科研进展 | AI从头设计蛋白组装体,构建高性能人工RNA递送载体STV C8

病毒经过数十亿年进化，演化出高效的遗传物质转运能力，多数病毒趋同进化形成二十面体、螺旋对称的蛋白衣壳。生成式AI蛋白设计工具能够创造自然界不存在的全新蛋白结构。

本研究将天然功能蛋白结构域与AI生成的人工蛋白组装体结合，从头创制出100余种人工 RNA转运载体STV（synthetic transfer vehicles）。筛选得到最优载体STV‑C8，具备非天然平面C8对称结构，RNA递送效率比现有主流递送系统高出数个数量级。

通过融合计算设计的肽段结合模块，可以对STV‑C8实现细胞靶向重编程；该载体可以向多种细胞模型递送治疗型RNA货物。本工作实现小鼠体内近单细胞分辨率的生物分布检测，验证体内安全性；并且在病人来源细胞以及猪模型上完成杜氏肌营养不良DMD的CRISPR基因编辑治疗验证。

本研究证明，借助生成式AI设计人工蛋白组装体，可以突破天然蛋白多样性的局限，理性构建具备预期性能的RNA转运系统。

△ 图1. 自下而上组装STV RNA载体的设计与筛选。

△ 图2. STV‑C8 RNA 载体的表征与靶向重编程。

1）与缺失膜结合域对照相比，STV‑C8使上清中货物RNA富集10000倍以上。

2）RNA‑seq、蛋白质组：发现STV-C8颗粒中EGFP载荷RNA的富集程度很高，部分mRNA被排除在外，此外，与出芽过程相关的ESCRT蛋白显著富集。

3）冷冻电子断层cryo‑ET：STV‑C8诱导产生50‑300 nm囊泡，峰值粒径约110 nm；囊泡内部存在22 nm左右的人工蛋白组装颗粒；组装体排布在囊泡膜内侧，RNA结合结构朝外，RNA货物结合在组装体表面，并非包裹进蛋白壳内部，因此无严格RNA长度包装上限。

4）性能对标：对比VLPs、EPN、SEND等基因编码载体，以及临床级LNP（BNT162b2所用ALC‑0315脂质）；同等表达水平下，STV‑C8递送效率比LNP高出1000‑10000倍。

5）免疫原性：细胞内转录产生、STV‑C8包装的mRNA不会激活IFNβ干扰素通路；而LNP递送未修饰体外转录mRNA会强烈触发天然免疫。

6）靶向重编程策略：使用受体结合缺陷的突变VSV‑G（保留内体逃逸），针对EGFR或IL-7Rα的计算设计肽结合蛋白，通过将其与信号肽及跨膜结构域融合，添加到STV-C8颗粒中，并在STV-C8(EGFP)表达细胞中，将这些构建体与盲测的VSV-G（K63Q/R370Q）共同表达，可特异性靶向EGFR、IL‑7Rα受体细胞，实现细胞类型选择性递送。

7）其它特性：4 ℃至少稳定保存一周；1‑10 kb范围内mRNA包装无明显尺寸限制；未检测到载体诱导细胞凋亡。

△ 图3. STV‑C8向多种细胞模型递送各类RNA货物。

在多物种多种原代/类器官模型开展递送测试：

1）iPS来源RPE视网膜色素上皮类球体、人原代单核细胞：可穿透类球体多层细胞，高效表达报告基因。

2）小鼠原代星形胶质细胞：递送转录因子Ascl1 mRNA，诱导> 30%细胞表达ASCL1蛋白。

3）CRISPR基因编辑应用：STV‑C8共递送Cas9‑mRNA+双sgRNA；在猪成纤维细胞实现dystrophin基因51号外显子敲除（DMD杜氏肌营养不良治疗策略），编辑效率约40%。

4）抗病毒应用：递送Cas13d‑NCS以及新冠crRNA；在感染SARS‑CoV‑2‑GFP的人肺细胞中几乎完全抑制病毒复制。

5）稳定性：STV‑C8与人全血、血清孵育，递送活性无明显下降。

△ 图4. STV‑C8在小鼠、大动物猪模型的体内生物分布与基因编辑货物递送。

1）小鼠静脉注射STV‑C8‑EGFP，全身组织透明化光片显微镜（近单细胞分辨率）：主要富集表达在肺；肝脏几乎无信号（区别于多数脂质纳米颗粒）；未检测到明显毒性、免疫炎症反应。

