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一、选择题
1．(2024·泉州高三质检)像BclⅠ(－T↓GATCA－)、Bgl Ⅱ(－A↓GATCT－)、MboⅠ(－
↓GATC－)这样，识别序列不同，但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。如
图表示目的基因及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用
DNA 连接酶进行连接。下列分析错误的是( )
选项
切割质粒
切割目的基因
结果分析
A
BclⅠ和BglⅡ
BclⅠ和BglⅡ
形成的重组质粒的碱基排列顺序
不一定相同
B
BclⅠ和BglⅡ
MboⅠ
切割后的质粒不可自我环化，切
割后的目的基因可以自我环化
C
MboⅠ
BclⅠ和BglⅡ
形成的重组质粒可被MboⅠ再次
切开，但可能无法被BclⅠ和
BglⅡ再次切开
D
MboⅠ
MboⅠ
切割后的质粒可以自我环化，切
割后的目的基因也可以自我环化
2.(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3 和酶4)、DNA 连接酶为工具，将目
的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达
载体。限制酶的切割位点如图所示。
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下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A．质粒和目的基因都用酶3 切割，用E.coli DNA 连接酶连接
B．质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割，用T4 DNA 连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割，用T4 DNA 连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割，用E.coli DNA 连接酶连接
3．(2023·重庆，12)某小组通过PCR(假设引物长度为8 个碱基短于实际长度)获得了含有目
的基因的DNA 片段，并用限制酶进行酶切(下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。
下列叙述错误的是( )
A．其中一个引物序列为5′－TGCGCAGT－3′
B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2 个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E.coli DNA 连接酶或T4 DNA 连接酶
4．(2024·镇江高三二模)转基因植物中标记基因的剔除可有效防止基因污染，剔除常用分离
剔除法和重组剔除法。分离剔除法是在转基因时将目的基因和标记基因分别构建在两个Ti
质粒上，通过共转化得到转基因植物后让其自交得到不含标记基因的转基因个体；重组剔除
法利用Cre/LoxP 重组酶系统，Cre 酶能有效剔除重组载体中含有标记基因的序列，只留下一
个LoxP 位点，具体原理如图。下列说法不正确的是( )
A．利用分离剔除法时，目的基因和标记基因都应插到Ti 质粒的T－DNA 序列内部
B．分离剔除时目的基因和标记基因插到植物细胞的同源染色体或非同源染色体上均可成功
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C．上述重组载体中启动子1 在农杆菌中可发挥作用，而在植物细胞中不能发挥作用
D．经重组剔除后的标记基因，因没有启动子而无法启动基因的转录
5．如图是培育抗除草剂玉米的技术路线图，含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确
表达，其产物能催化无色物质K 呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导
致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列相关叙述正确的是( )
A．过程①中除草剂抗性基因插入T－DNA 中，导致T－DNA 片段失活
B．过程①用两种限制酶就可防止酶切产物自身环化
C．过程②用Ca2＋处理，使农杆菌细胞壁通透性改变，使其处于能吸收周围环境中DNA 分
子的生理状态
D．过程③应在培养基中加入除草剂和物质K
6．(2024·西安高三一模)我国科学家利用Xba Ⅰ和Sac Ⅰ两种限制酶，并运用农杆菌转化
法，将富含赖氨酸的蛋白质编码基因(含678 bp)导入某植物细胞，再经植物组织培养获得转
基因植株，使赖氨酸的含量比对照组明显提高，如图表示相关培育过程(质粒的其他部位和
目的基因内部均无Xba Ⅰ、Sac Ⅰ、Hind Ⅲ的识别位点)，下列说法不正确的是( )
A．一个内含目的基因的模板DNA 经PCR 扩增4 次，共产生8 个等长DNA 分子
B．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法
C．植物组织培养过程中，培养基需添加卡那霉素以便筛选转基因植株
D．使用Sac Ⅰ和Hind Ⅲ切割重组质粒后能得到1 500 bp 左右的片段
7．自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱
性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基
因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。
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下列相关叙述错误的是( )
A．上述获得蓝色玫瑰的方案中不需要转入能调控液泡pH 的基因
B．将sfp 基因插入Ti 质粒时使用的限制酶是Pme Ⅰ和BamH Ⅰ
C．同时使用Spe Ⅰ和Sac Ⅰ能提高idgS 基因和Ti 质粒的重组效率
D．sfp 和idgS 基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的
8．(2024·莆田高三质检)如图表示利用基因工程生产黄金大米时所构建的基因表达载体，其
中基因Ⅰ和基因Ⅱ是β－胡萝卜素合成所必需的基因，基因Ⅲ表达的蛋白质可使细菌在特殊
培养基上生长。下列分析错误的是( )
A．A 序列是该基因表达载体的复制原点
B．基因Ⅲ的作用是便于筛选该重组质粒
C．β－胡萝卜素是检测基因Ⅰ、基因Ⅱ表达的关键指标之一
D．图中基因插入质粒时需要限制酶和DNA 连接酶
9．(2024·南京高三联考)某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，使青蒿素合成过程中的某
一关键酶基因fps 在野生青蒿中过量表达，其过程如图所示。下列有关叙述错误的是( )
A．也可用PCR 技术直接扩增RNA 来获取目的基因
B．酶1、酶2 和酶3 作用的化学键都是磷酸二酯键
C．本过程中，可以采用一种、两种甚至四种酶2
