步骤:(1)目的基因的获取：利用PCR 技术扩增和人工合成。(2)基因表达载体
的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。(3)将目的
基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。(4)目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）利用PCR 获取目的基因时，PCR 反应体系需要加入缓冲液、模板DNA、引物、4 种脱氧核
苷酸、耐高温的DNA 聚合酶等。PCR 时，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3'端开始延伸DNA 链，即
DNA 的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的，已知Gad B 基因一条链序列为5'-
ATCTACGCGCTCATCCG……CGCAGCAATGAGTAGCG-3'，依据碱基互补配对原理，利用PCR 获取Gad
B 基因可选用的引物是②和④。
（2）据图1 分析，Gad B 基因插入了Nco Ⅰ、Kpn Ⅰ限制酶切位点之间，并结合转录方向，设计Gad B
的引物时，需要在引物②的5'端添加限制酶Nco Ⅰ识别序列，在引物④5'端添加限制酶Kpn Ⅰ识别序列。
（3）利用Nco Ⅰ切割3 种质粒后，琼脂糖凝胶电泳结果如图2 所，泳道3 单酶切后大小为10000bp 左右，
结合图1 可知，质粒A 为4176bp，质粒B 为5000 多bp，质粒C 最符合要求。
（4）数据显示基因敲除菌(R2)的发酵液中γ-氨基丁酸的含量相对于原始菌株R1 提高了4.2 倍。据此推测，
敲除的基因的功能可能是抑制谷氨酸脱羧酶的活性。
（5）从物质和能量分配的角度发现，虽然SNO 1 和SNZ 1 的表达能够提高磷酸吡哆醛的含量，进而提高
谷氨酸脱羧酶GadB 的活性，但是SNO 1 和SNZ 1 的表达需消耗更多的物质与能量，不利于后续γ-氨基丁
酸的合成，导致γ-氨基丁酸生产能力下降。
10．（2024·贵州贵阳·一模）靛蓝是最早发现的天然染料之一。研究人员将靛蓝色素酶基因（IDG）与启动
10
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
子PTL12 相连以构建基因表达载体（如图，KpnⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ代表不同限制酶，图中质粒上酶
的位置为其对应的酶切位点），并最终培育出能在棉纤维细胞中表达靛蓝色素酶的彩色棉新品种。请据图
回答下列问题：
(1)图中所示是基因工程操作步骤中的 ，该过程用到 种酶。
(2)本研究中将IDG 与启动子PTL12 结合的主要目的是 。
(3)过程①②都使用KpnⅠ切割质粒，目的是 ，过程③使用的Ti 质粒中的T-DNA 内部至少应含有的限
制酶是 。
(4)利用农杆菌转化法将目的基因导入棉花细胞的过程：首先将 转入农杆菌，然后通过农杆菌侵染植
物细胞将 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的 上。
【答案】(1) 基因表达载体的构建 3/三
(2)由于PTL12 是棉纤维细胞特异启动子，将IDG 与特异启动子PTL12 结合的主要目的是保证IDG 基因能
在棉纤维细胞中特异表达。
(3) 形成相同的黏性末端，使PTL12 片段后能与IDG 按设计方向正确连接，保证IDG 的正确表达。
Hind Ⅲ和BamH Ⅰ
(4) 重组Ti 质粒 T—DNA 染色体
【分析】基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。启动子是RNA 聚合酶特异性识别和
结合的DNA 序列，是基因的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。终止子是
给予RNA 聚合酶转录终止信号的DNA 序列。
【详解】（1）图示是基因工程操作步骤中的基因表达载体的构建，该过程中需要用到限制酶2 种和DNA
连接酶，共3 种酶。
（2）由于PTL12 是棉纤维细胞特异启动子，将IDG 与特异启动子PTL12 结合的主要目的是保证IDG 基因
能在棉纤维细胞中特异表达。
（3）根据图示拼接过程分析，过程①、②均使用了Kpn Ⅰ，可形成相同的黏性末端，使PTL12 片段后能
与IDG 按设计方向正确连接，保证IDG 的正确表达。结合过程①、②可以确定“PTL12－IDG”片段的两
端分别是Hind Ⅲ和BamH 的识别序列，且Ti 质粒中仅有T－DNA 可转移整合到受体细胞中，因此选择的
Ti 质粒的T－DNA 内部必需有这两种酶识别序列。
（4）农杆菌转化法将目的基因导入棉花细胞的过程：首先将重组Ti 质粒转入农杆菌，利用重组Ti 质粒中
的T—DNA 能够转移的特性，T—DNA 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体上，使其在
受体细胞中稳定存在，并且发挥作用。
11
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
11．（2024·安徽合肥·一模）某同学在家里进行了提取花椰菜DNA 的实验。取绿色的花芽部分，充分研磨
获得匀浆；再加入含有中性洗涤剂的浓度约为2mol/L 的盐水，其作用是[甲]，以释放细胞核和细胞器[乙]
中的DNA；静置10min 后过滤，然后将滤液轻轻倒入[丙]溶液中，出现白色絮状物。下列选项中，甲、乙、
丙对应的内容，正确的是（ ）
选项
甲
乙
丙
A
破坏膜结构
核糖体、内质网
植物油
B
使膜蛋白变性
线粒体、叶绿体
清水
C
破坏膜结构、溶解DNA
线粒体、叶绿体
预冷的酒精
D
破坏细胞壁
高尔基体、叶绿体
预冷的酒精
A．A
B．B
C．C
D．D
【答案】C
【分析】蛋白酶能水解蛋白质，但对DNA 没有影响。大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，而DNA 在
80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA 没有影响。将处理后的滤液过滤，加入与滤液体
积相等的、冷却的酒精溶液（体积分数为95%），静置2-3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取
的DNA。
【详解】取绿色的花芽部分，充分研磨获得匀浆是为了破坏细胞膜；再加入含有中性洗涤剂的浓度约为
2mol/L 的盐水是为了溶解DNA；细胞器线粒体、叶绿体中有DNA；向含DNA 的滤液中加冷酒精搅拌后有
白色絮状物析出，C 符合题意，ABD 不符合题意。
故选C。
12．（2024·广东深圳·一模）番茄在种植过程中容易发生虫害。研究人员将双价抗虫载体转入番茄中，获
得具有抗虫特性的转基因番茄。图为所用载体的部分结构示意图，其中Bar 为除草剂抗性基因，Cry1Ac 为
苏云金杆菌毒蛋白基因，Pta 为半夏凝集素基因。
回答下列问题：
(1)双价抗虫载体中的P1、P2和P3是属于基因表达载体中的 ，其作用是 。
(2)构建的载体通常用 法转入到番茄子叶中并进行植物组织培养，并在培养基中添加 用
于筛选转基因番茄。
(3)为验证Pta 基因是否转入番茄基因组中，研究人员使用 技术筛选转基因番茄中的Pta 基因，再进
行凝胶电泳鉴定，结果如图所示。
12
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
图中①为阳性对照，②为阴性对照，③为待测植株，试分析③中出现2 条条带的可能原因是 。
(4)对于成功转化的番茄植株还需进一步进行抗虫鉴定，研究人员选取3 株阳性转基因番茄进行小菜蛾幼虫
抗性实验，结果如下表。
株系编号
CK
1
2
3
幼虫致死率（%）
0
39.8
6.5
48.9
注：CK 表示对照
由表中可知，株系2 的幼虫致死率较低，推测其可能原因是 。
【答案】(1) 启动子 RNA 聚合酶识别和结合的位点
(2) 农杆菌转化法 除草剂
(3) PCR 所使用的的Pta 引物特异性不高
(4)抗虫基因在转基因番茄株系2 的表达水平比较低
【分析】1、基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA 连接酶、运载体。
2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因
导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。
【详解】（1）双价抗虫载体中的P1、P2 和P3 位于基因的首端，是属于基因表达载体中的启动子，启动
子是转录的起点，是RNA 聚合酶识别和结合的位点。
（2）番茄为双子叶植物，常用农杆菌转化法转入到番茄子叶中并进行植物组织培养，基因表达载体中有
Bar 为除草剂抗性基因，可作为标记基因，可在培养基中添加除草剂用于筛选转基因番茄。
（3）为验证Pta 基因是否转入番茄基因组中，可使用PCR 技术，筛选转基因番茄中的Pta 基因，再进行凝
胶电泳鉴定，若PCR 过程中引物特异性不高，可能会出现多条条带，③中出现2 条条带的可能原因是所使
用的的Pta 引物特异性不高
（4）由表中数据可知，株系2 的幼虫致死率较低，可能是因为抗虫基因在转基因番茄株系2 的表达水平比
较低。
13．（2024·湖南·一模）土壤盐渍化影响水稻生长发育，将水稻耐盐碱基因OsMYB56 导人不耐盐碱水稻
品种吉粳88 中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图，其中bar 为抗除草剂基因，
Tetr为四环素抗性基冈，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，①～⑦表示操作过程。
13
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
限制酶
BamH I
BclI
Sma l
Saa3A I
识别位点及切割位
点
一G,GATCC
-T↓ GATCA-
-CCC ↓ GGG
-↓GATC-
(1)过程①利用PCR 扩增OsMYB56 基因时加入的酶催化 键的形成，还需要添加引物，应选用下列引物
组合 。
5'-CTTGGATGAT-3'