2）大动物猪局部肌肉注射STV‑C8 (Cas9/sgRNA)：成功实现dystrophin基因51号外显子敲除，测序验证编辑产物；局部注射无显著免疫应答。

3）病人来源DMD骨骼肌细胞（Δ52突变背景），STV‑C8处理后成功删除51号外显子，恢复阅读框，验证临床转化潜力。

本工作利用RFdiffusion生成式AI蛋白设计，完全从头构建人工RNA转运载体STV，筛选得到最优STV‑C8。STV‑C8不模仿天然病毒衣壳的经典二十面体/螺旋结构；采用非天然C8环对称蛋白组装体，RNA结合在组装体外表面，摆脱病毒衣壳的包装尺寸限制。载体RNA递送性能显著优于多种生物载体、临床LNP。可兼容报告mRNA、转录因子、CRISPR编辑系统、Cas13抗病毒RNA等多种货物；实现细胞靶向重编程；完成细胞、小鼠、猪多层面验证。

技术启示：当前AI蛋白生成工具擅长产出静态对称蛋白复合体，但设计动态蛋白、酶活蛋白仍存在短板。未来结合分子动力学、多模态大模型，可进一步拓展De Novo Protein Design解决生物医学问题的边界。

研究局限：

1）本研究猪实验仅做局部肌肉注射；距离DMD全身系统性给药仍有待后续开发靶向改造。

2）STV体内细胞嗜性、循环稳定性、免疫原性还需要更多动物批次评估。

3）STV‑C8生产依靠哺乳动物细胞质粒转染；未来需要开发规模化生产工艺。

本工作证明：绕过进化约束，AI从头设计蛋白组装体，是开发下一代核酸递送载体的全新可行路线。

全部载体使用标准分子克隆；PCR扩增、限制性酶切、基因片段合成；NEBuilder组装；DH5α感受态转化；质粒小提/大提；Sanger测序验证；全部载体序列见补充表。

不同培养板按密度铺细胞；JetOptimus转染试剂；不同培养板体系对应DNA用量。

HEK293T常规培养：

1）split‑Luc报告细胞：AAVS1安全位点定点整合LgBiT‑P2A‑C‑split‑Fluc，嘌呤霉素筛选。

2）EGFR、IL‑7Rα单/双受体敲入细胞：AAVS1位点整合对应受体，嘌呤霉素/杀稻瘟菌素筛选。

收集来自STV释放的细胞上清液，0.45 μm滤膜过滤；提取总RNA；一步法RT‑qPCR，特异性探针定量EGFP货物mRNA。

RFdiffusion产出对称寡聚蛋白，排除D2对称；共39种骨架，C端融合STV功能模块，进入高通量筛选。

以大鼠PHPLCδ（PDB：1MAI）为模板，FoldSeek数据库检索；分为其它物种、人源、宏基因组蛋白三类；候选序列合成，融合到STV骨架N端，进入释放‑摄取‑递送三维筛选。

96孔板高通量转染；HiBiT发光检测上清载体释放；上清加到split‑Luc报告细胞；检测NanoLuc信号评价载体摄取；检测萤火虫荧光素酶信号评价mRNA递送。对照蛋白用于信号绝对定量校准。

收集STV生产细胞上清，浓缩；加到靶细胞；StemPro Accutase分离细胞，流式检测EGFP阳性细胞比例。

RFdiffusion开源脚本，A100GPU计算，生成更多C8对称新骨架。

HA标签标记STV组件；固定透化；抗‑HA一抗、Alexa荧光二抗；荧光显微镜成像，观察膜定位。

共转染恒定EGFP‑PP7，搭配不同长度mRuby3‑PP7（1‑10 kb）；STV递送后流式检测双荧光表达，评估包装上限。

收集细胞上清；蔗糖/碘克沙醇密度梯度超速离心纯化载体；负染、冷冻制样；冷冻断层扫描采集，AlphaFold3模型辅助颗粒分割与尺寸分析。

纯化STV‑C8囊泡；有SynL出芽域/无SynL对照组；质谱蛋白质组；生产细胞与STV‑C8的mRNA转录组比较。

信号肽‑跨膜域融合AI设计EGFR / IL‑7Rα微型结合蛋白minibinder；搭配受体结合缺陷VSV‑G (K63Q/R370Q) 共转生产细胞；囊泡出芽时将结合蛋白展示在囊泡表面，实现靶向。

iPS‑RPE类球体、人原代单核细胞、小鼠原代星形胶质细胞；Cas13d抗新冠病毒感染模型；病人来源DMD骨骼肌细胞；完成转导、编辑、成像检测。

小鼠：尾静脉STV‑C8注射；vDISCO全身组织透明化；光片显微镜成像；组织病理学、免疫炎症评价安全性。

猪：肌肉局部多点注射STV‑C8 (Cas9/sgRNA)；取材，PCR+测序验证dystrophin外显子51敲除；局部组织炎症评估。

生物学重复n见对应图注；t检验、方差分析；荧光、生存、编辑效率统计；GraphPad完成统计绘图。