D．通过抗原—抗体杂交技术可检测fps 基因是否表达出蛋白质
10．(2024·徐州高三质检)图甲为培育转基因生物时选用的载体，图乙是含有目的基因的一段
DNA 序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述错误的是( )
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A．若通过PCR 技术提取该目的基因，应该选用引物a 和引物c
B．构建表达载体时可选用BclⅠ和Hind Ⅲ这两种限制酶
C．若将基因表达载体导入大肠杆菌中，需用Ca2＋处理大肠杆菌
D．只利用含四环素的培养基就可以直接筛选出成功导入表达载体的受体细胞
二、非选择题
11．(2021·全国乙，38)用重组DNA 技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类
需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4 种限制性内切核酸酶的切割位点如
图所示。
回答下列问题：
(1)常用的DNA 连接酶有E.coli DNA 连接酶和T4 DNA 连接酶，上图中____________酶切
割后的DNA 片段可以用E.coli DNA 连接酶连接，上图中______________________切割后的
DNA 片段可以用T4 DNA 连接酶连接。
(2)DNA 连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
(3)重组DNA 技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA 分子上有复制原点，可以
保证质粒在受体细胞中______________；质粒DNA 分子上有________________________，
便于外源DNA 的插入；质粒DNA 分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素
可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是___________________________________________
____________________________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指____________________________________________。
12．(2021·福建，21)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类广
泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT 基因导
入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MT cDNA 的核苷酸序列设计了相应的引物(图1 甲)，通过PCR 扩增MT 基因。
已知A 位点和B 位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应
为______________。
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(2)本实验中，PCR 所用的DNA 聚合酶扩增出的MT 基因的末端为平末端。由于载体E 只有
能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P 将MT 基因接入载体E。载体P 和载体E 的
酶切位点及相应的酶切序列如图1 乙所示。
①选用______________酶将载体P 切开，再用__________(填“T4 DNA”或“E.coli81
DNA”)连接酶将MT 基因与载体P 相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT 基因的____________和__________。选用______________酶组合
对载体P′和载体E 进行酶切，将切下的MT 基因和载体E 用DNA 连接酶进行连接，将得
到的混合物导入到用____离子处理的大肠杆菌，筛出MT 工程菌。
(3)MT 基因在工程菌的表达量如图2 所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中
重金属的MT 工程菌，理由是_____________________________________________________
______________________________________________________________________________。
13．科研人员通过转基因技术培育出超量表达P 蛋白的转基因甜玉米。在超量表达P 基因载
体的构建中，含P 基因的DNA 片段以及Ti 质粒的酶切位点如图所示，其中强启动子能驱动
基因的持续转录。请回答下列问题：
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限制酶
识别序列
Cla Ⅰ
5′AT↓CGAT3′
BamH Ⅰ
5′G↓GATCC3′
Hind Ⅲ
5′A↓AGCTT3′
EcoR Ⅰ
5′G↓AATTC3′
Kpn Ⅰ
5′GGTAC↓C3′
Sac Ⅰ
5′GAGCT↓C3′
(1)以RNA 为模板，通过RT—PCR 技术可获取P 基因。进行RT—PCR 时，一般要加入4 种
脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)而不是脱氧核苷酸，其原因是_____________________________，
同时需加入的酶有________________________________。为了特异性扩增P 基因序列，需根
据______________________设计特异性引物。
(2)在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是__________和__________，这样操作不
仅使P 基因在玉米植株中超量表达，还可利用T－DNA 的______________特性，最终使P
基因__________________________________。
(3) 将农杆菌液浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养时，培养基中需加入
______________，筛选出的愈伤组织经再分化过程形成丛芽，最终获得转基因玉米植株。
(4)对转基因再生玉米植株进行鉴定时发现，有些植株虽有P 基因，但几乎没有P 蛋白，造
成该现象的原因可能有_______________________________________________________
________________________________________________________________________。
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