5'-TAAGTTGTCT-3'
5'-TAGTAGGTTC-3'
5'-ATTCAACAGA-3'
5'-
①
②
③
④
⑤
TCTGTTGAAT-3'
5'- ATCATCCAAG-3'
⑥
(2)根据基因表达载体的结构组成分析，Ti 质粒中的CaMV35S 功能是 。
基因表达载体中，OsMYB56 基因和bar 基因编码链的方向 （填“相同”或“相反’’）。
(3)过程③应选用限制酶 切割质粒，利用所选限制酶进行操作的优势是 （答两
点），切割后需要用 （写具体名称）进行连接才能获得重组质粒。
(4)若要鉴定OsMYB56 基因是否表达，从分子水平上检测的方法有 （答出一种即可）。
【答案】(1) 磷酸二酯 ①⑤
(2) RNA 聚合酶识别和结合的部位（启动转录过程） 相反
(3) Bcl Ⅰ和Sma Ⅰ 防止酶切后的质粒、目的基因自身环化；保证OsMYB56 基因和酶切后的质
粒定向连接 T4DNA 连接酶
(4)提取细胞的mRNA，逆转录得到cDNA 后进行PCR 扩增；根据OsMYB56 基因设计探针进行核酸分子杂
交检测OsMYB56 基因或者其转录出的mRNA；通过抗原一抗体杂交技术检测OsMYB56 基因表达的蛋白
质（答出1 点即可）
【分析】PCR 技术可特异性的扩增DNA 片段，关键在于引物可以和特定DNA 片段的3'端特异性结合，使
14
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
耐高温的DNA 聚合酶沿引物的3'端延伸子链。基因表达载体一般包括启动子、终止子、目的基因、标记基
因、复制原点等元件。
【详解】（1）DNA 分子由2 条链构成，每一条链都有3'端与5'端，-OH 端为3'，磷酸基团的末端为5'，因
此OsMYB56 基因游离的磷酸基团侧为5'端，羟基端为3'端。过程①PCR 扩增OsMYB56 基因时加入的酶
是Taq,该酶能催化磷酸二酯键的形成。
在进行PCR 操作时，引物应分别与基因两条链的3'端根据碱基互补配对原则结合，根据图中两端序列，通
常选择5′-CTTGGATGAT-3′（上面链的引物）和5′-TCTGTTGAAT-3′（下面链的引物）作为引物对，
①⑤正确。
（2）基因表达载体的结构应该包括启动子、终止子、复制原点、限制酶切割位点、标记基因等，由图可
知CaMV35S 是启动子，功能是RNA 聚合酶识别和结合的位点。RNA 聚合酶的移动方向是从启动子移向
终止子，故两个基因编码链方向相反。
（3）据图可知，质粒中的两个标记基因Tetr 和Ampr 中都含有限制酶BamH Ⅰ识别序列，如果用限制酶
BamH Ⅰ，会破坏质粒中的两个标记基因，为防止质粒自身环化，保证OsMYB56 和酶切后的质粒定向连
接，需要用双酶切，因此过程③可以选择限制酶Bcl Ⅰ和Sma Ⅰ。酶切后的质粒和目的基因片段，通过
T4DNA 连接酶作用后获得重组质粒。
（4）分子水平检测OsMYB56 基因是否表达，可以检测基因是否转录形成RNA 或翻译成蛋白质，因此方
法如下;可以提取细胞的mRNA，逆转录得到cDNA 后进行PCR 扩增；根据OsMYB56 基因设计探针进行
核酸分子杂交检测OsMYB56 基因或者其转录出的mRNA；通过抗原一抗体杂交技术检测OsMYB56 基因
表达的蛋白质。
14．（2024·安徽合肥·一模）人溶菌酶（hLYZ）是一种具有抑菌活性的蛋白质，因具有抑菌效果显著、结
构稳定且对人体无毒副作用等优点，在食品保鲜、抗菌消炎等方面广泛应用。为提高溶菌酶的产量，研究
人员利用酵母细胞表达人溶菌酶，构建的重组质粒的部分结构如图1 所示，回答下列问题。
(1)人工合成hLYZ 基因时，改变天然hLYZ 基因的部分碱基，使密码子由酵母菌稀有密码子优化成常用密
码子，从而提高人溶菌酶在酵母细胞中的表达量。此过程中，基因的碱基发生改变，而蛋白质的氨基酸序
列不变的原因是 。
(2)由图1 可知，人工合成hLYZ 基因时，需在基因两端分别引入Xhol 和NotI 两种不同限制酶的识别序列，
15
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
这样设计的优点是 ，经过酶切的hLYZ 基因和质粒连接时，可选用 酶。
(3)hLYZ 基因上游的启动子能被 识别并结合，从而开启转录过程。构建的重组表达载体中还应有标
记基因，标记基因的作用是 。
(4)为检测重组人溶菌酶的活性，可进行X 菌的抑菌试验。将X 菌均匀涂布在固体培养基上，放入经不同处
理的无菌滤纸片，在适宜条件下培养36h，观察抑菌圈的直径如图2 所示。检测结果说明 。
【答案】(1)优化前后的密码子编码同一种氨基酸，密码子具有简并性
(2) 使目的基因与载体正确连接 DNA 连接
(3) RNA 聚合酶 筛选含目的基因的受体细胞
(4)重组人溶菌酶对X 菌有明显的抑菌圈，说明重组人溶菌酶具有抑菌作用，但抑菌效果低于0.2g/L 天然的
人溶菌酶纯品
【分析】基因工程的基本操作程序：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建，将目的基因导入受体
细胞，目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）人工合成hLYZ 基因时，改变天然hLYZ 基因的部分碱基，使密码子由酵母菌稀有密码子优
化成常用密码子，从而提高人溶菌酶在酵母细胞中的表达量。此过程中，基因的碱基发生改变，而蛋白质
的氨基酸序列不变的原因是优化前后的密码子编码同一种氨基酸，密码子具有简并性。
（2）由图1 可知，人工合成hLYZ 基因时，需在基因两端分别引入Xhol 和NotI 两种不同限制酶的识别序
列，这样设计的优点是使目的基因与载体正确连接，防止自身环化和反向连接，经过酶切的hLYZ 基因和
质粒连接时，可选用DNA 连接酶。
（3）启动子是RNA 聚合酶结合和识别位点，所以hLYZ 基因上游的启动子能被RNA 聚合酶识别并结合，
从而开启转录过程。构建的重组表达载体中还应有标记基因，标记基因的作用是选含目的基因的受体细胞。
（4）将X 菌均匀涂布在固体培养基上，放入经不同处理的无菌滤纸片，在适宜条件下培养36h，观察抑菌
圈的直径如图2 所示,可以根据抑菌圈的直径来判断抑菌的效果。检测结果说明重组人溶菌酶对X 菌有明显
的抑菌圈，说明重组人溶菌酶具有抑菌作用，但抑菌效果低于0.2g/L 天然的人溶菌酶纯品。
15．（2024·贵州·一模）单个B 细胞抗体技术可用于制备高亲和力、高特异性的单抗，其技术流程如下：
①康复者单个B 淋巴细胞的分离和筛选；②利用RT-PCR 获取和扩增抗体基因；③构建基因表达载体；④
将抗体基因导入动物细胞；⑤单抗的筛选和鉴定。下列叙述错误的是（ ）
A．操作①选用单个B 淋巴细胞以保证最终获得纯度较高的单抗
B．操作②使用的PCR 反应体系常添加Mg2+以激活DNA 聚合酶
C．操作③常用两种限制酶切割抗体基因和载体以防止其自身环化
D．操作④前可用Ca2+处理受体细胞促使其主动吸收DNA 分子
【答案】D
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
16
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记
基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方
法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将
目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基
因--DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译
成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、不同的效应B 细胞分泌的抗体不同，操作①选用单个B 淋巴细胞可以保证最终获得纯度较高
的单抗，A 正确；
B、PCR 反应体系中，常加入Mg2+以激活DNA 聚合酶，促进PCR 延伸中子链的合成，B 正确；
C、为了防止目的基因和载体自身环化或反向连接，常用两种不同的限制酶去同时切割目的基因和载体，C
正确；
D、用Ca2+处理细胞，该受体细胞是微生物，需要用Ca2+处理微生物细胞，使其处于感受态，D 错误。
故选D。
16．（2024·江西南昌·一模）HNFlα 基因突变可引发糖尿病等疾病。HNFlα 的第249 位丝氨酸（S249）是
其重要功能位点，为进一步研究S249 的重要性，研究人员将249 位丝氨酸（S）突变为丙氨酸（A），成
功构建了人源HNF1αS249A 转基因小鼠。下图为基因表达载体部分结构示意图，Myc 为标记基因，引物F
和R 之间的序列长度为386bp 碱基对。回答下列问题：
(1)CMV 位于HNFlαcDNA 上游，据此推测CMV 的功能为 。
(2)为保证HNFlαcDNA 准确插入载体，可利用PCR 技术在其两端添加限制酶识别序列 ，应将限制酶
识别序列添加在引物的 （填“5'”或“3'”）端。
(3)获得HNFlαcDNA 后，可利用cDNA 中间序列设计引物实现定点突变目的，从而制备HNFlα-
S249AcDNA．已知HNFlα 中248、249、250 三个氨基酸对应的密码子序列为ACCUCUGUG，丙氨酸对应
的密码子有GCU、GCC、GCG、GCA 四种，为了保证引物与模板的结合效率及突变目的，请设计其中一
个引物： 。
(4)利用上述基因表达载体制备转基因小鼠，请用文字和箭头写出制备流程图 。
(5)提取转基因小鼠DNA 作为模板，利用引物F 和R 进行PCR 技术扩增，经过琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产
物。若出现 结果，初步证明转基因小鼠模型构建成功。
【答案】(1)RNA 聚合酶的识别和结合位点，驱动HNF1αcDNA 的转录
17
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(2) Hind Ⅲ和Xba Ⅰ 5´
(3)ACCGCTGTG 或TGGCGACAC
(4)基因表达载体→显微注射→受精卵→培养→早期胚胎→胚胎移植→代孕小鼠子宫→转基因小鼠
(5)一条386bp 的DNA 条带
【分析】1、PCR 获取目的基因时，引物的作用是界定目的基因，为DNA 聚合酶提供结合位点并使DNA
聚合酶能够从引物的3'端连接脱氧核苷酸。
2、科学设计引物是PCR 能否成功的关键。若引物的碱基过多或引物的G、C 含量过高，会造成PCR 的效
率偏低，收获的目的基因较少，原因是C、G 之间含有3 个氢键，引物与模板链结合过于紧密，变性时引
物不易与模板链脱离（影响变性）。
【详解】（1）根据题意可知，CMV 位于HNFlαcDNA 上游，由此推测CMV 可能是RNA 聚合酶的识别和
结合位点，驱动HNF1αcDNA 的转录。
（2）为保证HNFlαcDNA 准确插入载体，可利用PCR 技术在其两端添加限制酶识别序列Hind Ⅲ和Xba
Ⅰ，由于DNA 聚合酶只能从引物的3´端开始催化脱氧核苷酸连接，故应将限制酶识别序列添加在引物的5
´端。
（3）根据题意可知，HNFlα 中248、249、250 三个氨基酸对应的密码子序列为ACCUCUGUG，丙氨酸对
应的密码子有GCU、GCC、GCG、GCA 四种，为了保证引物与模板的结合效率及突变目的，则其中一个
引物序列可为ACCGCTGTG 或TGGCGACAC。
（4）利用上述基因表达载体制备转基因小鼠时，制备流程为基因表达载体→显微注射→受精卵→培养→
早期胚胎→胚胎移植→代孕小鼠子宫→转基因小鼠。
（5）根据题意可知，引物F 和R 之间的序列长度为386bp 碱基对，提取转基因小鼠DNA 作为模板，利用
引物F 和R 进行PCR 技术扩增，经过琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物，如果出现了一条386bp 的DNA 条带，
初步证明转基因小鼠模型构建成功。
17．（2024·江苏泰州·一模）胆固醇O 酰基转移酶1(SOAT1)与肝癌的发生密切相关，可作为潜在的肝癌生
物标志物。科研人员从肝癌细胞Huh7 中获取SOAT1 基因，经原核表达、蛋白质纯化后免疫小鼠制备单克
隆抗体。请回答下列相关问题：
(1)从肝癌细胞Huh7 中提取 ，通过 获得SOAT1 的cDNA。
(2)根据SOAT 1 的编码序列设计的两个引物如下图1。引物F 加入的EcoR Ⅰ酶切位点位于 端，引
物R 上添加的XhoⅠ酶识别的回文序列的6 个碱基是 。
(3)利用上述引物对SOAT1 基因进行PCR 扩增，该实验设计的扩增程序中热循环次数为30 次，一般PCR
反应中设计的热循环次数不超过40 次，原因是 。PCR 反应结束后，将产物经1%琼脂糖凝
胶 后，对PCR 产物进行胶回收。
(4)将胶回收后的PCR 产物和载体pET32a 分别用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，加入DNA 连接酶后在冰面上过夜。
18
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
在冰面上操作的目的是 。在将重组质粒转化至大肠杆菌前用CaCl2处理大肠杆菌，使其处
于 的生理状态，以提高转化效率。
(5)将测序正确的重组载体诱导表达并进行电泳，实验部分结果见下图2，SOAT 1 重组蛋白的相对分子质量
为50 kD 左右，下图中基本符合要求的条带包括 。
(6)用纯化的SOAT1 重组蛋白免疫小鼠，利用 技术获得SOAT1 单克隆抗体细胞株以制备单克隆抗
体。
【答案】(1) 总RNA 逆转录
(2) 5′ CTCGAG(或5′—CTCGAG—3′)
(3) 40 次循环后可能出现大量非特异性产物(或40 次循环是PCR 反应的有效极限) 电泳
(4) 降低连接反应的速率，减少多联体(非目标重组DNA)的形成(或低温使氢键稳定，减少错配等)
感受态(或易吸收外源DNA 状态)
(5)2、3、5
(6)杂交瘤(动物细胞培养和动物细胞融合)
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标
记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的
方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；
将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因
——DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否
翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）为获得SOAT1 的cDNA，需要从肝癌细胞中获得总RNA，通过逆转录过程获得。
（2）EcoR Ⅰ酶特异性识别GAATTC 序列，并在GC 之间切割，从F 引物看出，EcoR Ⅰ酶切位点位于
5′，引物R 上添加的Xho Ⅰ酶识别的回文序列的6 个碱基是CTCGAG(或5′—CTCGAG—3′)。
（3）由于40 次循环后可能出现大量非特异性产物(或40 次循环是PCR 反应的有效极限)，所以一般PCR
19
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
反应中设计的热循环次数不超过40 次，产物1%琼脂糖凝胶电泳后，对PCR 产物进行胶回收。。
（4）双酶切，加入DNA 连接酶后在冰面上过夜，冰面温度低，使酶的活性降低，所以操作的目的是降低
连接反应的速率，减少多联体(非目标重组DNA)的形成。将重组质粒转化至大肠杆菌前用CaCl2 处理大肠
杆菌，使其处于感受态，以提高转化效率。
（5）观察电泳图，在条带2、3、5 中含有50KD 的蛋白质分子，而SOAT 1 重组蛋白的相对分子质量为50
kD 左右，所以符合要求的条带包括2、3、5。
（6）获得SOAT1 单克隆抗体细胞株可以利用杂交瘤(动物细胞培养和动物细胞融合)技术，特点是可以无
限增殖，并产生特异性抗体。
18．（2024·山东泰安·一模）Cre-loxP 系统能实现特定基因的敲除（如图1）。把几种荧光蛋白基因和Cre
酶能识别并切割的序列（loxP1 和loxP2）串在一起，构建表达载体T（如图2）。部分荧光蛋白基因会被
Cre 酶随机“剪掉”，且两个loxP1 之间或两个loxP2 之间的基因，最多会被Cre 酶敲除一次，剩下的部分
得以表达，随机呈现不同的颜色。下列说法错误的是（ ）
A．Cre 酶切下一个待敲除基因的过程，需要破坏四个磷酸二酯键
B．若小鼠细胞含一个表达载体T（不含Cre 酶），其肌肉组织细胞呈红色
C．若小鼠细胞含一个表达载体T（含Cre 酶），其脑组织细胞呈红色或黄色或蓝色
D．若小鼠细胞含两个表达载体T（含Cre 酶），其一个细胞内可能随机出现两种颜色
【答案】B
【分析】1、基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA 连接酶、运载体。
2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因
导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。
【详解】A、DNA 单链上相邻的两个脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键相连，DNA 由两条单链螺旋缠绕形
成，Cre 酶切下一个待敲除基因的过程中，需要切断基因前后两端，因此需要破坏四个磷酸二酯键，A 正
确；
B、据图可知，小鼠有编码红、黄、蓝荧光蛋白的基因，前端有脑组织特异性表达的启动子，肌肉细胞不
会表达颜色基因，故若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre 酶)，其肌肉组织细胞呈无色，B 错误；
C、1oxP1、1oxP2 位置如图2 黑白三角符号所示，两个loxP1 和两个loxP2 之 间的基因最多会被Cre 酶敲
除一次，将含Cre 酶的病毒注入小鼠体内，Cre 酶表达情况不同，识别的loxP 不同，则有可能未敲除荧光
蛋白基因，此时为红色(同不含Cre 酶时)，也有可能敲除两个loxP1 之间的红色荧光蛋白基因，此时为黄色，
也有可能敲除两个1oxP2 之间的红色和黄色荧光蛋白基因，此时为蓝色，因而不同脑细胞会差异表达红色、
黄色或蓝色荧光蛋白基因，C 正确；
20
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
D、小鼠脑组织细胞内有2 个相同表达载体T(含Cre 酶)，Cre 酶对每个DNA 片段随机剪切，因而细胞的颜
色由细胞内两种荧光蛋白的颜色叠加而成，故其脑组织细胞可能出现两种颜色，D 正确。
故选B。
19．（2023·山东菏泽·一模）大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA 就会缠绕在细胞壁碎片上，静
置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，
电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述不正确的是（ ）
A．提取DNA 时可加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解
B．将提取的DNA 溶于2mol/LNaCl 溶液后；可用二苯胺试剂进行鉴定
C．电泳鉴定DNA 利用了DNA 在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理
D．根据电泳结果，质粒上一定没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点
【答案】D
【分析】DNA 粗提取和鉴定的原理：
1、DNA 的溶解性：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同（DNA 在0.14mol/L 的
氯化钠中溶解度最低）；DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。
2、DNA 的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、由于蛋白质可溶于酒精，而DNA 在冷酒精中溶解度很低，所以在提取DNA 时加入酒精，使
溶于酒精的蛋白质等物质溶解，而让DNA 析出，A 正确；
B、由于DNA 在2mol/LNaCl 溶液中溶解度较大，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色，所以将提取的DNA 溶
于2mol/LNaCl 溶液后，可用二苯胺试剂在沸水条件进行鉴定，B 正确；
C、DNA 带负电，电泳鉴定DNA 利用了DNA 在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理，C 正确；
D、因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个切割
位点，也可能没有切割位点，D 错误。
故选D。
20．（2024·山东泰安·一模）融合PCR 技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR 产物，通过
PCR 产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA 片段连接起来。其原理如图所示，据图分析正确的
是（ ）
21
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
A．上述过程中使用的引物P2 和P3 的碱基需要完全互补配对
B．设计引物的目的是为了能够从其3'端开始连接脱氧核苷酸
C．融合PCR 的第一步两条链重叠部位可互为另一条链的引物
D．若融合PCR 的第二步获得128 个融合基因，理论上该过程消耗了254 个引物
【答案】BCD
【分析】PCR 是利用DNA 在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C 左右）时引物与单
链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA 聚合酶最适反应温度（72°C 左右），DNA 聚合酶沿着磷
酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR 仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，
复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
【详解】A、上述过程中使用的引物P2 和P3 的碱基不需要完全互补配对，只需要与DNA 的两条模板链的
两端互补配对即可，A 错误；
B、引物为一段核苷酸，引物与DNA 模板链结合后，能够从其3＇端开始连接脱氧核苷酸，开始子链的合
成，B 正确；
C、结合图示可知，融合PCR 的第一步两条链重叠部位即互补配对，可互为另一条链的引物，C 正确；
D、若融合PCR 的第二步获得了128 个融合基因，引物数目和新合成的子链数目相同，即该过程消耗了
128×2-2=254 个引物，D 正确。
故选BCD。
21．（2024·山东烟台·一模）哺乳动物体内一定含量的w-3 多不饱和脂肪酸(LCPUFA)可以起到预防心血管
疾病的作用，但LCPUFA 在大多数动物体内不能合成，只能从食物中摄取。科研人员从秀丽隐杆线虫中获
得LCPUFA 合成酶基因fat-1(1229bp),培育转fat-1 基因家兔，其部分流程如图一所示。
22
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(1)PCR 扩增fat-1 基因的前提是 ，以用于特异性制备PCR 扩增需要的引物。PCR 扩增过程中，经过
4 轮循环后，得到的产物中只含一种引物的DNA 分子占比为 。
(2)在构建PEBf 质粒时，为确保fat-1 基因按正确方向插入，需要双酶切，还需对fat-1 基因的引物进行相应
设计。已知fat-1 基因转录的模板链为a 链，与b 链结合的引物5'端添加了限制酶识别序列GAATTC,则另一
引物5’端需添加的限制酶识别序列为 ,理由是 。
(3)转染是将外源分子如DNA、RNA 等导入真核细胞的技术。为了检验图一家兔成纤维细胞是否转染成功，
科研人员分别提取培养液中各细胞的DNA，利用fat-1 基因引物进行PCR 扩增后电泳，部分结果如图二所
示。据图分析，1 组和2 组分别是 细胞组PCR 产物。
(4)检测转基因家兔细胞中是否含有LCPUFA 合成酶，可采用 技术。如果fat-1 基因已正确插入PEB
质粒且成功转染，但在转基因家兔细胞中没有检测到LCPUFA 合成酶，从构建基因表达载体的角度分析，
可能的原因是 。
【答案】(1) 获得一段已知目的基因的序列 1/8
(2) GGATCC 另一引物应和a 链配对，且转录的模板链是a 链，则a 链引物所在一侧应靠近启动
子，所以应选择BamH I 限制酶的序列作为引物5’端序列，即另一引物5’端需添加的限制酶序列为
GGATCC
23
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(3)未成功转染和成功转染
(4) 抗原-抗体杂交 重组质粒缺少启动子和终止子，无法正常转录
【分析】1、PCR 扩增：目的基因DNA 受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链
DNA 为模板，在DNA 聚合酶作用下进行延伸，如此循环多次。
2、选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性
基因；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的
基因自身环化和质粒的自身环化。
【详解】（1）在进行PCR 扩增目的基因时，需要加入引物，引物是根据一段已知目的基因的序列合成的
DNA 片段。PCR 扩增过程中，经过4 轮循环后，得到16 个DNA 分子，其中有2 个DNA 分子只有含有母
链，且该DNA 分子只含一种引物，故得到的产物中只含一种引物的DNA 分子占比为1/8。
（2）在构建PEBf 质粒时，为确保fat-1 基因按正确方向插入，需要双酶切，还需对fat-1 基因的引物进行
相应设计。已知fat-1 基因转录的模板链为a 链，与b 链结合的引物5'端添加了限制酶识别序列GAATTC,另
一引物应和a 链配对，且转录的模板链是a 链，则a 链引物所在一侧应靠近启动子，所以应选择BamH I 限
制酶的序列作为引物5’端序列，即另一引物5’端需添加的限制酶识别序列序列为GGATCC。
（3）据图分析，M2 组和1 组没有扩增出DNA 片段，故细胞内不存在目的基因，即可能是细胞内导入
PEB 质粒或者未成功转染，而M2 组是PEB 质粒转染细胞PCR 产物，故1 组是未转染细胞PCR 产物，2 组
出现一条DNA 条带，即为目的基因条带，则细胞内导入的是PEBf 质粒，1 组和2 组分别是未成功转染和
成功转染细胞组PCR 产物。
（4）检测转基因家兔细胞中是否含有LCPUFA 合成酶，可采用抗原-抗体杂交技术。如果fat-1 基因已正确
插入PEB 质粒且成功转染，但在转基因家兔细胞中没有检测到LCPUFA 合成酶，从构建基因表达载体的角
度分析，基因正确插入却无法检测到相应蛋白质，考虑目的基因未正确表达，从构建基因表达载体的角度
分析，可能的原因是重组质粒缺少启动子和终止子，无法正常转录。
22．（2024·山东泰安·一模）与普通玉米相比，甜玉米细胞中可溶性糖向淀粉的转化较慢导致可溶性糖含
量高，汁多质脆。为提高甜玉米的商品价值，科研人员培育出了超量表达G 蛋白转基因甜玉米新品种。在
超量表达G 基因载体的构建中，所用DNA 片段和Ti 质粒的酶切位点如图1、2 所示。
(1)强启动子能被 识别并结合，驱动基因持续转录。在培育转基因甜玉米中T-DNA 的作用是 。为
使DNA 片段能定向插入T-DNA 中，可用PCR 技术在DNA 片段的两端添加限制酶识别序列，M、N 端添
加的序列所对应的限制酶分别是 。处理好的DNA 片段与Ti 质粒的重组过程共需要 种酶。
(2)外植体经脱分化形成的愈伤组织放入农杆菌液浸泡后，进行植物组织培养时培养基中需加入 进行筛
选，获得玉米株系a1、a2、a3、a4。通过对四个株系的G 蛋白表达量进行测定，发现a4株系的表达量与野生
24
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
型相近，原因可能是 。
(3)下图示淀粉合成酶基因片段，其转录后形成的前体RNA 需通过剪接（切去内含子对应序列）和加工后
方能用于翻译。科研人员希望通过降低淀粉合成酶基因的表达，进一步提高甜玉米中可溶性糖的含量，将
吗啉反义寡核苷酸（RNA 剪接抑制剂）导入玉米受精卵中，发现其基因表达受阻。科研人员对其作用机制
提出两种假说。
假说1：导致RNA 前体上内含子1 的对应序列不能被剪切；
假说2：导致RNA 前体上内含子1 和外显子2 的对应序列同时被剪切。
①为验证上述假说，分别在受精卵发育后3 天的胚细胞中从实验组和对照组提取 ，逆转录形成
cDNA。若假说1 成立，使用图示引物2 和引物4 进行PCR 后电泳的结果为 （目的条带的有无）。
②若要证明假说2，需选择图示引物 进行PCR。
③若某次实验电泳结果发现：实验组和对照组都没有任何条带，从PCR 操作过程角度解释可能的原因是
（至少写出两点）。
【答案】(1) RNA 聚合酶 将强启动子和G 基因带入甜玉米细胞并整合到甜玉米细胞染色体的
DNA 上 Not Ⅰ和Sac Ⅰ 3
(2) 潮霉素 a4 株系玉米中可能没有导入目的基因或目的基因未表达
(3) 总RNA 实验组有目的条带、对照组无目的条带 3 和4 退火温度太高、引物自连
或互连
【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和
终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA 分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是
荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
【详解】（1）强启动子驱动基因的持续转录，可知强启动子能被RNA 聚合酶识别并结合。T-DNA 在该实
验中的作用是将强启动子和G 基因带入甜玉米细胞并整合到甜玉米细胞染色体的DNA 上。为使G 基因在
玉米植株中超量表达，应确保强启动子和G 基因不被破坏，故应优先选用Not Ⅰ和Sac Ⅰ酶切割质粒，为
保证强启动子和G 基因能连在质粒上，M、N 端添加的序列所对应的限制酶分别是Not Ⅰ和Sac Ⅰ酶，然
后再用DNA 连接酶将强启动子和G 基因与质粒连接，因此该过程共需3 种酶。
（2）由图2 可知潮霉素抗性基因位于T 质粒的T-DNA，随T-DNA 整合到玉米细胞的染色体上，所以将农
杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养。由于限制酶破坏了潮霉素抗性基因，故在培养基中需加入
卡那霉素进行筛选。筛选出的愈伤组织可(再)分化形成丛芽，最终获得多个转基因玉米株系。蛋白质的表
达量与基因的表达有关，故a4 株系P 蛋白表达量的表达量与野生型相近，即表达量较低的原因可能是其没
有导入目的基因或者目的基因没有表达。
（3） ①为验证上述假说，分别从受精卵发育后3 天的实验组和对照组胚细胞中提取总RNA，逆转录形成
cDNA。根据引物2 和引物4 在淀粉酶合成基因片段上的位置，通过PCR 扩增能得到内含子2 的序列，若
25
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
假说1 成立，即吗啉反义寡核苷酸导致RNA 前体上内含子1 的对应序列不能被剪切，故实验组中应含有内
含子1 的序列，而对照组的该片段被切除了，因此用引物2 和引物4 进行PCR 反应，其结果为实验组中有
杂交带，而对照组中无杂交带。
②若要证明假说2 成立，即RNA 前体上外显子2 的对应序列同时被剪切下去，则可以选择图示引物3 和引
物4 进行PCR，观察是否有杂交带出现，如果RNA 前体上外显子2 的对应序列同时被剪切下去，PCR 后
电泳不会出现杂交带。
③PCR 是通过调节温度来控制DNA 双链的解聚与结合的。在PCR 操作过程中，如果退火温度太高、引物
自连或互连，均会导致电泳后的实验组和对照组没有任何条带出现。
23．（2024·山东聊城·一模）易错PCR 是利用低保真的Taq 酶和改变PCR 的反应条件，降低DNA 复制的
准确性，在新DNA 链的合成过程中增加碱基错配，从而使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导DNA
序列变异的方法。从自然界中的生物体内分离得到的天然酶，在工业生产环境中催化效率往往较低。下图
是研究人员利用易错PCR 技术对某种天然酶进行改造，获得了高催化效率的酶的流程示意图。回答下列问
题：
(1)在体外利用PCR 技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA 解链为单链的条件是 。PCR 反应
体系中需添加引物，引物的作用是 。
(2)图中步骤①为易错PCR 过程，其扩增过程中需要加入Taq 酶，这是因为Taq 酶具有 的特点。图中步
骤②是将构建的重组质粒溶于缓冲液中与用 处理的受体菌混合，在一定温度下完成转化。转化是指 。
(3)Taq 酶的某一区域负责将碱基与模板链正确地互补配对，Mn2+可以降低这一功能；非互补的碱基对由于
氢键不易形成，稳定性差，Mg2+可以提高该错配区的稳定性。因此，与普通PCR 相比，易错PCR 的反应
体系中应适当 （填“提高”或“降低”）Mn2+浓度、 （填“提高”或“降低”）Mg2+浓度。
(4)阐述通过易错PCR 技术改造天然酶与通过蛋白质工程改造天然酶原理的本质区别 。
【答案】(1) 温度升高到90°C 使DNA 聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
(2) 耐高温 Ca2+ 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
(3) 提高 提高
(4)易错PCR 技术是利用基因突变的原理来改造天然酶，是不定向的；而蛋白质工程是利用基因重组的原
理来改造天然酶，是定向的
【分析】PCR 技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于TaqDNA 聚合酶的酶促合
26
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
成反应。DNA 聚合酶以单链DNA 为模板，借助一小段双链DNA 来启动合成，通过人工合成的引物与单
链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA 聚合酶将脱氧单核苷
酸加到引物3′-OH 末端，并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA 互补链。
【详解】（1）在体外利用PCR 技术扩增目的基因时，利用DNA 高温变性的特点加热至90-95℃，破坏双
链之间的氢键，使DNA 解链变为单链。用PCR 技术扩增目的基因时，需要在PCR 扩增仪中加入2 种引物，
其作用是使DNA 聚合酶（Taq 酶）从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
（2）PCR 技术需要高温加热使DNA 双链解旋，而Taq 酶热稳定性高，在高温条件下不会失活，因此在降
温时仍可发挥作用。步骤②是将重组质粒导入不同受体菌，由于受体菌用钙离子处理后更容易吸收周围环
境中的DNA，因此步骤②是将构建的重组质粒溶于缓冲液中与用Ca2+处理的受体菌混合，在一定温度下
完成转化。转化是指目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
（3）PCR 技术通过DNA 的双链复制，在耐高温的TaqDNA 聚合酶的催化下，遵循碱基互补配对原则，扩
增DNA 片段。TaqDNA 聚合酶与一般DNA 聚合酶相比最大的特点是高温下保持酶的活性或耐高温或热稳
定，其某一区域负责将碱基与模板链正确地互补配对，Mn2+可以降低这一功能，提高碱基的错配，而
Mg2+可以提高稳定性，故易错PCR 时应适当提高Mn2+和Mg2+浓度。
（4）通过易错PCR 技术改造天然酶属于基因工程，与通过蛋白质工程改造天然酶原理的本质区别为：易
错PCR 技术是利用基因突变的原理来改造天然酶，是不定向的；而蛋白质工程是利用基因重组的原理来改
造天然酶，是定向的。
24．（2024·广东江门·一模）在构建基因表达载体时，传统方法常受限于限制酶识别序列。科研人员研发
了新的DNA 重组方法: In-Fusion 技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的
DNA 序列（即同源序列），然后用In-Fusion 酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会
在受体细胞内形成完整的重组序列。主要操作过程如图示。下列叙述错误的是（ ）
A．推测In-Fusion 酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端、连接磷酸二酯键
B．载体A 端和B 端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化
C．形成重组质粒时，如果温度远高于50℃，黏性末端的碱基不容易互补配对
D．该技术无需识别特定切割位点，需识别目的基因与线性质粒任意同源序列
【答案】A
【分析】基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条
链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（2）DNA 连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸
二酯键。（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体、动植物病毒。
27
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
【详解】A、分析题意可知，本技术的过程是在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA 序列（即
同源序列），然后用In-Fusion 酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形
成完整的重组序列，推测In-Fusion 酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端，不具有连接磷酸二酯键的作
用，A 错误；
B、若用限制酶切割后黏性末端相同，会导致自身环化和反向连接等，载体A 端和B 端的序列不同，可防
止目的基因与质粒反向连接及自身环化，B 正确；
C、据图可知，重组质粒形成时需要加入In-Fusion 酶连接磷酸二酯键，且如果温度远高于50℃，黏性末端
的碱基不容易互补配对，C 正确；
D、分析题意，传统方法常受限于限制酶识别序列，故科研人员研发了新的DNA 重组方法: In-Fusion 技术，
结合图示可知，该技术无需识别特定切割位点，但用In-Fusion 酶处理，使同源序列形成黏性末端，故需识
别目的基因与线性质粒任意同源序列，D 正确。
故选A。
25．（2024·山东青岛·一模）“DNA 粗提取与鉴定”的实验步骤是：研磨→去杂质→析出→鉴定：某研究
小组欲探究不同的去杂质方法对实验结果的影响，实验结果如下表所示。下列说法错误的是（ ）
去杂质方式
沉淀质量（g）
DNA 浓度（ng/μL）
OD260/OD280
二苯胺鉴定
离心
0.068
81.5
1.53
蓝色
4℃冰箱静置
0.1028
336.4
1.41
（注：OD260与OD280的比值可检查DNA 纯度。纯DNA 的OD260/OD280为1.8，当存在蛋白质污染时，这一
比值会明显降低）
A．猪肝和菜花均可作为提取DNA 的材料
B．对研磨液进行离心是为了加速DNA 的沉淀
C．离心法可以获得更高纯度的DNA
D．析出时的离心转速明显高于去杂质时
【答案】B
【分析】DNA 的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA 的溶解性，DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度的
氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA 溶解或析出，从而达
到分离的目的；②DNA 不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋
白质和DNA 进一步分离；③在沸水浴的条件下DNA 遇二苯胺会呈现蓝色。
【详解】A、DNA 粗提取与鉴定的实验中，应选择富含DNA 的材料，猪肝和菜花均可作为提取DNA 的材
料，A 正确；
BC、离心研磨液的目的是加速沉淀，离心能够加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质的沉淀，离心法可以获
得更高纯度的DNA，B 错误，C 正确；
D、据表可知，离心时DNA 浓度是81.5，4℃冰箱静置是336.4，说明静置时蛋白质含量较多，沉淀质量离
心时是0.068，4℃冰箱静置是0.1028，比较可知DNA 的沉淀质量小，故析出时的离心转速明显高于去杂
质时，D 正确。
28
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
故选B。
26．（2024·山东青岛·一模）CRISPR-Cas12a 系统是第二类用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR-Cas 系统，
该系统主要包含crRNA 和Cas12a 蛋白两部分，crRNA 能特异性识别并结合特定的DNA 序列，从而引导
Cas12a 蛋白到相应位置剪切DNA。某科研团队基于CRISPR-Cas12a 系统对宫颈癌细胞中的KIFC1 基因进
行敲除，来探讨KIFCI 基因在宫颈癌细胞中的功能及对宫颈癌HeLa 细胞增殖的影响。
(1)在CRISPR-Cas12a 系统中，crRNA 的序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含
种核苷酸；细菌细胞中的 也能起到类似Cas12a 蛋白的作用。若要将KIFCI 基因从目标DNA 上
剪切下来，需要设计 种crRNA。
(2)为保证目的基因与PX458 质粒正确连接，在扩增目的基因时，应在引物端加入相应的限制酶序列，其中
P1 的碱基序列为5′ 3′（写出前9 个碱基）。采用PCR 技术对一个DNA 进行扩增时，第n 次循
环共需要引物 个。
(3)
在目的基因
与PX458 质粒连接时，可用 （填“E.coliDNA 连接酶”或“T4DNA 连接酶”）进行连接。
(4)将crRNA-Cas12a 重组载体成功转染至HeLa 细胞，与对照组相比，实验组中KIFCl 蛋白表达量如图2 所
示，细胞数目的变化如图3 所示，由此可得出的结论是 ，判断依据是 。
【答案】(1) 8/八 限制酶（限制性内切核酸酶） 2/二/两
(2) CAGCTGCTC 2n
(3)T4DNA 连接酶
(4) KIFC1 基因可以促进HeLa 细胞的增殖 敲除细胞株中KIFC1 蛋白表达量明显下降，证明HeLa
细胞KIFC1 基因敲除成功：KIFCl 敲除组细胞数目显著低于对照组，表明KIFC1 敲除可使HeLa 细胞增殖
能力下降
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选和获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR
技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、
启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一
29
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细
胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检
测与鉴定：分子水平上的检测：个体水平上的鉴定。
【详解】（1）在CRISPR-Cas12a 系统中，crRNA 的序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域既
有DNA 也有RNA，故最多有种核苷酸（4 种脱氧核苷酸和4 种核糖核苷酸）；Cas12a 蛋白可以到相应位
置剪切DNA，其作用相当于限制酶；若要将KIFCI 基因从目标DNA 上剪切下来，需要有两个切口，而
crRNA 的识别具有特异性，故需要2 种crRNA。
（2）扩增目的基因时，应在引物端加入相应的限制酶序列，引物需要与模板链的3'端结合，按照碱基互补
配对原则保证子链从5'向3'延伸，结合图示可知，P1 的碱基序列为5′CAGCTGCTC3′；一个DNA 分子
有两条链，第n 次复制形成2n 个DNA，相当于新合成2n-1 个DNA 分子，合成一个DNA 分子需要两个引
物，因此需要的引物数目为2n-1×2=2n 个。
（3）T4DNA 连接酶可连接黏性末端和平末端，故在目的基因与PX458 质粒连接时，可用T4DNA 连接酶
连接。
（4）结合图示可知，敲除细胞株中KIFC1 蛋白表达量明显下降，证明HeLa 细胞KIFC1 基因敲除成功：
KIFCl 敲除组细胞数目显著低于对照组，表明KIFC1 敲除可使HeLa 细胞增殖能力下降，据此可知，KIFC1
基因可以促进HeLa 细胞的增殖。
27．（2024·河北·一模）为研究干旱胁迫基因LEA 和VOC 对甘蓝型油菜油脂的积累机制，科研人员构建
了两个基因表达载体。其中基因LEA 与荧光素酶基因（Luc）构建成基因表载体甲，基因VOC 和标记基因
构建成基因表达载体乙，相关序列及酶切位点如图所示。
(1)利用PCR 扩增LEA 基因时，需要在反应体系中添加的有机物质有引物、模板、4 种脱氧核苷酸、 ，
还需要在引物的 （填“3'端”或“5'端”）添加限制酶识别序列，添加序列对应的限制酶是 。
(2)为了构建基因表达载体甲，依据图中已知碱基序列，在PCR 扩增仪中加入的引物的碱基序列为 ，
扩增 代后会得到等长的8 条DNA 片段。
(3)农杆菌转化甘蓝型油菜细胞时，T—DNA 的作用是 ，该过程发生的变异类型为 。
(4)乙酰-CoA 羧化酶基因（AC）是油脂合成过程的关键酶基因，甘油三酯酯酶基因（ATGL）是油脂分解
过程的关键酶基因。将基因表达载体甲、乙分别导入植物细胞培养成转基因植物A、B，在干旱胁迫的环
境下培养两种转基因植物和正常植物，分别检测植物体内AC 和ATGL 基因的表达水平，结果如下图。
正常植株
转基因A 植株
转基因B 植株
AC 酶
30
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
ATGL 酶
①在分子水平上，用 方法检测AC 酶和ATGL 酶的含量可得到上述结果。
②基于以上研究，干旱胁迫基因LEA 和VOC 在甘蓝型油菜油脂积累中的机制是 。
【答案】(1) 耐高温的DNA 聚合酶 5'端 EcoRV 和Xba Ⅰ
(2) 5'—GATATCATGGGC—3'和5'—TCTAGACTAGTG—3' 4/四
(3) 携带目的基因进入受体细胞并将其整合到受体细胞的染色体DNA 上 基因重组
(4) 抗原—抗体杂交 在干旱胁迫的环境下，LEA 通过促进AC 的表达使植物油脂增加；VOC 通过
抑制ATGL 的表达减弱油脂的降低
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：目的基因的获取，基因表达载体的构建，将目的基因导
入受体细胞，目的基因的检测与表达。
【详解】（1）利用PCR 扩增LEA 基因时，需要在反应体系中添加的有机物质有引物、模板、4 种脱氧核
苷酸和耐高温的DNA 聚合酶。耐高温的DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3'端延伸
DNA 链，因此PCR 扩增需要引物。引物与目的基因所在DNA 分子遵循碱基互补配对原则，所以扩增LEA
基因时，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。由于Luc 中存在BamH I 识别序列，BamH I 会将Luc
切断，一种酶切会导致载体、LEA 自身环化及LEA 反向连接等，因此选择的限制酶是EcoR V 和Xba I。
（2）根据已知序列，由于引物只能引导子链从5'→3'延伸，根据碱基互补配对原则，用PCR 扩增时的两个
引物对应的序列为:5'-GATATCATGGGC-3'和5'-TCTAGACTAGTG-3'。PCR 要得到等长的片段至少需要进行
3 轮循环，等长片段的数量为2n-2n，要得到等长的8 条DNA 片段，则2n-2n=8，n=4，故应该扩增4 次。
（3）农杆菌转化甘蓝型油菜细胞时，T-DNA 的作用是携带目的基因进入受体细胞并将其整合到受体细胞
的染色体DNA 上，该过程发生的变异类型为基因重组。
（4）①检测酶(蛋白质)分子水平上采用抗原-抗体杂交技术进行检测。②根据检测结果，转基因A 植株的
AC 酶变高了，B 的ATGL 酶变低了，可以推测在干旱胁迫的环境下，LEA 通过促进AC 的表达使植物油脂
增加；VOC 通过抑制ATGL 的表达减弱油脂的降低。
28．（2024·辽宁辽阳·一模）棉花是我国重要的经济作物，黄萎病是棉花的最主要病害之一，有棉花的
“癌症”之称。我国科学家在世界上首次获得转基因抗黄萎病棉花新株系。这将使棉花“癌症”有望得到
根治。科学家将从海岛棉中分离出来的抗黄萎病基因At7 导入陆地棉中，使陆地棉获得抗病性状。下列对
转基因棉的检测与鉴定的叙述，错误的是（ ）
A．检测转基因棉是否导入基因At7，需要一段能与基因At7 互补的短单链核酸引物
B．检测转基因棉中的基因At7 是否转录出mRNA，其原理是抗原与抗体的特异性结合
C．检测到转基因棉表达出At7 蛋白，说明转基因棉中成功导入了基因At7 并能表达
D．检测转基因棉是否抗黄萎病，可接种黄萎病的病原体到转基因棉植株上
【答案】B
【分析】目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基
因--PCR 技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--PCR 技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗
原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
31
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
【详解】A、检测转基因棉是否导入基因At7，可采用PCR 技术，PCR 时需要一段能与基因At7 互补的短
单链核酸引物，A 正确；
B、检测转基因棉中的基因At7 是否转录出mRNA，也可采用PCR 技术，其原理是DNA 半保留方式复制，
B 错误；
C、基因表达表示转录和翻译，检测到转基因棉表达出At7 蛋白，说明转基因棉中成功导入了基因At7 并
能表达，C 正确；
D、个体水平检测转基因棉是否抗黄萎病，可接种黄萎病的病原体到转基因棉植株上，D 正确。
故选B。
29．（2023·山东菏泽·一模）大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA 就会缠绕在细胞壁碎片上，静
置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，
电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述不正确的是（ ）
A．提取DNA 时可加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解
B．将提取的DNA 溶于2mol/LNaCl 溶液后；可用二苯胺试剂进行鉴定
C．电泳鉴定DNA 利用了DNA 在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理
D．根据电泳结果，质粒上一定没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点
【答案】D
【分析】DNA 粗提取和鉴定的原理：
1、DNA 的溶解性：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同（DNA 在0.14mol/L 的
氯化钠中溶解度最低）；DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。
2、DNA 的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、由于蛋白质可溶于酒精，而DNA 在冷酒精中溶解度很低，所以在提取DNA 时加入酒精，使
溶于酒精的蛋白质等物质溶解，而让DNA 析出，A 正确；
B、由于DNA 在2mol/LNaCl 溶液中溶解度较大，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色，所以将提取的DNA 溶
于2mol/LNaCl 溶液后，可用二苯胺试剂在沸水条件进行鉴定，B 正确；
C、DNA 带负电，电泳鉴定DNA 利用了DNA 在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理，C 正确；
D、因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个切割
位点，也可能没有切割位点，D 错误。
故选D。
30．（2024·广东·一模）健康的生活方式、乐观的心态和定期体检是预防癌症的主要手段。（CAR-T 细胞
疗法是治疗血液恶性肿瘤及淋巴瘤的研究热点，我国首款新型肿瘤治疗方法——CAR-T 产品于2021 年上
市。左图为CAR-T 细胞疗法的原理示意图，该疗法借助基因工程和细胞工程技术，根据CAR 蛋白（右
32
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
图）是多种肿瘤的嵌合抗原受体的特点而设计。
回答下列问题：
(1)机体肿瘤的发生主要与免疫系统的 功能降低有关。
(2)图中过程①称为 ，这是基因工程的核心步骤，需要用到的工具酶有 。过程②最常用的方法
是 。CAR-T 细胞输入患者体内后，其活化需要两个信号的刺激，具体是 。
(3)据图可知，CAR-T 细胞疗法相对传统的药物化疗和放疗而言，具有 （请写出两点）的突出优点。
(4)CAR-T 细胞在治疗肺癌、肝癌、乳腺癌等实体瘤的总体效果上还不尽如人意，请根据右图并结合特异性
免疫的原理，提出一种CAR 蛋白改造的简单思路，以提升CAR-T 细胞对实体瘤的疗效： 。
【答案】(1)免疫监视
(2) 基因表达载体的构建 限制酶和DNA 连接酶 显微注射法 CAR 蛋白与肿瘤细胞表面
抗原结合；细胞因子刺激
(3)治疗更精准、免疫排斥反应少、杀瘤效果更持久、杀瘤范围更广
(4)改造胞外识别区，使CAR 蛋白能与更多实体瘤的癌细胞结合；改造胞内信号域，更好调控CAR-T 细胞
的活化与增殖
【分析】由图可知，CAR-T 细胞疗法是通过设计CAR 基因，并导入癌症患者的T 细胞中，使其转化为
CAR-T 细胞。CAR-T 细胞膜上的CAR 蛋白与癌细胞表面抗原特异性结合后，可激活CAR-T 细胞使其增殖、
分化，从而实现对癌细胞的特异性杀伤和记忆。
【详解】（1）免疫系统的三大功能是：免疫防御、免疫自稳、免疫监视。机体能识别和清除突变的细胞，
防止肿瘤发生，这与免疫监视功能有关。
（2）CAR 基因作为目的基因与PCDH 质粒连接，属于基因工程中的基因表达载体构建环节；过程中需要
使用同种限制酶切割目的基因与质粒，保证获得相同的黏性末端，再用DNA 连接酶使目的基因与质粒连
接形成基因表达载体；将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射法；CAR-T 细胞输入患者体内后，
33
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
其活化需要两个信号的刺激，具体是CAR 蛋白与肿瘤细胞表面抗原结合和细胞因子刺激。
（3）传统的化疗、放疗只是杀死癌细胞，只能暂缓病情，无法遏制癌细胞的增殖和扩散。而且癌细胞有
很多干扰机制能让它逃掉免疫细胞的追杀。据题可知，CAR—T 细胞疗法是一种免疫疗法，CAR—T 细胞
可以在癌细胞的干扰下，继续精准识别并消灭癌细胞。这种调用病人自身免疫系统的治疗方法比传统疗法
更精准（不伤害正常细胞、副作用小）、更持久、排斥反应更少、杀瘤范围更广。
（4）①据图分析，CAR-T 细胞表面表达有CAR 蛋白，CAR 蛋白的胞外识别区能直接识别肿瘤细胞表面的
特异性抗原，并与细胞内信号域蛋白相连，建立信号通路，目前，CAR-T 疗法是治疗血液恶性肿瘤及淋巴
瘤的热点，面对实体瘤，其识别能力不强。因此可以改造CAR-T 细胞的胞外识别区，使CAR 蛋白能识别
并结合更多实体瘤的癌细胞。
②改造CAR 蛋白的胞内信号域部分，可以增强信号通路，使CAR-T 细胞更易活化，快速增殖，增强免疫
能力。
31．（23-24 高三下·江西·阶段练习）猕猴桃溃疡病是一种严重影响猕猴桃产量的细菌性病害。为获得抗猕
猴桃溃疡病的转基因猕猴桃，科研人员以猕猴桃的愈伤组织（对卡那霉素敏感）为转基因受体，通过农杆
菌转化法将抗菌肽基因导入猕猴桃。图1 表示抗菌肽基因和卡那霉素抗性基因（nptⅡ基因）及其上限制酶
酶切位点的分布情况，图2 表示Ti 质粒及其上限制酶酶切位点的分布情况。回答下列问题：
(1)限制酶能识别双链DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的 断
裂。限制酶主要来源于原核生物，但不会切割原核生物自身的DNA 分子，推测原因是 。目的基因
可随T-DNA 整合到目的细胞的染色体DNA 上，这体现了 的生物学变异原理。
(2)若只用EcoRI 切割目的基因和Ti 质粒，会产生多种连接产物。为筛选出含有目的基因正向连接的重组Ti
质粒的菌株，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到了①②③三类菌落，其生长情况如下表，“+”表
示生长，“-”表示不生长。根据表中结果判断，应选择的菌落是 （填表中序号），菌落②的导入情况
是 。
项目
①
②
③
无抗生素
+
+
+
卡那霉素
-
-
+
氨苄青霉素
-
+
+
卡那霉素+氨苄青霉素
-
-
+
34
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(3)若既要避免上述多种连接情况的发生，又要使目的基因最终能整合到猕猴桃愈伤组织细胞的染色体
DNA 上，最好选择限制酶 对目的基因和Ti 质粒进行切割。
【答案】(1) 磷酸二酯键 原核生物的DNA 分子上没有该限制酶的识别序列(或识别序列被修饰，
使限制酶不能将其切开) 基因重组
(2) ③ 导入不含目的基因的Ti 质粒(自身环化的Ti 质粒)(或导入目的基因反向连接的重组Ti 质粒)
(3)KpnI 和PstI
【分析】 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA 重组和转基因技术，赋予生物
以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品．基因工程是在DNA 分子水平上进
行设计和施工的，又叫做DNA 重组技术。
【详解】（1）限制酶能识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核
苷酸之间的磷酸二酯键断开。由于限制酶来源于原核生物，可能 原核生物的DNA 分子上没有该限制酶的
识别序列(或识别序列被修饰，使限制酶不能将其切开)，所以限制酶不能将原核生物的DNA 切开。目的基
因可随T-DNA 整合到目的细胞的染色体DNA 上，这属于基因重组。
（2）从图1 和图2 看出，用EcoRI 切割目的基因和Ti 质粒，目的基因上有卡那霉素抗性基因，质粒上有
氨苄青霉素抗性基因，二者重组后，对氨苄青霉素和卡拉霉素都有抗性，所以应该选择③，菌落②对卡拉
霉素不具抗性，但抗氨苄青霉素，应该导入不含目的基因的Ti 质粒。
（3）为避免质粒或目的基因自身连接，根据质粒和目的基因的限制酶分布情况，可以选择KpnI 和PstI
（二者形成的粘性末端不同，且在质粒和目的基因上都有该酶的酶切位点）。
32．（2024·山东聊城·一模）易错PCR 是利用低保真的Taq 酶和改变PCR 的反应条件，降低DNA 复制的
准确性，在新DNA 链的合成过程中增加碱基错配，从而使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导DNA
序列变异的方法。从自然界中的生物体内分离得到的天然酶，在工业生产环境中催化效率往往较低。下图
是研究人员利用易错PCR 技术对某种天然酶进行改造，获得了高催化效率的酶的流程示意图。回答下列问
题：
(1)在体外利用PCR 技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA 解链为单链的条件是 。PCR 反应
体系中需添加引物，引物的作用是 。
(2)图中步骤①为易错PCR 过程，其扩增过程中需要加入Taq 酶，这是因为Taq 酶具有 的特点。图中步
骤②是将构建的重组质粒溶于缓冲液中与用 处理的受体菌混合，在一定温度下完成转化。转化是指 。
35
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(3)Taq 酶的某一区域负责将碱基与模板链正确地互补配对，Mn2+可以降低这一功能；非互补的碱基对由于
氢键不易形成，稳定性差，Mg2+可以提高该错配区的稳定性。因此，与普通PCR 相比，易错PCR 的反应
体系中应适当 （填“提高”或“降低”）Mn2+浓度、 （填“提高”或“降低”）Mg2+浓度。
(4)阐述通过易错PCR 技术改造天然酶与通过蛋白质工程改造天然酶原理的本质区别 。
【答案】(1) 温度升高到90°C 使DNA 聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
(2) 耐高温 Ca2+ 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
(3) 提高 提高
(4)易错PCR 技术是利用基因突变的原理来改造天然酶，是不定向的；而蛋白质工程是利用基因重组的原
理来改造天然酶，是定向的
【分析】PCR 技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于TaqDNA 聚合酶的酶促合
成反应。DNA 聚合酶以单链DNA 为模板，借助一小段双链DNA 来启动合成，通过人工合成的引物与单
链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA 聚合酶将脱氧单核苷
酸加到引物3′-OH 末端，并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA 互补链。
【详解】（1）在体外利用PCR 技术扩增目的基因时，利用DNA 高温变性的特点加热至90-95℃，破坏双
链之间的氢键，使DNA 解链变为单链。用PCR 技术扩增目的基因时，需要在PCR 扩增仪中加入2 种引物，
其作用是使DNA 聚合酶（Taq 酶）从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
（2）PCR 技术需要高温加热使DNA 双链解旋，而Taq 酶热稳定性高，在高温条件下不会失活，因此在降
温时仍可发挥作用。步骤②是将重组质粒导入不同受体菌，由于受体菌用钙离子处理后更容易吸收周围环
境中的DNA，因此步骤②是将构建的重组质粒溶于缓冲液中与用Ca2+处理的受体菌混合，在一定温度下
完成转化。转化是指目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
（3）PCR 技术通过DNA 的双链复制，在耐高温的TaqDNA 聚合酶的催化下，遵循碱基互补配对原则，扩
增DNA 片段。TaqDNA 聚合酶与一般DNA 聚合酶相比最大的特点是高温下保持酶的活性或耐高温或热稳
定，其某一区域负责将碱基与模板链正确地互补配对，Mn2+可以降低这一功能，提高碱基的错配，而
Mg2+可以提高稳定性，故易错PCR 时应适当提高Mn2+和Mg2+浓度。
（4）通过易错PCR 技术改造天然酶属于基因工程，与通过蛋白质工程改造天然酶原理的本质区别为：易
错PCR 技术是利用基因突变的原理来改造天然酶，是不定向的；而蛋白质工程是利用基因重组的原理来改
造天然酶，是定向的。
33．（2024·安徽蚌埠·一模）研究发现人溶菌酶（hLZ）是天然抗生素替代品。科学家培育出转入溶菌酶基
因山羊，以大规模生产人溶菌酶（从乳汁中提取），过程如图所示。其中编号①~⑨表示过程：质粒S 中
的基因Leu 通过控制相关酶的合成而控制亮氨酸的合成（亮氨酸是山羊细胞维持生命活动必不可少的一种
必需氨基酸），基因GFP 控制合成绿色荧光蛋白。四种限制性内切核酸酶的识别序列及切割位点见下表。
请回答下列问题：
限制酶
BamHI
BgIII
HindIII
Xbal
识别序列和切割位点
G'GATCC
A'GATCT
A'AGCTT
TCTAGA
36
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
(1)过程②需要的限制性内切核酸酶是 ，在③中，B 与切割后的质粒S 用 酶连接，在两个片段
相邻处形成 ，获得重组质粒T。
(2)为成功筛选出含重组质粒T 的成纤维细胞，质粒S 中用作标记基因的是 。为达到筛选目的，培养
基的营养成分中特殊之处是 。若用PCR 检测目的基因是否成功导入受体细胞中，实验组以待测的样
本DNA 为模板，使用目的基因的特异性引物进行PCR 扩增，同时将以 片段为模板的组别作为阳性
对照组，将以非目的基因片段为模板的组别作为阴性对照组。
(3)过程⑧形成的早期胚胎中 （填结构）将发育成完整转基因羊个体。
【答案】(1) BamH Ⅰ、Hind Ⅲ DNA 连接 磷酸二酯键
(2) 基因Leu、基因GFP 不含有亮氨酸 非目的基因片段
(3)内细胞团
【分析】
基因工程又称基因拼接技术和DNA 重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的
现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA 分子，然后导入活细胞，
以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的
基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基
因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）过程②为对目的基因进行切割，结合切割出的黏性末端GATC、AGCT 可知，需要的限制性
内切核酸酶是BamH Ⅰ、Hind Ⅲ；B 与切割后的质粒S 具有相同的黏性末端，可以用DNA 连接酶连接形
成磷酸二酯键，构建重组质粒T。
（2）基因GFP 控制合成绿色荧光蛋白、Leu 通过控制相关酶的合成而控制亮氨酸的合成，两者都为标记
基因，有助于重组质粒的筛选。为达到筛选目的，培养基的营养成分中特殊之处是不含有亮氨酸，这样能
生长的菌株即为含有普通质粒和重组质粒的菌株，重组质粒GFP 基因被破坏，即能在缺乏亮氨酸的培养基
上生长又不能表现为绿色的即为含重组质粒的菌株。以目的基因片段为模板的组别作为阳性对照组，若实
37
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
验组导入成功，则也会出现与阳性对照组一样的条带，以非目的基因片段为模板的组别作为阴性对照组，
表明电泳的准确性。
（3）过程⑧为早期胚胎培养，早期胚胎的囊胚期的内细胞团细胞将发育成完整转基因羊个体。
34．（2024·河北邯郸·一模）华南农业大学科研团队首次利用转基因猪的唾液腺作为生物反应器，高效合
成一种对人的神经性疾病具有良好治疗作用的蛋白质——人神经生长因子(hNGF)，为生产高活性的人类药
用蛋白提供了一种高效的新技术，拓展了畜牧动物在人类医学中的应用。图示为该团队构建的基因表达载
体，请回答下列相关问题：
(1)科研人员曾经利用小鼠唾液腺组织中分离纯化的鼠源神经生长因子(mNGF)及大肠杆菌表达的hNGF 进
行一些神经损伤疾病的治疗，但其治疗效果均比人体自身合成的hNGF 差。请分析mNGF 治疗效果较差的
原因可能是 ，导致mNGF 的活性较低；大肠杆菌表达的hNGF 治疗效果也较差的原因可能是
，导致大肠杆菌表达的hNGF 活性也较低。
(2)家畜的唾液腺是一种高效的生物反应器，与乳腺生物反应器相比较，其优点是 (答出两点)；
在构建hNGF 基因表达载体时，需将hNGF 基因与 等控制元件重组在一起，通过
技术将基因表达载体导入猪的受精卵中，经 等技术将受精卵培养成胚胎并转移到受体猪体内。
(3)为确定转基因猪是否培育成功，除了分子水平的鉴定，还可以进行个体水平的鉴定，具体的方法是
。
【答案】(1) mNGF 与hNGF 的结构可能存在部分差异 大肠杆菌没有内质网和高尔基体等细胞器，
合成的hNGF 不能进行进一步修饰和加工
(2) 在整个生命周期都可以在唾液腺中表达hNCF、不受性别的限制；唾液的分泌量大、唾液中蛋白质
的种类和含量比乳汁中少,便于收集 唾液腺中特异性表达的基因的启动子 显微注射
(3)体外胚胎培养技术和胚胎移植
(4)在黑暗的环境中用紫外光照射转基因猪的唾液，观察绿色荧光是否出现
【分析】基因工程基本操作步骤，需要经历四步：目的基因获取→基因表达载体的构建→目的基因导入受
体细胞→目的基因检测与鉴定，其中基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。基因工程的应用：①植
物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。②动物基因工程：提高动物生
长速度；改善畜产品品质；用转基因动物生产药物，如乳腺生物反应器和膀胱生物反应器。③基因治疗是
把正常基因导入病人的体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗的目的，这是治疗遗传病最有
效的手段。
【详解】（1）小鼠唾液腺组织中分离纯化的鼠源的NGF(mNGF)生物活性比hNGF 低的原因可能是mNGF
与hNCF 的结构存在差异，因为蛋白质的结构决定蛋白质的功能。在大肠杆菌中表达的hNGF 生物活性也
比较低，是因为大肠杆菌为原核生物，没有内质网、高尔基体等细胞器，hNGF 合成后不能进行加工、修
饰。
（2）家畜的唾液腺是一种高效的生物反应器，与乳腺生物反应器相比较，其优点是在整个生命周期都可
38
关注公众号：陆陆高分冲刺 ~领取：最新版“中考/高考-总复习”、最新试卷下载
以在唾液腺中表达hNCF、不受性别的限制；唾液的分泌量大、唾液中蛋白质的种类和含量比乳汁中少。
为了可以使特定的蛋白在猪的唾液腺细胞中表达，在构建基因表达载体时，需将hNGF 基因与唾液腺中特
异性表达的基因的启动子等控制元件重组在一起，通过显微注射技术导入猪的受精卵中，需利用体外胚胎
培养技术先将受精卵培养成早期胚胎，然后利用胚胎移植技术将早期胚胎移到受体猪体内，以培育成完整
个体。
（3）为确定转基因猪是否培育成功，除了分子水平的鉴定，还可以进行个体水平的鉴定。因基因表达载
体中存在绿色荧光蛋白基因，可以在黑暗的环境中用紫外光照射转基因猪的唾液，观察绿色荧光是否出现。
39
